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Revista Electrónica de Biotecnología Versión On-line ISSN 0717-3458 Electrón. J. Biotechnol. Vol.17 no.2 Valparaíso mar. 2014 Http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbt.2014.02.002

La purificación y caracterización de una proteasa aspártica del extracto de proteasa de Rhizopus oryzae , Peptidase R Nai-Wan Hsiao a, 1 , Yeh Chen b, 1 , Yi-Chia Kuan b, c , Yen-Chung Lee Kang Lee b , Hsin-Hua Chan b , Chao-Hung Kao b,

d

, Shuo-

Instituto de Biotecnología, la Universidad Nacional Changhua de Educación, Changhua 500, Taiwán B Departamento de Biotecnología, Universidad de Hungkuang, Taichung 433, Taiwán C Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad Nacional Tsing Hua, Hsinchu 300, Taiwán D Departamento de Ciencias Bioagriculturales, Universidad Nacional Chiayi, Chiayi 600, Taiwán Estos autores contribuyeron igualmente. Un

ABSTRACTO Fondo Las proteasas aspárticas son una subfamilia de endopeptidasas que son útiles en una variedad de aplicaciones, especialmente en la industria de procesamiento de alimentos. Aquí se describe una nueva proteasa aspártica que se purificó a partir de Peptidase R, una preparación de proteasa comercial derivada de Rhizopus oryzae . Resultados Una proteasa aspártica procedente de la peptidasa R se purificó a homogeneidad mediante cromatografía de intercambio aniónico seguido de pulido con una columna de cromatografía de interacción hidrófoba, dando como resultado un aumento de 3,4 veces en la actividad específica (57,5 x 103 U / mg) y una recuperación del 58,8%. El peso molecular estimado de la enzima purificada fue de 39 kDa. La secuencia Nterminal de la proteína purificada exhibió una identidad del 63-75% a las rhizopuspepsins de varias especies de Rhizopus . La enzima mostró actividad máxima a 75 ° C en tampón de glicina-HCl, pH 3,4 con caseína como sustrato. La proteasa era estable a 35 ° C durante 60 min y tenía una semivida observada de aproximadamente 30 min a 45 ° C. La actividad enzimática no fue significativamente inhibida por

quelación con ácido etilendiamino tetraacético (EDTA), y la adición de iones metálicos a la proteasa tratada con EDTA no cambió significativamente la actividad enzimática, lo que indica que la proteólisis no depende de iones metálicos. La enzima purificada fue completamente inactivada por el inhibidor aspártico de proteasa Pepstatina A. Conclusión Basándose en la actividad enzimática observada, el perfil de inhibición con Pepstatina A y la similitud de secuencias con otras rizopuspepsinas, hemos clasificado esta enzima como una proteasa aspártica. Keywords: Cromatografía; Endopeptidasa; Industria de procesamiento de alimentos; Homogeneidad; Rhizopuspepsin

1. Introducción Las proteasas, también denominadas peptidasas o proteinasas, son una gran categoría de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos. Las proteasas que escinden enlaces peptídicos en los extremos N o C de las cadenas polipeptídicas se denominan exopeptidasas y las que escinden los enlaces peptídicos dentro de la cadena polipeptídica se clasifican como endopeptidasas [1]. Las proteasas pueden clasificarse como proteınas aspárticas, cisteınas, glutámicas, serınicas y treonıneas, dependiendo de los aminoácidos presentes en el sitio activo, o como metaloproteasas si se requiere un ión metálico para la actividad catalıtica [2]. Las proteasas ocurren naturalmente en todos los organismos y están implicadas en muchos procesos fisiológicos, incluyendo la producción de nutrientes para el crecimiento y la proliferación celular [3], la degradación de proteínas [4], y como componentes reguladores para diversas funciones fisiológicas [5, 6]. Las proteasas de origen microbiano son valiosas enzimas comerciales que representan aproximadamente el 60% del total de las ventas mundiales de enzimas industriales [7]; Se utilizan en la industria alimentaria, farmacéutica, detergente y biotecnología [1,8,9,10,11]. Las proteasas aspárticas (EC 3.4.23), también conocidas como proteasas ácidas, son una subfamilia de endopeptidasas que han sido aisladas de diversas fuentes, incluyendo virus, bacterias, hongos, plantas y animales [12,13,14] . Varias proteasas aspárticas fúngicas han sido purificadas y caracterizadas como renina-como y pepsinacomo las enzimas [7]. Las enzimas tipo renina son producidas por Endothia parasitica (endothiapepsin, EC 3.4.23.22), Mucor y Rhizomucor (mucorpepsina, EC 3.4.23.23) [10]. Las enzimas de tipo pepsina incluyen aspergilpepsina (aspergilpepsina I, EC 3.4.23.18) de especies de Aspergillus [15] y rhizopuspepsina (EC 3.4.23.21) de especies de Rhizopus [16]. Estas enzimas tienen pesos moleculares en un rango de 3045 kDa y contienen uno o dos residuos de ácido aspártico conservados en el sitio activo [2, 17]. Las proteasas aspárticas son óptimamente activas a pH ácido (pH 3-5) y son inhibidas específicamente por Pepstatina A [12], [15] and [16]. Debido a su alta actividad y estabilidad en ambientes ácidos, las proteasas aspárticas son reactivos útiles en la industria de procesamiento de alimentos. Por ejemplo, las proteasas aspárticas se utilizan como enzimas coagulantes de la leche para la fabricación de queso [10] y como aditivos para mejorar el sabor y la textura de los alimentos [18].

Las proteasas aspárticas forman la clase dominante de las proteasas secretadas por Rhizopus , conocidas como rhizopuspepsins [3, 19]. Las especies de las que se han aislado y caracterizado bioquímicamente Rhizopus chinensis [20], Rhizopus microsporus [21], Rhizopus hangchow [22], Rhizopus oryzae MTCC 3690 [16] y R. oryzae NBRC 4749 [23]. Una enzima coagulante láctea adecuada debe tener una alta actividad caseinolítica específica; Sin embargo, muchos niveles de actividad reportados son pobres. Una preparación de proteasa neutra derivada de R. oryzae , Peptidase R, se utiliza en el procesamiento comercial de alimentos para mejorar el sabor y el contenido nutricional. Aquí se describe la purificación y caracterización de una proteína derivada de Peptidase R con alta actividad caseinolítica y un perfil de inhibición consistente con el de una proteasa de ácido aspártico. 2. Materiales y métodos 2.1. Productos químicos La peptidasa R se adquirió de Amano Enzyme Inc. (Nagoya, Japón). Caseína, Pepstatina A, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), Pefabloc SC, N-etilmaleimida, ácido yodoacético, ß-mercaptoetanol y ditiotreitol se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Todos los demás productos químicos y disolventes eran de calidad analítica y se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania) y Sigma-Aldrich. 2.2. Purificación de proteínas Todas las etapas de purificación se realizaron a 4ºC en un sistema AKTA Purifier 10 (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Suecia). Se disolvió la peptidasa R (500 mg) en 50 ml de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, y se filtró a través de un filtro Millex-HA de 25 mm (Millipore, Bedford, MA) con un tamaño de poro de 0,45 μm. La solución de enzima se cargó en una columna HiLoad 26/10 Q Sepharose de alto rendimiento (GE Healthcare Biosciences) equilibrada con tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0. Las fracciones se eluyeron a un caudal de 10 ml / min utilizando un tampón de equilibrio con un gradiente en fase de NaCl de 0-0,17 M para 180 ml, 0,17-0,30 M para 480 ml y 0,30-1,0 M para 300 ml. Las fracciones se detectaron por absorbancia de UV a 280 nm para su recolección. La actividad de la proteasa aspártica en las fracciones recogidas se midió como se describe en la Sección 2.5. Se reunieron las fracciones que contenían proteasa aspártica y se añadió sulfato de amonio a una concentración final del 50% (v / v) para precipitar las proteínas contaminantes. La proteína insoluble se eliminó por centrifugación a 12.000 rpm y 4ºC durante 10 min. El sobrenadante se aplicó a una columna HiTrap Phenyl Sepharose (GE Healthcare Biosciences) equilibrada con tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,0. La proteasa aspártica se eluyó a un caudal de 1 ml / min utilizando un tampón de equilibrado con un gradiente descendente lineal de sulfato de amonio del 100% (solución saturada) al 0%. Las fracciones que exhiben actividad proteasa aspártica se combinaron y se dializaron frente a tampón glicina-HCl 50 mM, pH 3,4, para el almacenamiento. La proteína purificada se concentró por ultrafiltración usando un dispositivo de filtro centrífugo Amicon (corte de 10 kDa, Millipore) y se almacenó a 4ºC. 2.3. Determinación del peso molecular y cuantificación de proteínas La homogeneidad de las proteínas y el peso molecular se determinaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) en geles de separación de 5% y 12% de separación, usando marcadores de proteína de amplio

espectro (6,5-200 kDa; ) Como estándares de tamaño. Las proteínas en el gel se tiñeron con Bio-safe Coomassie Blue (Bio-Rad Laboratories). El peso molecular de la proteína se determinó usando el software TotalLab (Nonlinear, Durham, NC) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de proteína se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de proteínas Bio-Rad con albúmina de suero bovino como patrón. 2.4. Secuenciación de aminoácidos N-terminal La enzima purificada se separó mediante gel de SDS-PAGE y se transfirió por electroblotting a una membrana de fluoruro de polivinilideno (Millipore) en tampón de ácido 3- (ciclohexilamino) -1-propanosulfónico 10 mM, pH 11, que contenía metanol al 10%. La proteína transferida se tiñó con Coomassie Blue R-250 y la banda que contenía proteína purificada se escindió de la membrana para la secuenciación de aminoácidos N-terminal por degradación de Edman usando un secuenciador de proteínas ABI Procise 494 (Applied Biosystems, Foster City, CA). La comparación de la secuencia con secuencias codificantes de proteasa similares en GenBank se realizó usando la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica (BLAST) en el sitio web del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI) ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi ). La alineación de secuencias múltiples y las identidades (%) se realizaron utilizando Clustal Omega en el sitio web del Instituto Europeo de Bioinformática (EMBL-EBI) ( http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ ). 2.5. Ensayo de actividad enzimática La actividad proteolítica se midió utilizando caseína como sustrato. La mezcla de reacción, que contenía 50 μl de solución de caseína al 2% (p / v), 190 μl de tampón glicina-HCl 50 mM, pH 3,4 y 10 μl de la concentración apropiada de enzima purificada, se incubó a 35 ° C durante 30 Min. La reacción se terminó añadiendo 250 μl de ácido tricloroacético al 10% (p / v). La proteína precipitada se eliminó por centrifugación a 12.000 rpm y 4ºC durante 10 min. La absorbancia del sobrenadante a 280 nm se midió usando un espectrofotómetro Hitachi U3000 (Hitachi, Tokio, Japón). Una unidad (U) de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima requerida para aumentar la absorbancia a 280 nm por 0,001 AU por minuto en las condiciones de ensayo antes mencionadas [15]. 2.6. Caracterización enzimática para pH y temperatura óptima El pH óptimo para la proteasa aspártica purificada se determinó midiendo la actividad a 35 ° C durante 30 min en el intervalo de pH de 2,2-4,0 usando 50 mM de glicina-HCl (pH 2,2-3,6) y 50 mM citrato de sodio (pH 2,6-4,0) como Tampones de ensayo. La temperatura óptima para la actividad proteasa se determinó mediante ensayos realizados usando temperaturas de 15-85ºC durante la etapa de incubación de 30 min en tampón glicina-HCl 50 mM, pH 3,4. La actividad máxima observada bajo cualquiera de las condiciones de reacción documentadas se definió como 100% y las actividades relativas se calcularon como una fracción de este valor. 2.7. Termoestabilidad La termoestabilidad de la proteasa aspártica se determinó incubando la enzima purificada durante 65 minutos en tampón de glicina-HCl 50 mM, pH 3,4, a 35ºC y 45ºC. A intervalos de tiempo definidos, las soluciones enzimáticas se enfriaron en hielo

y se ensayó la actividad residual bajo condiciones estándar de ensayo enzimático. La actividad residual relativa se expresó como un porcentaje de la actividad observada para la enzima no calentada. 2.8. Efecto de reactivos químicos e iones metálicos sobre la actividad enzimática Para determinar los efectos de los inhibidores de la proteasa y de los activadores de la cisteína proteasa sobre la actividad enzimática, la enzima purificada se incubó con cada reactivo en tampón glicina-HCl 50 mM, pH 3,4, a 35ºC durante 30 min, seguido de la medición de su actividad bajo el ensayo estándar Condiciones descritas anteriormente. La enzima se ensayó para la inhibición por los inhibidores de serina proteasa PMSF (0,1 mM y 1 mM) y Pefabloc SC (1 mM), los inhibidores de cisteína proteasa N-etilmaleimida (1 mM) y ácido yodoacético (1 mM), y la aspártica Inhibidor de la proteasa pepstatina A (1 μM). También se realizaron ensayos sobre la enzima con ß-mercaptoetanol (1 mM) y ditiotreitol (1 mM), que se sabe que aumentan la actividad de la cisteína proteasa. Para determinar si la proteasa es dependiente del metal, se realizó un ensayo sobre la proteína purificada después de la incubación con el quelante ácido etilendiamino tetraacético (EDTA). Específicamente, la enzima purificada se incubó a 35ºC durante 30 min en tampón de glicina-HCl 50 mM, pH 3,4, con EDTA 10 mM. El EDTA se eliminó por ultrafiltración centrífuga usando un dispositivo de filtro centrífugo Amicon (corte de 10 kDa, Millipore) antes de ensayar espectrofotométricamente la actividad. El efecto de los metales divalentes añadidos en la enzima tratada con EDTA se determinó incubando la enzima después de la eliminación del quelante con una solución acuosa de cloruro metálico a una concentración final de 1 mM durante 30 min. La enzima se ensayó en presencia de CaCl2, ZnCl2, NiCl2, CuCl2, MnCl2 y CoCl2. La actividad relativa se expresa como un porcentaje de la actividad enzimática no tratada.

3. Resultados y discusión 3.1. Purificación de la proteasa aspártica Se separó una solución de enzima cruda de Peptidasa R que mostraba actividad de proteasa aspártica (17 x 103 U / mg) mediante cromatografía utilizando una columna HiLoad 26/10 Q Sepharose de Alto Rendimiento y se eluyó con un gradiente de NaCl escalonado. El perfil cromatográfico se muestra en la Fig. 1a . Hay dos picos principales de proteínas; La que eluyó a NaCl 0,17-0,20 M contenía proteína activa. La actividad específica de las fracciones activas agrupadas fue de 36,7 x 103 U / mg, lo que representa un rendimiento del 90,6% de la actividad enzimática original. Las fracciones activas se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de interacción hidrófoba en una columna HiTrap Phenyl Sepharose en la que las fracciones 9 - 15 contenían actividad enzimática objetivo ( figura 1b ) y se agruparon para comprender la muestra final de proteasa purificada. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los pasos de purificación para la proteasa aspártica derivada de Peptidasa R. Después de dos etapas de purificación por cromatografía en columna, la enzima se purificó 3,4 veces a partir de una Peptidasa R bruta, con un rendimiento final de 58,8% y una actividad específica observada de 57,5 x 103 U / mg. Las proteasas aspárticas purificadas de Aspergillus oryzae MTCC 5341 [15] y Aspergillus niger BCRC 32720 [18] mostraron una alta actividad proteolítica con una actividad específica de aproximadamente 43,6 × 10 3 U / mg y 23,3 × 10 3 U / mg, respectivamente. La actividad de la proteasa aspártica

purificada aquí fue una de las más altas informadas, y puede ser útil como una ayuda digestiva.

Higo. 1. Purificación cromatográfica de una proteasa aspártica de la preparación de enzimas brutas de R. oryzae . (A) Cromatografía de intercambio aniónico usando una cromatografía de interacción hidrófoba de columna HiLoad 26/10 Q Sepharose High Performance (b) usando una columna HiTrap Phenyl Sepharose. Las condiciones de purificación se describen en Materiales y métodos.

Tabla 1. Purificación de una proteasa aspártica a partir de una preparación de enzima cruda de R. oryzae .

Paso de purificación

Total Total proteína actividad (Mg)

(10

6

Enzima cruda

500

8.5

Q Sepharose

210

7,7

Fenil Sepharose

87

5.0

U)

(10

La pureza enzimática se confirmó mediante SDS-PAGE. La proteína purificada emigró como una banda única con un peso molecular aparente de ~ 39 kDa ( Fig. 2 ). El peso molecular de la enzima purificada es mayor que el indicado para las rizopuspepsinas de R. oryzae MTCC 3690 (34 kDa) [16], R. oryzae NBRC 4749 (34 kDa) [23] y R. microsporus (34,5 kDa) [21 ]. Estos resultados sugieren que la proteasa purificada de Peptidase R es una rizopuspepsina distinta, previamente no reportada.

Higo. 2. Perfil SDS-PAGE de proteasa aspártica purificada. Carril M, marcadores de peso molecular; Carril 1, proteasa aspártica purificada. La flecha indica la banda correspondiente a la proteasa

aspártica purificada (peso molecular aproximado, 39 kDa).

3.2. Análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal La secuencia de aminoácidos N-terminal de la proteasa purificada se identificó como Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Val-Pro-Met-Thr-Asp-Tyr-Glu-Tyr-Asp-Ile-Glu-Tyr. La búsqueda de homología y los resultados de la alineación de múltiples secuencias se muestran en la Fig. 3 . La secuencia de aminoácidos N-terminal de la enzima purificada muestra identidad de 75, 71, 69 y 63% con las rizopuspepsinas de R. oryzae (nº de acceso GenBank ACL68093.1), R. microsporus var. Chinensis ( nº de acceso GenBank AAA33880.1), R. niveus (nº de acceso de GenBank AAA33882.1) y R. oryzae NBRC 4749 (nº de acceso GenBank ACL68087.1), respectivamente. También era idéntica en un 71% a la sincefafetasina de Syncephalastrum racemosum ( nº de acceso GenBank AAC69517.1) y era sólo un 31% idéntica a la aspergilpepsina I de A. niger (nº de acceso GenBank XP_001401093.1). La homología de la secuencia con enzimas reninacomo endothiapepsin y mucorpepsin fue baja (datos no incluidos en la Fig. 3 ). Para la identificación de proteínas, la secuencia N-terminal también se utilizó para buscar en la base de datos del genoma de R. oryzae RA 99-880 ( http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/rhizopus_oryzae/Blast.html ), pero una significativa No se identificó una secuencia similar. La secuencia de aminoácidos Nterminal de la enzima purificada mostró una alta homología con los de las rizopuspepsinas, lo que indica que la enzima purificada posee actividad proteasa aspártica.

Higo. 3. Alineación secuencial múltiple de secuencias de aminoácidos N-terminales de las proteasas aspárticas purificadas y de otros hongos. (1) proteasa aspártica purificada a partir de Peptidasa R; (2) rizopuspepsina de R. microsporus var . Chinensis ( nº de acceso GenBank AAA33880.1); (3) rizopuspepsina de R. niveus (GenBank nº de acceso AAA33882.1); (4) rhizopuspepsina de R. oryzae NBRC 4749 (GenBank nº de acceso ACL68087.1); (5) rhizopuspepsin de R. oryzae (GenBank nº de acceso ACL68093.1); (6) syncephapepsin de S.

racemosum (GenBank número de acceso AAC69517.1); (7) aspergilpepsina de A. niger (nº de acceso GenBank XP_001401093.1). Los residuos idénticos están en caja.

3.3. Efectos del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática y la estabilidad La actividad proteasa de la enzima purificada se estudió a través del intervalo de pH 2,2-4 usando caseína como sustrato a una temperatura de ensayo de 35ºC. El perfil de pH de la proteasa aspártica purificada se muestra en la Fig. 4a . La enzima fue más activa entre los valores de pH 3,0-3,6 con actividad máxima a pH 3,4. La actividad proteasa disminuyó significativamente por debajo de pH 3,0 y fue aproximadamente 45% de la actividad máxima cuando se ensayó a pH 2,2 en tampón glicina-HCl. La actividad enzimática se redujo ligeramente a pH 4,0 en tampón citrato de sodio y no se detectó a pH 7,0 (datos no mostrados). Similar pH óptimo para las actividades de la proteasa han sido reportados de R. oryzae NBRC 4749, pH 3,0 [23]; R. hangchow , pH 3,0 [22]; R. chinensis , pH 3,1 [20]; A. niger I1, pH 3,0 [24]; Y A. oryzae MTCC 5341, pH 3,2 [15]. El pH óptimo en el mismo rango también se han informado de mucorpepsins de varias especies de Mucor [10]. Por el contrario, la R. oryzae MTCC 3690 enzima exhibe una actividad óptima a pH 5,5 [16] y las enzimas de A. niger BCRC 32720 [18] y R. microsporus muestran óptima actividad a pH 2,5 [21]. La mayoría de las proteasas aspárticas fúngicas muestran una actividad máxima a pH 34, debido a que el par de residuos de ácido aspártico en el sitio activo debe reaccionar en forma ionizada y sindicalizada para la actividad catalítica [7]. El pH óptimo podría indicar un mecanismo de reacción similar entre la enzima purificada y las proteasas aspárticas.

Higo. 4. Determinación del pH y temperatura óptimos para la proteasa aspártica purificada. (A) El efecto del pH sobre la actividad de la proteasa purificada se determinó a 35ºC durante una incubación de 30 minutos, como se describe en Materiales y métodos, ya sea con 50 mM de glicina-HCl, pH 2,2-3,6 ( ) O citrato sódico 50 mM, pH 2,6 - 4,0 (

) buffer.

(B) La temperatura óptima se determinó en tampón de glicina-HCl 50 mM, pH 3,4 a diversas temperaturas durante 30 min. Los puntos de datos mostrados son los medios para tres experimentos independientes, y la mayor actividad observada se definió como

100%. Las barras de error indican las desviaciones estándar.

Durante el estudio de optimización del pH, se observó que la actividad enzimática era mayor a través de valores de pH de 2,6-3,6 en glicina-HCl frente a tampón citrato de sodio. Este fenómeno también se observó en la rizopuspepsina de R. oryzae NBRC 4749, en el que la actividad enzimática es mayor a pH 3,0 en tampón de glicina-HCl que en el tampón de fosfato de citrato [23]. La glicina es un agente de carga común en formulaciones de proteínas farmacéuticas y se utiliza para estabilizar la proteína durante la solución de congelación-descongelación [25]. Glicina también se ha utilizado para mejorar la estabilidad de las proteasas alcalinas a alta temperatura y en detergentes [26]. Sugerimos que la glicina se protona a pH bajo en el tampón glicinaHCl; Esto podría impedir la agregación de proteínas en el sistema de amortiguación, lo que conduce a una mayor actividad proteolítica. Los efectos de la glicina en la agregación y estabilidad de la proteasa aspártica purificada se examinarán en el futuro. Como se muestra en la Fig. 4b , la actividad hidrolítica de la proteasa purificada aumentó con el aumento de la temperatura, alcanzando un máximo a 75 ° C, que es superior a los reportados previamente para las rizopuspepsinas de R. oryzae NBRC 4749 (50 ° C) [23] y R. oryzae MTCC 3690 (60 ° C) [16]. El perfil de termoestabilidad de la proteasa purificada se muestra en la Fig. 5 . A 35 ° C, la enzima conservó la actividad completa después de 1 h de incubación. A 45 ° C, la actividad enzimática disminuyó con el aumento del tiempo de incubación; La semivida observada para la proteasa fue de aproximadamente 30 minutos a 45ºC. Rhizopuspepsin de R. oryzae MTCC 3690 tiene una vida media de aproximadamente 20 min a 60 ° C y retiene la actividad completa después de la incubación a 40 ° C durante 1 h [16]. Por otra parte, medias vidas de aproximadamente 3,5 hy 10 min a 40 ° C y 60 ° C, respectivamente, se informó de rhizopuspepsin 6 de R. oryzae NBRC 4749 [23]. Estos resultados sugieren que las proteasas aspárticas de especies de Rhizopus parecen ser estables a temperaturas por debajo de 40 ° C y propensas a inactivación por encima de esta temperatura.

Higo. 5. Determinación de la termoestabilidad de la proteasa aspártica purificada. La termoestabilidad se determinó mediante ensayos de enzima purificada en tampón de glicina-HCl 50 mM (pH 3,4) incubado a 35ºC ( ) O 45 ° C ( ) Y se ensayó la actividad enzimática bajo condiciones estándar. La actividad residual se expresa como el porcentaje en comparación con la actividad de la enzima no incubada. Los puntos de datos mostrados son los medios de tres experimentos independientes y las barras de error indican desviaciones estándar.

3.4. Efectos de inhibidores e iones metálicos Para caracterizar la proteasa purificada, se examinaron los efectos de diversos inhibidores sobre la actividad enzimática. La proteasa purificada fue fuertemente inhibida por Pepstatina A, un inhibidor hexapeptídico que se une específicamente e irreversiblemente al aspartato dentro del sitio activo de la proteasa aspártica, presentándose una inactivación completa a una concentración de inhibidor de 1 μM ( Tabla 2 ). Por el contrario, los inhibidores de serina proteasa (PMSF y Pefabloc SC) y los inhibidores de cisteína proteasa ( N- etilmaleimida y ácido yodoacético) no inhibieron la actividad enzimática incluso a 1 mM (datos no mostrados). Los activadores de cisteína proteasa ditiotreitol (1 mM) y β-mercaptoetanol (1 mM) no aumentaron la actividad proteasa (datos no mostrados). La fuerte inhibición por el inhibidor de la proteasa

aspártica, la Pepstatina A, sugiere que la proteína purificada puede clasificarse como una proteasa aspártica.

TABLA 2 Efectos de los inhibidores de proteasa y diversos iones metálicos sobre la actividad enzimática purificada.

Compuesto

Concentración

Ninguna

0

Pepstatina A

1 μM

EDTA

10 mM

CaCl

$

₂

1 mM

$

ZnCl

$₂$

1 mM

NiCl

$₂$

1 mM

CuCl

$₂$

1 mM

MnCl

$₂$

1 mM

CoCl _ {

2

}

1 mM

Actividad enzimática ensayada en ausencia de iones metálicos e inhibidores se definió como actividad al 100%. A

Los efectos de EDTA e iones metálicos en la enzima tratada con EDTA se examinaron a pH 3,4 y 35 ° C usando caseína como sustrato ( Tabla 2 ). El agente quelante EDTA (10 mM) no tuvo ningún efecto sobre la actividad enzimática, lo que sugiere que no es una metaloproteasa. La adición de Ca2 + 1 mM no tuvo efecto sobre la actividad proteolítica, mientras que la adición de Zn2 + 1 mM, Ni2 + , Cu2 + , Mn2 + y Co2 + redujo ligeramente la actividad enzimática. Estos resultados indican que la actividad de la enzima purificada no es metalo-dependiente. Los iones metálicos tienen efectos variables sobre la actividad de las proteasas aspárticas de diferentes hongos. Rhizopuspepsin de R. chinensis es significativamente inhibido por Fe 3 + , mientras que no se observa efecto inhibitorio con Cu 2 + , Hg 2 + , Fe 2 + y Pb 2 + [20]. Fe 2 + se activa fuertemente y Fe 3 + , Cr 3 + , Sb 3 + , Pb 2 + , Sn 2 + , Sr 2 + , y Ag + inhibe fuertemente la enzima de A. niger BCRC 32720 [18]. Cu 2 + inhibe fuertemente la enzima de A. niger I1 [24]. Ca 2 + es un potente activador que se combina con para - \ beta - caseína para formar coágulos firme durante la coagulación de la leche [10]. La actividad proteolítica de la proteasa aspártica purificada no fue inhibida por Ca2 + , apoyando su utilidad potencial en el procesamiento de alimentos.

4. Observaciones finales Se purificó una proteasa aspártica a homogeneidad a partir de una preparación comercial de Peptidasa R por cromatografía líquida usando una columna de intercambio aniónico fuerte seguida por una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba, dando como resultado un aumento de 3,4 veces en la actividad específica y un rendimiento de 58,8%. Se determinó que el peso molecular de la enzima purificada era de aproximadamente 39 kDa mediante SDS-PAGE. La enzima purificada parece ser una

proteasa aspártica, basada en la inhibición observada en presencia de Pepstatina A. La enzima era óptimamente activa a pH 3,4 y estable a 35ºC, apropiada para aplicaciones biotecnológicas y procesamiento de alimentos. Se están realizando análisis genéticos y de proteínas estructurales para elucidar las propiedades bioquímicas y potenciales aplicaciones industriales de esta enzima.