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EXPERIMENTO N° 1: ESTUDIO DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA a) Fundamento: Las transformaciones biológicas de sustratos comprenden procesos de óxido- reducción y transferencia de electrones a través de una serie de sistemas enzimáticos. En las oxido reducciones se produce transferencia de e - . Algunas veces el transporte de e - es realizada mediante la transferencia de atomos de hidrogeno o bien átomos de hidrogeno y un electron. Las enzimas que realizan este tipo de reacciones son las deshidrogenasas pudiendo ser piridin (NAD, NADH) o flavina (FAD) dependientes; además existen los citocromos que son de naturaleza ferroporfirínica y se encuentran ordenados de acuerdo a su potencial de óxido reducción constituyendo la llamada “Cadena de Transporte Mitocondrial”. Algunos compuestos organicos coloreados, al aceptar hidrógenos se convierten en leucoderivados. Tal es el caso del azul de metileno cuyo potencial de óxido-reducción es +0.01 y el 2.6-diclorofenolindofenol cuyo potencial de óxido-reducción es +0.22. La succinato deshidrogenasa (SDH) es una flavoproteina unida a hierro no hémico. El metal tiene como finalidad actuar como enlace para conservación de energía y desacoplar los dos equivalentes reductores del ion hidrogeno aceptado por flavina y, finalmente estabilizar la forma semiquinoide de la flavina. Diversas sustancias pueden actuar inhibiendo los sistemas biológicos de óxido reducción. Por ejemplo, el malonato actúa específicamente inhibiendo a la succinato deshidrogenasa por un mecanismo competitivo; por lo tanto la prueba experimental con azul de metileno será negativa, ósea no se decolora por no haber movilización de electrones. El cianuro, actúa impidiendo la reacción de los citocromos, pues se combina específicamente con Fe +++ de la citocromo oxidasa; por ello los citocromos permanecen reducidos e incapaces de seguir actuando se bloquea la respiración b) Objetivo -

-

Poner en manifiesto experimentalmente una de las etapas del metabolismo intermediario y la acción de la succinato deshidrogenasa, haciendo uso de un aceptor de electrones como es el azul de metileno. Verificar la acción inhibitoria del malonato sobre la succinato deshidrogenasa y del cianuro a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial.

c) Procedimiento 1. Se procede a obtener material biológico del cuy ; hígado, corazón y músculo colocándolas en lunas de reloj

HÍGADO 2. Se procede rápidamente a pesar: Muestra

Hígado

CORAZÓN Corazón

MÚSCULO Músculo

Cantidad (gr)

10

2.3

3. Las muestras se pican en un mortero.

4. Se añade Sucrosa 0.25 M. y se homogeniza siempre teniendo una base de hielo Muestra Hígado Corazón Músculo

Sucrosa 0.25 M (ml) 100 20.7 100

5. Se procede a filtrar con una gasa

6. Se prepara el siguiente sistema de tubos para los tres casos

10

Tubo N° Succinato de sodio 0.1 M. Buffer fosfato pH 7.4 Malonadi de sodio Cianuro de potasio 0.1 M. Agua destilada Azul de metileno 0.05% Extracto enzimatico Aceite mineral

1 2.0 1.5 0.5 0.5 1.0

2 0.5 2.0 1.0 0.5 0.5 1.0

3 0.5 2.0 0.5 0.5 0.5 0.5 1.0

4 0.5 2.0 0.5 0.5 0.5 0.5 1.0

7. Cada tubo se coloca durante 10 minutos a baño María y observar el decoloramiento

d) Resultados:

HÍGADO

MÚSCULO

CORAZÓN

e) Discusión ¿Para qué se utiliza el azul de metileno? El azul de metileno tiene como función aceptar electrones. Al ser un compuesto orgánico coloreado al aceptar hidrógenos se conviereten en leucoderivado. ¿Porque el azul de metileno actua como aceptor final de electrones y no los otros compuestos? En el proceso de la cadena respiratoria mitocondrial los complejos se ordenan de acuerdo al potencial de óxido-reducción. Mientras más positivo el potencial es más oxidante. Se ordenarian de la siguiente forma:

FADH2

Dirección de transporte de eCoQ CoQ-Citc

CitoxidasaO2

-0.219

+0.045

+0.254

+0.29

+0.816

Azul de metileno +0.01 Por lo tanto como el azul de metileno tiene un potencial de reducción de +0.01 que es mayor al potencial de los otros complejos, los electrones pasan directamente al azul de metileno. ¿Cómo determino que el azul de metileno ha aceptado los electrones? Mediante el cambio de coloración Azul de metileno azul Oxidado

Azul de metileno incoloro Reducido

¿Que sucede en el sistema de tubos? ¿A que se deben las coloraciones que presentan? Tubo N° 1: no se decolora ósea no hay reducción, debido a que no hay sustrato( succinato de sodio 0.1 M) Tubo N° 2: si se decolora porque si hay presencia de sustrato (succinato de sodio 0.1 M) Tubo N°3: no se decolora porque hay presencia de un inhibidor competitivo (malonato de sodio) por lo tanto no hay reducción Tubo N°4: no se decolora porque hay un inhibidor (cianuro)

f) Conclusión - Se comprobó que el azul de metileno es un aceptor de electrones que se evidencio en el cambio de coloración de azul (oxidado) a incoloro (reducido). -

Se verifico la acción inhibitoria del malonato y el cianuro sobre la succinato deshidrogenasa a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial ya que no se evidencio cambio de color