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• ROBERTO ARREGOCES

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ESTUDIO Y RECONOCIMIENTO DE BIOMOLECULAS (STUDY AND RECOGNITION OF BIOMOLECULES)

INTEGRANTES: ARREGOCES ROBERTO CORREA JAUN MIGUEL FERREIRA KAROLAY MONTENEGRO HANNER PEREZ ANDRES

ING. NATALY DE LA PAVA

BIOLOGIA GENERAL LAB. FISIOLOGIA VEGETAL

UNIVERSIDAD DEL MAGDALENA SANTA MARTA D. T. C. H. 2016

RESUMEN En el siguiente informe se encuentra plasmada la experiencia del estudio y reconocimiento de biomoleculas que llevamos a cabo en el laboratorio de fisiología vegetal, lo cual determinamos la presencia bio-compuestos que hacen parte de los tejidos vegetales, verificamos las propiedades más notorias de las biomoleculas a partir de reacciones químicas utilizando diferentes tipos de reacciones y soluciones teniendo en cuenta la composición y su función como lo es la reacción de Fehling, la reacción de Benedict, el reactivo Lugol, el compuesto ácido nítrico, Sudan III, etc. Para llevar a cabo esta práctica tuvimos de igual forma como referencia variedad de productos que son usados en la vida diaria como la papa, el huevo, aceite de cocina, maíz, etc. Y como elementos de apoyo o también llamados elementos necesario de laboratorio como bisturí, microscopio, beaker, etc. Pero todo con la finalidad de determinar la presencia y cómo actúan las biomoléculas. PALABRAS CLAVES: amiloplastos, lípidos, proteínas, almidón, reactivo. ABSTRAC In the following report it is embodied the experience the study and recognition of biomolecules we carried out in the laboratory of physiology vegetal, which we determine the presence biomolecules that are part of plant tissues, we verify the most notable properties of biomolecules from chemical reactions using different types of reactions and solutions taking into account the composition and function as is the Fehling. The reaction Benedict, Lugol reagent, nitric acid compound, Sudan III, etc. to carry out this practice had equally as a reference variety of products that are used in everyday life such as potatoes, egg, cooking oil, corn, etc. but everything in order to determine the presence and how the act biomolecules. KEY WORDS: amyloplasts, lipids, protein, starch, reagent.

INTRODUCCION La materia viva está constituida por C, H, O, N, S y P. De los más de 100 elementos químicos, solo cerca de 26% se encuentran en forma natural en las plantas y animales. Los elementos que se encuentran en abundancia y son esenciales para la vida son: carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno, fosforo y azufre, todos ellos constituyen alrededor del 92% del peso seco de los seres vivos. BIOCOMPUESTOS: Resultan de la unión de los bioelementos, de acuerdo con su composición pueden ser: BIOCOMPUESTOS INORGÁNICOS y BIOCOMPUESTOS ORGANICOS. Bio-compuestos inorgánicos: Entre los más importantes están: el agua, las sales Minerales, funciones Reguladoras del PH (Boyer R, 2000).Bio-compuestos Orgánicos: Los más importantes de la biosfera (zona de aire, tierra y Agua del planeta ocupada por seres vivos) Son los carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos. Carbohidratos: Son moléculas que almacenan energía y constituyen una gran variedad de componentes estructurales de la célula, están formados

por carbono, hidrogeno y oxígeno. Los carbohidratos de acuerdo con las Moléculas de azúcar que contienen se clasifican en: Monosacáridos, Disacárido, Polisacáridos (Bohinski R.1998).Los Carbohidratos son conocidos por el papel que desempeñan en el metabolismo energético. Algunos de estos compuestos (glucosa y sus derivados) sirven como combustible de consumo inmediato por los organismos, mientras que otros compuestos (almidón, glucógeno) son depósitos químicos que sirven para para satisfacer las necesidades energéticas futuras en las plantas y en los animales. Como las proteínas, algunos carbohidratos desempeñan funciones estructurales proporcionando los armazones para las paredes celulares de plantas, bacterias y las cubiertas del exoesqueleto en los artrópodos. Los carbohidratos se encuentran combinados covalentemente con las proteínas y los lípidos complejos sobre las superficies celulares donde actúan como marcadores para el reconocimiento de otras biomoléculas (Boyer R.2000).Los Lípidos están formados por carbono, hidrogeno y oxígeno, proporcionalmente tienen mucho menos oxigeno que los carbohidratos. Son de consistencia oleosa, algunos son sólidos como el tocino, y otros líquidos como el aceite de oliva. Las moléculas de Los lípidos están formadas por glicerina y ácidos grasos, No son solubles en agua pero se disuelven fácilmente en disolvente orgánicos (solventes no polares) como éter, cloroformo y benceno. Sirven para almacenar energía y también tienen funciones estructurales en los organismos. Algunos lípidos polares que contienen nitrógeno y fósforo, son componentes importantes de las membranas biológicas, las cuales están constituidas por lípidos y proteínas formando barreras moleculares alrededor de las células y sus orgánulos.Los lípidos se clasifican en dos grupos Lípidos simples, Lípidos Compuestos (Bohinski R. 1998). Las Proteínas son compuestos orgánicos formados por Carbono, Hidrogeno, oxígeno y nitrógeno, Además pueden contener azufre, fosforo, hierro u otros elementos. Dentro de la gran variedad de proteínas se encuentran las enzimas, las hormonas y las proteínas de almacenamiento como las que se encuentran en los huevos de las aves y en las semillas de los vegetales, Proteínas de transporte de gases como la hemoglobina, contráctiles como la Actina y la miosina, de los músculos y muchas otras de funciones estructurales. Las funciones de las proteínas son muchas debido a la gran cantidad de ellas que existen en los seres vivos.Las unidades básicas de las proteínas son los aminoácidos, moléculas pequeñas de ácidos carboxílicos que poseen un grupo amino (NH2) el cual se encuentra unido al carbono adyacente al grupo carboxilo(COOH). Dos aminoácidos pueden unirse entre sí, formando un dipéptido, al unirse los aminoácidos por medio de enlaces peptídicos se forman tripeptidos, tetrapéptidos o polipéptidos, según tengan tres, cuatro o más aminoácidos. Para estructurarse una Proteína debe unirse muchísimos aminoácidos, formando una larga cadena poli- peptídicas. No existe un criterio definido para clasificar las proteínas, De acuerdo con su composición se pueden agrupar en: proteínas simples, proteínas Conjugadas (Boyer R, 2000). El reactivo de Fehling, también conocido como Licor de Fehling, es una disolución descubierta por el químico alemán Hermann von Fehling y que se utiliza como reactivo para la determinación de azúcares reductores. Sirve para demostrar la presencia de glucosa, así como para detectar derivados de ésta tales como la sacarosa o la fructosa.

OBJETIVOS:  Determinar la presencia de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleícos en muestras de tejidos vegetales.  Verificar algunas propiedades de las biomoléculas mediante algunas reacciones bioquímicas.  Diferenciar los cambios de conformación de algunas proteínas cuando son afectadas por la temperatura, pH y sales. MATERIALES       

NECESARIOS Microscopio Porta objetos Cubre objetos Pipeta Pinzas de madera Tubos de ensayos Gradillas

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BIOLÓGICOS Azúcar Papa fresca Maíz molido Huevos fresco

REACTIVOS  Felhing A y B  Benedict  Solución de glucosa (10%)  Solución de sacarosa (10%)  Lugol  Hidróxido se sodio (30%)  Sulfato de cobre (30%)  Sudan III  Ácido nítrico  Azul de metileno  Cloruro de sodio  Ácido clorhídrico  Agua destilada  Acetona

MÉTODOS MONOSACARIDO (GLUCOSA) Reacción de Fehling: Tomamos dos tubos ensayo, previamente marcados con los números 1 y 2 respectivamente. En el primero agregamos 5 ml de agua destilada, y al segundo le agregamos 5 ml de solución de glucosa, a cada tubo se le agregaron 20 gotas de soluciones de Fehling A y B, agitamos, observamos lo ocurrido, luego calentamos los tubos con un mechero hasta ebullición observando el resultado. Reacción de Benedict: Tomamos dos tubos de ensayo y procedimos a agregar al primero 5 ml de agua destilada, y al segundo 5 ml de la solución de glucosas, a cada tubo se añade 3 cc de reactivo de

Benedict, agitando y mirando lo ocurrido y luego sometimos los tubos a calentamiento hasta ebullición y observamos y analizaos bioquímicamente. DISACARIDO (SACAROSA) Reacción de Fehling: Tomamos dos tubos de ensayo, le agregamos al primero 5 ml de agua destilada y al segundo 5 ml de solución de sacarosa, a cada tubo le agregamos 20 gotas de solución de Fehling A y B, agitando y observando, luego sometimos los tubos a calentamiento hasta ebullición y tuvimos en cuenta los cambios producidos. RECONOCIMIENTO DE LIPIDOS SAPONIFICACIÓN Con una pipeta tomamos 5 ml de aceite y lo vertimos en un tubo de ensayo. Añadimos 5 ml de solución de hidróxido sódico, agitamos ligeramente hasta formar una emulsión y se calienta a la llama hasta que entre en ebullición. Al tubo 2 le añadimos 2 ml de cloruro sódico al 20% Al tubo 3 le agregamos 10 gotas de limón. REACCION CON SUDAN III Se tomaron dos tubos de ensayo limpios y marcados 1 y 2. Al tubo 1 se le agregó 5 ml de agua destilada y al 2 se le agrega 5 ml de aceite de cocina. Se le adicionaron 10 gotas del reactivo de Sudan III se espera por 30 min. Observamos y se describió bioquímicamente lo observado. DETERMINACION DE PROTEINAS Prueba 1. Se tomaron dos tubos de ensayos lavados y rotulados con los números 1 y 2. Al 1 se adiciono 5 ml de agua destilada y al 2 se le adiciona 5 ml de clara de huevo. A cada tubo se le adicionaron 5 ml de ácido nítrico concentrado. Se observó y se describió bioquímicamente. Prueba 2. Se tuvieron como referencia 6 tubos de ensayos previamente lavados y rotulados con los números del 1 al 6, se le adiciono a cada tubo 3 ml de clara de huevo (albumina) e inmediatamente se procedió a hacer el siguiente proceso: Tubo 1. Se calentó suavemente en un mechero Tubo 2. Se añadió 4 ml de acetona Tubo 3. Se añadió 1 ml de ácido clorhídrico Tubo 4. Se añadió 2 ml de cloruro de sodio al 20% Tubo 5. Se añadió 10 gotas de limón Tubo 6. No se le adiciono nada

Observamos lo que ocurrió y explicamos bioquímicamente. TINCION CON YODO (LUGOL) Se tuvieron como referencia dos tubos de ensayos previamente lavados y rotulado con los números 1 y 2. Al tubo 1 se le agrego 5 ml de agua destilada y al 2 se le agrego 5 ml de almidón. A cada tubo se le agrego 5 gotas de Lugol; observamos y describimos lo observado. Luego, sometemos la muestra obtenida a calentamiento sin dejarlo entrar en ebullición o hervir, hasta que esta pierda el color obtenido anteriormente; enfriar la muestra y describir lo observado. Rodajas de papa: tomamos una papa fresca, la pelamos e hicimos 4 rodajas. Colocamos tres rodajas en una caja petri, le agregamos 5 gotas de Lugol y describimos lo obtenido. Maíz molido: toamos una porción de maíz molido y lo colocamos esparcido en una caja petri, le agregamos 5 gotas de Lugol y describimos lo observado. Observación de amiloplastos: tomamos una rodaja de papa y le hicimos un raspe fino hasta obtener una pequeña porción de macilla, lo colocamos en un porta objetos y lo cubrimos; observamos en el microscopio los amiloplastos y describimos lo observado. Luego extrajimos la muestra y se agregó una gota de azul de metileno y lo volvimos a observar en el microscopio.

RESULTADOS MONOSACARIDO (GLUCOSA) Reacción de Fehling Cuando le aplicamos la reacción de Fehling al tubo que contenía agua destilada esta se tornó azul claro; cuando le agregamos Fehling al tubo que contenía glucosa al 10% esta se tornó azul oscuro. Cuando calentamos el tubo que contenía la solución de Glucosa y que se le aplico Fehling, se observó que cambió a color verde, naranja y por ultimo marrón con un intervalo de 5 segundos cada uno a diferencia que a temperatura ambiente se mantuvo de color azul. El tubo control se mantuvo en su color pero presento unas pequeñas partículas suspendidas.

Reacción de Benedict Cuando aplicamos Benedict al tubo control con agua destilada se torna azul claro, a diferencia del tubo que contenía glucosa que se tornó azul oscuro a temperatura ambiente luego de agitar. Al colocarlo a punto de ebullición el tubo testigo permaneció en su color pero presento unas partículas suspendidas. El tubo que contenía glucosa cambio de azul a verde, y de verde a naranja.

DISACARIDO (SACAROSA) Reacción de Fehling Cuando le agregamos al tubo que contenía sacarosa este se tornó azul oscuro y al colocarlo a ebullición se tornó verde y de verde paso a naranja oscuro. El tubo control se tornó azul claro al tener contacto con la solución de Fehling, al estar en ebullición se tornó azul oscuro y en su interior se podían observar partículas suspendidas. RECONOCIMIENTO DE LIPIDOS Saponificación: El aceite al entrar en contacto con el hidróxido de sodio a temperatura ambiente nunca se mezcló, al entrar a punto de ebullición el aceite quedo arriba y el hidróxido de sodio quedo abajo con partículas suspendidas quedando una mezcla heterogénea. REACCION CON SUDAN III Cuando agregamos Sudan III al tubo que contenía agua destilada logramos observar que el Sudan III no es soluble en agua formándose así una mezcla heterogénea, quiere decir que en esta muestra no hubo presencia de lípidos por lo que el Sudan III no es soluble en solventes utilizados para su disolución. Al momento que le agregamos Sudan III al tubo que contenía aceite de cocina pudimos observar que se obtuvo un mezcla homogénea y si hubo presencia de lípidos por lo que el Sudan III es soluble en los lípidos. DETERMINACION DE PROTEINAS Prueba 1. Tubo 1: Agregamos acido al agua destilada y pudimos observar que no se altera nada, no se obtiene ningún cambio. Tubo 2: Cuando agregamos ácido nítrico a los 5ml de clara de huevo que se tenía de referencia, pudimos notar que la proteína ósea el huevo se desnaturaliza. Prueba 2. Tubo1. Se calentó suavemente en un mechero. Notamos que la clara de huevo se coagulo porque perdió su solubilidad, se ve de color blanca. Tubo 2. Se añadió 4 ml de acetona. Notamos que la proteína pierde su estructura llegando a precipitarse. Tubo 3. Se añadió 1 ml de ácido clorhídrico. Notamos que la proteína cambia de color y que el ácido desnaturalizo la proteína.

Tubo 4. Se añadió 2 ml de cloruro de sodio al 20%. Pudimos observar que no hubo ninguna alteración. Tubo 5. Se añadió 10 gotas de limón. Notamos que la proteína cambia su composición, desnaturalizando provoco un cambio en el pH. Tubo 6. No se le adiciono nada. No hay ninguna alteración. TINCION CON YODO (LUGOL) Cuando agregamos Lugol al primer tubo que contenía agua destilada se tornó a un amarillo y al someterlo a calor este no se alteró puesto que no había nada que desnaturalizar, a diferencia del tubo 2 que contenía almidón y al adicionarle Lugol se torna de un color azul, morado y al someterlo a calor pierde el color por lo que el Lugol es sensible a las altas temperaturas y también porque el almidón contiene unas espiras que al someterlas a las altas temperaturas ellas se esparcen hasta hacer perder el color, mientras que las espiras en las bajas temperaturas se reúnen obteniendo así nuevamente el color. Cuando agregamos Lugol a las rodajas de papa cambian de color, se tornan a un color azul gracias a la presencia de almidón que contiene el vegetal. Cuando agregamos Lugol al maíz molido no sucedió nada por lo que este está actuando sobre la capa que recubre al maíz y también por el estado en que se encuentra el maíz.

DISCUSION DE RESULTADOS MONOSACARIDO (GLUCOSA) REACCION DE FEHLING Mediante esta práctica de laboratorio notamos que el tubo que contenía glucosa se tornó azul al tener contacto con el Fehling a temperatura y al colocarla a punto de ebullición cambio de azul a marrón debido a que el Licor de Fehling, en presencia de glucosa o de algún otro monosacárido, al calentarse, adquiere color anaranjado. La glucosa se oxida y reduce los iones cúpricos que pasan a cuprosos combinándose a la vez con iones hidroxilo, formando hidróxido cuproso (amarillo), que por el calor se convierten en oxido cuproso. La glucosa se vuelve visible mediante el reactivo de Fehling, que contiene óxido de cobre en solución alcalina. El óxido de cobre se reduce a óxido cuproso, de color pardo rojizo, al reaccionar con la glucosa o con otros azúcares reductores análogos, como lo es la glucosa misma. El motivo es que sobra oxígeno, que resulta al ser detectado por el reactivo de Fehling, haciendo susceptible la glucosa a la oxidación (Boyer R, 2000).

REACCION DE BENEDICT: Vemos que se forma un precipitado azul oscuro que se fue tornando marrón anaranjado. El fundamento de esta reacción es similar a la de Fehling con glucosa, lo único diferente es que utilizamos un reactivo más suave como el carbonato sódico (Boyer R. 2000). El Benedict es un reactivo utilizado para el reconocimiento de azucares reductores, como la glucosa, la solución A está compuesta por carbonato de sodio anhidro y agua; la solución B está compuesta por sulfato de cobre (II) pentahidratado y agua. La solución A se mezcla con la solución B para obtener la solución Beneditc (Franco C. 2002). SACAROSA (REACCION DE FEHLING) Esta reacción se debe a que la sacarosa es un disacárido de glucosa y fructuosa unidos por un enlace alfa y beta glusidico. La sacarosa es un disacárido no reductor, cuando se hidroliza genera 2 monosacáridos reductores que son la glucosa y la fructosa. (Boyer R, 2000).

El licor de Fehling se fundamenta en el poder reductor del grupo carbonilo de los aldehídos. Éste se oxida a ácido y reduce la sal de cobre en medio alcalino a óxido de cobre, formando un precipitado de color rojo. (Boyer R, 2000). El reactivo de Fehling sirve para demostrar la presencia de glucosa, así como para detectar derivados de ésta tales como la sacarosa o la fructosa. (Boyer R, 2000). REACCION DE LA PAPA ANTE EL LUGOL: El reactivo de Lugol es una solución de yodo en agua destilada, y se utiliza para evidenciar la presencia de almidón en la papa. El yodo forma con los polisacáridos de alto peso molecular como almidones, glucógeno y dextrinas un compuesto de inclusión que absorbe en el espectro visible, en la gama del amarillo y naranja, por lo que estos compuestos resultan de color azul o violeta. La papa, como todos los vegetales, almacena glucosa en forma de almidón, por lo que al reaccionar con Lugol da un color marrón oscuro. Esto se debe a que el almidón es un homopoliosido no reductor insoluble en agua fría, constituido por glucosa; está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y amilo pectina que al ser expuesto al yodo se torna de este color (Callen J. 2000). La amilasa, el componente del almidón de cadena lineal, forma hélices donde se juntan las moléculas de yodo, formando un color azul oscuro a negro. La amilo pectina, el componente del almidón de cadena ramificada, forma hélices mucho más cortas, y las moléculas de yodo son incapaces de juntarse, obteniéndose un color entre naranja y amarillo. Al romperse o hidrolizarse el almidón en unidades más pequeñas de carbohidrato, el color azul-negro desaparece. En consecuencia, esta prueba puede determinar el final de una hidrólisis, cuando ya no hay cambio de color constituyendo una evidencia experimental ampliamente utilizada (Beaker J; Allen Garland)

OBSERVACION DE AMILOPLASTOS Los amiloplastos se dejan ver en el microscopio debido al azul de metileno que usamos ya que este deja verlos pues los amiloplastos son incoloros y el azul de metileno funciona como un fijador de tejidos (Callen J. 2000). REACCION DE SUDAN III Esta reacción se debe a que el Sudan III pertenece al grupo de colorantes indiferentes, que son aquellos que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante. Los colorantes para grasas son más solubles en las propias grasas que en el medio en el que van disueltos. Así, al bañar la grasa con la solución del colorante, éste tiende a disolverse en la grasa que se va cargando del colorante. Por regla general estos colorantes siempre van en solución alcohólica o bien en una mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua. (Callen J. 2000)

DETERMINACION DE PROTEINA Ante el cloruro de sodio La solubilidad de las proteínas es sensible a la composición y al pH del medio, así como a la presencia de otros solventes. Asimismo, las proteínas presentan comportamiento de electrolitos simples en solución, por lo que son susceptibles a la concentración iónica del medio. Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las proteínas globulares. A baja concentración, las sales incrementan la solubilidad de muchas proteínas, fenómeno que recibe el nombre de solubilizarían por salado. Las sales de los iones divalentes, MgCl2 y el (NH4)2SO4, son mucho más eficaces en la solubilizarían de las proteínas que las sales de iones monovalentes, NaCl, NH4Cl y Kcal. La capacidad de las sales neutras para influir en la solubilidad de las proteínas está en función de su fuerza iónica, que constituye una medida, tanto de la concentración como del número de las cargas eléctricas existentes en los cationes y los aniones aportados por la sal. (Callen J.2000)

CONCLUSIÓN Con esta práctica de laboratorio aprendimos a manipular Distintos reactivos y aplicarlos para reconocer las distintas estructuras biomoleculares que se encontraban en cada uno de los materiales orgánicos. De igual manera aprendimos como se comportaban estos en las diferentes reacciones a conocer, las cuales nos exigían algunos métodos de precaución al momento de utilizar ciertos materiales químicos. Pudimos notar cómo cambia su color, y

textura en algunas, debido a los cambios químicos se presentan por los electrones presentes en cada biomoléculas. PREGUNTAS COMPLEMETARIAS A) ¿cuál es la composición química del reactivo de Fehling A y B? R// El Fehling A está compuesto por sulfato de cobre II pentahidratado y agua, y la solución B está formada por sal de rochelle, hidróxido de sodio y agua (Franco A, 2002).

B) ¿Por qué es importante la celulosa en la célula vegetal? R// la celulosa es importante porque es el componente esencial de las paredes celulares de las plantas. Las moléculas de celulosa están organizadas en haces de cadenas paralelas que forman fibrillas que en las paredes celulares de las plantas rodean a la célula, formando capas cruzadas (Cultural S.A.; Enciclopedia Alfa Temática).

C) ¿Qué son los amiloplastos? R// los amiloplasto son plastos especializados que se observan en los vegetales verdes sin pigmentos fotosintéticos que fabrican y almacenan almidón por periodos prolongados. Pueden formarse directamente a partir de los protoplastidios mediante deposición en el estroma o dentro de vesículas derivadas de la membrana interna o por diferenciación de los cloroplastos (los cloroplastos comunes almacenan almidón durante el día y lo hidrolizan por la noche) (Callen J. 2000).

D) ¿que son los lípidos y que funciones cumplen? R// compuestos orgánicos que contiene fundamentalmente carbono oxígeno e hidrogeno y muy a menudo fosforo, azufre y nitrógeno. Tienen consistencia grasosa o aceitosas son insolubles en agua y solubles en disolventes no polares. Tienen como función la composición de la membrana (fosfolípidos); Actúan como almacenadores de energía química en las células animales y vegetales (triglicéridos); recubrimiento protector sobre la piel, el pelaje o sobre las hojas y frutos (ceras) (VILLE, C. 1996).

BIBLIOGRAFIA

 BOHINSKI R, 1998; Bioquímica, Quinta Edición, Iberoamericana S.A, México, 739 Pág.

Editorial Addison

Wesley

 BOYER R; 2000 Conceptos En Bioquímica, Editorial Thomson Editores S.A, México 694 Pág.  CALLEN J; 2000, Biología Celular de Las Moléculas a Los Organismos, Primera Edición, Compañía Editorial Continental México, 488 pág.  Cultural S.A.; Enciclopedia Alfa Temática tomo I (biología) y tomo III (química), editorial amphora editores y CIALTDA. Madrid, España, 1183 pág.  FRANCO A; 2002, Preparación de Reactivos y Soluciones Para Trabajo de Laboratorio, primera edición, Editorial Ápice, Bogotá, 69 Pág.  VILLE, C. 1996. Biología Octava Edición. Editorial McGraw Hill. 960 pág.