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Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Práctica 4: precipitación, separación y punto isoeléctrico de proteínas. Diego Vargas Gloria Paola. López Portillo Felipe de Jesús. Laboratorio de Bioquímica de Q.B.P, Sección 3, Semestre 2/17; Grupo: 4QM1 Prolongación Manuel Carpio y Plan de Ayala s/n, Miguel Hidalgo, Santo Tomás, 11350 Ciudad de México. precipitación blanca, es poco soluble e4l ácido 3.0 Se observa el tubo completamente turbio, blanco y tiene poca consistencia característica del huevo, un poc soluble, consistencia lechosa.

Objetivos. Analiza el efecto que produce la modificación de factores fisicoquímicos sobre la solubilidad de las proteínas. Determinar el punto isoeléctrico de la insulina, basandose en sus propiedades de solubilidad a diferentes valores de pH.

Etanol 96° (mL)

Observaciones

Resultados.

cambio, el hidróxido es soluble 3.0 Se observa un poco turbio el la parte superior color blanco, se observa más soluble.

blanco, no se soluble 3.0 Se observa turbidez completa, pierde la consistencia del huevo, por lo tanto no se soluble, se observa de aspecto lechoso.

I. Separación de proteínas por precipitacion con sales (salting out). Tabla 1. Resultados del SALTING-OUT Biuret Interpretación Positivo Presencia de enlaces Filtrado 1 peptidicos. Positivo Presencia de enlaces Precipitado 1 peptidicos. Positivo Presencia de enlaces Filtrado 2 peptidicos. Positivo Presencia de enlaces Precipitado 2 peptidicos. II. Precipitación por efecto del pH y de solventes. Tabla 2 Precipitacion por efecto del pH y solventes. Tubo No. 1 2 3 Clara de huevo filtrada, dil 1:3 (mL) HCl 0.1N (mL) NaOH 0.1N (mL) Regulador de acetatos 0.1M, pH 4.7 (mL) Observaciones

3.0

3.0

3.0

1.0 -

1.0

-

-

-

1.0

Se observa turbidez y

poca

No observa ningún

se

Se observa una tubidez y precipitado

III. Precipitación por metales pesados. Tabla 3. Precipitación por metales pesados. Tubo No. Clara de huevo filtrada dil. 1:3

1

2

3

4

5

6

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

1.00

0.25

-

-

-

-

-

-

0.25

-

-

-

-

-

-

0.25

-

-

-

-

-

-

0.25

-

-

Cloruror de sodio 5% (mL)

-

-

-

-

0.25

-

Agua (mL)

-

-

-

-

-

0.25

Cloruro mercúrico 5% (mL) Nitrato de plata 2% (mL) Acetato de plomo 5% (mL) Cloruro de bario 5% (mL)

Tubo No.

Observaciones

Grado de turbiedad… Grado de solubilidad..

1

2

3

4

5

6

Se observa completa mente turbio, de aspecto lechoso con coágulo

Turbio, lechoso, con un poco consistenc ia de huevo

Turbo, lechoso, con coágulo s o grumos visibles

Se observ a un poco turbio.

No se obser van camb ios. Más solub le.

Se observ a ligera mente turbio, con aun consist encia de huevo

+++

++

++++

+ °°

°°°

°

IV. Determinación del punto isoeléctrico de la insulina. Tabla 4. Determinación del punto isoeléctrico de la insulina. Tubo No.

1

Ác. acetic o 0.2M 0.23

Acetato de sodio 0.2 M 0.02

2

0.15

0.10

3

0.05

0.20

4

0.01

0.24

5

0.00

0.25

Insulina 40 U/mL

6U (0.06mL) 6U (0.06mL) 6U (0.06mL) 6U (0.06mL) 6U (0.06mL)

pH

3.6 4.57

5.35 6.13 10.6 7

Observacion es

5´ Soluble 10´ soluble 5´ Soluble 10´ Poco soluble 5´ Insoluble 10´ insoluble 5´ Soluble 10´ soluble 5´ Soluble 10´ soluble

Discusión. Los resultados de precipitación de proteínas por sales indican que en el precipitado y filtrado uno, hubo una precipitación de sales que se pus en manifiesto con el Reactivo de biuret, un indicador de enlaces peptídicos, sin embargo, en el segundo precipitado y filtrado los resultados esperados eran negativos, sin embargo, al no usar un filtro no se logró separar las proteínas precipitadas lo que dio una prueba positiva en los resultados obtenidos, es necesario centrifugar y hacer uso del filtro para separar las proteínas de la solución satisfactoriamente. Los resultados de la precipitación por efecto del pH y solventes en las primeras observaciones antes de agregar el etanol el ácido clorhídrico este empieza a observarse turbio ya que al agregar iones 𝐻 + las cargas se repelen formando el precipitado igual que en el regulador de acetatos es turbio, por lo tanto es insoluble, contrario al hidróxido de sodio que no precipitado y se considera soluble. Al agregar el etanol este cambia y todos se ponen turbios y de aspecto lechoso, ya que disminuye la constante dieléctrica y se atraen las proteínas uniéndose y formando un mayor precipitado. En el experimento de precipitación de metales, los metales interactúan con el ión carboxilato de la proteína precipitando esto se debe a los efectos inter-iónicos en las soluciones que se llevaron a cabo con los metales, entre mayor sea la interacción hay mayor precipitado, que en este caso podemos observar que interactuó mas con el plomo. En el caso de la determinación del pulso eléctrico de la insulina se formo un precipitado en el tubo 3 y se sabe que la carga neto que presentan los péptidos y proteínas es mínima y en una sustancia química es equivalente a cero.

Bibliografía. Cálculos Cálculos de pH. Indicar el pulso isoeléctrico para insulina.



Plummer, D. (1994). Introducción a la bioquímica práctica. Madrid: Universidad de Barcelona. Pág(s). 120-135

Preguntas extra. ¿Qué es salting out? y ¿Qué es salting in?. Cuando se añade sal a una solución de proteína ocurre un incremento en la solubilidad y esto se conoce con el nombre de solubilización por salado (salting in). Este incremento inicial en la solubilidad se debe a la estabilización de la proteína efectuada por un descenso en el coeficiente de actividad de los grupos ionogénicos. A medida que se aumenta la fuerza iónica, se obtiene un máximo en la solubilidad seguido por un descenso en la

misma que se conoce como insolubilización por salado (salting out). ¿Qué es una fuerza iónica? Es una medida adecuada del efecto de las interacciones, ion-ion y ion-solvente, en una solución electrolítica. La fuerza iónica se define como un medio de la sumatoria de la concentración molar (o molal) de cada tipo de ión, multiplicada por el cuadrado de la valencia ¿Constante dieléctrica? Propiedad de un medio que es dieléctrico, es decir, que no posee conductividad eléctrica, por lo cual se tratan como aislantes de la electricidad, relacionándolo con la permisividad que tiene un medio a la electricidad. Debye-Hückel P. Debye y E. Hückel (1923), trabajaron en el problema de las interacciones iónicas, sobre la base de que los iones en solución se encuentran rodeados de un exceso de iones de carga opuesta (atmósfera iónica), que limita su movimiento (es más probable, por ejemplo, que un ión positivo, considerado central o de referencia, se encuentre rodeado por iones negativos, que por iones de su mismo signo). El movimiento se ve limitado en dos aspectos: la atmósfera iónica es deformada cuando el ión central se mueve, de manera que su centro se encuentra detrás del ión, y el movimiento de éste es retardado por la atmósfera (efecto de relajación); también, esta última, al tener carga opuesta a la del ion central, tenderá a moverse en sentido contrario a la del ion, debido al campo eléctrico, durante la migración (efecto electroforético). Las atracciones interiónicas y el efecto del solvente son, en esencia, la causa de la desviación que sufren los electrolitos del comportamiento ideal. Es importante, por otra parte, hacer referencia a la cantidad conocida como fuerza iónica, I, que es una medida adecuada del efecto de las interacciones, ion-ion y ionsolvente, en una solución electrolítica.