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• Daniela Najera

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COSTA RICA

FACULTAD DE TIERRA Y MAR

ESCUELA DE CIENCIAS AGRARIAS

LABORATORIO DE FISIOLOGÍA DE LOS

CULTIVOS AGRÍCOLAS

MANUAL DE FISIOLOGÍA DE CULTIVOS

AGRÍCOLAS

PROFESOR: JOSÉ ANTONIO GARCÍA G. MSc.

II CICLO, 2018

1

Índice

Introducción

5

Práctica 1: Determinación del Potencial hídrico

7

Práctica 2: Transpiración

16

Práctica 3: Presión radical

23

Práctica 4: Conductividad hidráulica en tallos leñosos de café Coffea arabica 30 Práctica 5: Efecto de la luz en la germinación de semillas de lechuga y establecimiento de almácigos hidropónicos 34 Práctica 6 Cultivo de tomate (​Lycopersum esculentum​) en solución nutritiva y elemento faltante 45 Práctica 7: ​Cultivos Hidropónicos

56

Práctica 9: Micropropagación de Orquídeas

80

PRÁCTICA 8: Uso de la cámara de flujo laminar, confección de soluciones madres y medios de cultivo. 69 Práctica 10: Establecimiento ​In vitro de vainilla ( ​Vanilla planifolia​ Andrew) 85 Práctica 11 (fitohormonas)

Reguladores

de

crecimiento

vegetal 90

Conductividad hidráulica y grosor de los vasos del xilema en cinco materiales de vid sometidos a déficit hídrico 99

2

Introducción Los cultivos (granos, tubérculos, raíces, frutales, aromáticos, medicinales entre otros) han formado parte de la dieta de los seres humanos, indirectamente representan una alternativa para la alimentación de otros organismos como los insectos y roedores; los cuales son utilizados como fuente primaria de energía. El uso que se le da a las plantas no es solo para la alimentación, también son utilizadas como materia prima para la industria y la obtención de combustibles. Es por ello que se debe conocer el mecanismo de desarrollo de las plantas en general, para determinar las técnicas de manejo adecuadas de los cultivos con el fin de obtener productos de calidad y

aprovechar al

máximo el material vegetal que se desea obtener. A la fisiología se le conoce como la ciencia

que estudia las

funciones de los seres orgánicos. Este término se deriva del vocablo latino ​physilogia que significa conocimiento de la naturaleza. Etimológicamente, se dice que la fisiología vegetal es el conocimiento físico de las plantas. La fisiología vegetal se encarga del estudio de los procesos que tienen lugar en las plantas, además, estudia el funcionamiento de las plantas y explica sus fundamentos físicos sobre las bases estructurales a diferentes niveles: molecular, celular, de tejidos, de órganos y de la planta como un todo. Explica los mecanismos 3

de crecimiento y desarrollo de las plantas y sus respuestas a los agentes externos. La fisiología vegetal mantiene relaciones con disciplinas como la bioquímica, genética (fitomejoramiento), ecología, biología celular y molecular, anatomía e histología, taxonomía-filogenia, entre otras. Existen varios factores que afectan la fisiología de las plantas, como la herencia y el medio ambiente, procesos que regulan los mecanismos internos y las condiciones de la planta y finalmente determinan su crecimiento y desarrollo. Es por ello que la forma, el tamaño y funcionamiento de la planta resulta de una compleja serie de interacciones entre la composición genética (tipo de raíz, tipo y estructura de las hojas, forma y desarrollo del tallo, tipo de flor y semilla, ciclos reproductivos y adaptación) y el ambiente (interacciones abióticas y bióticas) en el cual creció. Debido al aumento de la población mundial y la reducción de disponibilidad de suelos cultivables, además de las predicciones desfavorables para la agricultura a nivel mundial por los efectos negativos del cambio climático, se debe buscar soluciones para cultivar

alternativamente con el fin de satisfacer la demanda

creciente de alimento, lo cual solo es posible con el correcto conocimiento y entendimiento de la fisiología de las plantas.

4

Práctica 1. Determinación del Potencial hídrico Introducción El potencial hídrico (Ψ) es el potencial químico del agua que corresponde a la medida de la energía disponible para la reacción y movimiento. El valor de Ψo depende del contenido en solutos: Ψo = − R ​· ​T ​· ​[solutos] El valor de Ψp se corresponde con el de la presión a la que está sometida el agua: Ψp = P Se puede determinar el valor del potencial hídrico y de sus componentes en los tejidos vegetales mediante técnicas relativamente sencillas. Los sistemas biológicos están formados por el potencial osmótico (Ψo), que representa la energía del agua dentro la célula y siempre tiene un valor negativo, por la adición de partículas de soluto que disminuye la energía libre. En el caso del potencial de presión (Ψ​p​), indica la presión que se ejerce contra las paredes celulares, por lo general su valor es positivo, excepto cuando se generan tensiones. Ψ = Ψo + Ψp​, se expresa en unidades de presión. Se han desarrollado varios métodos para medir el potencial hídrico, por ser una de las propiedades más importantes de poder medir en el sistema suelo-planta–aire. Su importancia radica en que determina 5

el movimiento de difusión y el movimiento del flujo de masa que responde al gradiente de presión. El método de Chardakov es simple y eficiente, el cual permite determinar la solución en la cual no ocurre cambio en la concentración. Se prepararan tubos de ensayo con soluciones de concentraciones conocidas de sacarosa y se agregara un colorante. En otra serie de tubos con las mismas soluciones y sin colorante, se colocaran muestras de tejido vegetal. Se dejaran por poco tiempo para permitir el intercambio de agua. Después se removerá el tejido y se agregará una gota de la solución colorante. Si la gota sube, significa que la solución en la que se incubó el tejido se volvió más densa debido a que el tejido absorbió agua​, por lo tanto, el tejido presenta ​un potencial hídrico más bajo (más negativo) que la solución original. Si la gota baja​, significa que la solución se volvió ​menos densa tomando agua del tejido, de allí que el potencial hídrico del tejido es mayor (​menos negativo que la solución original. Cuando la gota coloreada se difunde en forma uniforme, no baja ni sube, se argumenta que no hubo cambio en la concentración de la solución y que el potencial hídrico de la solución es igual al del tejido​. En esta práctica se estudiarán dos métodos para determinar el potencial hídrico, el volumétrico y gravimétrico Objetivo Determinar el potencial hídrico prácticos. 1- Método de Chardakov 6

utilizando dos métodos

Materiales y métodos Preparar dos series de 6 tubos de ensayo pequeños (a y b) (Figura 1). En la serie (a) agregar a cada tubo 10 ml de una de las soluciones de sacarosa y una hoja pequeña o un trozo de tejido, cuyo potencial se desea conocer. Para ello se cortarán segmentos de la zona media de varias hojas de la planta en estudio. Posteriormente se enrollarán en forma de cilindros para su adaptación al tubo de ensayo que contiene la solución de sacarosa de la primera serie de tubos. El tejido debe quedar inmerso en la solución de sacarosa. Por otro lado, en cada tubo de la serie (b) se colocarán 10 ml de la solución de sacarosa, igual que en la serie (a), luego se agrega a cada tubo dos gotas de azul de metileno. Después de una hora, se sacan las muestras de hojas de la primera serie con una pipeta limpia, y se deposita una gota de la serie correspondiente a azul de metileno (b) a la serie (a), de tal forma que corresponda cada número, es decir el tubo número 1 de la serie a con el tubo número 1 de la serie b. Observe el comportamiento de la gota coloreada y anote los resultados.

7

Cuadro 1. Valores de potencial osmótico de varias soluciones de sacarosa a 25 °C Solución de sacarosa (M)

Potencial osmótico

0.1

2.44

0.2

4.89

0.3

7.33 8

0.4

9.78

0.5

12.22

0.6

14.67

0.7

17.11

0.8

19.56

0.9

22.00

Cuadro 2. Determinación del potencial hídrico por el método de Chardakov

Solución de sacarosa (M)

Gota coloreada

Conclusiones

Baja

Diluye

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.9 Sube

9

II- Métodos volumétrico y gravimétricos Determinación del potencial hídrico en células de tubérculo de patata Para determinar el valor del potencial hídrico en células de tubérculo de patata se utilizará el método gravimétrico. Para ello, sumergirán discos de patata en una serie de soluciones de sacarosa de concentración creciente, de modo que, en función de las diferencias de Ψ entre la solución externa y el interior de las células del disco, tenderá a entrar o a salir agua. Esto se traducirá en un incremento o una disminución del peso del disco, respectivamente ( Figura 2).

Numerar las cajas Petri y agregar 10 ml de las siguientes soluciones por separado. 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)

agua destilada sacarosa 0,1 M sacarosa 0,2 M sacarosa 0,4 M sacarosa 0,5 M sacarosa 0,6 M sacarosa 0,7​ M 10

Cortar con un sacabocados trozos de papa de aproximadamente 5 cm de largo. Medir el largo y diámetro de cada trozo. Pesar cada trozo en forma individual. Colocar un trozo en cada uno de los platos petri. Tapar Después de 2, 6 y 24 horas, medir el largo de trozos, secar cuidadosamente con papel absorbente y verificar su peso. Resultados Cuadro 3: Variaciones de peso y volumen del tejido de papa sumergido en diferentes soluciones de sacarosa.

Volumen de un cilindro: π x r​2​ x h Cuestionario 1-¿Qué conclusiones puede sacar con respecto a la cantidad relativa de agua en el tejido al inicio del experimento? 11

2-¿Cuál de las soluciones tiene la mayor concentración de agua por unidad de volumen? 3- ¿Qué unidades de presión se utilizan para expresar el potencial hídrico? 4- ¿Por qué se cierran los estomas cuando el potencial hídrico de las hojas es bajo? ANEXO Información para determinar la Molaridad de una solución 1-gramos = moles ​ /​ peso molecular (PM) moles 2- ----------- = molaridad (M) volumen 3-Gramos = Molaridad (M) x Volumen (V) PM

Ejemplos * 1) 2 gr de NaCl (de peso molecular 58,44 g mol-1 ojo que pusimos aquí el valor exacto del peso a diferencia y no el aproximado de 58,5)

se disuelven en 100 mL de agua

¿Cuál es la molaridad de la solución?. Si aplicamos la ecuación 3 tenemos: M: G/PMxV 2g/58,5x0,1 L M= 0,34 La molaridad de la solución es ​0,34 M 12

2) ​¿Cuántos gramos de NaCl son necesarios para obtener 500 ml de una solución 0,2 M? Si aplicamos la ecuación 3 tenemos: x (0,2 M) (0,5 L) = 58,44 X = 5,844 gr de cloruro de sodio En el caso de la sacarosa conocemos lo siguiente: 0,4 M y PM de sacarosa: 342,30 Para determinar la cantidad de gramos que se requiere agregar a un volumen de 0,1 litro de agua, se procede de la siguiente forma 0,4 M X 0.1 L = X/ 342,30 g (342,3)(0 0.04) = X X= 13 g /100ml Práctica 2. Transpiración Introducción Consiste en la pérdida de agua en forma de vapor a través de estomas, cutícula y peridermis (superficie suberizada con lenticelas). Se ha estimado que una planta de maíz debe transpirar 600 Kg de agua para producir un Kg de granos de maíz seco y para obtener un Kg de biomasa seca (incluyendo hojas, tallos y raíces) necesita transpirar 225 Kg de agua. De la cantidad total de agua que es absorbida del suelo, transportada en el tallo y transpirada hacia la atmósfera, solamente una fracción muy pequeña (1%) se incorpora a la biomasa. Casi toda el agua que se pierde por la hoja lo hace a través de los poros del aparato estomático, los cuales son más 13

abundantes en el envés de la hoja. Las hojas pierden agua irremediablemente a través de los poros estomáticos como consecuencia de la actividad fotosintética de las células del mesófilo. Se afirma que la transpiración es un mal necesario, puesto a que si los estomas no se abren no penetra el CO​2 requerido para la fotosíntesis por las células del parénquima clorofílico. El potencial hídrico de la planta está determinado por dos factores: la humedad del suelo, que controla el suministro de agua y la transpiración que gobierna la pérdida de agua. Estos factores ejercen su acción a través de la conductancia estomática, que depende tanto del contenido de agua del suelo como de la humedad relativa del aire. En promedio se encuentran 10.000 estomas por cm​2 de superficie foliar, aunque muchas plantas xerófitas como las suculentas (cactáceas) pueden tener en promedio 1000 y algunos árboles deciduos tienen 100.000 o más por cm​2​. Los estomas regulan el intercambio gaseoso, generalmente abren en la luz y cierran en la oscuridad, a excepción de las plantas con metabolismo ácido de crasuláceas en que se cierran de día y abren de noche. Las hojas que presentan los estomas en el envés se denominan hipoestomáticas, las que lo tienen en la haz son epiestomáticas, o como ocurre en muchas plantas herbáceas que presentan estomas en ambas superficies y reciben el nombre de anfiestomáticas. Para determinar la transpiración en esta práctica se usará el método del papel impregnado con cloruro de cobalto al 5 % y el método del potómetro. A-método del papel impregnado de cloruro de cobalto. Retire con pinzas dos trozos de papel previamente impregnados con cloruro de cobalto al 5%. Cubra con ellos 14

las caras de una hoja previamente separada de la planta y ubíquela en condiciones naturales o en oscuridad (Fig 1.). Lleve a cabo el mismo montaje con otra hoja. Colóquela bajo la luz de una lámpara. Desmontar el sistema después de una hora y revisar el cambio de color del papel de filtro. Resultados Hacer un diagrama que ilustre lo observado durante el ensayo, comente. Cuestionario

¿Qué limitaciones tiene este método para medir la transpiración?

B-Método del potómetro

15

Materiales y métodos Construir el potómetro de acuerdo con la Figura 2. Una vez que el sistema esté completamente lleno con agua, seleccionar una distancia apropiada en la parte horizontal del capilar, marcar el punto de origen y uno de finalización. Levantar por corto tiempo el extremo del capilar para introducir una burbuja, luego de atrapar la burbuja, sumergir de nuevo el capilar en el agua que contiene la bandeja. La burbuja se usará como indicador para medir la velocidad de la transpiración Cortar el tallo de la planta en estudio dentro del agua que contiene la bandeja, sellar el lado cortado de la planta con plasticina (siempre debajo del agua para evitar infiltraciones de aire). En el caso de fuga en el sistema, sellar con plasticina. Por último introducir la rama cortada en el tubo con agua y sellar el orificio con plasticina. Mida el tiempo que tarda la burbuja en recorrer la distancia marcada en la parte horizontal del capilar. Repetir esta medición colocando una lámpara a 50 cm del potómetro. Realizar de nuevo las mediciones reemplazando la lámpara por un ventilador colocado a 50 cm del potómetro. Resultados Anotar los resultados de las observaciones. Preparar un cuadro donde se señala la distancia recorrida por la burbuja en cada tratamiento, en el tiempo. Cuestionario 16

Señale los factores que retardan la transpiración en las plantas. ¿Por qué el potómetro no se considera un método preciso para medir la transpiración? Anote los defectos de este método. ¿Por qué la velocidad de transpiración es generalmente mayor en la luz que en la sombra, a pesar de que los estomas podrían no estar cerrados en este último caso? ¿Por qué se utiliza agua sin aire en este experimento?

Figura 2. Potómetro 17

C- Transpiración. Método cuantitativo directo (Lisímetro) Preparar dos plantas de la siguiente manera: 1-Introducir la maceta en una bolsa plástica y atar la boca de la bolsa al tallo dejando la planta afuera (figura 3) 2- medir el peso de la maceta y la planta cada día hasta que marchite 3-Anotar en el cuadro de registro de datos los pesos de su planta 4- Haga un gráfico del cambio de peso proporcional de agua transpirada (eje de abscisas) en función del tiempo (días) (eje de las ordenadas.

Grup o

Peso inicial maceta y planta

1 2 3 1 2 3 1 2 3

18

Figura 3.Método cuantitativo directo ​Laboratorio de Fisiología

de los Cultivos Agrícolas

19

Práctica 3. Presión radical Introducción El balance hídrico: Absorción y transporte del agua El agua es transportada desde la raíz a las hojas a través de una columna continua aunque heterogénea. Mientras que las hojas toman CO​2 de la atmósfera, para realizar el proceso fotosintético, en esta actividad se pierden grandes cantidades de H​2​O, por lo que, la supervivencia de la planta depende de la toma continua de agua desde el suelo y su transporte a lo largo del xilema.

El agua del suelo El agua del suelo disponible para la planta está determinada por la conductividad hidráulica del suelo, que depende del tipo y características de la matriz que lo forma. Un suelo saturado de agua tendrá un potencial hídrico ​de 0.00 MPa, y una capacidad de campo (% de peso de agua) que dependerá de su textura (alrededor de 30% en suelos arenosos y del 70% en suelos arcillosos. A medida que estos suelos se sequen el potencial hídrico del suelo disminuirá, hasta un contenido hídrico en que las plantas se marchitan (porcentaje de marchitez permanente), que corresponde a -1.5 MPa, varía entre especies (es menor en plantas adaptadas a sequía).

20

Tradicionalmente se define al agua disponible para la planta como la diferencia entre la capacidad de campo y el porcentaje de marchitez permanente.

Absorción radical del agua Aunque hay especies capaces de absorber la humedad de la niebla y el rocío, la cantidad de agua foliar incorporada es insignificante comparada con la absorción radicular. Para la entrada de agua por la raíz es necesario el contacto físico entre esta y el suelo. Los pelos radicales aumentan la superficie de absorción del agua de la raíz y fijan al suelo las raíces jóvenes, sin embargo, no son imprescindibles, y existen casos en que no se desarrollan. La estructura de la raíz determina la absorción del agua. En el ápice, el sistema vascular no está desarrollado, de forma que el agua no puede ascender y en zonas muy distales del ápice, el grado de suberización y lignificación es tan elevado que el agua encuentra una gran resistencia. Así, la zona de máxima absorción es la inmediata superior a la zona meristemática. El agua entra inicialmente por la epidermis y el córtex de la raíz por vía apoplástica, transmembrana y/o simplástica,atravesando el córtex hasta llegar a la endodermis, donde el agua es transportada por vía apoplástica hasta encontrarse con la banda de Caspari. Esta banda consiste en un conjunto de células suberizadas que impide el paso del agua. El agua tiene que entrar en las células para seguir por vía simplástica hasta alcanzar el xilema. Transporte de agua a largas distancias vía xilema. 21

Una vez que el agua llega al xilema es transportada verticalmente hacia las hojas. Si se corta un tallo de una planta herbácea, es frecuente la exudación de líquido por la superficie del corte, en un fenómeno llamado presión radical. A veces, en algunas plantas se puede observar, sobre todo en días calurosos gotas de líquido en los márgenes de las hojas (en estructuras llamadas ​hidátodo​s). Este fenómeno se denomina ​gutación y es provocado por la presión radical. El origen de estas fuerzas está en el transporte de iones desde el parénquima acompañante del xilema al interior del mismo, disminuyendo así su potencial osmótico. Aunque una presión radical de 0.1 MPa, podría ascender al agua a 10 m, la presión radical no se ha demostrado en ​ todas las especies y es circadiana y estacional. El diferencial de presión hidrostática necesario para transportar agua a una altura de 100 metros es de unos 3MPa, teniendo en cuenta el diferencial de presión debido a la gravedad, por lo que la presión radical no puede explicar esta ascensión del agua en las plantas. Las tráqueas y traqueidas que constituyen el xilema, son células muertas muy delgadas, con perforaciones laterales que permiten el contacto entre ellas formando largos capilares que hacen del xilema la vía que ofrece menor resistencia al transporte de agua.

Teoría de la tensión-cohesión A diferencia de los animales, el transporte de agua en las plantas es pasivo, sin consumo de energía, y aunque sería más fácil de explicar en especies de porte 22

pequeño, el sistema de transporte vertical de agua hacia la copa de los árboles es muy controvertido. La teoría más aceptada en la actualidad es la de la tensión-cohesión. Según esta teoría el diferencial de presión hidrostática entre el agua de las hojas y de la raíz es la fuerza motriz para transportar el agua verticalmente. Los espacios aéreos intercelulares del parénquima del mesófilo foliar está prácticamente al 100% de humedad; el p es de -14.2 MPa, la temperatura del agua en el aire, entre 20​o​C y 90% de humedad relativa, Este diferencial de presión es suficiente para succionar el agua de la raíz a las hojas, por lo que la atmósfera, siempre se encuentra menos húmeda, “tirará” del agua (transpiración). La elevada fuerza de cohesión del agua hace que ésta se comporte como una columna homogénea. Esta fuerte succión puede producir roturas de la columna de agua induciendo “embolias”(burbujas de aire). La estructura de las tráqueas y traqueidas dificulta la formación de las cavidades. El aumento de la presión radicular, al disminuir la transpiración, podría ayudar a expulsar el aire y eliminar algunas de las embolias.

Movimiento del agua en las hojas En las hojas, el sistema vascular se ramifica por todo el limbo, las célula se encuentra aproximadamente a dos o tres células vecinas de distancia de un elemento xilemático. Esto permite que en ellas, las fibras de celulosa y pectinas de las paredes celulares, que pierden agua por transpiración, ejerzan una fuerza de atracción vía xilema. Las paredes celulares del mesófilo forman una red de espacios aéreos en contacto con la atmósfera facilitando el movimiento del agua. El vapor en estos espacios difunde 23

mucho más rápido que en estado líquido, por lo que en el mesófilo el movimiento célula-célula es fundamentalmente a través de difusión intracelular.

Procedimiento: Riegue una de las plantas de tomate con 100 ml de agua destilada y la otra con una solución de un fertilizante foliar 20-20-20 (2 g / L de agua), utilice 100ml de esta solución. Corte el tallo a tres cm del suelo. Espere 10 minutos para eliminar la acción de la corriente transpiratoria original. Coloque sobre cada muñón un tubo de goma del diámetro del tallo y amárrelo. Introduzca en el tubo de goma dos gotas de azul de metileno. Conecte el tubo capilar con la manguera de goma, amarre bien. Para mantener el tubo capilar en posición vertical, sujételo con una pinza para bureta. Cada 15 minutos mida la distancia recorrida por la solución en el tubo capilar hasta completar 50 minutos. Vuelva a medir a las 2, 24 y 48 horas de efectuado el experimento. Resultados -Anote las distancias recorridas por la solución en el tubo capilar.

24

Cuadro 1. Distancia recorrida en el capilar Tiempo (minutos)

Control

Distancia (cm)

Presión desarrollad a

Solución salina

15

30 60 75 90 120 24 h La presión manométrica (P) se mide con un dispositivo llamado manómetro de tubo abierto. En un tubo abierto cargado de agua conectado a la raíz, la presión ejercida por la raíz se calcula con base en la siguiente ecuación: P= pgh, donde p es la densidad del agua pura (kg m​-3​), g es la fuerza de la gravedad (9,80 ms​-2 ​al nivel del mar), y h es la altura de la columna de agua (metros). Heredia está aproximadamente a 1300 msnm.

1 m³ : 1000000 ml 1Kg :1000g 1m : 1000mm 25

26

Práctica 4. Conductividad hidráulica en tallos leñosos de café ​Coffea arábica Introducción La conductividad hidráulica ​de una porción del tejido (madera de tallo, raíces y hojas.) es una medida de su capacidad de conducir agua. Esta propiedad está ligada a la capacidad de la planta de abastecer de agua a los tejidos fotosintéticos, por lo que tiene relación directa con la posibilidad de mantener los estomas abiertos y fijar carbono (Hubbard ​et al.​ 2001). En especies leñosas, en las que el agua se conduce por una red de elementos de conducción, la resistencia de los tejidos al transporte de agua constituye un elemento clave para comprender su comportamiento productivo y ecológico frente a distintas condiciones ambientales. Es por ello que la medición de las variables relacionadas con la conductividad hidráulica de una planta o de sus distintos órganos, se ha difundido ampliamente en los estudios de especies leñosas, lo que se ve facilitado por la sencillez y bajo costo de sus mediciones. La Conductancia hidráulica (K) es una variable que cuantifica la capacidad de conducción de agua de un segmento o más comúnmente, de una planta entera, sin considerar sus dimensiones. En este término influyen las conductividades hidráulicas de todos los componentes de la planta, desde las raíces hasta las hojas, las que determinan una conductancia total. La conductividad hidráulica puede medirse mediante un conductímetro sencillo que mide una muestra por vez, el cual se construye colocando una pipeta graduada a cierta altura por encima del tallo a medir, y se conectan a ambos 27

con una manguera (figura1). Se introduce agua en el sistema con una jeringa hasta que esté lleno el sistema, luego se cierra la válvula, y se deja el agua circulando por diferencia de presión desde la pipeta hacia afuera, atravesando el tallo. Por último se establece un tiempo determinado o bien se fija un volumen de agua, para determinar la cantidad de agua que pasó por la pipeta en ese tiempo, o cuánto tiempo transcurrió para pasar por la pipeta el volumen de agua determinado. Materiales y métodos Cortar con una tijera para podar una ramita terminal de 15,0 cm de largo, de 0,7 a 1,5 cm de grosor con las hojas incluidas y colocar en un balde con agua, verificar que no tenga hojas en el segmento que se va a usar. Seguidamente se corta de nuevo el tallo de un tamaño mayor de las secciones que se va a usar bajo el agua. Una vez en el laboratorio se cortan secciones de aproximadamente 12 cm de largo (Lr). Luego limpie los cortes con una navaja afilada y mida la longitud final de la sección. Ahora introduzca el tallo de café en dirección a la conducción del agua en el sistema de mangueras. Trate de eliminar todas la burbujas que se forman en las mangueras, intente ahora llenar con agua el extremo de manguera pegado a la parte distal del tallo con una pizeta. Por último introduzca una pipeta de 1,0 ml . Espere a que el menisco de agua se encuentre cerca del 0,0 ml ahora cuente el tiempo (en segundos) necesarios para que menisco recorra una distancia en la pipeta. (2 ml tres veces) Proceda a medir la longitud de la Hoja (Lh) y el ancho (w, por la parte más ancha) de todas las hojas de la rama: 28

determine el área foliar ( AF en M2) con la ecuación Σ(2/3 Lhx W) para láminas foliares lanceoladas Luego proceda a calcular Kh para la ramita medida con la siguiente fórmula: Kh = Flujo x Lr/ P. También calcule la conductividad especifica foliar (KAF= KH/AF Flujo: V/t(m³/s)

1c​m³​ : 0.00000 1​ m³ 1m³ :1000000 cm³ 1m : 1000mm

29

Figura 1. conductímetro ​Laboratorio de Fisiología de los Cultivos Agrícolas

Práctica 5. Efecto de la luz en la germinación de semillas de

lechuga y establecimiento de almácigos hidropónicos Introducción El estudio del efecto de la luz sobre la germinación es de interés para los fisiólogos y los ecofisiólogos. La fotoinducción o fotoinhibición de la germinación es uno de los casos más claros del control de un proceso fisiológico por un factor ambiental. Se desconoce el número de especies de plantas superiores que presentan semillas fotoblásticas (germinación regulada por la luz), debido a que la fisiología de las semillas de la gran mayoría de las plantas no ha sido investigada; sin embargo, existen evidencias que 30

indican que el porcentaje de especies con semillas fotoblásticas es particularmente alto entre las plantas anuales. Las tres principales bandas del espectro lumínico que tienen acción sobre la germinación, corresponden a la franja de 660 nanómetros (rojo), 730 nanómetros (rojo lejano) y la luz comprendida entre 400 y 500 nanómetros (azul), aunque con efectos mucho menos claros. Tanto el rojo como el rojo lejano son absorbidos por un compuesto denominado fitocromo, que es una cromoproteína que actúa como sensor. Este pigmento en su forma activa es inductor de la germinación e interviene en procesos de permeabilidad, activación de enzimas y expresión genética. La conversión del fitocromo inactivo (P​r​) a fitocromo activo (P​fr​) por lo general, se lleva a cabo con el efecto de la luz roja, y la reacción opuesta ocurre bajo el efecto del rojo lejano. Estas dos formas del fitocromo corresponden a cada uno de sus picos de absorción de luz. Esta reacción de conversión en ambos sentidos está relacionada con la inducción y la inhibición de la germinación, y puede ser modificada o controlada por otros factores ambientales como la temperatura o el termo periodo. La intensidad de la luz, el fotoperiodo y la cantidad de rojo en relación con el rojo lejano presente (denominada relación R: RL) modulan la respuesta de las semillas a la luz a través de este pigmento. La cantidad de fitocromo activo presente en una semilla en el momento de su liberación determina la capacidad para germinar en la oscuridad o su necesidad de luz para iniciar el proceso. Existe una gran variedad de respuestas en la germinación de las semillas con respecto a la luz. Entre las plantas cultivadas se ha visto que no requieren luz para germinar, pues lo hacen de igual manera en la luz que en la 31

oscuridad. En cambio, muchas semillas silvestres tienen comportamientos diferenciales con respecto a la luz. Existen aquellas que sólo germinan en la oscuridad, las que sólo germinan bajo luz continua, otras que requieren de unos periodos breves de iluminación y otras más que son indiferentes a la presencia de luz u oscuridad para germinar. Algunas semillas sólo requieren luz para germinar cuando están recién colectadas, mientras que en otras este efecto persiste hasta por un año y existen aquellas que requieren más tiempo. Por lo tanto, se deduce que la edad de la semilla también es determinante. La sensibilidad a la luz en semillas de muchas especies, aumenta con relación al tiempo de imbibición. El almacenaje de semillas bajo condiciones de humedad relativa alta es suficiente para hacerlas sensibles a la luz. Las primeras investigaciones que analizaron con detalle el efecto de la luz en la germinación se llevaron a cabo con semillas de lechuga. Demostraron que dentro del espectro de luz había tres regiones que afectan la germinación y la latencia: a) el azul, alrededor de los 450 nm, b) el rojo, alrededor de los 650 nm y c) el rojo lejano, alrededor de los 750 nm . Se encontró ​que la luz roja ​rompe la latencia y promueve la germinación​, mientras que la ​luz azul y la roja lejana la inhiben​. También influye la alternancia de luz provocando una reversión de la estimulación y la inhibición de la germinación. La germinación de las semillas de lechuga es estimulada por la luz roja pero puede inhibirse si posteriormente se iluminan con luz infrarroja. Si más tarde se iluminan con luz roja se vuelve a inducir la germinación. La luz roja estimula la germinación y la luz infrarroja la inhibe. La naturaleza de la última iluminación será la que determine la respuesta germinativa. 32

Es importante mencionar que factores tanto internos como externos modifican la respuesta de las semillas a la luz. La presión osmótica, la presencia de promotores o inhibidores del crecimiento, la tensión de O2, entre otros factores, pueden cambiar la duración e intensidad de luz requerida para obtener alguna respuesta. De tal forma, que todos los factores internos y externos que afectan la germinación, interactúan de alguna manera. Por lo tanto, en muchas ocasiones la latencia de una especie puede romperse por la acción de diversos factores y no sólo por uno. Por ejemplo, la latencia de ​Nicotiana tabacum se rompe por la luz o por la alternancia de temperaturas. Esta diversidad de posibilidades hace que la semilla tenga más oportunidades de germinar en un ambiente heterogéneo y cambiante

Efecto de la luz sobre la germinación de semillas de lechuga

La germinación de las semillas inicia a partir de la entrada de agua, lo cual desencadena una serie de procesos metabólicos que llevan posteriormente a la aparición de la radícula. Este acontecimiento puede ser afectado por muchos factores, uno de ellos es la luz. Algunas semillas requieren de oscuridad para ello y otras por el contrario necesitan la presencia de ésta para que ocurra. También, la calidad de la luz o su longitud de onda, son factores que

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lo afectan. Es por eso que interesa evaluar el efecto de estos factores sobre dicho proceso.

I- Procedimiento para evaluar calidad de la luz​: -

Tome 6 platos de Petri y coloque en cada uno un papel filtro

-

Humedezca el papel con ayuda de una piseta y escurra el exceso de agua

-

Cuente 6 repeticiones de 50 semillas de lechuga y colóquelas en forma ordenada sobre el papel filtro Cierre los platos de Petri

-

Efectúe los siguientes tratamientos:

-

•

Plato envuelto con dos capas de papel celofán azul.

•

Plato envuelto con dos capas de papel celofán verde.

•

Plato envuelto con dos capas de papel celofán amarillo.

•

Plato envuelto con dos capas de papel celofán rojo.

•

Plato envuelto con dos capas de papel aluminio (testigo en oscuridad).

•

Plato envuelto con dos capas de papel celofán transparente (testigo en presencia de luz).

Rotule cada plato.

34

-

Colóquelos en la mesa con luz directa, a una temperatura cercana a 20º C.

-

Verifique diariamente que el papel filtro tenga una humedad adecuada, para evitar la desecación de las semillas.

Evaluaciones: -

2 y 5 días después de iniciada la prueba, efectúe las siguientes mediciones:

Porcentaje de germinación en cada plato (Cuadro 1) Longitud de la parte aérea de 15 plántulas seleccionadas al azar en cada plato (Cuadro 1)

Cuadro 1. Efecto de la luz sobre la germinación de semillas de lechuga Tratamiento

Azul

Verde

Amarillo

% de germinación

35

Rojo

Testigo oscuridad

Testigo luz

Longitud promedio (mm) Desviación estándar de la longitud

Cuestionario -

Discuta el efecto causado por cada tratamiento.

-

Comente los resultados con base en literatura.

Discuta qué tipo de reposo presenta la especie estudiada. II- Procedimiento para evaluar efecto de la luz y de la oscuridad. a- Tome semillas de lechuga y de otras especies y al igual que en la parte anterior, colóquelas en platos de Petri con papel húmedo. b- Deje

un

grupo

de

platos

expuestos

permanentemente a la luz. Un segundo grupo cúbralos con una bolsa negra o colóquelos dentro de una caja que no le entre luz. Un tercer grupo déjelo en alternancia de luz y oscuridad.

36

Diariamente o según se considere conveniente, proceda a evaluar el porcentaje de germinación y a medir la longitud de plántula Almácigos hidropónicos La utilización de los semilleros se justifica en los casos de semillas muy pequeñas, de baja germinación y lento crecimiento. Las plantas de los almácigos hidropónicos bajo invernadero crecen más vigorosas, sanas y uniformes. Importancia de la calidad del almácigo Para tener éxito en los cultivos, se requiere un almácigo de calidad, de ello depende la sanidad, el desarrollo y producción futura del cultivo. Algunas características de las plantas que indican calidad son las siguientes: Sanidad, buen desarrollo de raíces, crecimiento uniforme, compacto y controlado, plantas fuertes y duras, tallo grueso, buen color y vigor. Prueba de germinación Se aplica a semillas que han permanecido mucho tiempo almacenadas, semillas reempacadas y semillas que se ha sacado de su recipiente original. Esta actividad es un factor de seguridad al garantizarnos una buena germinación y vigor, antes de llevar

a cabo el establecimiento de los

almácigos que implica invertir tiempo y dinero. La prueba de germinación requiere los siguientes pasos:

37

1-desinfectar cajas petri con cloro al 1 % (10ml/L) y luego se lavan 2-colocar en el interior del plato dos servilletas 3-humedecer las servilletas y escurrir el exceso de agua 4- seleccionar y colocar las semillas ordenadas sobre el papel ( 25,50 , 100 semillas) 5- tapar con plástico adhesivo para mantener humedad 6-rotular caja con la siguiente información: nombre del cultivo, variedad, fecha y cantidad de semillas colocadas 6- ubicar platos en lugar protegido de la luz del sol y contaminantes 7- 8-

revisar

todos

los

días

la

humedad. Cálculo del porcentaje de germinación Una vez terminado el periodo de germinación, se procede al conteo de las semillas germinadas y se calcula el % de germinación de acuerdo con la siguiente fórmula:

Nº de semillas germinadas ---------------------------------

x 100

Nº de semillas al inicio

38

La prueba de germinación para semillas de hortalizas se juzga de acuerdo con los siguientes criterios: -semilla óptima (85-100% de germinación): tiene una alta viabilidad y es adecuada para sembrar. -semilla regular (60-84%): se debe sembrar más semilla para compensar la baja germinación -semilla de mala calidad (menos del 59 % de germinación): no se acepta para la siembra Preparación del sustrato para el almacigo​: Debe ser liviano y con características físicas para un adecuado desarrollo de las plantas. Para cumplir con estas características se combinan materiales que provean drenajes con otros que mejoren retención de humedad y capilaridad. Para la preparación del sustrato se hace de la siguiente forma: 1-seleccionar el tamaño de la partícula adecuado​: para ello se utiliza una zaranda de un tamaño de orificio no mayor de 3 milímetros. 2-Mezcla : debe ser lo más homogénea y en las proporciones adecuadas , ejemplo piedra pómez ( carbón vegetal, cascarilla de arroz o arena con fibra de coco molida en una proporción de 1: 1 2-humedecer sustrato​: para determinar la humedad adecuada se recomienda llevar a cabo prueba del tacto, consiste en tomar un puño de sustrato presionando un 39

poco. Al abrir la mano la muestra debe guardar la forma del puño y la palma de la mano debe estar húmeda

Desinfección del sustrato​: Los métodos naturales son más fáciles de aplicar y evitan contaminación ambiental, entre estos métodos tenemos los siguientes: Vapor de agua a 80 ºC, agua hirviendo o solarización

Recipientes usados Para escoger el recipiente se tiene en cuenta las dimensiones, el costo, el material con que está construida, durabilidad, peso y facilidad de manipulación. El número de huecos varía para algunas hortalizas como lechuga, repollo, coliflor y brócoli es de 288, 200 y 162 celdas Preparación del Almacigo 1-Desinfectar la bandeja​: cuando han sido usadas se recomienda desinfectar en una lejía de cloro 40 mililitros /l de agua 2​-Humedecer el sustrato​: se hace prueba de tacto para asegurarse que tenga una adecuada humedad, si está seco se humedece antes de colocarlo en la bandeja 40

3-Llenado del recipiente​: se coloca el sustrato y se compacta golpeándolo suavemente sobre la mesa, luego se rellena, se nivela raspando el sustrato con una regla fina ​4-Huequeado​: El hueco se hace en el centro de cada celda a una profundidad uniforme, que varía de 0,5 a o.75cm para la mayoría de cultivos. En semillas muy pequeñas, por ejemplo el apio o tabaco la siembra de las semillas es superficial 5- siembra​: las manos deben estar desinfectadas, limpias y secas. Si la viabilidad de semillas es buena se coloca una semilla por hueco. ​6-Tapado​: se hace con el mismo sustrato sin presionar 7- Pregerminación​: los recipientes con las semillas se colocan en un lugar protegido de la luz y el viento, para mantener la humedad homogénea 8-la duración de la pregerminación depende del cultivo: una vez que germinan las primeras semillas se sacan los recipientes del germinador y se colocan en el área donde se va a desarrollar el almacigo 9- Etiquetado​: anote con lápiz la variedad y la fecha de siembra

41

Práctica 6. Cultivo de tomate (​Lycopersum esculentum​) en solución nutritiva y elemento faltante Introducción Las sustancias minerales tienen muchas funciones en las plantas. Entre las más importantes se encuentran las siguientes: constituyentes de los tejidos, catalizadores en varias reacciones, reguladores osmóticos, componentes de sistemas de amortiguación y reguladores de la permeabilidad de las membranas. Algunos ejemplos de minerales que contienen las plantas: son el calcio en las paredes celulares, el magnesio en la molécula de clorofila, el azufre en ciertas proteínas y el fósforo en los fosfolípidos y nucleoproteínas. Aunque el nitrógeno no es un elemento mineral, su importancia como constituyente proteico debe ser reconocida. Varios elementos (incluido hierro, zinc y cobre), aunque son requeridos en muy bajas cantidades, son esenciales debido a que constituyen grupos prostéticos o coenzimas en ciertos sistemas enzimáticos. Otros minerales, como el manganeso y el magnesio funcionan como activadores o inhibidores de enzimas. Se entiende por cultivo en soluciones nutritivas el que se efectúa en una disolución de composición química definida y no en el suelo. La enorme capacidad de este sistema de producción se conoce desde 1929, y a partir de ese momento se inicia su utilización comercial. La hidroponía funda sus bases en la teoría de que todos los factores para el crecimiento suplidos naturalmente por el suelo pueden ser proporcionados artificialmente mediante el uso de agua, oxígeno y sales minerales. Este método permitió comprender mejor la función que desempeñan los diferentes elementos minerales en el desarrollo y crecimiento de la planta.

En el siglo XIX se realizó una actividad intensa en el campo del crecimiento de plantas en soluciones nutritivas. Investigadores como Sachs, Boussingault y Knop, realizaron experimentos que ayudaron a determinar la 42

importancia en el crecimiento de las plantas. Knop en 1865 (Cuadro 1), publicó los resultados del efecto de la composición nutritiva sobre el crecimiento e inventó la fórmula de una solución nutritiva simple, basada en relaciones moleculares, que ha sido el punto de partida para modificaciones posteriores por otros autores. Se puso énfasis en mejorar la presión osmótica de la solución, el balance de los elementos, pero manteniendo una composición simple. Cuadro 1. Solución nutritiva de Knop

Las primeras formulaciones propuestas, se prepararon con sales impuras, contaminadas con trazas de otras sales. Desde que se demostró que un elemento como el hierro, se requería en pequeñas cantidades, se pensó que otros elementos debían ser esenciales en cantidades muy pequeñas. Se encontró que mientras se suministraban sales más puras, el crecimiento de las plantas era más pobre, esto explica los resultados obtenidos al comienzo con la solución de Knop. Arnon y Hoagland. En (1940), propusieron una solución nutritiva que ha sido ampliamente aceptada, para la cual basaron su composición elemental en las proporciones absorbidas por plantas de tomate, incluyendo también los micronutrientes. 43

En el crecimiento y reproducción normal de la mayoría de plantas se necesitan de 16 elementos esenciales (3 no minerales y 13 minerales). Un elemento es esencial si: 1. la planta no puede completar su ciclo de vida en su ausencia (no forma semillas viables). 2. Forma parte de cualquier molécula o constituyente que es a la vez esencial en las plantas (por ejemplo N en proteínas y Mg en clorofila). 3. Su acción debe ser específica e irremplazable por otro elemento. Las tres reglas anteriores pueden resumirse diciendo que: ​Un elemento es esencial si la planta lo requiere para su desarrollo normal y que pueda completar su ciclo de vida. Los elementos minerales se han clasificado de acuerdo con la cantidad en que los absorben las plantas de la siguiente forma: •

•

•

Macronutrientes o elementos mayores: las plantas los requieren en cantidades más altas y dentro de éstos están los primarios: nitrógeno (N), fósforo (P) y potasio (K) e intermedio o secundarios: azufre (S), calcio (Ca) y magnesio (Mg). Micronutrientes o elementos menores: las plantas los requieren en cantidades muy pequeñas, incluyen el cobre (Cu), manganeso (Mn), zinc (Zn), hierro (Fe), boro (B), molibdeno (Mo) y cloro (Cl). No indispensables: cobalto (Co), silicio (Si), vanadio (V), selenio (Se) y sodio (Na). 44

En el caso de la hidroponía 13 de ellos son aportados en solución nutritiva mientras que el carbono (C), hidrógeno (H) y oxígeno (O) son obtenidos del aire y agua (macroelementos). El Ni puede incluirse como un elemento esencial (microelemento) debido a que Brown (1967) ha demostrado su esencialidad para el crecimiento de la cebada. El níquel ejerce efectos beneficiosos en el crecimiento del tomate, avena, trigo; así como en algunas algas. La esencialidad del níquel (Ni​2+​) está asociada a la enzima ureasa, que cataliza la hidrólisis de la urea, produciendo CO​2​ y NH​4​. Como se mencionó antes, los elementos se agrupan de acuerdo con la cantidad requerida por las plantas en: macronutrientes, que pueden tener efectos estructurales, catalíticos y electroquímicos (H, C, O, N, K, Ca, Mg, P,S) y micronutrientes que actúan en cantidades mínimas, básicamente como catalizadores de distintos procesos (Cl, Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo ). El C, H y O se incorporan a la planta por las hojas; el resto es tomado por el suelo (en algunas especies el N se obtiene de atmósfera por fijación simbiótica). En 1860 tres fisiólogos alemanes (Pfeffer, Julius Von Sachs y Knop) reconocieron la dificultad de determinar los tipos y cantidades de elementos esenciales para el crecimiento vegetal en un medio complejo como el suelo. De allí que establecieron el cultivo de plantas con la raíz inmersa en una solución de sales minerales, con una composición química controlada y limitada únicamente por el grado de pureza en ese momento. Mediante el progreso de las técnicas de purificación de sales y agua, el método fue más exacto hasta convertirse en el preferido para los estudios de nutrición mineral. La forma descrita anteriormente para el cultivo de plantas se conoce como cultivo hidropónico o cultivo en solución nutritiva. 45

Entre las ventajas que presenta el cultivo hidropónico se encuentran: a-no está influenciado por ningún material sólido de soporte b- las condiciones son conocidas con exactitud y c- reproducibles en el cultivo de las plantas. Presenta desventajas como la necesidad de aireación de raíces, debido a la sensibilidad de muchas plantas a la baja tensión de oxígeno; cambios en composición química de la solución (unos iones son absorbidos más rápidos que otros y los cambios en el pH de la solución por la absorción selectiva de iones. Debido a esto, en la producción a escala comercial de plantas mediante este método, se recomienda ajustar el pH y la concentración de la solución periódicamente. Para establecer la necesidad de determinados elementos nutritivos en una especie en particular se debe observar primero si la deficiencia de alguno de estos en el medio de nutrición tiene algún efecto en su crecimiento y desarrollo. Cuando se inducen deficiencias, uno de los mayores problemas consiste en mantener en equilibrio las soluciones nutritivas, de lo contrario, se provocarían cambios en la planta, causados no solo por la deficiencia, sino por las modificaciones adicionales del medio (concentración iónica y pH, entre otros).. La determinación de los síntomas de deficiencia no brinda en todos los casos respuestas satisfactorias, debido a que la función del elemento deficiente depende del intercambio de sustancias dentro de la planta. Para eso son necesarios otros experimentos. Cuando se presentan síntomas agudos de deficiencia, es importante conocer si el elemento se recicla de hojas viejas a las jóvenes o puntos de crecimiento. Si un elemento es inmóvil la deficiencia aparece primero en 46

hojas jóvenes, mientras que si es móvil en el interior de la planta la deficiencia se observa en hojas viejas (Cuadro 2.).

Cuadro 2. Clasificación de los elementos minerales según su movilidad en el interior de la planta y su tendencia a ser re-translocado durante la deficiencia. Móvil

Inmóvil

Nitrógeno Potasio Magnesio Fósforo Cloro Sodio Zinc Molibdeno

Calcio Azufre Hierro Boro Cobre

Objetivo Estudiar el efecto de los elementos esenciales en el crecimiento de las plantas, mediante el método de cultivo de soluciones y analizar las deficiencias de algunos macro y micronutrientes a través del elemento faltante. Procedimiento Preparación de soluciones madres: ​La solución nutritiva que se utilizará será la solución Hogland y se preparará de acuerdo con la información del cuadro 3, para luego 47

obtener las diferentes fórmulas nutritivas (completa y con alguno de los elementos faltantes). Se debe llenar cada recipiente con agua destilada hasta la mitad y agregar de las soluciones madres las cantidades adecuadas para cada tratamiento (las cantidades de solución a agregar están dadas para un litro). Utilizar pipetas diferentes para cada solución. Aforar la solución. Seleccionar plantas de tamaño similar. Colocar una planta por envase de cultivo a través del orificio de la tapa (la cual se elaborará con estereofón). Observar dos o tres veces por semana durante 4 semanas. Rellenar el envase con la solución nutritiva correspondiente, cuando disminuya de volumen, para asegurar que las raíces estén sumergidas. Medir el pH de la solución final. Realizar observaciones y mediciones de acuerdo con el Cuadro 5. Cuadro 3. Soluciones madre Símbol o A

Compuesto

Concentració n 1Molar

PM

Cantidad (gramos/litro) PM x Mol x V= g; 236,15x1x0,25litr :59g/250ml 25,27g/250ml

B

(CaNO​3​)​2​*4H​2 O KNO​3

1Molar

236.1 5 101.1

C

MgSO​4​*7H​2​O

1Molar

246.5

61,6g/250ml

D

KH​4​PO​4

1Molar

136

34g/250ml

E

Quelato de Fe

F G

Micronutriente s NaNO​3

1Molar

84.99

21,3g/250ml

H

MgCl​2

1Molar

95.23

23,8g/250ml

I

NaSO​4

1Molar

35,5g1/250ml

J

NaH​2​PO​4​*H​2​O

1Molar

K

CaCl​2

1Molar

L

KCl

1Molar

142.0 4 138.0 1 110.9 9 74.55

1 ml disuelto en 100ml de H​2​O

48

34,5g/250ml 27,74g/250ml 18,64g/250 ml

Cuadro 4. Preparación de las soluciones nutritivas Soluciones nutritivas Completa Sin N Sin P Sin K Sin Ca Sin S Sin Mg Sin Fe Sin microelementos

Cantidad de cada solución madre (ml) para preparar 800 ml de solución nutritiva A B C D E F G H I J K L 5 5 2 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 1 1 0 0 0 0 5 5 5 5 2 0 1 1 0 0 0 0 0 1 5 0 2 0 1 0 5 0 0 1 0 0 0 5 2 1 1 1 5 0 0 0 0 0 5 5 0 1 1 1 0 2 0 0 0 0 5 5 0 1 1 1 0 0 2 0 0 0 5 5 2 1 0 1 0 0 0 0 0 0 5 5 2 1 1 0 0 0 0 0 0 0

Micronutrientes:​ en balón aforado de 100 ml 50 ml de agua + 0.286 H​3​BO​3 + 0.181 g de MnCl​2​*4H​2​O + 0,022 g de ZnSO​4​*7H​2​O + 0.008 g de CuSO​4​*5H​2​O (PM 249.7) + 0.002 g de Na​2​MoO​4​*2H​2​O . Reactivos sustitutos para preparar las soluciones madre: KH​2​PO​4​ (PM 136.1) CaCl​2​*2H​2​O (PM 147) Na​2​HPO​4​ (PM 142) MgCl​2​*6H​2​O (PM 203.31)

Resultados •

Estudie las plantas cuidadosamente y anote cualquier cambio de aspecto en el sistema radical, coloración del tallo y de hojas. 49

•

•

•

•

Anote los cambios que ocurren en hojas nuevas y viejas, en toda su superficie o sólo en un sector (ápice o base), si es entre las nervaduras o a lo largo de los bordes. Mida la altura de las plantas semanalmente y construya un gráfico altura (cm) vs tiempo (semanas). Haga lo mismo con la longitud de la raíz. Determine los momentos de inicio de floración y fructificación en cada uno de los tratamientos (días a la floración). Al finalizar el experimento separe vástago de raíces y lave éstas con agua destilada. Si hay algas o muchas impurezas lave las raíces con HCl al 1% y después con agua destilada. Seque todo con papel absorbente. Separe las hojas del vástago. Tome el peso fresco de cada una de las tres secciones, coloque las raíces hojas y tallos separadamente en bolsas de papel marcadas y ponga a secar a 70º C durante 48h para, una vez fríos, tomar el peso seco. Anote sus resultados en el cuadro 6.

Cuadro 5. Evaluaciones semanales de diversos parámetros de plantas con diferentes deficiencias nutricionales. Tratamiento

Longitu d tallo (cm)

Long itud raíz (cm)

Longit ud hojas (cm)

Completa Sin N Sin P Sin K Sin Ca Sin S Sin Mg

50

p H

Colo r hoja s

Númer o de flores

Númer o de frutos

Sin Fe Sin microeleme ntos

Cuadro 6. Crecimiento de plantas de tomate, en diversas condiciones de disponibilidad de sales, a las 4 semanas. Tratamiento

Largo total (cm) raíces vástag o

Peso fresco (mg) raíce vástag s o

Peso seco (mg) raíce vástag s o

Completa Sin N Sin P Sin K Sin Ca Sin S Sin Mg Sin Fe Sin microelement os

Cuestionario 1. ¿Explique los síntomas de deficiencia de N, P, K y Fe. ¿Cuál es la función de estos nutrimentos en las plantas? 2. ¿Cuáles son las razones fisiológicas para que cada deficiencia se manifieste de la forma en que lo hizo? 51

3. Relacione los procesos fisiológicos involucrados en el desarrollo de la planta. 4. ¿Qué es un fertilizante? ¿Qué ventajas tiene su aplicación sobre en el suelo? 5. Señale y explique qué papel juega la materia orgánica en la disponibilidad de nutrimentos en el suelo. 6. ¿Qué elemento mineral del suelo es absorbido en mayor cantidad por las plantas?

Práctica 7: ​Cultivos Hidropónico Introducción A pesar de que la hidroponía es una práctica muy antigua con antecedentes como los Jardines Colgantes de Babilonia ( siglo VI a.d.C.), los Jardines Flotantes de China, los Jardines Flotantes de los Aztecas, llamados chinampas, fue hasta los años treinta en que se le llamó a este sistema hidroponía, derivada de los vocablos griegos Hidro​ (agua) y ​Ponos​ (labor o trabajo). Definición: la hidroponía es una ciencia para cultivar las plantas sin tierra, en donde las raíces reciben una solución nutritiva equilibrada disuelta en agua y todos los alimentos esenciales para el desarrollo de la planta. Entre los años 60 y 70 la investigación en horticultura se enfocó en buscar nuevas alternativas (sustratos), como respuesta a la problemática de los suelos (problemas de nutrición, de agua y el aumento de la resistencia de las plagas y enfermedades). Actualmente representa una solución a la creciente disminución de las zonas agrícolas producto de la contaminación, la desertificación, el cambio 52

climático y el crecimiento desproporcionado de las ciudades y áreas urbanas. Es una técnica de producción rápida, limpia, sencilla, de bajo costo y en armonía con el ambiente. El sistema hidropónico tiene los siguientes componentes: sustrato y nutrientes Sustratos El sustrato no cumple la función de reservorio de nutrientes, sus funciones son de retención de humedad, facilitar la buena aireación y drenaje, servir de medio de anclaje para las plantas y proteger las raíces de la luz del sol. Para ello deber cumplir con las siguientes características: estable físicamente, ser un medio sólido, inerte, proveer buena capilaridad, liviano, de bajo costo y fácil acceso. Los más usados son granza de arroz, arena, carbón, fibra de coco, piedra de río, piedra volcánica, piedra pómez, aserrín, ladrillo, estereofón, vermiculita, perlita, lana de roca y peat moss. El sustrato o la combinación de ellos que depende de factores como: la disponibilidad, la planta a sembrar, el recipiente o sistema en que se va a sembrar, el clima, las plagas, entre otros. Nutrientes La solución de nutrientes consiste en los elementos que requiere la planta para crecer y reproducirse. Ventaja: la planta no sufre de excesos ni deficiencias, así crecen mejor y más rápido, lo que resulta en una mayor producción con respecto a plantas cultivadas en tierra. La solución nutritiva está compuesta por 15 elementos: 53

• • •

• •

elementos mayores: nitrógeno (N), fósforo (P) y potasio (K). elementos que la planta requiere en cantidades medianas: azufre (S), calcio (Ca), magnesio (Mg). elementos menores: hierro (Fe), zinc (Zn), manganeso (Mn), boro (B), cobre (Cu), molibdeno (Mo). otros elementos útiles pero no indispensables: cloro (Cl), sodio (Na) y silicio (Si). Los otros tres indispensables para las plantas son absorbidos por medio del aire y el agua: carbón (C), hidrógeno (H) y oxígeno (O).

Existen fórmulas estándar, sin embargo, algunos proponen hacer ajustes de acuerdo con la especie cultivada, el sistema utilizado, la edad de la planta y si está en producción o crecimiento. Otros factores importantes a tomar en cuenta son: la calidad del agua, el pH, la temperatura, la salinidad o conductividad eléctrica (CE) y la aireación de las raíces. Normalmente la solución nutritiva está disponible como soluciones madre, que deben ser diluidas en agua para aplicarla a las plantas. Algunas que se utilizan comercialmente son las soluciones A, B y C. La solución A está compuesta por los elementos mayores y medianos (excepto calcio), la B por los elementos menores y la C por el calcio. Cada cultivo tiene cuidados y exigencias medioambientales y nutricionales propias o específicas, aunque la misma fórmula química, se puede aplicar a la mayoría de cultivos.

54

Sistemas Los sistemas hidropónicos se clasifican en dos grandes grupos: abiertos y cerrados Sistemas abiertos En estos sistemas los excesos de riego son desechados, es decir, salen del recipiente de cultivo a través de drenajes (Figura 1a y 1b). Ejemplos: 1) Camas o bancales 2) Columnas de bolsa plástica tubular o mangas 3) Tubos de PVC verticales u horizontales 4) Cultivos en macetas o en recipientes reutilizados para el cultivo (galones de leche, llantas, botellas de refresco, etc.)

55

Figura 1a. Sistema abierto camas o bancales

Figura 1 b. Sistema abierto bolsa tubular Sistemas cerrados

En estos sistemas, la solución nutritiva se recircula sin que exista pérdida o salida. Ejemplos: 1) NFT: Nutrient Film Technique (Técnica de la película de nutriente). Consiste en la circulación de una lámina fina de solución nutritiva que pasa a través de las raíces del cultivo (Figura 3 ). 2) Raíz flotante 3) Canales de PVC o bambú en escalera o planos 4) Macetas de plástico o estereofón en columnas

56

Figura 3. Sistema cerrado, técnica de película de nutrientes

Sistema de cultivo en raíz flotante​. Constituye el auténtico cultivo hidropónico, donde el medio de cultivo es el agua con nutrientes. Los recipientes usados en este sistema tienen una profundidad de 10-15 cm, las plantas están sostenidas sobre una lámina de estereofón que contienen perforaciones, permitiendo que las raíces queden sumergidas en la solución nutritiva. Las plantas que se cultivan en estas condiciones son las hortalizas de hojas, por ejemplo lechuga, apio y albahaca entre otros. Ventajas respecto con los sistemas de sustrato sólido 57

Disminuyen los costos de producción al no necesitar de sustrato, se aprovecha más eficientemente el agua y los nutrientes. No requiere de sistema de riego muy tecnificado que demanden mano de obra profesional y equipos costosos Desventajas Extremo cuidado con la calidad del agua, y el manejo de la solución nutritiva, por el peligro de contaminación con patógenos En sistemas comerciales se requiere de equipo costoso para el manejo riguroso de las propiedades químicas del agua (acidez y salinidad) La solución residual se puede convertir en fuente de contaminación de los acuíferos Etapas del cultivo Se desarrolla en tres etapa: -Almácigo -Primer transplante Segundo transplante Almácigo Se usan cajones y en su interior se agrega sustrato suelto con tamaño de partícula entre 0.5 a 2.0 milímetros, como sustrato se adiciona piedra pómez, piedra volcánica y piedrilla de río o arena

Siembra de la semilla Se siembra cada centímetro, en hileras espaciadas a 4-5 cm y a una profundidad de 0.5 cm. 58

También los almácigos se preparan en cubos de espuma, oasis, que permite individualizar las plántulas en pequeños cubos para trasplantarlas directamente. Primer transplante Se hacen en contenedores de 0.25 metros cuadrados, para facilitar la manipulación del almácigo en la lámina de estereofón de 0,5 pulgadas de grosor. El estereofón sirve de estructura de soporte a la planta. Procedimiento primer trasplante Marcar en la lámina de estereofón los puntos para siembra a 10x10cm en cuadrado, con 5 cm del borde. Perforar la lámina en los puntos de siembra marcados con tubo de hierro de 1,0 pulgada de diámetro Extraer las plántulas con cuidado, se lava el sustrato y se sumerge en una solución desinfectante La plántula se introduce en el hueco de la lámina, sujeta con un pedazo de esponja. Medir la capacidad del contenedor en litros de agua La solución nutritiva se prepara a partir de soluciones concentradas, se usa de 3.75, 2.0 y 3.75 mm /l , de A, B y C. Segundo transplante​. Entre los 10-15 días en lechuga y 30 días en apio después del primer transplante se pasan las plántulas a contenedores de mayor tamaño, a la distancia adecuada para la fase final (cuadro 1). Cuadro 1.Etapas del sistema de raíz flotante y su duración por cultivo

59

Cultivo

Almácigo

I transplante

Lechuga Apio

10-15 días 4 semanas

2 semanas 4 semanas

Transplante definitivo 3.5 a 4 semanas 8 semanas

Cuadro 2. Características de la lámina de estereofón de acuerdo con la etapa de cultivo

Cultiv o Lechu ga Apio

Lechu ga Apio

I TRANSPLANTE Diámetro hoyo(cm) 2

Distancia plantas(cm) 8-10

2 II TRANSPLANTE 3

8-10

Grosor lámina 0.5-1.0 pulgada 1 pulgada

de

17-20

1 pulgada

4

15 – 20

1-1.5 pulgadas

En esta práctica se usará el sistema de raíz flotante (Figura 4), el grupo del jueves trabajará con un contenedor (caja de estereofón) y trabajará con una distancia entre planta y planta 12 x 12 cm. y 5 cm de borde. El grupo del viernes usará otro contenedor sembrara una planta de lechuga por hueco a 15 x 15 cm con igual distancia entre borde . Variables 1- longitud total 2- número de hojas.

60

Las medidas se llevaran a cabo al inicio y mes y medio después de la siembra y se realizarán en 10 plantas por tratamiento.

Objetivo Adquirir los conocimientos prácticos de la hidroponía en raíz flotante para el cultivo de lechuga, con el fin de evaluar los efectos de factores nutricionales y sus interacciones.

Figura 4. Sistema cerrado raíz flotante

Sistemas abiertos Mangas colgantes

61

Son estructuras en forma de sacos de polietileno, los más usados corresponden a 1.0 metro de alto Las dimensiones de estos contenedores varían de 0.5 a 2.5 metros y de diámetro entre 20 a 30 centímetros Para el color se consideran las condiciones ambientales, en lugares soleados se recomiendan el color plata o blanco y negro en lugares fríos, se evita que sean transparentes para que no crezcan algas en su interior. Las algas compiten por luz, agua, oxígeno y nutrientes, alteran el pH de la solución nutritiva y en su descomposición aportan materia orgánica. Los sacos cuentan con perforaciones en su parte inferior para evitar los excesos de agua o de solución nutritiva. En relación con el sustrato se prefiere que sea liviano, con buena capilaridad para retener agua. Con partículas no mayor a 3 milímetros de diámetro. Algunas mezclas que dan buenos resultados en invierno son los siguientes: 6 partes de cascarillas de arroz con 4 partes de carbón, el carbón puede sustituirse por piedra pómez, fibra de coco u otro material liviano. Para el verano se obtienen mejores resultados con las siguientes mezclas: 5 partes de fibra de coco con 5 partes de pómez o carbón 3 partes de cascarilla de arroz con 3 partes de pómez o carbón más 4 partes de fibra de coco. Procedimiento Siembra: para disminuir el autosombreo y captar más luz se distribuyen las columnas en pata de gallo, a una distancia de 0.8 a 1.0 metro entre columnas y de 1.0 a 1.2 metros entre hileras. Para la siembra de las plantas, se marcan los puntos donde se van a colocar, para lo cual se usa un triángulo equilátero de 15- 20 cm. dependiendo del 62

cultivo. El hueco donde va la planta puede ser en t invertida, redondo o triangular con 4 cm de diámetro. El corte del hueco se hace antes de llenar el saco, para ello se coloca un cartón en el centro con el fin de no perforar las bolsas por los dos lados.. Se distribuyen los agujeros para la ubicación de las plántulas y cerca del amarre para el riego mediante el uso de los embudos. Luego se llena la bolsa con el sustrato, humedecido previamente, se cierra la bolsa en la parte superior con un mecate o cordón adecuado y por último se colocan las plántulas. Riego y aplicación de solución Para mangas de 1.0 metro, el riego se hace por la parte superior con un embudo o media botella invertida, también se pueden colocar tubos perforados en forma de t invertida colocados internamente al centro de la bolsa Se recomienda en forma general, dependiendo del clima, la especie, edad del cultivo y tipo de sustrato, aplicar 1.0 a 2.0 litros de solución por día por metro lineal de columna. Se acostumbra riegos cortos y frecuentes para evitar desperdicios de solución nutritiva. Riegue con un litro de las soluciones nutritivas, las cuales tendrá que diluir previamente en agua de la siguiente forma: diluya las soluciones A y C en dos litros de agua y la B en un litro. Las soluciones anteriores funcionarán como soluciones madre de las cuales tendrá que tomar 5cc de A y C y 2,5cc de B y llevar el volumen a un litro, con el cual se regara la manga (medio litro por cada ¨embudo¨). Riegue la manga hidropónica durante un mes y observe los resultados. Anote sus observaciones y discuta sobre: • Efectividad del sistema. 63

• • • •

Efectividad de acuerdo con el cultivo. Comparación entre sitios o efecto de la ubicación (invernadero vs no invernadero). Ventajas y desventajas de la hidroponía. Ventajas y desventajas del sistema de manga.

Todo lo anterior aplicado a factores que afectan el crecimiento como luz, agua, nutrientes, aire, sustrato, temperatura.

Cuestionario 1) ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los cultivos hidropónicos? 2) ¿Cuál sistema es más adecuado para el cultivo de lechuga? ¿cuáles ventajas tiene el sistema de manga para este cultivo en relación con el sistema de raíz flotante? 3) ¿Qué métodos se utilizan para controlar plagas en estos sistemas? 4) ¿Qué factores habría que tomar en cuenta para sembrar diferentes tipos de cultivos en una manga? 5) ¿Por qué no se recomienda usar tierra en semilleros para transplantarlos a sustratos hidropónicos?

64

PRÁCTICA 8: Uso de la cámara de flujo laminar, confección de soluciones madres y medios de cultivo. Introducción Para que un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales funcione adecuadamente se requieren de condiciones estrictas de asepsia. Estas condiciones deben imperar en el área de trabajo, en lo personal, en los medios de cultivo y en los instrumentos. El material vegetal a introducir se desinfecta superficialmente y su posterior manejo se hace en condiciones asépticas en una cámara de flujo laminar. Para la desinfección de los explantes se lleva a cabo comúnmente con hipoclorito de sodio (Na C0l) e hipoclorito de calcio Ca(Ocl)2 en diferentes concentraciones. En la esterilización del equipo y en los medios de cultivo, el método más usado es el vapor húmedo, mediante el uso de autoclaves que actúan con vapor a presión. El tiempo necesario para una esterilización adecuada en un litro de medio de cultivo es de 15 minutos a una presión de 15 lb/in​2 y una temperatura de 121 ˚C, al aumentar el volumen de material a esterilizar también aumenta el tiempo de autoclavado. El éxito en el cultivo ​in vitro depende del medio de cultivo adecuado, del uso de tejidos viables y de la calidad de reactivos. Los medios de cultivo son combinaciones de sustancias químicas que permiten que las plantas crezcan y se multipliquen ​in vitro​. Existen 16 elementos considerados esenciales para el crecimiento de las plantas, 9 de ellos son requeridos en mayor cantidad y se 65

denominan macronutrientes; los otros nutrientes restantes o micronutrientes, se requieren en pequeñas cantidades. Los medios de cultivo están formados por: 1- Sales inorgánicas​ : ➢ Elementos mayores​: nitrógeno, fósforo, potasio, azufre, calcio, magnesio, hierro,carbono, hidrógeno y oxígeno. ➢ Elementos menores​: Boro, molibdeno, manganeso, cobalto, zinc, cobre,cloro y yodo. 2- Compuestos orgánicos​: ➢ Carbohidratos​: sacarosa (2-3 %) , glucosa, fructosa y almidón ​➢ Reguladores del crecimiento​: -Auxinas: AIA, AIB, ANA, Piclorán, 2,4 D, Tordón ,Dicamba. -Citocinas: BAP, 2ip, Kinetina y Zeatina. -Giberelinas: obtenida del hongo Giberella fujikuroi. ➢ Vitaminas​: tiamina, ácido nicotínico, piridoxina, pantotenato y riboflavina. 3-Complejos naturales​: extracto de malta, agua de coco, extracto de levadura, pulpa de banano, caseína hidrolizada, jugo de naranja, tomate y emulsión de pescado. 4-Materiales inertes​: agar, phytagel y gelrite . 1- Preparación de soluciones madres La preparación del medio de cultivo se inicia con el establecimiento de las soluciones concentradas (soluciones madres) de uno o más compuestos. Un volumen conocido de cada una de estas soluciones se 66

mezclan para la formulación del medio de cultivo final. Se recomienda preparar las soluciones madres en cantidades relativamente altas y con antelación con el fin de ahorrar tiempo y trabajo que conlleva pesar los ingredientes por separado, cada vez que se prepara el medio de cultivo. Además, muchos de los componentes (microelementos, vitaminas y reguladores de crecimiento) se adicionan en pequeñas cantidades, si se multiplica esa cantidad por un número determinado de veces para preparar la solución madre, la medida del peso se hace más precisa y fácil. Es necesario tener presente, que una solución madre muy concentrada tiende a formar precipitados. En algunos casos esos precipitados son el resultado de mezclar sustancias incompatibles, por ejemplo, calcio y fosfato o sulfato, magnesio y fosfato. Como regla general se recomienda que la concentración de la solución madre no sea mayor de 100 veces (100X) de la concentración final del medio​.

Preparación de los macroelementos y microelementos En el nitrato de amonio la fórmula indica 1650mg/l en el medio de cultivo, por lo tanto, para preparar una solución madre 50X (50 veces más concentrada, suficiente para preparar 50 litros de medio de cultivo), 1650 mg x 50 = 82500 mg. En un balón aforado de un litro con aproximadamente 500 ml de aguas destilada, agregue las cantidades pesadas de cada uno de los macroelemtos, agite y agregue agua hasta la marca de aforo. Vuelque el balón y agite varias veces. Transfiera la solución de macroelementos a una botella ámbar para su almacenamiento en el refrigerador. Etiquete la botella. 67

Para recordar la cantidad que se requiere agregar por litro de medio de cultivo recuerde dividir 1000 ml/50 = 20ml de la solución madre /1 litro de medio. Repita el procedimiento con los microelementos. Preparación del hierro Ponga a hervir 700 ml de agua bidestilada en un erlenmeyer de 1000 ml, cuando está hirviendo agregue la cantidad pesada de Na 2EDTA y FeSO4. 7 H 2O (recuerde está preparando una solución madre 50 x , por lo tanto, multiplique la cantidad indicada en la fórmula por 50) hasta que desarrolle color, tápela y déjela enfriar en un lugar oscuro. Cuando esté a temperatura ambiente transfiérala a un balón aforado y agregue agua destilada hasta marca de aforo. Almacene en el refrigerador en una botella ámbar para evitar foto descomposición. METODOLOGÍA 1-Para el trabajo en la cámara de flujo laminar se deben seguir los siguientes pasos: ➢ Lavase las manos y antebrazos con jabón antibacterial ➢ Ponga a funcionar la cámara de flujo laminar una hora antes de iniciar el trabajo. ➢ Limpie la cámara con etanol de 70% ➢ Use etanol de 96% para flamear la cámara( apague la luz) ➢ Flamee el vidrio y los instrumentos dentro de la cámara (apague la luz). ➢ Limpie con etanol de 70% los frascos con medio antes de introducirlos a la cámara.

El cuadro 1 muestra las fórmulas químicas y las cantidades en miligramos por litro de los diferentes 68

componentes en la preparación del medio Murashige and Skoog (1962). Siga los siguientes pasos para la preparación de soluciones madres de Macronutrientes, Micronutrientes, Vitaminas y Hierro Cuadro 1. Formulación química y cantidad utilizada para la preparación de soluciones madres del medio MS* Cantidad en Componentes Reactivo mg/L

Macronutriente s

Reactivo NH ​4​NO​3 KNO​3 CaCl ​2​2H ​2​O MgSO​4​ 7 H ​2​O KH ​2​PO ​4

Micronutrientes

Hierro

170

KI H ​3​BO​3 MnSO​4​ 4H ​2​O

0.83 6.30 223.

CuSO​4​ 5 H ​2​O CoCl ​2​6 H ​2​O

0.025 0.025

Zn SO​4​ 7H ​2​O NaMoO​4​ 2H ​2​O

Vitaminas

1650 1900 440 370

Myo-inositol Glicina Ácido Nicotínico Piridoxina

8.60 0.25

100.0 2.0 0.5 0.5

Tiamina

0.1

Na ​2​EDTA

37.3

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*Tenga presente que cuando los reactivos tienen diferentes composiciones de agua a los que están en la tabla, tiene que hacer la conversión.

Cuadro 2. Componentes y volúmenes necesarios para preparar 1 litro de medio MS.

Componente

Reactivo

NH ​4​NO​3

Macronutrient es

Micronutriente s

Cantidad en g/L 16,6

KNO​3 CaCl ​2​2H​2 ​O

19,0

MgSO​4​ 7 H ​2​O

3,7

KH ​2​PO ​4

1,7

KI

0,083

H ​3​BO​3

0,0630

MnSO​4​ 7H ​2​O Zn SO​4​2H ​2​O

4,4

CoCl ​2​6 H ​2​O Myo-inositol Glicina

100ml

2.77 0.860

NaMoO​4​ 2H ​2​O CuSO​4​ 5 H ​2​O

Alícuota

10ml

0.025 0.0025 0.0025 10.0 0.2 10ml

70

Vitaminas

Hierro

Ácido nicotínico Piridoxina

0.05 0.05

Tiamina

0.01

Na2EDTA

3.78

FeSO​4​ 7 H ​2​O

2.78

10ml

2-Preparación de medios Para la confección de un litro de medio MS siga los siguientes pasos: ➢ Agregue en un balón de un litro que contenga un cuarto de agua destilada desionizada las siguientes cantidades de soluciones madres: 100ml de Macronutrientes -10ml de Micronutrientes -10 ml de Vitaminas -10ml de Hierro -30 gramos de azúcar Consideraciones generales Nutrientes. En la optimización de los requerimientos de sales es necesario tener en cuenta las interacciones y formas iónicas. En algunos casos como en el K​+​ o Ca​++​, los requerimientos de un ion son dependientes de la disponibilidad de otro. El nitrógeno es suministrado como NH​+​4 o hierro se ​ NO​3 . El ​ 71

suministra en forma de quelatos con el fin de prolongar su disponibilidad en el medio de cultivo. Los compuestos orgánicos relativamente insolubles en agua requieren de codisolventes, por ejemplo la mayoría de reguladores de crecimiento. pH . En medios de cultivo con pH muy bajo se pueden presentar los siguientes inconvenientes: ➢ -El AIA y el AG​3​ son menos estables ➢ -El agente gelificante pierde efectividad ➢ -Existe precipitación de sales de fosfato o hierro ​➢ -Inestabilidad de la vitamina B​1 y del Ácido Pantoténico ​➢ -Retardo de absorción de iones amonio​. Algunas aplicaciones del medio Murashige y Skoog (1962) Este medio se usa con frecuencia en la iniciación de cultivo ​in vitro ​de helechos, en la preparación de plantas obtenidas ​in vitro para su transplante al suelo. Al medio Murashige y Skoog se le agregan 0.1 mg /l de cinetina y 0.3 mg/l de 2,4-D para la inducción de callos de algunas especies. Cuando se suplementa con 1mg/l de cinetina y 0.3 mg/l de AIA se obtiene un medio para enraizamiento de pequeños ápices, usados en la producción de plantas libres de patógenos. En la multiplicación se agregan una alta concentración de citocina y una baja concentración de auxinas, con el propósito de estimular ramificaciones axilares. Citocininas Las citocininas promueven el surgimiento de brotes y las auxinas estimulan el surgimiento de raíces. Con 72

frecuencia los efectos son antagónicos: una de las dos sustancias inhibe la acción de la otra. Son bases débiles, por lo tanto son solubles en ácido diluido. Entre las citocininas, las más activas son las zeatina y el 2 ip Auxinas Las auxinas son ácidos débiles y son solubles en bases débiles. La eficiencia de estas sustancias depende de la auxina o citocina con que se esté trabajando. La auxina más activa es el 2,4-D; la menos activa es el AIA Generalmente se usan 0.3 ml de Na OH 1N o HCl 1N por cada 10 mg de citocina o auxina. Las soluciones madre deben mantenerse en refrigeración o a temperatura ambiente si se conoce su estabilidad Preparación de la solución madre de regulador de crecimiento (RC) Para preparar la solución madre de reguladores, cada regulador de crecimiento se prepara por separado. Solución madre de benciladenina: pese 25 mg de BA, luego con un gotero agregue lentamente y con agitación HCL 1M hasta que el BA se disuelva, eche un poco de agua y vaya disolviendo poco a poco hasta aforar a 250ml. Esta solución provee 0.1 mg de BA por ml de solución madre. Si para el medio de cultivo que prepara se indica adicionar 1 mg de BA por litro, se debe tomar 10 ml de la solución madre para obtener la cantidad recomendada. Para aquellas concentraciones que se indiquen en ppm (partes por millón) recuerde que 1 mg /L equivale a 1 ppm.

Nota: Para La preparación de soluciones madres de reguladores de crecimiento (BAP, ANA, 2IP, AIA, AIB, etc), el instructor le indicará cual es la mejor forma. 73

Porcentaje en volumen: 5% de leche de coco, se refiere a que 50 ml de este compuesto son agregados a 950 ml de agua​. Porcentaje en peso: Se usa para el azúcar y agentes gelificantes; 2% equivale a 20 g del producto por cada 1.000 (1 litro), de medio nutritivo​. Molar: ​0,01 M representa 1/100 de mol / litro( 1 mol es el peso molecular expresado en gramos) ​Partes por millón (ppm): ​1 parte / millón equivale a 1mg/l.

Concentración molar: Una concentración molar (M) contiene por litro el número de gramos que indica su peso molecular​. Preparaciones y diluciones frecuentes en cultivo de tejidos. 1-Ácido clorhídrico 1 N. Tome 8.6 ml de Hcl concentrado (36.6 %) y afore con agua destilada hasta 100 ml. 2-Ácido clorhídrico al 0.1 N Tome una alícuata de 2 ml de la solución 1 N y afore con agua destilada hasta 20,0 ml. 3-Hidróxido de potasio (KOH) 1 N

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Pese 2 gramos de KOH y agréguele 35.7 ml de agua destilada. 4-Hidróxido de potasio 0.1 N Tome una alícuota de 2 ml de la solución de KOH al 1 N y afore hasta 20ml con agua destilada. 5-Solución de KCL 2 M para guardar los electrodos del potenciómetro. Pesar 15 gramos de KCL y aforar con agua destilada hasta 100 m Tarea: por favor, traer una cápsula de orquídea para la próxima práctica. Cuestionario. 1-Defina asepsia y comente sobre su importancia en el laboratorio de cultivo de tejidos. 2-¿Por qué es importante utilizar espátulas limpias cada vez que se pesa un reactivo diferente; probetas y pipetas diferentes para cada solución madre? 3-¿Qué cuidados se deben de tener a la hora de realizar un medio de cultivo? 4-por favor, elabore un cuadro con la función de los macros y micronutrientes en las plantas cultivadas ​in vitro. 5-Si para la práctica carece de Mg SO​4 7 ​ H ​2 O, pero tiene a mano MgSO 4​ ​2 H 2​ O, tampoco existe Na​2 Mo O​4 2 H 2​ O , pero cuenta con la sal anhidra. ¿Qué cantidad en gramos de estas sales necesita agregar en cada caso? 6-Determine los milimoles de las sales y vitaminas del medio de cultivo M &S (1962)

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Práctica 9: Micropropagación de Orquídeas ​Introducción: La familia orchidaceae es la más grande dentro del grupo de las angiospermas. Su línea de evolución se ubica en el grupo de las monocotiledóneas, ligada más estrechamente con la familia Liliácea. Existen de 20.000 a 30.000 especies, de las cuales se han descrito 1.500 en el país, distribuidas en 125 a 130 géneros. Esta familia ha alcanzado su mayor diversidad y desarrollo en los trópicos. Encontrándose los dos principales centros de diversidad en Malasia y al norte de Sudamérica. Entre los factores que afectan las poblaciones de estas plantas sobresalen los siguientes: 1- Deforestación Uno de los aspectos que contribuyó a la deforestación fue la actividad ganadera, que incluyó la formación de potreros, con lo cual fue necesaria la eliminación de árboles, destruyendo así el hábitat de estas epífitas (que utilizan los árboles como soporte natural). Otra actividad que contribuye a la disminución de este recurso es la explotación irracional con fines comerciales que llevan a cabo personas inescrupulosas con escasa o ninguna regulación, así como el manejo inadecuado de las plantas que poseen algunos coleccionistas aficionados. Esta situación ha llevado a muchas de estas especies en peligro de extinción. 2- Características de las semillas La estructura, tamaño y viabilidad de las semillas es otro de los factores que agrava el problema. Estas son diminutas (su longitud va de 0.25 a 1.2 mm y su ancho es de 0.090 a 0.270 mm) , pesan un poco menos de una millonésima de gramo. Para contrarrestar su pequeño tamaño, las orquídeas producen muchas semillas por 76

cápsulas .El número de semillas por cápsula puede oscilar entre 1.300 a 3.7000.000 .La gran mayoría de especies tienen semillas indiferencias forradas de una membrana delgada, llamada testa. Las semillas carecen de cotiledones y endospermo. Por eso necesitan una fuente de nutrición externa hasta que se han desarrollado lo suficiente para sobrevivir fabricando su propio alimento. Estos factores influencian notablemente la distribución de las especies de orquídeas. Debido al reducido tamaño, ligereza y abundante cantidad, las semillas son distribuidas por el agua y el viento. Pero, como carecen de reservas alimenticias o deben asociarse a un determinado tipo de hongo, son muy pocas las que logran completar el ciclo. Lo expuesto influye en que estas semillas tengan requerimientos específicos, para su germinación y desarrollo. La necesidad de poder asegurar la propagación de estas plantas dio origen a la búsqueda de métodos artificiales, capaces de sustituir la reproducción natural. El primero en tratar el tema fue Knudson (1922) al establecer el método simbiótico, basado en la utilización de un medio sintético, para la germinación de semillas de orquídeas, a la vez propicio el camino para el desarrollo de la hibridación con lo que hizo posible la supervivencia de plantas que sucumbiría en condiciones normales. Existen factores que afectan la germinación de las semillas de orquídeas, por ejemplo: 1- alta concentración de nitrógeno en el medio de cultivo, 2- mucho azúcar en el medio, concentraciones mayores de 25 g /L, 3concentraciones altas de sales, 4- Cápsulas muy verdes con semillas que no han alcanzado la madurez fisiológica óptima. Considerando lo anterior se llevará a cabo esta práctica cuyo objetivo es: Dar a conocer dos técnicas para el cultivo ​in vitro​ de orquídeas. MATERIALES Y MÉTODOS 1- Material biológico. 77

Se utilizarán dos cápsulas verdes de 10 meses de edad. 2- Preparación de los medios de cultivo. En esta práctica se usará el medio Murashige y Skoog al 100 y 80 % de sales (cuadro 1). Cuadro 1. Contenido Químico del medio Murashige y Skoog . Compuesto quimico Cantidad en ml/L Macro: 100 80.0 Micronutrientes de MS 10 8.0 Vitaminas de MS 10 8.0 Hierro de MS 10 8.0 Sucrosa 20 gr 20 gr Phytagel 1.80 gr 1.90 gr Ph 5.7 5.7

El contenido de cada uno de los medios de cultivo se depositará por separado en frascos gerber. Esterilización El medio de cultivo se esterilizará en una autoclave durante 15 minutos a 1.07 Kg/cm​2 de presión y a una temperatura de 121 ˚C. 3- ​Desinfección de la cápsula 1- Lave con agua de cañería a presión la superficie externa. 2- Limpie en su exterior con esponja impregnada de jabón protex, luego lave con agua. 3- Sumerja la cápsula en una solución de hipoclorito de sodio al 50% V/V durante 10 minutos. Una vez 78

en la cámara lave tres veces la cápsula con agua destilada estéril. 4- Flamee la cápsula con etanol al 70%. 5- Siembra de las semillas: En este punto se realizarán dos técnicas diferentes para la siembra de las semillas ​in vitro. a- Siembra en película de agua - Corte la cápsula por la mitad - Deposite el contenido de la mitad de una de las cápsulas en 25.0 ml de agua estéril destilada en agitación. - Tome una alícuota de 1.0 ml de la solución y deposítelo en cada una de los medio de cultivo. b- Siembra directa - Corte la cápsula por la mitad. - Con una pinza estéril, tome pocos de semillas (del centro de la cápsula) y deposítelas sobre el medio de cultivo (Frascos gerber). 6- Traslade los medios de cultivo con las semillas sembradas al cuarto de crecimiento, con período de luz de 16 horas, con una intensidad de 80 watts y una temperatura de 25 + - 1 C. 7- Determine el número de semillas germinadas por cada frasco con medio sembrado. Cuestionario - Explique a que se deben las diferencias de viabilidad que existen dentro de una misma cápsula. - ¿Cuál es la finalidad de inocular las semillas mediante una película de agua?. - Explique detalladamente cual es la función de los siguientes compuestos del medio en la germinación y crecimiento de las orquídeas: Nitrógeno, Fósforo, 79

Hierro, Manganeso, Vitaminas.

Calcio,

Carbohidratos

y

Bibliografía -

DRESSLER, R. 1981. The Orchid Natural History and Clasification. Jodon. Printed in U.S.A. 332p.

KNUDSON, L. 1951. Nonsymbiotic Germination of Orchid Seeds. Bot. Gas. 73. (1):125. Anexo 1.

LITERATURA CONSULTADA 1-Hurtado, D Merino,N. 1994. Cultivo de tejidos vegetales. México. Trillas.231 p 2-Abdelnour, A y Vincent, J. 1994. Conceptos básicos de cultivo de tejidos vegetales. CATIE. 38p.

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Práctica 10: Establecimiento ​In vitro​ de vainilla ( ​Vanilla planifolia​ Andrew) 1- INTRODUCCIÓN. Descripción La vainilla es una orquídea epifita trepadora, sus raíces llegan al suelo por medio de un tallo suculento, carnoso, con entrenudos en Zig-Zag que se adhiere a los troncos y ramas. Sus flores se encuentran en inflorescencias con forma de racimo y son de color amarillo pálido. El fruto es una cápsula unilocular, color amarillo pálido a la madurez y se torna pardo oscuro hasta abrirse en dos valvas longitudinales. Distribución. Se encuentra en las tierras continentales húmedas y bajas de menos de 800 msnm, desde el sur de México hasta el norte de Bolivia. Reproducción. Se cultiva por estacas o semillas, lo habitual es a partir de estacas de alrededor de un metro y medio de largo. Para su cultivo se usa como soporte estacones vivos espaciados de uno a dos metros en línea y unos tres metros entre líneas. Importancia. El mercado de la vainilla comprende la pastelería, fábricas de refrescos, confección de bebidas y licores entre otros. El mayor comprador de vainilla en México es la empresa Coca Cola, la cual procesa las cápsulas para extraerles el extracto. El consumo de vainilla en el mundo es de unas 2000 toneladas y se estima que existe una demanda sin satisfacer de más de 2.500 toneladas. 81

En el mercado internacional la demanda de vainilla natural proviene principalmente de Francia (para uso en repostería), Alemania, Canadá y Japón entre otros. No obstante, el máximo importador es Estados Unidos que consume más de la mitad de la producción mundial, para utilizarla en la industria de helados. La tendencia de muchos países es regresar a los productos naturales. Es importante analizar que además, del aspecto económico hay que tomar en cuenta el impacto positivo en el ambiente al ser cultivado en forma orgánica y asociada a otras especies vegetales. 2.0 Materiales y Métodos. 2.1 Material biológico​. Se usarán los segmentos nodales del tallo de vainilla obtenidos de plantas de ​V. Planifolia que crecen en el invernadero. 2.2 ​Desinfección del material biológico​. ➢ Lavar los segmentos nodales con jabón líquido y agua de cañería por 15 minutos. ➢ Sumergir en etanol por 1 minuto ➢ Depositar explantes en una solución de Benomil 1g/L, agitar durante 10 minutos ➢ Sumergir en solución de hipoclorito de Calcio al 4% por 15 minutos y agitar. ➢ Lavar 4 veces con agua destilada estéril, cortar las partes dañadas por la solución de calcio y sembrar la yema axilar en el medio de cultivo. El grupo de la mañana inoculará el explante en un medio semisólido y el de la tarde en un medio líquido con puente. El puente de papel filtro tiene forma de M, en el domo se colocará el explante. Medidas del puente: alto 3,5 cm, ancho del pie 1,5 cm y ancho del domo 2 cm.

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Cuadro 1. Componentes del medio de cultivo utilizados en la etapa de Introducción de ​V. planifolia. Componentes del Cantidades medio /l Macroelementos 100 ml Microelementos 10ml Vitaminas 10ml Fe 10ml Tiamina-HCL 0.1 mg Piridoxina-HCL 0.5mg Inositol 100 mg Ácido nicotínico 0.5 mg Glicina 2.0 mg Caseína hidrolizada 1.0 g BA 0.5 mg Sucrosa 30g pH 5.7 Agar

Cuestionario. La vainilla se reproduce en forma sexual y asexual; de la forma asexual tradicionalmente se reproduce por esquejes. Analice los dos métodos expuestos y explique las ventajas al usar el cultivo de tejidos como herramienta en la propagación asexual de este material.

Bibliografía. Kononowicz, H; Janick 1984. In vitro propagation of Vanilla planifolia h ​ ort Science 19 (1):58-59 Gervera. E.; R Madrigal. 1981. ​In vitro propagation of vainilla (​Vanilla planifolia​) Environ. Expt. Bot. 21: 441 83

Anexo

Cápsulas fermentadas

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Práctica 11. Reguladores de crecimiento vegetal (fitohormonas)

Introducción El crecimiento está determinado por la absorción de sustancias minerales a través de raíces y por los hidratos de carbono sintetizados en las hojas. También lo regulan las sustancias químicas que actúan como agentes específicos y correlacionan el crecimiento entre las diversas partes de las plantas. Estos compuestos son las fitohormonas. Esta denominación se fundamenta en que su comportamiento es similar a las hormonales animales, sin embargo, tienen diferencias significativas en los modos de acción. Una característica común de este grupo es su capacidad para inducir o reprimir algún proceso de crecimiento de la planta o actuar de forma localizada en un sitio ajeno al de síntesis. En muchos casos estos reguladores se han usado con éxito en el estudio de procesos controlados internamente por las fitohormonas, proporcionando así una herramienta poderosa al agricultor moderno para regular el crecimiento de las plantas, la época de floración, el llenado de frutos y más recientemente en la propagación masiva, por cultivo de tejidos de materiales seleccionados. Las fitohormonas se clasifican en cinco grupos: auxinas, giberelinas, citoquininas, etileno y ácido abscísico. Recientemente se han identificado otras sustancias con formas de acción semejantes como: el ácido jasmónico, el ácido salicílico, la proteína sistemina y los brassinosteroides. Entre los reguladores de crecimiento más conocidos están las auxinas, ejemplos de ellas son: los ácidos indolacètico (AIA), Indolbutírico (AIB) y Naftalenacético (ANA) que inducen la división y elongación celular, la iniciación cambial celular y enraizamiento de estacas. 85

Auxinas La más abundante y estudiada en las plantas es el ácido indolacético (AIA). Muchos compuestos químicos, relacionados en su estructura con el AIA, pueden sustituirlo para provocar respuestas similares de crecimiento. Ejemplo el 2-4- D, es constituyente de muchos herbicidas. Se ha observado la presencia de compuestos tipo indol en plantas, pero es probable que su actividad como auxina se deba a su conversión en AIA. Esta auxina se sintetiza principalmente en los ápices de tallos y raíces, de donde migra a la zona de elongación y a las otras zonas donde ejercerá su acción. Esta migración desde el ápice es, aproximadamente, de 1 cm/hora y siempre es unidireccional: desde el ápice a la base (basipeta). Este movimiento se conoce como transporte polar. Uno de los efectos fundamentales del AIA se observa en el fenómeno de elongación. En muchos casos segmentos de tallos donde se eliminó la auxina endógena denota elongación en presencia de AIA exógeno. Esta elongación es proporcional, dentro de ciertos límites, a la concentración de auxina usada. El efecto más conocido del AIA es el papel que juega en los tropismos al determinar la curvatura de ciertos tejidos en respuesta a un estímulo localizado. Esta curvatura es el resultado de una distribución asimétrica de auxina en el órgano. Otro de los papeles importantes de la auxina es iniciar o promover la división celular. Así la iniciación de la actividad cambial en muchos árboles es controlada por la auxina, que difunde basipetamente desde las yemas apicales. Además de estos efectos directos en la promoción de división celular y elongación, la auxina tiene otros efectos en el crecimiento de las plantas. Por ejemplo, determina el 86

fenómeno de dominancia apical, es decir, en plantas intactas sólo crece la yema apical y no las próximas a ellas. La eliminación del ápice da como resultado el crecimiento de las yemas laterales cercanas a él. Sin embargo, si se cubre la superficie cortada con auxina, las yemas laterales continuarán inhibidas, porque la auxina ejerce dominancia sobre ellas. También es importante para regular la caída de las hojas y frutos. Cuando la hoja se vuelve deficiente en producción de auxinas se forma en el pecíolo un tejido especial llamado capa de abscisión que aísla a la hoja permitiendo su caída. Giberelinas Se caracterizan porque al ser aplicadas en ciertas plantas producen una gran elongación de los tallos que en algunos casos da como resultado una disminución del área foliar. La aplicación de giberelinas a plantas genéticamente enanas revierte este carácter y produce plantas de apariencia normal. Tienen efecto en la inducción de la síntesis de enzimas como la alfa amilasa en el endosperma de cebada y otros cereales. Reemplazan los requerimientos de luz en semillas fotosensibles y sustituyen los requerimientos de frío o día largo necesario para la floración de muchas especies.

Objetivo Estudiar el efecto de las auxinas en la dominancia apical y el enraizamiento de estacas.

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A. Efecto del AIB en la formación de raíces Procedimiento Corte estacas con 3 a 6 nudos de distintas plantas. El corte debe efectuarse basalmente inmediatamente debajo de un nudo y el corte superior debe llevarse a cabo sobre un nudo. Proceda a eliminar las hojas inferiores. Luego en cada uno de los vasos plásticos agregue 100ml de una de las soluciones de AIB (1.0, 2.5, 5,0 y 10,0 ppm y un control) y coloque 10 estacas durante una hora (dos estacas/tratamiento). Rotule cada vaso. Plante las estacas en propagadores con un sustrato húmedo, el ambiente debe ser cálido y con luz. Se debe mantener la humedad en los propagadores mediante riegos periódicos de los sustratos. Después de dos o tres semanas inicie la evaluación de los tratamientos (Cuadro 1). Saque las estacas con cuidado de no romper las raíces y observe la presencia de raíces adventicias, primordios radicales y anormalidades como las partiduras excesivas, engrosamiento excesivo, necrosis y otros. Resultados Cuadro 1. Enraizamiento en estacas Respuesta

Concentraciones de AIB (ppm) 1.0 2.5 5.0 10

Estacas sin primordios ni raíces adventicias 88

Contr ol

Estacas con raíces de más de 1mm Estacas con primordios Nº raíces /estaca Estacas con (partiduras engrosamiento necrosis)

anormalidades excesivas, excesivo,

Analice la respuesta de acuerdo con la edad de la estaca (jóvenes o maduras) ​a- Anotar lo observado / tratamiento b- De acuerdo con los resultados ¿ Cuál es la concentración de AIB más efectiva? c- ¿Qué pasaría si las estacas se colocaran en una concentración mayor por menos tiempo? B. Respuesta de las hojas de violeta a la aplicación de ANA Procedimiento Preparar dos soluciones de ANA, una a 0.1 ppm y otra a 1ppm. Sumergir en cada una de las soluciones por separado seis hojas de violetas durante 10 horas. Sembrar en una bandeja con tierra, rotular y 15 días después evaluar el número promedio de raíces y brotes en cada tratamiento.

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C. Efecto del AIA en la abscisión Procedimiento Identifique las plantas y deje una como control (​a​). A tres de ellas (​b,c y ​d ) elimíneles tres hojas a partir del tercer par, contadas desde el ápice vegetativo; cuide dejar el pecíolo. Elija tres hojas en la planta ​e ​y corte la mitad de la lámina. La planta ​b aplíquele sólo lanolina en el pecíolo, a las plantas ​c lanolina con AIA al 0.1ppm y a las plantas ​d lanolina con AIA 5 ppm. Para cada tratamiento se usaran dos plantas (figura 1). ​Cuadro 2. Abscisión en pecíolos Tratamiento

Días después del tratamiento 3 6 9 12

Control Lanolina Lanolina con 0.1ppm AIA Lanolina con 1 ppm AIA Pecíolo más ½ lámina foliar Figura 1. Efecto del AIA en la abscisión

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Observacione s 1 5

Resultados: Anote el número de pecíolos desprendidos. D. Efecto herbicida de las auxinas (2,4 –D) Se usaran dos concentraciones de 2,4-D una con 0.1 ppm y otra con 1 ppm. Con la concentración de 0.1 ppm se asperjaran tres plantas, repetir para el tratamiento con 1,0 ppm. Observar: aspecto de la hoja (color, tamaño y forma), tallo, guías y floración. E. Retardo de la senescencia y aumento de la recepción de nutrientes, por la acción​ ​de las citocininas La senescencia es retardada por la acción de las citocininas y considerada un fenómeno natural, controlado 91

en su mayoría por las raíces. Su mecanismo de acción se lleva a cabo mediante el transporte de los solutos desde la parte más vieja de la hoja, a la zona tratada exógenamente. Procedimiento Aplicar 3,0 mg/L de 6 bencil aminopurina (BAP) a una de las hojas de vainicas en intervalos de seis días. Anotar los cambios de coloración en las hojas producto de la traslocación de nutrientes.

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