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Reporte Técnico RT-ID-015/2004

Incidencia de la agitación en el crecimiento microalgal en biorreactores Jorge Eliach1, Gastón Bourges1, Medina3,4, Miguel Lara2,5

Liliana

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Duré2, Mabel

Alumnos adscriptos del Laboratorio de Energías Alternativas (Conicet - UNR). Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniería y Agrimensura. Universidad Nacional de Rosario 2 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario. 3 Consejo de Investigaciones. Universidad Nacional de Rosario. 4 Departamento de Matemática. Escuela de Formación Básica. Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniería y Agrimensura. Universidad Nacional de Rosario 5 Conicet

Disciplinas: Ingeniería Mecánica, Microbiología, Física Aplicada

1 de Septiembre 2004 Revisado

Secretaría de Ciencia y Técnica Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniería y Agrimensura Universidad Nacional de Rosario Av. Pellegrini 250 - 2000 Rosario – Argentina http://www.fceia.unr.edu.ar/secyt

Este documento es publicado por la FCEIA para su consulta externa. El mismo se publica como Reporte de Investigación para divulgación de las tareas científicas que se desarrollan en la FCEIA, Universidad Nacional de Rosario. Los autores conservan los derechos de autoría y copia de la totalidad de su trabajo aquí publicado. Luego de su posterior eventual publicación externa a la FCEIA, los requerimientos deberán dirigirse a los autores respectivos. El contenido de este reporte refleja la visión de los autores, quienes se responsabilizan por los datos presentados, los cuales no necesariamente reflejan la visión de la SeCyT-FCEIA. Tanto la SeCyT-FCEIA como los autores del presente reporte no se responsabilizan por el uso que pudiera hacerse de la información y/o metodologías publicadas. Cualquier sugerencia dirigirla a: [email protected]

En este lugar debería explicitarse si el presente trabajo está basado en un manuscrito que ha sido remitido a publicación a los efectos de evitar su envío a revisión por parte de un par, ya sea local o externo a la Facultad, y acelerar de esta manera la difusión del reporte técnico.

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Incidencia de la agitación en el crecimiento microalgal en biorreactores Jorge Eliach1, Gastón Bourges1, Liliana Duré 2, Mabel Medina 3,4, Miguel Lara 2,5 1

Alumnos adscriptos del Laboratorio de Energías Alternativas (Conicet - UNR). Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniería y Agrimensura. Universidad Nacional de Rosario 2 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario. 3 Consejo de Investigaciones. Universidad Nacional de Rosario. 4 Departamento de Matemática. Escuela de Formación Básica. FCEIA. UNR. 5 Conicet La spirulina (Arthrospira platensis) es una microalga que se utiliza como un suplemento dietario en alimentación humana y animal. El objetivo de este trabajo es evaluar la incidencia de la agitación del medio líquido de cultivo en el crecimiento microalgal, con respecto a un cultivo que no es agitado. Para ello se compara la productividad de un cultivo spirulina en dos sistemas de biorreactores, uno con agitación, y otro sin agitación, manteniendo constante otros parámetros significativos. Se concluye que la agitación es un factor que incide en forma positiva sobre el crecimiento de nuestro cultivo de spirulina. Palabras claves: spirulina; biorreactores; cultivo de microalgas

Spirulina (Arthrospira platensis) is a microalgae used as nutritional supplement in human and animal feeding. Cultivation is carried out in a liquid medium. The objective of this report is to show how the culture agitation impacts in the microalgae growth. The spirulina productivity in two biorreactores systems, one with agitation and the other one without agitation, maintaining constant other significant parameters is compared. The conclusion is that agitation is a factor that impacts in positive form on the growth of our spirulina culture.

Keywords: spirulina; bioreactors; microalgae culture

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[email protected] malara @fceia.unr.edu.ar

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1. Introducción Entre los procariotas autótrofos existen tres tipos de bacterias fotosintéticas: las bacterias verdes, las bacterias fotosintéticas purpúreas y las Cianobacterias. Como sucede en las plantas, estas bacterias capturan la luz mediante pigmentos específicos. Las Cianobacterias se parecen a las plantas y a las algas en que contienen clorofila a, escinden el agua durante la fotosíntesis y desprenden oxígeno. No fotosintetizan almidón sino un tipo de glucógeno llamado gránulo de poliglucano. Las células viejas forman grandes gránulos de cianoficina considerada químicamente como una proteína especial con sólo dos aminoácidos: arginina y ácido aspártico. Cuatro géneros se destacan por su interés agronómico y en la alimentación: Nostoc, Anabaena, Cylindrospermum y Arthrospira platensis (spirulina). Los tres primeros géneros citados son fijadores de nitrógeno atmosférico que acumulan en las vacuolas de gas y en los heterocistos para cubrir sus necesidades nutricionales y fisiológicas. Cuando las citadas microalgas se utilizan como biofertilizantes, aportan al suelo, además de los nutrientes mencionados, sustancias que actúan como factores de crecimiento en vegetales superiores, por lo que aumenta su valor como fertilizantes.

1.1 Microalga spirulina La spirulina ha sido el alimento tradicional de los aztecas y de los Kanembous de Tchad. Es más rica en proteínas que la carne y actualmente es cultivada en grandes establecimientos en Estados Unidos, India, China y Tailandia. En la naturaleza, la spirulina crece en lagos y lagunas con medio alcalino en clima cálido (Jourdan, 1999). Se presenta en forma de filamentos espiralados (Figura 1) constituidos por células yuxtapuestas, la reproducción es asexuada y se realiza por división de filamentos (Vonshak, 1997). Esta microalga posee unas características muy especiales desde el punto de vista nutricional ya que se trata de una fuente natural de proteínas, con una concentración variable entre el 55 y Figura 1. Imagen microscópi- 70% de sustancias asimilables de alta calidad (Falquet, 1996). ca de la espirulina. La digestibilidad está entre el 88 y el 92%, este amplio margen obedece a la composición celular de la misma, ya que su pared celular está formada por mucopolisacáridos que permiten que el organismo pueda extraer los nutrientes presentes con mayor facilidad, sin gasto energético. Entre las vitaminas que contiene se encuentran la A, B1, B2, B3, B6 y B12, ácido fólico, biotina, inositol, ácido pantolénico, beta caroteno y vitamina E, junto con minerales que actúan como potentes antioxidantes que permiten la neutralización de los radicales libres. Presentes están también los siguientes minerales: Calcio, Fósforo, Hierro, Sodio, Potasio, Zinc, Cobre, Manganeso, Germanio, todos en concentraciones apreciables. Conviene señalar también que la biodisponibilidad del hierro es un 60% más elevada que en las maneras habituales de suministro de este metal en las formas dietarias. Puede utilizarse como suplemento en la alimentación de diversos animales: rumiantes, cerdos, aves, peces y crustáceos, como una fuente proteica o como complemento de proteínas en dietas balanceadas. Aumenta el valor comercial de ciertas especies, por ejemplo; mejora la coloración de la piel y de la yema de huevos en aves y también aumenta la vitalidad, el peso y la coloración en peces (Fox 1999).

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Figura 2. Estanques en producción de spirulina Por lo anteriormente dicho, el cultivo de estas cianobacterias es importante desde el punto de vista económico y social. La producción comercial se realiza en estanques de varias decenas de metros de largo por 4 o 5 metros de ancho, con una profundidad media de 15 cm, con una cubierta tipo invernadero (Figura 2). En los estanques se realiza un control constante de las variables: temperatura, agitación, alcalinidad, salinidad y control microbiano de crecimiento que son fundamentales para optimizar la producción. Se considera como producción media 10 gr m-2 día-1 . Para cosecharlas, se separaran del medio de cultivo por filtración, y luego son secadas como única forma de garantizar la conservación de sus propiedades en el tiempo (Chini Zittelli et al., 1996). Para dar idea de la importancia de este cultivo, la industria de la spirulina en China está desarrollándose rápidamente como un programa estratégico nacional. En 1997, había 80 lugares de producción, con un total de producción anual de más de 350 toneladas de polvo seco y un área de producción de 106 m2 (Ding-Mei Li, Yu-Zao Q, 1997). En Argentina, su cultivo comenzó en la década del noventa. El grupo de investigación del Laboratorio de Energías Alternativas (Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniería y Agrimensura – Conicet), a través de un proyecto de I+D, se encuentra trabajando en colaboración con una empresa productora de spirulina en la localidad de San Jorge, Provincia de Santa Fe. El conocimiento de las técnicas de cultivo y producción es una herramienta indispensable en la obtención masiva de este alimento altamente proteico.

1.2 Condiciones de cultivo de la microalga spirulina El cultivo de la microalga spirulina se realiza comercialmente en estanques que pueden ser a cielo abierto o con cubiertas tipo invernadero (Figura 2). El cultivo en estanques abiertos se caracteriza por la baja producción por unidad de área y la no uniformidad de la calidad del producto. Una mejora considerable es el aporte de cubiertas, ya que se cultiva en un ambiente controlado, protegido de la polución y con posibilidades de acondicionamiento térmicos. El cultivo en biorreactores se reduce a casos muy puntuales y generalmente se realiza en laboratorios. Se entiendo por biorreactor el sistema cerrado que permite el crecimiento de organismos fotoautótrofos (microalgas). Como ejemplos de biorreactores en uso, podemos citar los tubulares, planos, serpentina, manifold, etc (Tredici, 2002). Son motivo de activa investigación para lograr una producción donde la calidad de la masa microalgal esté asegurada. Uno de los mayores problemas que presenta la explotación comercial de spirulina y otras microalgas es el bajo rendimiento por unidad de superficie cultivada (Richmond et al., 1990). Los cultivos de spirulina en estanques pequeños y muy controlados pueden llegar de 15 a 19 g m-2 día-1 y de estos valores menos de la mitad se obtiene en grandes explotaciones comerciales (Vonshak and Richmond, 1988). Pequeños bioreactores cerrados, operando por 5

pocas semanas o meses, estrictamente controlados han alcanzado rendimientos de 25-28 g m-2 día -1 (Tredici and Chini Zittelli, 1997) Cuando se quiere cultivar industrialmente, es necesario controlar las siguientes variables (Zarrouk, 1966): • Temperatura: El crecimiento de la spirulina se da entre 25-40 0 C, siendo el rango de mayor producción entre 35-40 0 C. • Alcalinidad del medio: Los mejores resultados se obtienen con valores de pH 10-11. • Radiación: La mayor producción se da entre 30-50 klux. • Salinidad: Entre 1500 - 5250 g m-2 , en un estanque de 15 cm de profundidad. • Agitación: Se recomienda una velocidad de 30 cm/s

1.3 Agitación En la superficie del medio de cultivo se forma una capa compacta y densa de spirulina debido al crecimiento competitivo de las mismas, que limita el paso de la luz al fondo del recipiente, actuando como aislante térmico y formando una estratificación en el perfil de vertical de temperatura del medio de cultivo. Se ha podido medir (en los estanques de Figura 2) hasta 10 0 C de diferencia entre la superficie y el fondo del estanque. Esto limita el crecimiento del alga a la superficie del líquido, desaprovechándose la mayor parte del volumen del estanque. Como respuesta a este problema, se utiliza la agitación del medio de cultivo para: • Permitir que mayor número de individuos puedan exponerse a la luz solar o artificial. • Permitir mayor intercambio gaseoso entre el medio ambiente y el medio de cultivo, favoreciendo la liberación del oxígeno generado por la respiración. • Disminuir la estratificación y formación de coágulos o grumos, que impiden el paso de la radiación hacia el interior del medio de cultivo. • Disminuir la precipitación de sales del medio de cultivo, manteniendo una mezcla de sales más homogénea. Estos efectos benefician el crecimiento y productividad del cultivo (Richmond et al. 1990). Sin embargo, el verdadero rol de la agitación en el aumento de la producción alga l todavía debe ser evaluado. Se han observado efectos positivos provocados por una intensa agitación sobre la productividad solamente en cultivos algales que se desarrollan en estanques agitados por ruedas de paletas. En biorreactores cerrados, con utilización de bombas, el efecto positivo puede ser enmascarado debido al daño mecánico que sufren las paredes de las células. En biorreactores de columnas de burbujeo, la provisión de aire sirve para el doble propósito de proveer turbulencia y remoción del oxígeno. Así, es más difícil evaluar si la influencia sobre la productividad se debe al grado de turbulencia alcanzado o proviene del bajo contenido de oxígeno disuelto en el medio.

2. Objetivos del trabajo El objetivo de este trabajo es mostrar cómo incide la agitación del medio de cultivo en el crecimiento microalgal al exponer las células a un régimen de luz más adecuado, con respecto a un cultivo que no es agitado. Para ello se compara la productividad de un cultivo spirulina en dos sistemas de biorreactores, con agitación y sin agitación, manteniendo constante otros parámetros (temperatura, radiación y composición del medio de cultivo).

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3.Material y método Los materiales utilizados durante la experiencia son: Cámara de ambiente controlado Biorreactores (recipientes cilíndricos de 2,25 litros de capacidad) Resistencia y ventilador centrífugo Termocupla Microscopio óptico Cámara de Neubauer Dispositivo mecánico de agitación Dispositivo de radiación La metodología empleada consistió en medir el crecimiento (aumento de número de células) de una muestra usando un diseño experimental de bloques al azar con tres repeticiones y las evaluaciones se hicieron durante 30 días con lecturas a intervalos de 4 días, repitiéndose en dos períodos subsiguientes. La medición del número de células se hizo por conteo directo al microscopio con cámara de Neubauer. El conteo se realizó teniendo en cuenta la longitud de los filamentos de las cianobacterias, considerando solamente aquellas que tenían entre dos y cuatro espiras. Este criterio se adoptó porque no se vieron al microscopio células con más de cuatro espiras, y aquellas que tenían menos de dos no se consideraron.

4. Desarrollo de la experiencia Para lograr el objetivo, se procede a cultivar las microalgas en seis recipientes cerrados (fotobiorreactores) en condiciones idénticas de temperatura, medio de cultivo y radiación. Para ello se dispone de una cámara de ambiente controlado (Figura 3). La temperatura se mantiene constante en la cámara a 30 0 C, el medio de cultivo es el de Zarrouk y la radiación es suministrada por tubos que generan un radiación uniforme de 30 Klux, durante un período de doce horas diarias. Tres de los recipientes se agitarán mecánicamente, los otros tres se mantendrán en reposo (Figura 4).

4.1 Cámara de cultivo de ambiente controlado La cámara de cultivo (Figura 3) se diseña de forma tal que minimiza las pérdidas de calor para mantener la temperatura constante, a través de una estructura en madera y un recubrimiento en poliestireno expandido. El volumen interior debe permitir el conjunto agitado de tres recipientes (botellas) y los otros recipientes en reposo a un lado del agitador (Figura 4).

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PLANO X-Y

PLANO Z-Y

Poliestireno

Madera

Figura 3. Cámara de ambiente controlado. Consta de un armazón de madera y un revestimiento de poliestireno expandido para minimizar las pérdidas de energía.

Botellas en reposo

Forzador de aire

Botellas agitadas

Fuente de calor

Figura 4. Distribución en planta de las botellas en reposo y de las botellas agitadas en el dispositivo agitador. Abajo, a la izquierda se ubica un ventilador con resistencia que proporciona aire caliente.

4.2 Fotobiorreactores Para el desarrollo de la experiencia se utilizaron botellas transparentes de 2,25 litros de capacidad, de plástico, que permiten el ingreso de radiación por la parte superior y por los laterales. La relación área / volumen es de 0.5 m-1 .

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Las botellas agitadas se colocaron sobre el dispositivo agitador. Algunos de los factores que se tuvieron en cuenta para el mejor funcionamiento consistieron en que el volumen del medio de cultivo fuera el máximo permitido sin que se derrame líquido durante la agitación ( 1 dm3 ) y que la botella tuviera una perforación que permita el intercambio gaseoso con la atmósfera (Figura 5).

Figura 5. Esque ma de la botella a agitar, con tapa y con un orificio para aireación.

4.3 Dispositivo agitador El dispositivo agitador que se diseña consta de una base basculante sobre la que apoyan las botellas, movida por un motor eléctrico. La agitación se realiza durante 15 minutos por hora y en el período de luz (de 8:00 horas a 20:00 horas). 4.3.1 Funcionamiento del dispositivo mecánico (Figura 6) El arranque y la parada del motor eléctrico está controlada por un timer, que cierra el circuito de alimentación. Cuando este arranca, el eje de transmisión comienza a rotar hasta que hace contacto con la barra (7), esto produce el descenso de la base oscilante (5), y la compresión del resorte (2). Al continuar el movimiento, el eje de transmisión zafa de la barra (7), haciendo que se dispare el resorte (2), haciendo girar la base (5) en sentido contrario, lo que produce la agitación de las botellas. La velocidad de giro del eje de transmisión es de 8 revoluciones por minuto, siendo el descenso del extremo de la barra de contacto (7) de 60 mm. (Figura 7)

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Eje de transmisión

Figura 6. Dispositivo de agitación 1) Motor eléctrico con reductor de velocidad. 2) Resorte. 3) Base de madera. 4) Soporte de botella. 5) Base oscilante. 6) Eje base oscilante. 7) Barra que transforma el movimiento rotatorio del eje de transmisión, en un movimiento oscilatorio de la base oscilante.

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Figura 7. Detalle del apoyo sobre el resorte de la barra y del vástago solidario al eje de transmisión. 4.3.2 Generación de calor Se colocó un ventilador centrífugo funcionando continuamente, para que homogeneizara la temperatura en la cámara, y una resistencia conectada al sistema de control, de esta forma se producía el control instantáneo de la temperatura gracias a la radiación generada por la resistencia y la homogenización de la misma por medio de la convección generada por el ventilador centrífugo. Cabe aclarar que el ventilador centrífugo tiene la toma de aire en forma axial (en la parte superior) y lo impulsa en forma tangencial a las aspas (plano horizontal), lo que permite una recirculación y renovación del aire dentro de la cámara de cultivo. La disposición de la resistencia y del ventilador centrífugo, dentro de la cámara de cultivo se muestra en la Figura 8.

Sentido de circulación del aire.

Resistencia

Ventilador centrífugo

Figura 8. Esquema del movimiento del aire en la cámara de ambiente controlado

4.3.3 Sistema de control de temperatura

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Consta de una termocupla (Figura 9) conectada a un sensor de temperatura por medio de un dispositivo de alimentación de intensidad para la resistencia eléctrica. PLANO Y-Z

PLANO X-Y

Fuente de radiación.

Sentido de circulación del aire.

Termocupla

Termocupla

Figura 9. Esquema del sistema de control de temperatura en la cámara de ambiente controlado Esta disposición responde a la necesidad de que el punto de control esté lo mas alejado de la fuente de radiación, como así del efecto de la convección generada por el ventilador.

4.4 Dispositivo de iluminación En la experiencia, para simular el efecto de la luz solar, se diseñó un dispositivo formado por 8 tubos que generan un uniforme radiación de 30 Klux, durante un período de doce horas diarias (8:00 - 20:00 horas). El dispositivo que se observa en la Figura 10, detalla la disposición de los tubos. El encendido y apagado se controlaba por medio de un timer.

Tubos

Estructura de metal.

Figura 10. Disposición de los tubos que se ubican en la parte superior de la cámara de ambiente controlado

4.5 Dificultades encontradas Los mayores inconvenientes encontrados fueron con la generación de calor.

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4.5.1 Falla del ventilador Durante la primera experiencia se utilizó un ventilador de corriente continua. En un momento dado falló la conexión eléctrica del mismo, deteniendo su funcionamiento por algunas horas. Como la resistencia eléctrica que generaba el calor seguía funcionando, ya que no había movimiento convectivo forzado del aire, el sensor no registraba el incremento de temperatura, debido a que la resistencia transmite por radiación y el sensor esta muy alejado de la misma. Esto generó un elevado incremento de la temperatura en zonas cercanas a la resistencia, al estar el ventilador muy cerca de la misma, alcanzó temperaturas muy elevadas, derritiéndose sus aspas plásticas. La temperatura alcanzada dentro de la cámara de cultivo superó en algunas zonas de la misma los 70 0 C (sobre todo en las zonas aledañas a la resistencia eléctrica). Como resultado, sólo algunas de las algas de las botellas más alejadas a la fuente de calor pudieron resistir. Para que eso no vuelva a ocurrir, se colocó un ventilador centrífugo, que funcionaba continuamente con un buen caudal de aire. 4.5.2 Falla del sensor Otro inconveniente surgió cuando falló el sensor de temperatura de la cámara. Esto produjo que la temperatura máxima aumente, haciendo que el calentador genere más calor que el necesario. Como resultado, la temperatura de la cámara superó en poco tiempo los 45 0 C. Esto no fue suficiente para destruir por completo todas las células.

5. Resultados En la gráfica de la Figura 11 se muestran los resultados promedio obtenidos de las tres series de mediciones de 30 días realizadas. En un próximo trabajo se mostrará el análisis estadístico de estos datos. Se puede observar un aumento en el número de microalgas en las botellas que fueron agitadas con respecto al número de microalgas contado en las botellas que permanecieron en reposo. Otra observación realizada fue que la coloración de la masa algal era más oscura y homogénea en los biorreactores que se agitaban con respecto al color del medio de cultivo de los que estaban en reposo. Estos últimos mostraban una concentración de microalgas en la superficie, transformando el medio de cultivo en una masa heterogénea.

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32 30

Cultivo sin agitación Cultivo con agitación

28 26 24

-1

Células l x 10

4

22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Día

Figura 11. Gráfica que compara el crecimiento de las células por litro en los biorreactores en reposo y agitados.

6. Conclusiones La agitación es un factor que afecta en forma directa al crecimiento de un cultivo de spirulina. Es posible que esto se deba a las siguientes razones: • Permite que mayor número de individuos puedan exponerse a la luz • Favorece el intercambio gaseoso entre el medio ambiente y el medio de cultivo, permitiendo que escape el oxigeno generado durante la fotosíntesis, e introduciendo dióxido de carbono de la atmósfera. • Disminuye la estratificación y formación de coágulos o grumos, que impiden el paso de la radiación hacia el interior del medio de cultivo. • Impide la precipitación de sales del medio de cultivo, manteniendo una mezcla de sales más homogénea. Por otro lado una agitación muy violenta produciría daño mecánico en la pared celular, por lo que cabría investigar cuál sería la agitación óptima.

Agradecimientos Este trabajo se ha realizado en el marco del Proyecto ING84, “Análisis de procesos de transferencia de calor y materia en procesos agroindustriales. Aplicaciones a la producción de microalgas”. Los autores agradecen al Ing. Agr. Armando Cassinera su aporte en la ejecución de los dispositivos.

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Referencias Becker E.W. (1995) "Microalgae, biotechnology and microbiology", Cambridge University Press. Chini Zittelli G, Tomasello V, Tredici M., (1996). “Outdoor cultivation of Spiurlina platensis during autumn and winter in temperate climates”. J. Appl. Phycol. 8: 293-301. Ding-Mei Li, Yu-Zao Qi, (1997). “Spirulina Industry in China: Present status and future prospects”. J. Appl. Phycol 9: 25-28. Falquet J. (1996) "Spiruline, Aspects nutritionnels", Antenna Technologie, Genève. Fox R.D. (1999) "Spiruline, Technique pratique et promesse", Edisud, Aix-en-Provence Jourdan J. P. (1999). “Cultivez votre spiruline”. Antenna Technology. Genève. Richmond A, Lichtenberg E, Sthal B, Vonshak A (1990) Quantitative assessment of the major limitation on productivity of Spirulina Platensis in open raceways. J.Appl. Phycol, 2, 195. Richmond A (2002) “Handbook of microalgal Mass Culture” CRC Press Inc., Boca Ratón, Florida. Tredici M (2003). “Mass Production of Microalgae: Photobioreactors”. Handbook of microalgal Mass Culture, Ed. Richmnond Blackwell Publishing. Oxford, pp. 178-214. Tredici M. and Chini Zittelli G.(1997). “Cultivation of Spirulina (Arthrospira) platensis in Flat Plate Reactors”. Spirulina platensis (Arthrospira) Physiology Cell-biology and Biotechnology Ed.by Avigad Vonshak Taylor and Francis. Vonshak A. (1997) "Spirulina platensis (Arthrospira): Physiology, Cell-biology, and Biotechnology" . Taylor and Francis. Vonshak A. and Richmond A. (1988) Mass production of the blue- green alga Spirulina: an overview, Biomass, 15, 233. Zarrouk C.(1966) "Contribution à l'étude d'une cyanophycée: influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la croissance et la photosynthèse de Spirulina maxima (Setch et Gardner) Geitler", Thèse de doctorat, Faculté des Sciences de l'Université de Paris.

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