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• Jhonatan David Alarcon Ortiz

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(Universidad Del Perú, DECANA DE AMÉRICA)

CRECIMIENTO MICROBIANO Curva de crecimiento, fases, manejo e implicancias. Mg. Sc. Estela Memenza Z.

Crecimiento Bacteriano Incremento del número de células y masa celular ADN

FISIÓN BINARIA

Replicación del ADN

Una generación

Elongación de la célula, R, Mol, CoEnz., Dupl. Cromosoma Formación del septo

Terminación del septo con formación de paredes bien diferenciadas

Separación de las células

Crecimiento Bacteriano

Crecimiento de Poblaciones Aumento del número de células microbianas en una población (BM) Una generación Tiempo de generación/duplicación

Velocidad de Crecimiento: BM/dt Tasa de Crecimiento

Curva de Crecimiento

Logaritmos del número de células/ml

FASE EXPONENCIAL

FASE ESTACIONARIA

FASE LAG

Tiempo (Horas)

FASE DE MUERTE

Fases en la Curva de Crecimiento

Progresión geométrica 2 0 21 22 24 2 n

Fase Lag  Periodo de adaptación.  No hay incremento en el número de células.  Alta actividad metabólica: Inducción de la síntesis de enzimas capaces de utilizar los nutrientes disponibles.

Crecimiento microbiano exponencial Número total de células Logarítmica

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 : : : 10

1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096 : : : 1048576

0 0 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 4 : : : 6

Velocidad de crecimiento de un cultivo microbiano y = 0.602*X 4.5 4000

4.0 3.5

Logarítmica

3000

3.0

Crecimiento exponencial

2.5

Aritmética

2000

2.0 1.5

1000

1.0 0.5

0

0.0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Tiempo (h)

4

4.5

5

5.5

6

Número de células (escala logarítmica)

Número total de células Aritmética

Número de células (escala aritmética)

Tiempo (h)

Ejercicio Tiempo (Horas)

Células total de células

0 2 4 6 8 14 18

300 1.41E+08 9.95E+10 3.30E+13 2.70E+17 1.22E+26 2.16E+32

Hallar:

El número total de células a las 5 horas de crecimiento

35

Tiempo (Horas)

Células total de células

Número total de células

0

300

2

2

1.41E+08

8

20

4

9.95E+10

11

15

6

3.30E+13

14

8

2.70E+17

17

14

1.22E+26

26

18

2.16E+32

32

y = 1.5x + 4.0408 R² = 0.9934

30

25

10

5

0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Crecimiento microbiano exponencial Parámetros de crecimiento Cultivo bacteriano que crece exponencialmente = 2 1 20

2 21

4 22

8 23

16 ……………… 24……………… 2n

Número final de células

N = No *

2n

N: Número final de célula No: Número inicial de células n: número de generaciones durante el periodo de crecimiento exponencial

Tiempo de generación g

g = t/n

g: Tiempo de generación de la población celular

t: indica las horas o minutos de crecimiento exponencial n: número de generaciones durante el periodo de crecimiento exponencial

Número final de células N = No* 2n Log N = Log No + nLog2 LogN – LogNo = nLog2 n = LogN – LogNo Log2 n = LogN – LogNo 0.301 n = 3.3 (LogN – LogNo)

Ejemplo Calcular g, Sí N = 108 No = 5*107 y t = 2

Ejercicio Tiempo (Horas)

Células total de células

0 2 4 6 8 14 18

300 1.41E+08 9.95E+10 3.30E+14 2.70E+16 1.22E+26 2.16E+29

Hallar: El tiempo de generación entre las 2 y 4 horas de tiempo de crecimiento.

Fase exponencial Parámetros cinéticos:

 Velocidad específica de crecimiento celular(µ)

dX = µX dt

X = X0 a t=0 X = X0 e µ

Ln (X) = µt X0 ó

Ln (X) – Ln (X0) = µt

µ: Tasa específica de crecimiento (h-1), µmáx considere en la etapa exponencial X: concentración celular (g/L) T: tiempo (h)

Problema 1: Una bacteria crece en condiciones óptimas y duplica su biomasa cada 90 minutos. Si un medio de cultivo con 2.5% de glucosa se inocula con 500 mg/L de biomasa y, después de 6 h de cultivo, la concentración de azúcares en el medio es de 2.5 g/L. Calcule: (a) la concentración de sustrato (g/L) que se consume; (b) la concentración de biomasa (g/L) después de 2, 4 y 6 h de crecimiento exponencial. R. (a) 22.5 g/L R. (b) 1.3, 3.2 y 8.0 g/L, respectivamente

Fase estacionaria  No hay crecimiento neto del número de células (no hay división): Tasa de crecimiento = Tasa de muerte celular  Producción de metabolitos secundarios  Metabolismo endógeno: almacenamiento de energía para el mantenimiento de la viabilidad celular.  Producción de compuestos inhibitorios del crecimiento celular.

Fase de muerte  Ocurre lisis celular  Parámetros cinéticos:

Parámetros de crecimiento

Donde: µ = Constante de crecimiento K = Constante de decrecimiento/muerte N = Número de células

Medidas de Crecimiento Microbiano Medición del cambio del número de células 1. Método Directo a. Recuento de células totales

1. Método Directo b. Recuento de células viables

 Método Difusión

 Método Diseminación

 Método Estriado

Medidas de Crecimiento Microbiano 2. Método Indirecto a. Turbidimetría

Espectofotómetro: Densidad Óptica (Absorbancia)

Tubo control

Turbidez: Población microbiana

Sistemas de Cultivo Depende de la forma de operación del Biorreactor o Fermentador

Biorreactor

Biorreactor de Mesa 0.5 – 10 L

Biorreactor piloto 15 – 100 L

Biorreactor Industrial 150 – 10000 L

Agitador

Termómetro

Manómetro

pH

1. Cultivo en Lote o BATCH Cultivo de microorganismos a partir de una cantidad limitada NO RENOVABLE de medio de cultivo hasta que se agoten los nutrientes esenciales o se acumulen productos tóxicos en niveles que inhiben el crecimiento microbiano.

2. Cultivo Continuo Cultivo de microorganismos en sistemas abiertos con ADICIÓN CONSTANTE de medio de cultivo nuevo y SALIDA CONSTANTE de medio de cultivo usado más células (volumen cte.) a velocidad constante.

QUIMIOSTATO

2. Cultivo Continuo – Forma de Operación

2. Cultivo Continuo

3. Cultivo en lote Alimentado o FED BATCH Cultivo de microorganismos con un sistema semicontinuo con ADICIÓN CONSTANTE de medio de cultivo nuevo pero SIN SALIDA de medio de cultivo usado (sustrato cte.).

F: Flujo de entrada CSA: Concentración de sustrato alimentado. V: Volumen de la mezcla X: Concentración de biomasa en la mezcla

Cultivo en Lote

Cultivo Continuo

Cultivo en Lote Alimentado

Ventajas -Sistemas de simple operación - Ahorro de nutrientes

-Ampliamente utilizado - Mayor posibilidad de control de parámetros - Control de velocidad de crecimiento - Obtención de altas cantidades de productos - Automatizado

- Obtención de altas concentraciones de productos - Sin pérdida de células viables

Desventajas - Producción limitada del producto - Producción de sustancias que inhiben el crecimiento - Imposible su automización

- Pérdida de células viables - Gasto de medio de cultivo

- Acumulación de sustancias tóxicas - Limitado por la capacidad de trabajo del reactor