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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA DE POSGRADO EN ALIMENTOS DEL CENTRO DE LA REPÚBLICA

“Caracterización química y farmacológica de compuestos vasorrelajantes no polares presentes en el fruto de Prunus serotina” TESIS

Que como parte de los requisitos para obtener el grado de:

Maestro en Ciencia y Tecnología de Alimentos Presenta: Q.F.B. Francisco Javier Luna Vázquez

Dirigida por: Dra. Alejandra Rojas Molina

Santiago de Querétaro, Qro. Octubre de 2009 i

ii

Resumen Los frutos y las hojas de Prunus serotina (capulín) son utilizados en la medicina tradicional para el tratamiento de la diarrea, la tos y la hipertensión. A la fecha, no se cuenta con suficiente información fitoquímica y farmacológica sobre esta especie. Recientemente, se encontró que el aceite esencial y los extractos no polares obtenidos del fruto presentaron un efecto vasorrelajante significativo, sugiriendo la presencia de compuestos vasodilatadores no polares. En el presente trabajo se realizó el estudio fitoquímico biodirigido del extracto de diclorometano obtenido a partir del fruto de esta especie, empleando técnicas cromatográficas. Adicionalmente, se realizó el análisis del aceite esencial, mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Los compuestos purificados se analizaron por métodos espectroscópicos y espectrométricos. El efecto vasorrelajante se evaluó en el modelo de aorta aislada de rata, empleando un polígrafo Grass 7D. Las curvas concentración-respuesta se ajustaron a una ecuación sigmoidal, utilizando el programa Prisma 5.0. Para determinar las diferencias significativas entre las curvas se utilizó la prueba de Tukey. El estudio fitoquímico condujo a la purificación del β-sitosterol, el ácido ursólico, el uvaol y el aldehído ursólico. Este trabajo constituye el primer reporte de la presencia de estos metabolitos en el fruto del capulín. Por otra parte, el análisis del aceite esencial indicó la presencia de 58 compuestos, entre los que se encuentran el alcohol bencílico, el benzaldehído, el cinamaldehído y el alcohol cinámico como componentes mayoritarios. La evaluación farmacológica indicó que estos metabolitos inducen una relajación de la aorta aislada de rata. El alcohol cinámico fue el compuesto más potente. La caracterización del mecanismo de acción indicó que el alcohol bencílico y el benzaldehído inducen una vasorrelajación, independiente de endotelio, mediante la activación de canales de potasio. El cinamaldehído presenta un mecanismo independiente de endotelio que involucra una activación de la guanilato ciclasa. El alcohol cinámico induce una vasodilatación dependiente e independiente de endotelio. Esta última, mediante la estimulación de la guanilato ciclasa y la activación de los canales de potasio. Esta tesis presenta la primera descripción del mecanismo de acción vasorrelajante del alcohol bencílico, el benzaldehído y el alcohol cinámico.

(Palabras clave: Prunus serotina, aorta de rata, vasorrelajante, ácido ursólico, uvaol, benzaldehído, alcohol bencílico, alcohol cinámico, cinamaldehído)

i

Summary The fruits and the leaves of Prunus serotina (capulin) are used in traditional medicine for treating diarrhea, cough, and hypertension. This species has been the subject of few phytochemical and pharmacological studies. Previous analysis indicated that non-polar extracts and the essential oil prepared from the fruits exhibited a significant relaxation of arterial smooth muscle, suggesting the presence of non-polar vasorelaxing compounds. In this research we carried out a bioactivity guided fractionation of the dichloromethane extract prepared from P. serotina fruits, employing chromatographic techniques. In addition, the essential oil was analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry. The structures of the isolated compounds were elucidated by spectroscopic data measurement. The vasorelaxant effect was evaluated in the isolated rat aorta model, employing a 7D Grass polygraph. Concentration-response curves for the tested were adjust to the sigmoidal concentration-response equation using the data analysis and graphics program Prism 5.0. Statistical differences between the concentration-response curves were analyzed by the Tukey test. The phytochemical study led to the purification of β-sitosterol, ursolic acid, ursolic aldehyde and uvaol. These compounds are being reported from the fruits of P. serotina for the first time. On the other hand, chromatographic analysis of the essential oil allowed the detection of 58 compounds. The major compounds are benzyl alcohol, benzaldehyde, cinnamyl alcohol, and cinnamaldehyde. The pharmacological evaluation showed that those metabolites induced a concentration-dependent relaxation of rat aorta. The most powerful vasorelaxant effect was observed for cinnamyl alcohol. Benzaldehyde and benzyl alcohol elicited an endothelium independent vasorelaxing effect that involves activation of potassium channels. On the other hand, cinnamaldehyde evoked an endothelium independent vasodilator effect, activating soluble guanylyl cyclase. Whereas, cinnamyl alcohol induced an endothelium dependent and independent vasorelaxing effect. The endothelium independent one implies guanylyl cyclase stimulation and activation of potassium channels. This work shows the first description of the mechanism of action vasorelaxant of benzyl alcohol, benzaldehyde and cinnamyl alcohol.

(Key words: Prunus serotina, rat aorta, vasorelaxant, ursolic acid, ursolic aldehyde, uvaol, benzyl alcohol, benzaldehyde, cinnamyl alcohol, cinnamaldehyde)

ii

Dedicatoria

A los compañeros de camino que han permanecido conmigo a través de los años

iii

Agradecimientos

Al CONACyT, por la beca otorgada para la realización de este proyecto de investigación.

Al Dr. Fausto Rivero Cruz y a la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación de la UNAM, por su valiosa colaboración.

A los investigadores y personal del PROPAC que directa o indirectamente participaron en llevar a término este trabajo; particularmente a la Dra. Sandra Mendoza Díaz y el Dr. Eduardo Castaño Tostado.

A los miembros de mi comité de tesis, especialmente al Dr. Edmundo Mercado Silva, por sus valiosas observaciones y sugerencias a este trabajo.

A la Dra. Alejandra Rojas Molina y el Dr. César Ibarra Alvarado, por compartir este gran proyecto conmigo, por su entusiasmo y su confianza.

iv

Índice Resumen ...................................................................................................................... i Summary ...................................................................................................................... ii Dedicatoria .................................................................................................................. iii Agradecimientos .......................................................................................................... iv Índice ........................................................................................................................... v Índice de cuadros ...................................................................................................... viii Índice de figuras .......................................................................................................... ix I. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 1 II. ANTECEDENTES ................................................................................................... 4 2.1 Estudios químicos realizados sobre especies del género Prunus .............................. 4 2.2 Prunus serotina ......................................................................................................... 5 2.2.1 Taxonomía, características morfológicas y distribución ............................... 5 2.2.2 Usos de P. serotina en la Medicina Tradicional Mexicana ........................... 8 2.2.3 Estudios fitoquímicos y farmacológicos realizados sobre P. serotina por otros grupos de trabajo ........................................................................................ 8 2.2.4 Estudios fitoquímicos y farmacológicos realizados sobre P. serotina por nuestro grupo de trabajo .................................................................................... 12 2.3 Enfermedades cardiovasculares: incidencia y etiología ........................................... 18 2.4 Fisiología de los vasos sanguíneos ........................................................................ 19 2.4.1 Estructura de la pared vascular ................................................................. 19 2.4.2 Endotelio .................................................................................................. 20 2.4.2.1 Estructura y funciones del endotelio vascular ......................................... 20 2.4.2.2 Factores relajantes derivados del endotelio............................................ 22 2.4.2.3 Mecanismo de relajación de la musculatura lisa vascular ....................... 24 2.4.2.4 Factores vasoconstrictores derivados del endotelio ............................... 25 2.4.3 Músculo liso .............................................................................................. 27 2.4.3.1 Mecanismo de contracción de la musculatura lisa vascular .................... 27 2.4.4 Matriz extracelular ..................................................................................... 28 2.4.5 Túnica adventicia ...................................................................................... 28

III. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................. 29 IV. HIPÓTESIS .......................................................................................................... 31 v

V. OBJETIVOS .......................................................................................................... 31 5.1 Objetivo general ...................................................................................................... 31 5.2 Objetivos específicos ............................................................................................... 31

VI. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 33 6.1 Especímenes biológicos .......................................................................................... 33 6.1.1 Material vegetal ......................................................................................... 33 6.1.2 Animales ................................................................................................... 33 6.2 Compuestos químicos y solventes........................................................................... 33 6.3 Recolección y preservación del material vegetal ..................................................... 34 6.4 Evaluación farmacológica y análisis cromatográfico preliminar de los extractos de diclorometano y hexánico del fruto de P. serotina .......................................... 34 6.4.1 Preparación de los extractos no polares del fruto de P. serotina .............. 34 6.4.2 Evaluación farmacológica de los extractos de diclorometano y hexánico .. 34 6.4.3 Análisis cromatográfico preliminar de los extractos de diclorometano y hexánico ............................................................................................................ 35 6.5 Estudio fitoquímico biodirigido del extracto de diclorometano del fruto de P. serotina ........................................................................................................................ 35 6.5.1 Fraccionamiento biodirigido del extracto ................................................... 35 6.5.2 Análisis cromatográfico de las fracciones .................................................. 36 6.5.3 Evaluación farmacológica de las fracciones .............................................. 36 6.5.4 Purificación de los compuestos bioactivos................................................. 36 6.6 Determinación de la estructura química de los compuestos purificados .................. 37 6.7 Análisis químico del aceite esencial......................................................................... 37 6.7.1 Obtención del aceite esencial .................................................................... 37 6.7.2 Análisis del aceite esencial por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas ................................................................................... 38 6.8 Evaluación farmacológica: ensayo de aorta aislada de rata..................................... 38 6.8.1 Equipo ....................................................................................................... 38 6.8.2 Solución fisiológica empleada en el ensayo de aorta aislada de rata ........ 38 6.8.3 Preparación de las muestras para el ensayo de aorta aislada de rata ....... 38 6.8.4 Ensayo de aorta aislada de rata ................................................................ 39 6.9 Elucidación del mecanismo de acción vasorrelajante de los compuestos puros: determinación de la participación de la vía del NO/GMPc y la activación de los canales de potasio ........................................................................................... 40

vi

VII. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................... 43 VIII. RESULTADOS ................................................................................................... 44 8.1 Evaluación farmacológica y análisis cromatográfico preliminar de los extractos de diclorometano y hexánico del fruto de P. serotina .......................................... 44 8.2 Estudio fitoquímico biodirigido del extracto de diclorometano .................................. 45 8.2.1 Fraccionamiento secundario de la fracción PD-III...................................... 47 8.2.2 Fraccionamiento secundario de la fracción PD-IV ..................................... 49 8.2.3 Obtención del β-sitosterol a partir de la fracción no activa PD-I ................. 49 8.3 Evaluación farmacológica de los compuestos purificados........................................ 51 8.4 Obtención del aceite esencial de los frutos de P. serotina ....................................... 52 8.5 Identificación de los componentes del aceite esencial del fruto de P. serotina......... 53 8.6 Evaluación del efecto de los componentes del aceite esencial sobre el tono de la aorta intacta aislada de rata ............................................................................. 55 8.7 Evaluación del efecto del alcohol bencílico, el benzaldehído, el cinamaldehído y el alcohol cinámico sobre el tono de la aorta aislada de rata libre de endotelio ... 56 8.8 Evaluación de la participación de la vía del NO/GMPc ............................................ 59 8.9 Evaluación de la participación de la activación de los canales de potasio ............... 62

IX. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 67 X. CONCLUSIONES ................................................................................................. 76 XI. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 78 ANEXO 1 ................................................................................................................... 89

vii

Índice de Cuadros Cuadro

Página

2.1

Clasificación taxonómica de P. serotina

5

2.2

Principales metabolitos secundarios aislados e identificados en P. serotina

9

2.3

Valores de EC50 y Emax del efecto vasorrelajante inducido

13

por los

compuestos purificados a partir de las hojas de P. serotina 8.1

Resumen del fraccionamiento primario del extracto de diclorometano por cromatografía en columna al vacío en gel de sílice

8.2

46

Porcentajes de relajación inducidos por las fracciones primarias del extracto de diclorometano obtenido a partir del fruto de P. serotina

47

8.3

Constantes espectroscópicas del uvaol

48

8.4

Constantes espectroscópicas del ácido ursólico

48

8.5

Constantes espectroscópicas del aldehído ursólico

49

8.6

Constituyentes del aceite esencial del fruto de P. serotina

54

8.7

Valores de EC50 y Emax del efecto vasorrelajante del alcohol cinámico, cinamaldehído, alcohol bencílico, benzaldehído y YC-1 sobre aorta intacta aislada de rata

55

viii

Índice de Figuras Figura

Página

2.1

El árbol de P. serotina y su fruto

7

2.2

Efecto vasorrelajante sobre la aorta de rata de las fracciones de metanol, acetato de etilo y diclorometano obtenidas de las hojas de P. serotina

2.3

13

Curvas concentración-respuesta del efecto vasodilatador de la acetilcolina, empleada como control positivo, el hiperósido, la prunina y el ácido ursólico en segmentos de aorta intactos de rata

2.4

14

Curvas-concentración-respuesta del efecto vasorrelajante de los extractos de CH2Cl2 de las diferentes recolectas de los frutos de P. serotina en segmentos de aorta intactos de rata

2.5

16

Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante de los aceites esenciales de las diferentes recolectas de los frutos de P. serotina en segmentos de aorta intactos de rata

2.6

17

Mecanismos de transducción iniciados por los factores relajantes derivados de endotelio en la célula de músculo liso arterial

6.1

26

Esquema general del estudio fitoquímico biodirigido del extracto de diclorometano obtenido a partir del fruto de P. serotina

6.2

41

Esquema general de trabajo para la obtención, análisis y elucidación del me8.15canismo de acción de los componentes bioactivos del aceite esencial obtenido del fruto de P. serotina

8.1

42

Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante de los extractos de diclorometano y hexánico obtenidos a partir del fruto de P. serotina

8.2

45

Efecto vasorrelajante de las fracciones primarias obtenidas a partir del extracto de diclorometano del fruto de P. serotina

46

8.3

Estructuras de los compuestos 1- 4

50

8.4

Extracción,

fraccionamiento

primario

y

purificación

de

compuestos a partir del extracto de diclorometano obtenido del fruto de P. serotina 8.5

Curvas

concentración-respuesta

51 del

inducido por el ácido ursólico y la Ach

ix

efecto

vasorrelajante 52

Figura 8.6

Página Cromatograma de gases obtenido del aceite esencial del fruto de P. serotina

8.7

53

Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante del aceite esencial obtenido a partir del fruto de P. serotina, del alcohol bencílico, del benzaldehído, del cinamaldehído, del alcohol cinámico y del YC-1

8.8

Curvas

concentración-respuesta

56 del

efecto

vasorrelajante

inducido por el alcohol bencílico en ausencia (E-) y en presencia de endotelio (E+) 8.9

Curvas

concentración-respuesta

57 del

efecto

vasorrelajante

inducido por el benzaldehído en ausencia (E-) y en presencia de endotelio (E+) 8.10

Curvas

concentración-respuesta

57 del

efecto

vasorrelajante

inducido por el cinamaldehído en ausencia (E-) y en presencia de endotelio (E+) 8.11

Curvas

concentración-respuesta

58 del

efecto

vasorrelajante

inducido por el alcohol cinámico en ausencia (E-) y en presencia de endotelio (E+) 8.12

Curvas

concentración-respuesta

59 del

efecto

vasorrelajante

inducido por el alcohol bencílico en ausencia de endotelio y en presencia del bloqueador ODQ 8.13

Curvas

concentración-respuesta

60 del

efecto

vasorrelajante

inducido por el benzaldehído en ausencia de endotelio y en presencia del bloqueador ODQ 8.14

Curvas

concentración-respuesta

60 del

efecto

vasorrelajante

inducido por el cinamaldehído en ausencia de endotelio y en presencia del bloqueador ODQ 8.15

Curvas

concentración-respuesta

61 del

efecto

vasorrelajante

inducido por el alcohol cinámico en ausencia de endotelio y en presencia del bloqueador ODQ

62

x

Figura 8.16

Página Curvas

concentración-respuesta

del

efecto

vasorrelajante

inducido por el alcohol bencílico en ausencia de endotelio y en presencia de los bloqueadores TEA y glibenclamida 8.17

Curvas

concentración-respuesta

del

efecto

63 vasorrelajante

inducido por el benzaldehído en ausencia de endotelio y en presencia de los bloqueadores TEA y glibenclamida 8.18

Curvas

concentración-respuesta

del

efecto

64 vasorrelajante

inducido por el cinamaldehído en ausencia de endotelio y en presencia de los bloqueadores TEA y glibenclamida 8.19

Curvas

concentración-respuesta

del

efecto

65 vasorrelajante

inducido por el alcohol cinámico en ausencia de endotelio y en

9.1

presencia de los bloqueadores TEA y glibenclamida

66

Núcleo ursano

68

xi

I. INTRODUCCIÓN

De acuerdo al Dr. Stephen DeFelice, quien acuñó este término en 1989 (Kalra, 2003), un nutracéutico puede ser definido como “un alimento o parte de un alimento que proporciona beneficios a la salud, incluyendo la prevención o el tratamiento de enfermedades”. Por su parte, Robert E.C. Wildman (2001) maneja este término como “sustancia química que se encuentra como un componente natural de los alimentos o de otros materiales comestibles que presentan un beneficio a la salud, ya sea por prevención o tratamiento de enfermedades o bien, mejorando el desempeño fisiológico del organismo”.

Esto nos conduce a considerar que los nutracéuticos son componentes de los alimentos o sustancias relacionadas con éstos. Desde esta perspectiva, el concepto abarca un espectro muy amplio, desde alimentos completos y nutrientes propiamente

dichos,

hasta

metabolitos

secundarios

con

propiedades

farmacológicas bien definidas.

Las plantas han desempeñado a lo largo del tiempo y en todas las culturas un papel central, no sólo como elementos alimenticios, sino también como remedios para el tratamiento de diversas enfermedades, ya sea consumidas enteras o en partes, o bien, mediante algún proceso de extracción de sus componentes. Evidentemente, los compuestos contenidos en dichas plantas, denominados genéricamente fitoquímicos, son los responsables de los efectos farmacológicos presentados por estas especies vegetales.

De manera particular, México posee una gran tradición en el empleo de plantas medicinales, la cual se remonta hasta la época prehispánica, en la que se tenía un profundo conocimiento de numerosas especies vegetales y sus aplicaciones terapéuticas, como lo pone en evidencia la información contenida en 1

escritos tan antiguos como el “Libellus de Medicinalibus Indorum Herbis” o Códice Badiano, escrito en 1552; o bien en la “Historia General de las Cosas de la Nueva España” de Fray Bernardino de Sahagún publicada en el siglo XVI.

Desafortunadamente, a pesar de esta gran tradición en el empleo de plantas medicinales y la abundante riqueza florística que existe en nuestro país, el porcentaje de las especies vegetales medicinales estudiadas desde un punto de vista científico es muy bajo. Por lo tanto, es necesario continuar realizando investigaciones que, a partir de un criterio etnomédico, puedan conducir a la caracterización química y farmacológica de los compuestos responsables del efecto terapéutico que se les atribuye a las especies vegetales empleadas en la Medicina Tradicional Mexicana y se pueda, con base en un criterio científico, validar eventualmente su uso tradicional. Dentro de este contexto, se encuentra el caso del “capulín” (Prunus serotina), árbol cuya corteza, hojas, inflorescencias y frutos se utilizan en la Medicina Tradicional Mexicana para tratar padecimientos cardiacos, pulmonares e intestinales. Específicamente, el fruto es empleado, solo o preparado en jarabes y licores, para tratar la tos y la diarrea.

Existen escasos estudios químicos y farmacológicos acerca de P. serotina. De hecho, solo se ha reportado un estudio fitoquímico biodirigido realizado con las hojas de esta especie por nuestro grupo de trabajo. Dicho estudio permitió la obtención de tres compuestos bioactivos con efecto vasorrelajante.

Adicionalmente, nuestro grupo encontró evidencias que indicaron que los frutos de esta especie contienen metabolitos secundarios no polares capaces de producir relajación de la musculatura lisa vascular. Este hallazgo sugiere que los frutos del capulín también podrían ser útiles para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, tales como la hipertensión arterial. 2

Con base en estos antecedentes, se plantea el presente proyecto de investigación que tiene por objeto realizar la caracterización química y farmacológica de los metabolitos secundarios no polares que producen los efectos vasorrelajantes inducidos por el extracto de diclorometano y el aceite esencial obtenidos a partir de los frutos del capulín.

3

II. ANTECEDENTES

2.1 Estudios químicos realizados sobre especies del género Prunus

El género Prunus pertenece a la familia Rosaceae e incluye alrededor de 400 especies de amplia distribución en las regiones de clima caliente y templado, mayormente en el hemisferio norte. Este género comprende árboles o arbustos perennifolios o caducifolios, a veces espinosos; el fruto, en forma de drupa y a veces carente de pulpa jugosa, posee hueso liso o rugoso y por lo general contiene una sola semilla con endospermo escaso o ausente. Algunos ejemplos de especies del género Prunus son P. persica (durazno), P. domestica (ciruelo), P. armeniaca (chabacano) y P. serotina (capulín), entre otros (Calderón de Rzedowski y Rzedowski, 2001; 2005).

Se han aislado e identificado diferentes metabolitos secundarios a partir de las diferentes especies del género Prunus. Entre éstos se encuentran: flavonoides que incluyen glicósidos de camferol (Olszewska y Wolbis, 2001; Jung et al., 2003) y de quercetina (Olszewska y Wolbis, 2001; Milbury et al., 2006), tales como la hiperina (Olszewska, 2005; Wijeratine et al., 2006); antocianidinas, tales como glicósidos de cianidina (Ordaz-Galindo et al.,1999; Deineka et al., 2004; Ruiz et al., 2005); glicósidos cianogénicos: prunasina y amigdalina (Santamour, 1998; Yoshikawa et al., 2002; Lu et al., 2005); triterpenos como el ácido ursólico (Wolbis et al., 2001; Shengmin et al., 2002; Amico et al., 2006); algunos compuestos aromáticos simples: ácido procatéquico (Shegmin et al., 2002; Kayano et al., 2004; Milbury et al., 2006); ácido vainíllico (Kayano et al., 2004; Milbury et al., 2006) y fenilpropanoides como el ácido cafeico (Kayano et al., 2004), el ácido p-cumárico (Kayano et al., 2004) y un glicósido del ácido ferúlico (Kayano et al., 2004).

4

2.2 Prunus serotina

2.2.1 Taxonomía, características morfológicas y distribución El “capulín” ha sido descrito por varios autores desde 1651, pero fue hasta 1788 en que Ehrhart le dio su denominación científica como Prunus serotina (McVaugh, 1951). Este nombre científico es el que emplea la Comisión Nacional para el Conocimiento de la Biodiversidad (CONABIO), dentro del Sistema Integrado de Información Taxonómica

(SIIT) para establecer su clasificación

taxonómica (SIIT, CONABIO, 2008), la cual se muestra en el Cuadro 2.1.

Cuadro 2.1 Clasificación taxonómica de P. serotina Nombre científico

Prunus serotina Ehrh

Reino

Plantae

Sub-reino

Tracheobionta

División

Magnoliophyta

Clase

Magnoliopsida

Sub-clase

Rosidae

Orden

Rosales

Familia

Rosaceae

Género

Prunus

Especie

serotina

Variedades

P. serotina var. eximia P. serotina var. rufula P. serotina var. serotina P. serotina var. virens

Sin embargo, algunos autores afirman que Prunus serotina no es el capulín de las tierras altas de México y sugieren para este último el nombre de Prunus salicifolia Kunth o bien, Prunus serotina var. salicifolia (Morton, 1987). 5

Dejando a un lado esta divergencia, cuya resolución escapa de los objetivos de este trabajo, se empleará para fines prácticos el nombre de Prunus serotina tal como lo propone la CONABIO.

Por otra parte, el capulín recibe en México diversos nombres, dependiendo de la región y la lengua indígena predominante: Shencua, Shengua, Xengua (l. tarasca, Mich.); Cusabi (l. tarahumara, Chih.); Uasiqui, Jeco (l. guarigia, Chih.); Pakshumk (l. mixe,Oax.); T-nundaya (l. mixteca, Oax.); Tzu'uri (l. cora, Nay.); Paté, Shimal-ma-lu (l. chontal, Oax.); Capulitaunday (l. zapoteco, Oax.); Detze, Ghohto (l. Otomí) (Comisión Nacional Forestal, 2008).

Las

características morfológicas

de

esta

especie

se

enlistan a

continuación (Comisión Nacional Forestal, 2008): Forma: Árbol o arbusto monopódico, perennifolio o caducifolio, de 5 a 15 m con diámetro a la altura del pecho de hasta 1.2 m. Copa / Hojas: Copa ancha de forma ovoide que produce una sombra densa. Hojas estipuladas, simples, alternas, cortamente pecioladas, ovaladas a lanceoladas, de 5 a 16 cm de largo por 2 a 5 cm de ancho, margen aserrado; haz verde oscuro y brillante. Tronco: largo y recto en el bosque, pero en los claros es corto y ancho. Ramas alternas, erguido-extendidas. Corteza: café o grisácea casi lisa y glabra, exceptuando las ramas tiernas que a veces son pubescentes. Flores: numerosas, pequeñas y blancas, agrupadas en racimos axilares colgantes y largos, de 10 a 15 cm, con pedicelos de 5 a 10 mm de largo. Florece en los meses de marzo y abril. Fruto: de sabor agridulce y algo astringente, es una drupa globosa que generalmente tiene un diámetro de 6 a 8 mm, sin embargo, en ocasiones puede llegar a tener 1 cm de diámetro; la piel del fruto es de color negro rojizo y la carne es verde translúcida (Ordaz-Galindo et al., 1999; Calderón de Rzedowski y Rzedowsky, 2001). Fructifica entre mayo y agosto. 6

Semilla: esférica y rodeada por un endocarpio o hueso leñoso (almendra) de sabor amargo.

Como características notables de P. serotina se pueden mencionar su baja necesidad de riego y su gran tolerancia a la contaminación ambiental y a los suelos ácidos y pedregosos. Por este motivo esta especie suele emplearse para rehabilitación de suelos. Sin embargo, necesita luz abundante por lo que no se desarrolla a la sombra (Comisión Nacional Forestal, 2008). En la Figura 2.1 se muestra una imagen del árbol y de los frutos del capulín.

Figura 2.1 El árbol de P. serotina y su fruto

Esta especie es originaria de América. Se extiende actualmente desde Canadá hasta Guatemala. Se le encuentra en las regiones montañosas, usualmente en lugares templados o fríos en altitudes de 2,500 metros o más, en los estados de Chihuahua, Chiapas, Durango, Guanajuato, Jalisco, Michoacán, Morelos, Oaxaca, Puebla, San Luis Potosí, Tamaulipas, Veracruz y el Distrito Federal. El árbol del capulín es frecuente en el bosque de encino, bosque de pino y en los bosques mesófilos de montaña (Comisión Nacional Forestal, 2008). 7

2.2.2 Usos de P. serotina en la Medicina Tradicional Mexicana

El árbol de P. serotina ha sido empleado tradicionalmente en nuestro país con fines medicinales. La corteza se usa como tónico, sedante, digestivo y para el tratamiento de síntomas relacionados con procesos inflamatorios, tales como la gripa, la fiebre y la garganta cerrada. La corteza se utiliza también para tratar padecimientos pulmonares y cardiacos (Mills y Willoughby, 1996). Las hojas se usan para el tratamiento del asma, la tos, la hipertensión y la diarrea. Por su parte, el fruto se emplea para preparar remedios contra la diarrea y la tos (Martínez, 1991). Adicionalmente a su uso medicinal, el fruto de P. serotina es muy apreciado como complemento alimenticio por su agradable sabor; se come crudo o en conserva, en tamales, licores y bebidas frescas (Martínez, 1991).

2.2.3 Estudios fitoquímicos y farmacológicos realizados sobre P. serotina por otros grupos de trabajo

Se han realizado muy pocos estudios fitoquímicos sobre P. serotina y la mayor parte de éstos se han centrado en el estudio de las hojas. Biessels et al. (1974) reportaron la purificación del aldehído ursólico y un derivado del ácido ursólico a partir de las hojas de esta planta. De manera adicional, se identificó por HPLC la presencia de cinco glicósidos de quercetina, tres glicósidos de camferol y dos glicósidos de isoramnetina en las hojas e inflorescencias (Olszewska, 2005). En las semillas se detectó la presencia de la amigdalina y la prunasina (Santamour, 1998).

Con relación al fruto, sólo se ha reportado un estudio realizado con la piel de éste, en la cual se identificó la presencia de antocianidinas que pueden tener un posible uso comercial como colorante vegetal (Ordaz-Galindo et al., 1999). El Cuadro 2.2 presenta un resumen de los principales metabolitos aislados a partir de esta especie. 8

Cuadro 2.2 Principales metabolitos secundarios aislados e identificados en P. serotina (Villa De la Torre, 2008) COMPUESTOS

REFERENCIA

OH

HO

OH

O

HO

O

OH

HO

OH

O OH

OH

OH

O

O

O

Olszewska , 2005

H

OH

OH

camferol -3-O--D-

O O

CH2OH

glucopiranósido

camferol -3-O--L-

(astragalina)

arabinofuranósido (juglanina) OH

OH

OH

HO

O HO

O OH

Olszewska, 2005

HO

O

O

OH

OH

O

O

OH

O

OH

O

OH OH OH

camferol -3-O--D-

quercetina -3-O-

xilopiranósido

galactósido (hiperina)

OH

OH OH OH

OH

HO

O

OH

HO

O

OH O O OH

O

Olszewska, 2005

O

HO

OH OH

O

O OH

OH OH O

O

HO

quercetina -3-O-(2´´-O--

quercetina -3-O--L-

L-ramnopiranosil)--D-

arabinopiranósido

glucopiranósido

(guaijaverina)

9

Cuadro 2.2 Principales metabolitos secundarios aislados e identificados en P. serotina (continuación) COMPUESTOS

REFERENCIA OH

OH

OH

OH

HO

HO

O OH

O

OH

HO

O OH

O OH

O

OH

OH

O

Olszewska, 2005

OH

O

O

OH

quercetina -3-O--

quercetina -3-O--L-

glucopiranósido

arabino furanósido

(isoquercetrina)

(avicularina)

OH

OH OH

HO

OH OH

O

OH HO

OH OH

OH

HO

O

HO O OH

OH O

O

OH

O

OH

Olszewska, 2005

O

O

O OH

O

O

O

HO

OH

quercetina -3-O-rutinósido

quercetina -3-O-(2´´--L-

(rutina)

ramnopiranosil)--Dgalactopiranósido OCH3

OCH3

OH

OH

HO

HO

O

O

Olszewska, 2005

HO

O

CH2OH

O OH

OH OH

O OH

O

O

OH

O

O

H OH

OH O

OH

OH

isoramnetina -3-O--

isoramnetina -3-O-

arabinofuranósido

rutinósido

10

Cuadro 2.2 Principales metabolitos secundarios aislados e identificados en P. serotina (continuación) COMPUESTOS

REFERENCIA OH OH

OH

HO

OH + O

HO

+ O HO O

OH

OH

O

O

OH

O

Ordaz-Galindo et al.,

OH

OH HO

1999

O

OH OH

O

H3C HO HO

OH

cianidina -3-O-glucósido cianidina -3-O-rutinósido OH

OH

O

O

HO

O

HO

HO

OH

O

HO OH

HO

NC H

H O CN

amigdalina

CHO

H H

O

OH

prunasina

H

Santamour, 1998

HO

H

H

HO

COOM e

Biessels et al., 1974

H HO H

H H HO

aldehído ursólico

H

2,3-dihidroxi-urs-12-en 28-ato de metilo

11

2.2.4 Estudios fitoquímicos y farmacológicos realizados sobre P. serotina por nuestro grupo de trabajo

En una investigación previa, nuestro grupo de trabajo realizó el estudio de diez plantas utilizadas en la Medicina Tradicional Mexicana para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, con el objeto de determinar su actividad farmacológica y, eventualmente, validar científicamente su uso tradicional. La primera fase de este estudio consistió en la evaluación de los extractos acuosos preparados a partir de estas especies vegetales sobre el tono del músculo liso arterial (Ibarra-Alvarado et al., 2009a).

Una de las especies seleccionadas a partir del estudio etnobotánico y bibliográfico preliminar fue P. serotina. La evaluación farmacológica indicó que el extracto acuoso preparado a partir de las ramas y hojas de esta especie produce una relajación, dependiente de la concentración (EC50 190.4 µg/ml; Emax 70.2%), del músculo liso arterial (Ibarra-Alvarado et al., 2009a). En base a estos resultados, se inició el estudio fitoquímico biodirigido de las hojas.

En ese estudio se preparó el extracto metanólico de las hojas de P. serotina, el cual se sometió a un fraccionamiento primario, mediante particiones con acetato de etilo y diclorometano. Las fracciones resultantes fueron evaluadas empleando el modelo de aorta aislada de rata (Figura 2.2). La fracción de acetato de etilo, la cual presentó el mayor porcentaje de relajación, fue sometida a un fraccionamiento cromatográfico, el cual condujo a la purificación de tres compuestos conocidos, el hiperósido, la prunina y el ácido ursólico (IbarraAlvarado et al., 2009b).

12

Relajación (%)

80

Metanol acuoso (50%) Acetato de etilo Diclorometano

60 40 20 0 1

3.16

10

31.6 µg/ml

100

316

Figura 2.2 Efecto vasorrelajante sobre la aorta de rata de las fracciones de metanol, acetato de etilo y diclorometano obtenidas de las hojas de P. serotina

La evaluación farmacológica de los compuestos purificados indicó que el hiperósido (EC50 = 91.3 ± 14.1 μg/ml) y el ácido ursólico (EC50 = 154.4 ± 7.5 μg/ml) indujeron una significativa relajación, dependiente de la concentración, de la aorta aislada de rata (Cuadro 2.3). El compuesto que presentó el efecto máximo mayor fue el ácido ursólico (Figura 2.3) (Ibarra-Alvarado et al., 2009b).

Cuadro 2.3 Valores de EC50 y Emax del efecto vasorrelajante inducido por los compuestos purificados a partir de las hojas de P. serotina Compuesto

EC50 (µg/ml)

Emax (%)

Hiperósido

91.3 ± 14.1

92.3 ± 7.7

Prunina

66.0 ± 19.4

44.2 ± 5.6

Ácido Ursólico

154.4 ± 7.5

94.1 ± 5.9

13

100

ACh Hiperósido Ácido ursólico

Relajación (%)

80

Prunina

60

40

20

0 -1 0 1 2 Log concentración (µg/ml)

3

Figura 2.3 Curvas concentración-respuesta del efecto vasodilatador de la acetilcolina, empleada como control positivo, el hiperósido, la prunina y el ácido ursólico en segmentos de aorta intactos de rata

Nuestro grupo de trabajo también abordó el estudio farmacológico del fruto de P. serotina, en el cual se evaluó el efecto del aceite esencial y de los extractos acuosos y orgánicos (etanólico y de diclorometano), preparados a partir de los frutos de tres recolectas diferentes de capulín, sobre la musculatura lisa arterial y bronquial.

La selección de los solventes empleados para la obtención de los extractos se hizo con base en las preparaciones que son empleadas etnomédicamente con fines medicinales y que incluyen decocciones en agua y licores. Adicionalmente, se decidió preparar extractos de CH2Cl2 y los aceites esenciales. De tal manera, que con la selección de solventes polares (agua y etanol), no polares (CH2Cl2) y la obtención de los aceites esenciales, se 14

garantizara la extracción de metabolitos secundarios de diferentes polaridades con cierto grado de selectividad.

Las recolectas incluyeron muestras provenientes de Cholula, Puebla; Huimilpan, Querétaro y Huejotzingo, Puebla. Se guardaron muestras de referencia que se depositaron en la colección etnobotánica del Herbario Nacional, Instituto de Biología, UNAM.

La evaluación demostró que los extractos acuosos de los frutos de capulín provenientes de los tres sitios de recolecta inducen relajación de la musculatura lisa vascular. El extracto de la recolecta de Cholula relajó con mayor potencia (EC50=17.2µg/ml) la aorta de rata en comparación con las recolectas de Huimilpan (EC50= 85.7µg/ml) y Huejotzingo (EC50= 23.2µg/ml) (Villa De la Torre, 2008). Con respecto a los extractos etanólicos, todos indujeron un efecto vasorrelajante, el cual se incrementó de manera significativa a las concentraciones de 316 y 1000 g/ml. En este caso, al igual que lo que sucedió con los extractos acuosos, los extractos de las recolectas de Cholula y Huimilpan indujeron una relajación de aproximadamente 40% y 50%, respectivamente a la máxima concentración evaluada (1000 g/ml). El extracto de los frutos de Huejotzingo, por otra parte indujo una vasorrelajación menor del 30% a la máxima concentración evaluada (Villa De la Torre, 2008).

Por otra parte, de manera similar al efecto inducido por los extractos polares, todos los extractos de CH2Cl2 produjeron un efecto vasodilatador que fue más evidente a las concentraciones de

316 y 1000 g/ml. En este caso, el

extracto proveniente de los frutos de Huejotzingo indujo la mayor relajación de la aorta a la concentración de 1000 g/ml (Figura 2.4).

15

80

Cholula Huimilpan Huejotzingo

Relajación (%)

60

40

20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (g/ml)

Figura 2.4 Curvas-concentración-respuesta del efecto vasorrelajante de los extractos de CH2Cl2 de las diferentes recolectas de los frutos de P. serotina en segmentos de aorta intactos de rata (Villa De la Torre, 2008)

Finalmente, los aceites esenciales obtenidos de los frutos de las tres recolectas también relajaron el músculo liso arterial, de una manera dependiente de la concentración (Figura 2.5). Este caso fue similar al anterior, los frutos de la recolecta de Huejotzingo relajaron con mayor eficacia la aorta de rata, en comparación con las recolectas de Cholula y Huimilpan (Villa De la Torre, 2008).

Los resultados obtenidos a partir de la evaluación farmacológica de los extractos y aceites esenciales de los frutos del capulín indican que los frutos provenientes de las recolectas de Huimilpan y Cholula, contienen mayor cantidad de metabolitos polares que pudieran ser los responsables del efecto vasorrelajante inducido por los extractos acuosos y etanólicos preparados a partir de los frutos de estas recolectas. Por otra parte, como lo pone en evidencia la mayor eficacia mostrada por el extracto de CH2Cl2 y el aceite esencial preparado a partir de los frutos de la recolecta de Huejotzingo, estos frutos tienen un mayor contenido de metabolitos no polares que son los responsables del efecto vasodilatador. 16

80 Cholula Huimilpan Huejotzingo

Relajación (%)

60

40

20

0 0

1

2

Log concentración (g/ml)

Figura 2.5 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante de los aceites esenciales de las diferentes recolectas de los frutos de P. serotina en segmentos de aorta intactos de rata (Villa De la Torre, 2008)

De acuerdo con los antecedentes quimiotaxónomicos del género Prunus, es muy factible esperar que los frutos de esta planta contengan metabolitos polares como glucósidos de flavonoides, pero también es evidente que la planta produce otro tipo de compuestos vasorrelajantes no polares, cuya identidad se desconoce a la fecha, tal como lo evidencian nuestros resultados.

17

2.3 Enfermedades cardiovasculares: incidencia y etiología

Las enfermedades cardiovasculares constituyen una de las principales causas de mortalidad y se han convertido en uno de los mayores riesgos de salud a nivel mundial, ya que son las responsables de aproximadamente el 30% de muertes ocurridas al año (Ramaa, 2006). Esta cifra implica que los factores de riesgo asociados con las enfermedades cardiovasculares, tales como la obesidad, los hábitos alimenticios con altos contenidos en grasas saturadas y grasas trans, el incremento del consumo de sodio, tabaco y alcohol, la falta de ejercicio físico, así como otros cambios relacionados con la urbanización e industrialización no han sido suficientemente controlados.

En nuestro país, las enfermedades del corazón en conjunto constituyen la primera causa de mortalidad general. Cuando se desagrupan como causa única, la más prevalente de ellas, la cardiopatía isquémica se convierte en la segunda causa de mortalidad general, debajo de la diabetes mellitus cuya mortalidad es originada principalmente por complicaciones cardiovasculares. Dentro de este ámbito, la hipertensión arterial es uno de los principales factores de riesgo para enfermedad arterial coronaria y el accidente vascular cerebral (Velázquez et al., 2002, 2007).

La hipertensión, definida como una elevación de la presión sanguínea sistólica y diastólica arriba de 140/90 mm Hg, es la enfermedad cardiovascular más común. En México, en el año 2001, de 441,004 muertes que fueron registradas,

81,248

fueron

provocadas

por

enfermedades

relacionadas

directamente con la hipertensión (Aguirre-Crespo et al., 2005).

El tono vascular juega un papel importante en la regulación de la presión sanguínea y existen numerosas evidencias que sugieren que alteraciones en la función del endotelio vascular, el cual controla la relajación del músculo liso vascular, contribuyen a la patogénesis y a la expresión clínica de varias 18

enfermedades cardiovasculares. El desarrollo y mantenimiento de la hipertensión arterial involucra una producción deficiente de factores vasorrelajantes derivados de endotelio, lo cual resulta en una disminución del tono vascular, lo que a su vez provoca un incremento en la resistencia vascular y finalmente, contribuye a elevar la presión sanguínea (Kang et al., 2006).

Con base en estos antecedentes, resulta evidente que nuevas estrategias terapéuticas que involucren efectos relajantes de la musculatura lisa vascular representan un gran potencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades arterioscleróticas vasculares.

2.4 Fisiología de los vasos sanguíneos

2.4.1 Estructura de la pared vascular

La pared vascular es un órgano activo, flexible e integrado por componentes celulares (células endoteliales, musculares lisas y fibroblastos) y componentes no celulares, como la matriz extracelular. En forma dinámica estos componentes modifican su forma, aumentan, disminuyen o se reorganizan, en respuesta a estímulos fisiológicos y patológicos, manteniendo así la integridad del vaso en condiciones fisiológicas o participando en la alteración vascular que aparece en enfermedades como la hipertensión y la aterosclerosis (Risler et al., 2002).

En todos los tipos de arterias se pueden distinguir tres capas concéntricas: a) una capa interna, la túnica íntima, constituida por células endoteliales con su eje mayor orientado longitudinalmente; b) una capa media ó túnica media, compuesta fundamentalmente por células musculares lisas, dispuestas circularmente, y c) una capa externa, la túnica adventicia, constituida por fibroblastos y fibras de colágeno que están orientadas longitudinalmente. La capa íntima y la media están 19

separadas por la lámina elástica interna, y la media y la adventicia están separadas por la lámina elástica externa (Navarro-Cid et al., 1999).

La túnica íntima de las arterias elásticas está constituida por el endotelio y un espacio sub-endotelial compuesto por una matriz extracelular. En las arterias musculares la íntima es más fina que en las arterias elásticas, y en las arterias de pequeño calibre y arteriolas está constituida básicamente por endotelio y una capa sub-endotelial muy estrecha (Ganong, 2000).

El principal componente de la túnica media en las arterias elásticas es la elastina, que proporciona al vaso la elasticidad necesaria para adaptarse a los cambios de presión originados por el flujo pulsátil del corazón y dota a estas arterias de una capacidad de amortiguación que permite mantener un flujo sanguíneo continuo (Navarro-Cid et al., 1999).

La túnica adventicia está constituida por fibroblastos incluidos en una matriz extracelular compuesta de grandes haces de fibras de colágeno y una red laxa de fibras elásticas. En la túnica adventicia se observan las terminaciones nerviosas y pequeños capilares que penetran ligeramente en la media (Navarro-Cid et al., 1999; Ganong, 2000).

2.4.2 Endotelio

2.4.2.1 Estructura y funciones del endotelio vascular

El endotelio vascular, está situado en una posición anatómica estratégica entre la sangre y la pared vascular, lo cual le permite actuar como receptor y transmisor de señales. Las células endoteliales son capaces de registrar cambios hemodinámicos y responder a mensajeros químicos circulantes o procedentes de células vecinas y, en consecuencia, reaccionar a dichos cambios, mediante la 20

liberación de numerosos factores vasoactivos (Dejana et al., 1995; Navarro-Cid et al.,1999; Ganong, 2000).

El endotelio es considerado así, el principal órgano de regulación vascular con acción exocrina, paracrina y autocrina, que está implicado en diversos procesos

vasoactivos,

metabólicos

e

inmunitarios.

Entre

los

factores

biológicamente activos sintetizados y liberados por las células endoteliales caben destacar: la prostaciclina (PGI2), el óxido nítrico (NO), el factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF), la endotelina (ET), la prostaglandina H 2 (PGH2), el tromboxano A2 (TXA2), los heparinoides, el factor de crecimiento transformante  (TGF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF), el factor derivado de plaquetas (PDGF), el activador tisular del plasminógeno (t-PA), el inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1), especies reactivas de oxígeno (radicales superóxido e hidroxilo, peróxido de hidrógeno), interleucinas, quimiocinas, moléculas de adhesión de monocitos, entre otros (Dejana et al., 1995).

El endotelio también regula la homeostasis y la trombosis mediante sus funciones antiplaquetarias, anticoagulantes y fibrinolíticas, así como la inflamación, a través de la expresión de moléculas quimiotácticas y de adhesión. Ello hace del endotelio un verdadero sistema receptor y emisor de señales, que explica la razón por la que una hormona o la hemodinámica sanguínea pueden modificar la función vascular (Navarro-Cid et al., 1999; Ganong, 2000).

En condiciones normales, el endotelio presenta una importante actividad antitrombógena que involucra las acciones del NO y la PGI2, mensajeros que inhiben la adhesión y la agregación plaquetaria mediante aumentos respectivos de la concentración intraplaquetaria de GMPc y AMPc. En condiciones fisiológicas predominan las acciones antiagregantes y anticoagulantes, mientras que en pacientes hipertensos, dislipidémicos o diabéticos sucede lo contrario, por lo que

21

el endotelio participa en las complicaciones trombóticas de estos trastornos (Navarro-Cid et al., 1999).

2.4.2.2 Factores relajantes derivados del endotelio

El mantenimiento del tono vasomotor depende de forma decisiva del equilibrio entre las acciones relajantes del músculo liso vascular mediadas por el NO, la PGI2 y el EDHF, y las acciones constrictoras de la ET-1 y el TXA2. Los factores relajantes derivados del endotelio y en especial el NO, además de equilibrar las acciones constrictoras mencionadas, también equilibran las de agentes con acción sistémica como la angiotensina II, las catecolaminas y la vasopresina (Moncada y Higgs, 1991).

La PGI2 se sintetiza predominantemente en las células endoteliales vasculares a partir del ácido araquidónico, mediante la acción del complejo enzimático ciclooxigenasa-PGI2 sintasa. Sus principales acciones son: inhibición de la agregación plaquetaria y relajación de las células musculares lisas (Moncada y Higgs, 1991).

Sin embargo, no parece probable que la PGI2 este ejerciendo un efecto tónico vasodilatador importante sobre el músculo liso, y por tanto, su participación en el control de la presión arterial en condiciones normales aparentemente no es relevante. Su mecanismo de acción celular depende de la activación de la adenilato ciclasa (AC) y se inactiva mediante una degradación enzimática. Los principales factores capaces de estimular la síntesis y la liberación de la PGI 2 son la angiotensina II, la acetilcolina (Ach) o la bradiquina (BK), así como productos liberados de las plaquetas como la serotonina y el PDGF (Navarro-Cid et al., 1999).

Por otra parte, el NO se sintetiza a partir de la arginina en una reacción catalizada por la óxido nítrico sintasa (NOS) (Schmidt et al., 1993). Se han 22

identificado actualmente tres isoformas: NOSe, forma constitutiva en las células endoteliales; NOSi, isoforma inducible presente en macrófagos y células musculares lisas; NOSn, forma neuronal constitutiva presente en el tejido nervioso y en estructuras medulares renales. Las NOSn y NOSi se activan por los agentes que incrementan

la concentración del Ca2+ intracelular, entre los cuales se

incluyen los vasodilatadores Ach y BK. Sin embargo, la NOS en las células inmaduras no se induce por el Ca2+ sino que se activa por las citocinas (Schmidt et al., 1993; Fostermann et al., 1994; Li y Fostermann, 2000). El NO formado por el endotelio difunde hacia las células del músculo liso, en donde activa a la guanilatociclasa soluble (GCs) para producir cGMP; éste, a su vez, media la relajación del músculo liso vascular (Kamisaki et al.,1986; Humbert et al., 1990; Ignarro, 1990). El NO es un radical con un electrón desapareado, que ocupa un orbital  anti-enlazante, y que por lo tanto es muy inestable, actuando como una hormona paracrina. La acción fundamental del NO es la relajación del músculo liso de la capa media de las arterias y las venas, la inhibición de la agregación plaquetaria, la inhibición del crecimiento y la proliferación de las células del músculo liso, y la inhibición de la adhesión de monocitos y leucocitos del endotelio (Moncada y Higgs, 1991).

Como consecuencia, el NO desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la función, la estructura

y la integridad

vasculares. Los

defectos en la producción de NO contribuyen a la patogénesis de la hipertensión, la trombosis vascular, la aterogénesis, la reestenosis y la lesión prostangioplástica (Pfeifer et al., 1999; Hofmann et al., 2000).

El NO se libera de las células endoteliales en respuesta a numerosos factores, tanto físicos como de tipo humoral. El principal factor físico responsable de la liberación del NO por las células endoteliales son las llamadas fuerzas de cizallamiento o la presión ejercida por la sangre sobre el endotelio vascular 23

(Navarro-Cid y col., 1999). Debido a su acción de antiagregante plaquetario, el NO participa junto con la PGI2 en la inhibición de la agregación plaquetaria (Murad, 1996).

La degradación del NO se produce como consecuencia de la reacción con el radical superóxido (O2·-) que da lugar al peroxinitrito (ONOO-), el cual a su vez se degrada a otro agente oxidante, el radical hidroxilo, y nitrato (Beckman et al., 1994; Rubbo et al., 1996).

Otra sustancia química liberada por el endotelio es el factor hiperpolarizante del endotelio (EDHF). Este factor produce relajación del músculo liso vascular al inducir hiperpolarización de su membrana celular. La hiperpolarización y la relajación inducidas por el EDHF parecen ser debidas a un incremento en la conductancia al K+ a través de canales de potasio que son dependientes de calcio y ATP, los cuales se encuentran localizados en el músculo liso vascular. Respecto a su papel fisiológico o fisiopatológico, parece ser un mediador importante en la relajación, dependiente del endotelio, en las arterias mesentéricas de resistencia (Navarro-Cid et al., 1999).

2.4.2.3 Mecanismo de relajación de la musculatura lisa vascular

La relajación de los vasos sanguíneos depende en gran medida de las vías de señalización iniciadas por los factores vasorrelajantes liberados por el endotelio: NO, PGI2 y EDHF. Las vías del NO y de la prostaciclina son iniciadas por la estimulación provocada por ligandos como la acetilcolina (ACh), la 5-hidroxitriptamina (5-HT) o la histidina (His) sobre el receptor acoplado a proteína G (RAPG), de la célula endotelial.

24

En el caso de la vía del NO, la estimulación de los RAPG activa la fosfolipasa C (PLC), la cual induce la producción de diacilglicerol (DAG) y de inositol trifosfato (IP3); este último induce la liberación de Ca2+ en el citoplasma de la célula endotelial. El Ca2+ activa la calmodulina (CaM) y este complejo activa la óxido nítrico sintasa (NOS) para que se produzca NO a partir de la arginina (Arg). Éste difunde a las células del músculo liso arterial estimulando la guanilato ciclasa soluble (sGC). La estimulación de esta enzima provoca un aumento en la producción de GMPc, el cual a su vez provoca la activación de una proteína cinasa G (PKG) que dará como resultado la disminución del Ca2+ citoplasmático provocando con ello la relajación. Por otra parte, la estimulación de los RAPG puede activar la fosfolipasa A2 (PLA2) provocando la producción de ácido araquidónico (AA) que será el sustrato de la ciclooxigenasa (COX) para formar la prostaciclina (PGI2). La PGI2 llega a la célula muscular y mediante la estimulación de su receptor (RPGI) inicia la activación de la adenilato ciclasa (AC) para aumentar la producción de AMPc que a su vez activará una proteína cinasa A (PKA) que actuará provocando la disminución de Ca2+ y con ello la relajación.

Finalmente, el EDHF proveniente de la célula endotelial activa los canales de K voltaje dependientes con lo que genera una hiperpolarización que conduce a una eventual relajación de la célula muscular.

La Figura 2.6 muestra las cascadas de señalización que conducen a la relajación de la musculatura lisa vascular inducida por los factores endoteliales NO, PGI2 y EDHF. 2.4.2.4 Factores vasoconstrictores derivados del endotelio

Las células endoteliales también producen endotelina-1, que es el vasoconstrictor más potente conocido hasta la fecha. La endotelina-1 (ET-1), la endotelina-2 (ET-2) y la endotelina-3 (ET-3) constituyen los miembros de una 25

familia de polipéptidos similares de 21 aminoácidos, los cuales provocan una vasoconstricción intensa de las arterias coronarias y tienen efectos inotrópicos y cronotrópicos positivos en el miocardio (Liu et al., 1997; Miwa et al., 1999).

ACh 5-HT Ca+2

PLC

RAPG His

DAG

PI

IP3 PLA2 Ca

AA

2+

Ca2+

CaM

CaM

RE Ca

COX

2+

Cit

NOS

Ca+2

NO

Arg

Célula endotelial

PGI2 EDHF

NO

Célula muscular

RPGI GTP sGC ATP AC

AMPc

GMPc

K+

PKG

PKA

K+ Ch

K+

Hiperpolarización

2+

↓Ca

Relajación

Figura 2.6 Mecanismos de transducción iniciados por los factores relajantes derivados de endotelio en la célula de músculo liso arterial

Las endotelinas, como otros mediadores derivados del endotelio, se producen bajo condiciones basales, así como por estimulación mecánica, química y humoral. Entre los estímulos más importantes para la producción de estos 26

vasoconstrictores se encuentran la trombina, la angiotensina II, la adrenalina, la vasopresina, el TGF, los ésteres de forbol y la interleucina-1 (Navarro-Cid et al., 1999).

2.4.3 Músculo liso

La capa media y la túnica media están compuestas fundamentalmente por células musculares lisas, algunos fibroblastos, fibras de colágeno y otros componentes de la matriz intersticial. Las células musculares lisas se encuentran en la pared de todos los vasos sanguíneos, a excepción de los capilares, y son las responsables de que los vasos puedan modificar su diámetro de acuerdo con las necesidades de aporte sanguíneo de cada tejido. Estas células son fusiformes y presentan un único núcleo en posición central. Su disposición es circular, formado varias capas alrededor de la circunferencia del vaso.

El músculo liso contiene filamentos de actina y de miosina, de características químicas similares a las del músculo estriado; sin embargo, las células musculares lisas contienen una gran cantidad de una proteína reguladora denominada calmodulina. Las células musculares lisas y estriadas difieren en la manera en que se inicia la contracción (Christ y Brink, 2000).

2.4.3.1 Mecanismo de contracción de la musculatura lisa vascular

El acontecimiento iniciador de la contracción del músculo liso es un aumento de calcio intracelular. Este aumento puede ser causado por estimulación nerviosa de la fibra lisa, por estimulación hormonal, por distensión de la fibra, o incluso por cambios en el ambiente químico de la fibra (Guyton y Hall, 2001).

El calcio se une a la calmodulina, la cual activa la formación de los puentes transversales entre la miosina y la actina, lo cual provoca la contracción. Esta

27

activación, y la contracción subsiguiente, se producen según la siguiente secuencia: 1) Los iones de calcio se unen a la calmodulina. 2) El complejo de calmodulina y calcio se une y activa a la miosina cinasa, una enzima fosforiladora (Kamm y Stull, 1985; Somlyo y Somlyo, 1994; Heller et al., 2003). 3) Una de las cadenas ligeras de cada cabeza de miosina, denominada cadena reguladora, se fosforila por la acción de la miosina cinasa. Cuando esta cadena no esta fosforilada, no se produce el ciclo de enlace-separación de la cabeza con el filamento de actina. Cuando la cadena reguladora está fosforilada, la cabeza tiene la capacidad de unirse al filamento de actina y seguir todo el proceso de los ciclos, de la misma manera que en el músculo esquelético, causando así la contracción muscular (Guyton y Hall, 2001; Heller et al., 2003).

2.4.4 Matriz extracelular La

estructura

de

la

pared

vascular, así como

sus propiedades

biomecánicas, dependen en gran medida de la matriz extracelular, que está compuesta por fibras elásticas y de colágeno incluidas en un gel compuesto por proteoglucanos, ácido hialurónico, glucoproteínas y agua. Un equilibrio adecuado entre los componentes de la matriz permite mantener la integridad de la pared y la resistencia a roturas y hemorragias (Navarro-Cid et al., 1999).

2.4.5 Túnica adventicia Es una capa poco definida de tejido conectivo constituida por fibroblastos y haces de colágeno orientados longitudinalmente, así como por una red laxa de fibras elásticas delgadas y numerosas terminaciones nerviosas. Funcionalmente, se puede decir que la túnica adventicia aísla el vaso de otros tejidos y proporciona el soporte de nervios y vasos que penetran en la pared de los vasos (Navarro-Cid et al., 1999).

28

III. JUSTIFICACIÓN

A lo largo del tiempo, y como elementos asociados a todas las culturas, las plantas han sido objeto de atención, tanto por sus propiedades organolépticas y alimenticias, como por sus efectos medicinales. En el caso particular de México, es bien conocido el hecho de que nuestro país posee una gran tradición en el empleo de plantas medicinales, cuyo uso se remonta a la época prehispánica, en la que numerosas plantas eran empleadas para tratar diversos padecimientos. Sin embargo, a pesar de este hecho y de que la biodiversidad de nuestro país se encuentra entre las tres primeras a nivel mundial, existen pocos estudios multidisciplinarios que involucren investigaciones etnomédicas, químicas y farmacológicas de especies vegetales valiosas por sus propiedades medicinales y nutraceúticas.

Dentro de este contexto nuestro grupo de trabajo realizó un rastreo farmacológico de varias plantas, cuyos antecedentes etnobotánicos justificaban su análisis preliminar. En ese estudio se encontró que P. serotina presentaba una actividad farmacológica relevante: el extracto acuoso preparado a partir de las hojas y las ramas inducía un efecto relajante significativo de la musculatura lisa vascular. Adicionalmente, se demostró que los principios activos responsables de dicho efecto eran el ácido ursólico y el hiperósido.

Con respecto al fruto, nuestro grupo encontró evidencias experimentales que indicaban que éste también contiene metabolitos secundarios capaces de producir relajación de la musculatura lisa vascular. Este hallazgo es novedoso y relevante. Novedoso en el sentido de que indica una nueva aplicación terapéutica para los frutos del capulín, los cuales son empleados en la Medicina Tradicional Mexicana para tratar la tos y desórdenes gastrointestinales, de tal manera que estos resultados sugieren que los frutos también podrían ser útiles para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, tales como la hipertensión arterial. Relevante, considerando por una parte, que estudios epidemiológicos realizados 29

durante la última década han demostrado que las enfermedades cardiovasculares representan la principal causa de mortalidad en México y por otra parte, existen numerosas evidencias que sugieren que alteraciones en la función del endotelio vascular, el cual controla la relajación del músculo liso vascular, contribuyen a la patogénesis y a la expresión clínica de varias enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, nuevas estrategias terapéuticas que involucren efectos relajantes de la musculatura lisa vascular representan un gran potencial para la prevención y el tratamiento de las enfermedades arterioscleróticas vasculares.

Se ha reportado ampliamente que los compuestos fenólicos, incluyendo los flavonoides, presentan efectos protectores sobre la pared de los vasos sanguíneos. Este grupo de compuestos se encuentran presentes en los frutos de P. serotina. Sin embargo, los últimos resultados obtenidos por nuestro grupo de trabajo sugieren que además de este tipo de metabolitos secundarios, los frutos de P. serotina contienen metabolitos no polares que contribuyen al efecto vasorrelajante.

Con base en las consideraciones anteriores, se planteó el presente proyecto de investigación con el objeto de purificar e identificar los metabolitos secundarios no polares presentes en los frutos de P. serotina que inducen el efecto vasorrelajante, así como caracterizar su mecanismo de acción.

30

IV. HIPÓTESIS

Los frutos de P. serotina contienen metabolitos secundarios no polares que inducen relajación de la musculatura lisa vascular, mediante mecanismos que involucran la activación de la vía del NO/GMPc y/o la activación de canales de potasio.

V. OBJETIVOS 5.1 Objetivo general

Purificar, elucidar la estructura química y caracterizar el mecanismo de acción de los principales compuestos vasorrelajantes no polares contenidos en los frutos de P. serotina.

5.2 Objetivos específicos

1. Realizar el estudio fitoquímico biodirigido del extracto de diclorometano preparado a partir de los frutos de P. serotina con el objeto de purificar los principios activos vasorrelajantes.

2. Determinar la estructura química de los compuestos purificados a partir del extracto

de

diclorometano,

mediante

el

empleo

de

metodologías

espectroscópicas y espectrométricas.

3. Obtener el aceite esencial de los frutos de P. serotina mediante el método de hidrodestilación.

31

4. Realizar el análisis del aceite esencial de los frutos de P. serotina, mediante cromatografía de gases acoplada a masas, con el objeto de conocer su composición e identificar los compuestos mayoritarios contenidos en el aceite.

5. Determinar, mediante ensayos farmacológicos en aorta aislada de rata, la potencia del efecto relajante de los principios activos no polares obtenidos de los frutos de P. serotina y si éstos actúan mediante un mecanismo dependiente y/o independiente de endotelio.

6. Caracterizar, mediante ensayos farmacológicos, la participación de la vía del NO/GMPc y la activación de canales de potasio en el mecanismo vasorrelajante inducido por los principios activos obtenidos.

32

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Especímenes biológicos

6.1.1 Material vegetal

Los frutos de P. serotina en estado maduro se obtuvieron directamente de huertos localizados en San Miguel Teanguizolco, municipio de Huejotzingo, Estado de Puebla, a una altitud de 2340 m sobre el nivel del mar. Los especímenes fueron identificados y autentificados por el Dr. Robert Bye, guardándose muestras de referencia que se depositaron en la colección etnobotánica del Herbario Nacional del Instituto de Biología de la UNAM. 6.1.2 Animales

Ratas de la cepa Wistar, machos (250-300 g), proporcionadas por el Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Campus Juriquilla.

6.2 Compuestos químicos y solventes

La fenilefrina (Phe), la acetilcolina (ACh), el 1H-[1,2,4]oxadiazolo-[4,3-a]quinoxa 1 in-1-ona (ODQ), el cloruro de tetraetilamonio (TEA), la glibenclamida, el benzaldehído, el alcohol bencílico, el alcohol cinámico y el cinamaldehído fueron obtenidos de Sigma (St. Louis, MO, USA). Todas las sales, el hexano, el acetato de etilo (AcOEt), el diclorometano (CH2Cl2), el hexano, el metanol (MeOH), la acetona, otros reactivos y solventes se obtuvieron de J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA) o Sigma.

33

6.3 Recolección y preservación del material vegetal

Los frutos recolectados se colocaron en bolsas de plástico debidamente etiquetadas con la fecha y el origen, transportándose de inmediato a las instalaciones de la Facultad de Química de la UAQ. A su llegada a la Facultad de Química, se lavaron con agua destilada abundante y se secaron perfectamente evitando la presencia de residuos. Los frutos se conservaron almacenados en congelación a -70º C hasta su utilización.

6.4 Evaluación farmacológica y análisis cromatográfico preliminar de los extractos de diclorometano y hexánico del fruto de P. serotina

Con el objeto de seleccionar el extracto no polar de trabajo para este estudio, se realizó la evaluación farmacológica y el análisis cromatográfico de los extractos de diclorometano y hexánico preparados a partir del fruto liofilizado de P. serotina.

6.4.1 Preparación de los extractos no polares del fruto de P. serotina

El fruto entero se segmentó y se le retiró la semilla para ser liofilizado. Posteriormente, se sometió a maceración durante una semana con el correspondiente solvente de extracción (diclorometano o hexano) en una proporción 1:3 (w/v) para obtener el extracto correspondiente. Al término del tiempo indicado, el extracto se filtró y se le retiró el solvente a través del empleo de un rotaevaporador. El extracto resultante fue almacenado a -20º C.

6.4.2 Evaluación farmacológica de los extractos de diclorometano y hexánico

La evaluación farmacológica de los extractos de diclorometano y hexánico se llevó a cabo mediante el ensayo de aorta aislada de rata, el cual se describe en el apartado 6.8 de esta sección. 34

6.4.3 Análisis cromatográfico preliminar de los extractos de diclorometano y hexánico

Los extractos de diclorometano y hexánico fueron evaluados por cromatografía en capa fina con el objeto de determinar el extracto con mayor número de compuestos y el sistema que permitiera una mejor resolución de los mismos. Se emplearon 3 diferentes tipos de fase móvil: hexano-diclorometano partiendo de la proporción 7:3 y aumentando la polaridad hasta la proporción 3:7, hexano-acetato de etilo partiendo de 9:1 y aumentando la polaridad hasta 5:5 y hexano-acetona comenzando con la proporción 9:1 y posteriormente aumentando la polaridad hasta 5:5. Los cromatofolios empleados y los agentes reveladores se indican en el apartado 6.5.2.

6.5 Estudio fitoquímico biodirigido del extracto de diclorometano del fruto de P. serotina

En base a los resultados obtenidos en los ensayos preliminares se seleccionó el extracto de diclorometano para llevar a cabo el estudio fitoquímico biodirigido.

6.5.1 Fraccionamiento biodirigido del extracto

El extracto de diclorometano (3.7 g), obtenido a partir de 1.8 kg de fruto liofilizado, se sometió a un fraccionamiento inicial mediante cromatografía en columna en fase normal; empleando en este caso, una columna al vacío con gel de sílice (100 g, Kiesegel 60 Merck 70-230 mesh, tamaño de partícula 0.063-0.200 mm) y como eluyentes hexano y acetona en diversas proporciones para generar fracciones, las cuales se reunieron de acuerdo a su similitud cromatográfica al ser evaluadas por cromatografía de capa fina (Martínez, 2007).

35

6.5.2 Análisis cromatográfico de las fracciones

Los análisis cromatográficos en capa fina se efectuaron, utilizando cromatofolios de aluminio recubiertos con gel de sílice (sílica gel 60 GF 254 Merck). Los compuestos se visualizaron con luz UV de longitud de onda corta (254 nm) y larga (365 nm) y se revelaron utilizando como agentes cromógenos sulfato cérico al 1% y anisaldehído ácido al 0.5% (Wagner et al., 2001).

6.5.3 Evaluación farmacológica de las fracciones

Las fracciones resultantes se sometieron a la evaluación farmacológica, mediante el ensayo de aorta aislada de rata, para identificar las fracciones bioactivas. La actividad de cada fracción se evaluó a una concentración igual a la concentración efectiva media (EC50) del extracto de diclorometano. 6.5.4 Purificación de los compuestos bioactivos

La purificación de los constituyentes individuales de las fracciones bioactivas se realizó mediante cromatografía en columna en fase normal; empleando en este caso, columnas abiertas con gel de sílice (16 g, Kiesegel 60 Merck 70-230 mesh, tamaño de partícula 0.063-0.200 mm) y como eluyentes hexano y acetona en diversas proporciones para generar fracciones, las cuales se reunieron de acuerdo a su similitud cromatográfica al ser evaluadas por cromatografía de capa fina.

La pureza de los compuestos, obtenidos a partir de las diversas fracciones, se verificó mediante cromatografía en capa fina y determinación de su punto de fusión.

36

6.6 Determinación de la estructura química de los compuestos purificados

La elucidación estructural de los compuestos purificados se realizó, mediante el empleo de metodologías espectroscópicas y espectrométricas.

Para obtener los espectros de resonancia magnética nuclear protónica (RMN 1H)

y de carbono 13 (RMN 13C) se utilizó un equipo de 400 MHz,

empleando DMSO-d6 o CDCl3 como disolvente. Reportando los desplazamientos químicos en partes por millón (ppm) con referencia al tetrametilsilano (TSM). Los análisis de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas se realizaron mediante un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas (CG-EM-TOF) LECO Pegasus 4D.

Los estudios de espectroscopía y espectrometría se realizaron en la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación (USAI) edificio B de la Facultad de Química de la UNAM.

6.7 Análisis químico del aceite esencial

6.7.1 Obtención del aceite esencial

El fruto entero se segmentó y se le retiró la semilla para realizar una hidrodestilación. A partir de la mezcla acuosa obtenida del destilado se extrajo el aceite esencial con diclorometano por el método de partición. El extracto obtenido fue secado con sulfato de sodio anhidro. Posteriormente, se evaporó el CH2Cl2 por rotaevaporación a 35° C y a presión reducida, a fin de obtener el aceite esencial. El producto obtenido se almacenó en viales ámbar a -20ºC.

37

6.7.2 Análisis del aceite esencial por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

Este estudio se realizó en la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación (USAI) edificio B de la Facultad de Química de la UNAM. El cromatograma del aceite esencial se obtuvo en un cromatógrafo de gases marca Agilent 7683B, acoplado a un espectrómetro de masas (CG-EM-TOF) LECO Pegasus 4D. Se empleó una columna capilar de 10 m de largo, diámetro interno 180 m y espesor de película de 0.18 m marca HP-5MS, utilizando helio de alta pureza como gas acarreador.

6.8 Evaluación farmacológica: ensayo de aorta aislada de rata

6.8.1 Equipo

La tensión originada por la contracción del músculo liso arterial se registró por medio de un transductor de fuerza Grass modelo FT03 unido a un polígrafo Grass de 6 canales Modelo 7D (Astro-Med, Inc. West Warwick, RI. USA).

6.8.2 Solución fisiológica empleada en el ensayo de aorta aislada de rata

Solución de Krebs-Heinseleit para aorta: pH 7.4; 126.8 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 30 mM NaHCO3, 1.2 mM NaH2PO4 y 5 mM D-glucosa (Forstermann et al., 1994; Feelisch et al., 1999).

6.8.3 Preparación de las muestras para el ensayo de aorta aislada de rata

Se prepararon soluciones stock

del extracto (16.6 mg/ml), el aceite

esencial (16.6 mg/ml), y los compuestos puros (166.6 mg/ml), a partir de los cuales se hicieron las disoluciones correspondientes a las concentraciones a evaluar en las cámaras de tejido aislado (1 a 1,000 g/mL para los extractos y el 38

aceite esencial; 1 a 10,000 g/mL para los compuestos puros). Las fracciones se evaluaron preparando una única solución de 0.28 mg/mL. Para preparar las soluciones stock del extracto, del aceite esencial y de las fracciones, se empleó el agente tensoactivo Tween 80 con el objeto de solubilizar las muestras en el medio acuoso. Es pertinente mencionar que la más alta concentración de Tween 80 que se empleó en las evaluaciones fue de 0.20% v/v. En el caso de los compuestos puros identificados en el aceite esencial, las soluciones stock se prepararon directamente en agua, considerando que estos compuestos eran líquidos. Las subsiguientes diluciones de todas las sustancias de prueba se prepararon en agua desionizada.

6.8.4 Ensayo de aorta aislada de rata

Las ratas fueron anestesiadas con cloroformo y sacrificadas por decapitación. Se extrajo la aorta torácica descendente y se colocó en una solución fría de Krebs-Heinseleit, se cortó en anillos de 4 a 5 mm. Estos anillos fueron montados en cámaras de incubación de 7 ml con solución de Krebs-Heinseleit a 37 ºC y burbujeo constante de una mezcla de 95% 02 / 5% CO2. Las contracciones mecánicas se registraron por medio de los transductores de fuerza acoplados al polígrafo. El tejido se sometió a una tensión de reposo (basal) de 1.5 g y se dejó estabilizar por 60 min. Una vez que el tejido alcanzó el equilibrio, los segmentos se pre-contrajeron con una solución de KCl 100 mM durante 15 min, para estimular el músculo arterial. A continuación, se eliminó el KCl, lavando de 3 a 8 veces cada una de las cámaras. La aorta se dejó reposar hasta alcanzar nuevamente su tensión basal de 1.5 g. Una vez estabilizado el tejido, los segmentos de aorta se contrajeron con fenilefrina (1 M). Las diferentes sustancias de prueba obtenidas de los frutos de P. serotina se evaluaron en un intervalo de concentraciones de 1 a 1,000 g/ml. Las diferentes concentraciones de las muestras se adicionaron a las cámaras de tejido aislado, 20 min después de haber inducido la contracción de la aorta con la fenilefrina. La respuesta provocada por cada una de las concentraciones de las sustancias de prueba en la aorta se registró durante un 39

período de 10 min y los cambios en la tensión producidos por las sustancias se detectaron mediante los transductores de fuerza. Las respuestas se expresaron como el porcentaje de relajación tomando como base la contracción alcanzada al adicionar la fenilefrina (Feelisch et al., 1999; Ibarra-Alvarado et al., 2007).

6.9 Elucidación del mecanismo de acción vasorrelajante de los compuestos puros: determinación de la participación de la vía del NO/GMPc y la activación de los canales de potasio

Se realizaron experimentos, mediante el ensayo de aorta aislada de rata, para obtener información acerca del mecanismo mediante el cual los principios activos purificados de P. serotina podrían estar ejerciendo su efecto vasodilatador. Los experimentos con segmentos de aorta libres de endotelio se realizaron mediante la remoción mecánica suave de la capa de células endoteliales. Los experimentos en los que fue necesario inhibir enzimas importantes de las vías del NO/GMPc y la activación de canales de potasio se realizaron incubando los tejidos durante 20 minutos en presencia de los siguientes inhibidores, antes de agregar los principios activos: a) ODQ (10 µM) para inhibir la vía del NO/GMPc,

b) TEA

(1 mM) y c) glibenclamida (1 µM) para inhibir la activación de los canales de potasio (Galle et al., 1999; Ibarra-Alvarado et al., 2002).

La estrategia experimental antes descrita, tanto para el estudio fitoquímico biodirigido como para el análisis del aceite esencial, se resume en las Figuras 6.1 y 6.2

40

Fruto liofilizado Maceración con Hexano y CH2Cl2

Extracto hexánico

Extracto de CH2Cl2

Evaluación

Cromatografía en

Farmacológica

capa fina (ccf)

Elección del extracto

Purificación de los

de trabajo

compuestos de las fracciones bioactivas (cromatografía en columna)

Extracto de CH2Cl2

Fraccionamiento

Compuestos bioactivos

(cromatografía en columna)

Determinación pureza compuestos

de

de

la los

obtenidos

(ccf y punto de fusión)

Fracciones obtenidas

Evaluación

Evaluación

farmacológica

farmacológica

Elucidación estructural de Identificación

de

las

los compuestos aislados

fracciones bioactivas

Figura 6.1 Esquema general del estudio fitoquímico biodirigido del extracto de diclorometano obtenido a partir del fruto de P. serotina 41

Fruto fresco

Hidrodestilación

Extracción con CH2Cl2

Aceite esencial

Evaluación

Análisis por

farmacológica

cromatografía de gases/masas

Identificación

de

los

principales componentes

Compuestos identificados

Evaluación farmacológica

Elucidación del mecanismo de acción de los componentes bioactivos

Figura 6.2 Esquema general de trabajo para la obtención, análisis y elucidación del mecanismo de acción de los componentes bioactivos del aceite esencial obtenido del fruto de P. serotina

42

VII. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se realizaron de 4 a 6 evaluaciones para cada una de las concentraciones de las sustancias de prueba. Los resultados son expresados como el promedio ± el error estándar del promedio (S.E.M.).

Los datos experimentales generados en cada evaluación se ajustaron a una ecuación sigmoidal y graficaron mediante el programa PRISMA 5.0 Graph Pad ( Graph Pad Software Inc., San Diego, CA USA) para la obtención de las curvas concentración-respuesta. En cada caso se calculó la EC50. La EC50, definida como la concentración de sustancia de prueba (µg/mL) necesaria para producir el 50% de la relajación máxima sobre el tejido precontraído con fenilefrina, fue utilizada para evaluar la variación del efecto relajante en las diferentes condiciones de valoración de las curvas concentración respuesta.

Estos resultados fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA) mediante el programa estadístico J.M.P. 5.0.1., seguido por la prueba de Tukey para la evaluar la diferencia significativa entre las medias. Se consideraron estadísticamente significativas aquellas diferencias con p≤ 0.05.

43

VIII. RESULTADOS

8.1 Evaluación farmacológica y análisis cromatográfico preliminar de los extractos de diclorometano y hexánico del fruto de P. serotina

Considerando que tanto el diclorometano y el hexano son solventes que permiten la extracción de compuestos no polares, con el objeto de seleccionar cuál de estos dos solventes resultaba ser el más adecuado para abordar el estudio fitoquímico biodirigido del fruto de P. serotina se prepararon ambos extractos a pequeña escala, se evaluaron en el ensayo de aorta y se analizaron en cromatografía en capa fina

Ambos extractos relajaron, de manera dependiente de la concentración, la aorta aislada de rata (Figura 8.1). De acuerdo a estos resultados, el extracto de diclorometano presentó una EC50 de 282.3 ± 19.2 µg/ml y una Emax de 73.6 ± 6.6%, mientras que el extracto hexánico tuvo una EC50 de 222.6 ± 29.3 µg/ml y una Emax de 65.5 ± 5.4%. Por lo que respecta al análisis cromatográfico preliminar, éste mostró que el extracto de diclorometano contenía un mayor número de compuestos que el hexánico. De manera adicional, se observó que en todos los sistemas de elución utilizados hubo una mejor separación de los componentes en las muestras del extracto de diclorometano. La mejor resolución fue observada en el sistema hexano:acetona 9:1.

44

80

Extracto de diclorometano

Relajación (%)

60

Extracto hexánico

40

20

0 0

1

2

3

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.1 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante de los extractos de diclorometano y hexánico obtenidos a partir del fruto de P. serotina

8.2 Estudio fitoquímico biodirigido del extracto de diclorometano

A partir del fraccionamiento cromatográfico del extracto de diclorometano se obtuvieron 20 fracciones de 500 ml cada una, las cuales se reunieron de acuerdo a su similitud cromatográfica generando un conjunto de 8 fracciones primarias. En el Cuadro 8.1 se resume el fraccionamiento primario del extracto de diclorometano.

Se evaluó el efecto de las fracciones primarias sobre la musculatura lisa arterial a la EC50 (282.3 µg/ml) del extracto total. Este monitoreo dio como resultado una mayor relajación de la aorta para las fracciones PD-III, PD-IV, PD-V y PD-VI (Figura 8.2 y Cuadro 8.2).

45

Cuadro 8.1 Resumen del fraccionamiento primario del extracto de diclorometano por cromatografía en columna al vacío en gel de sílice Eluyente

Proporción Fracciones Fracciones combinadas

Clave

Hexano

100

1-3

1-2

PD-I

Hexano-Acetona

95:5

4-5

3-6

PD-II

90:10

6-8

7-8

PD-III

85:15

9-10

80:20

11-12

9-13

PD-IV

75:25

13-14

14

PD-V

70:30

15-16

15

PD-VI

1:1

17-18

16-17

PD-VII

100

19-20

18-20

PD-VIII

Acetona

50

% Relajación

40

30

20

10

0 PD-I

PD-II

PD-III

PD-IV

PD-V

PD-VI PD-VII PD-VIII

Fracción

Figura 8.2 Efecto vasorrelajante de las fracciones primarias obtenidas a partir del extracto de diclorometano del fruto de P. serotina

46

Cuadro 8.2 Porcentajes de relajación inducidos por las fracciones primarias del extracto de diclorometano obtenido a partir del fruto de P. serotina

Con

base

cromatográfico de

Fracción evaluada

% Relajación

PD-I

3.9 ± 1.4

PD-II

4.1±1.7

PD-III

41.1 ±3.5

PD-IV

40.5 ± 3.6

PD-V

38.3 ± 3.1

PD-VI

27.5 ± 5.7

PD-VII

15.0 ± 1.2

PD-VIII

22.9 ± 4.0

en

estos

resultados,

se

decidió

realizar

el

análisis

las fracciones primarias que mostraron el mayor efecto

vasorrelajante: PD-III y PD-IV.

8.2.1 Fraccionamiento secundario de la fracción PD-III

La fracción primaria PD-III se sometió a cromatografía en una columna abierta de sílica gel, con este procedimiento se obtuvieron 140 fracciones de 6 ml cada una, las cuales se reunieron de acuerdo a su similitud cromatográfica generando un conjunto de 13 fracciones secundarias (PD-III-1 a PD-III-13).

A partir de la fracción secundaria PD-III-2 se obtuvieron 4.5 mg de un sólido blanco, soluble en diclorometano cuyo punto de fusión fue 216-218°C, el cual

fue

identificado,

por

comparación

de

sus

constantes

físicas

y

espectroscópicas con las reportadas en la literatura (Mallavadhani et al., 2001), como el uvaol (1). El rendimiento en peso seco con relación al material vegetal fue de 0.00025%. En el Cuadro 8.3 se muestran las constantes espectroscópicas de este compuesto. 47

Cuadro 8.3 Constantes espectroscópicas del uvaol RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm)

δH 5.13 (1H, t, J= 3.5, H-12), 3.80 (1H, d, J= 10.8 Hz, H-20a), 3.38 (1H, d, J= 10.8 Hz, H-28b), 3.20 (1H, J= 10.5 y 5.4, H-3), 1.05 (3H, s, CH3), 0.98 (3H, s, CH3), 0.97 (3H, s, CH3), 0.96 (3H, s, CH3), 0.93 (3H, d, J=5.4 Hz, CH3), 0.83 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3), 0.80 (3H, s, CH3).

13

RMN- C (100 MHz, DMSO-d6) δ (ppm)

δC 177.8 (C-28),138.7 (C-13), 125.1 (C-12), 77.1 (C-3), 58.7 (C-18), 52.3 (C-5), 41.5 (C14).17.9 (C-29), 15.9 (C-23).

A partir de la fracción secundaria PD-III-11 se obtuvieron 40.2 mg de un polvo blanco amorfo con punto de fusión 259-260°C; soluble en acetona. Este compuesto fue identificado, por comparación directa con una muestra auténtica y de sus constantes espectroscópicas y espectrométricas reportadas en la literatura (Sang et al., 2002), como ácido ursólico (2). El rendimiento obtenido fue de 0.0022% Las constantes espectroscópicas de este compuesto se muestran en el Cuadro 8.4

Cuadro 8.4 Constantes espectroscópicas del ácido ursólico 1

RMN- H (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm)

δH 4.65 (1H, m, H-12), 3.84 (1H, m, H-3), 3.58 (1H, d, J=11.25 Hz, H-18), 0.53 (3H, s, CH3), 0.31 (3H, d, J=6.4 Hz, CH3), 0.24 (3H, s, CH3), 0.35 (3H, s, CH3), 0.16 (3H, d, J=6.4 Hz, CH3)

13

RMN- C (100 MHz, DMSO-d6) δ (ppm)

δC 178.8 (C-28), 138.1 (C-13), 125.1 (C12), 79.2 (C-3), 54.3 (C-18), 55.3 (C-5), 42.7 (C-14),16.5 (C-29), 15.9 (C-23).

EMIE (m/z)

456 [M]+ (5), 248 (100), 219 (6), 207 (23), 203 (33), 190 (11), 189 (13), 133 (23), 119 (10), 85 (10), 71 (14), 69 (10), 57 (19)

48

8.2.2 Fraccionamiento secundario de la fracción PD-IV

La fracción primaria PD-IV se sometió a cromatografía en una columna abierta de silica gel, con este procedimiento se obtuvieron 160 fracciones de 8 ml, las cuales se reunieron por similitud cromatográfica dando un total de 6 fracciones (PD-IV-1 a PD-IV-6).

A partir de la fracción secundaria PD-IV-3 precipitaron de manera espontánea 15 mg de un sólido blanco cristalino, soluble en diclorometano, cuyo punto de fusión fue de 217-219°C. Este compuesto fue identificado, por comparación de sus constantes físicas y espectroscópicas con las reportadas en la literatura (Kim et al., 2005), como el aldehído ursólico (3).El rendimiento obtenido fue de 0.00083%. Las constantes espectroscópicas de este compuesto se muestran en el Cuadro 8.5.

Cuadro 8.5 Constantes espectroscópicas del aldehído ursólico 1

RMN- H (Piridina-d5, 400 MHz,) δ (ppm)

δH 9.52 (1H, s, CHO), 5.50 (1H, s, H-12), 3.44 (1H, dd, J = 6.8 Hz, H-3), 3.29 (1H, m, H-18), 0.73 (3H, s, CH3), 0.51 (3H, d, J=6.0 Hz, CH3), 0.44 (3H, s, CH3), 0.38 (3H, s, CH3), 0.26 (3H, d, J=6.0 Hz, CH3).

13

RMN- C (100 MHz, CDCl3) δ (ppm)

δC 207.3(C-28), 137.7 (C-13), 126.1 (C-12), 79.0 (C-3), 52.6 (C-18), 55.2 (C-5), 42.2 (C14),16.7 (C-29), 15.7 (C-23)

FABMS m/z

463 [M + Na]+

8.2.3 Obtención del β-sitosterol a partir de la fracción no activa PD-I

A partir de la fracción no activa PD-I precipitaron de manera espontánea 30 mg de un sólido blanco cristalino de punto de fusión 140-141ºC, el cual fue identificado por sus constantes físicas y espectroscópicas como β-sitosterol (4). 49

En la Figura 8.3 se presentan las estructuras de los compuestos purificados a partir de las fracciones bioactivas. En la Figura 8.4 se muestra un resumen del estudio fitoquímico biodirigido del extracto de diclorometano del fruto de P. serotina

30

30

1

26

16

9 4

8

10

5

CH2OH 28

26

7

4

22 COOH 16 28

15 27 7

OH

6 24

23

24

8

10

5

6 23

17

14 9

3

27

OH

25

2

15

18

13

11 1

21

19

12

22

17

14

2 3

18

13

11 25

21

19

12

20

29

20

29

1

2

30

13

11 25

26 9 10

4

16 8

CHO 28

1

8

10

7

HO

6 23

13 9

15

7

5

3 4

6

24

3

4

Figura 8.3 Estructuras de los compuestos 1- 4

50

25 27

16

14

27

OH

24 23

17

19

2

15

5

20

11

14

2

26 18

12

22

17

1

3

18

22

21

21

19 12

29

28

20

29

Fruto liofilizado de P. serotina (1.8 kg)

Extracción con CH2Cl2 , vía maceración por 1 semana Filtrado y concentrado al vacío

Residuo Vegetal

Extracto de CH2Cl2 (EC50 =282.3 µg/ml) Cromatografía en columna al vacío de sílica gel Hexano: Acetona (1:0→0:1)

PD-I

PD-II

PD-III

PD-IV

PD-V

PD-VI

PD-VII

PD-VIII

Cromatografía en columna abierta de sílica gel Hexano:Acetona (1:0→0:1)

β-sitosterol

PD-IV-1 → PD-IV-6

PD-III-1 → PD-III-13

PD-IV-3 PD-III-2

PD-III-11

Uvaol

Ácido ursólico

Aldehído ursólico

Figura 8.4 Extracción, fraccionamiento primario y purificación de compuestos a partir del extracto de diclorometano obtenido del fruto de P. serotina

8.3 Evaluación farmacológica de los compuestos purificados

Se realizó la evaluación farmacológica del ácido ursólico, purificado a partir de la fracción PD-III-11. La evaluación de los otros dos compuestos purificados, el uvaol y el aldehído ursólico, no fue posible debido a la mínima cantidad obtenida en el proceso de purificación.

51

El ácido ursólico presentó una relajación significativa de la aorta, dependiente de la concentración (Figura 8.5), con una EC50 de 154.4 ± 7.5 µg/ml y una Emáx de 94.1 ± 5.9 %. El efecto de este compuesto se comparó con el de la ACh (EC50 = 8.7 ± 0.8 µg/ml; Emáx = 69.5 ± 5.7 %), la cual se utilizó como control positivo.

100

ACh Ácido ursólico

Relajación (%)

80

60

40

20

0 -1

0

1

2

3

Log concentración ( g/ ml)

Figura 8.5 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el ácido ursólico y la Ach

8.4 Obtención del aceite esencial de los frutos de P. serotina

Se obtuvieron 20 mg de aceite esencial a partir de 2 kg de fruto fresco lo cual implicó un rendimiento del 0.001%.

52

8.5 Identificación de los componentes del aceite esencial del fruto de P. serotina

El análisis por cromatografía de gases masas indicó que el aceite esencial obtenido del fruto del capulín contiene 58 componentes en la esencia (Figura 8.6). A la fecha se han identificado siete productos mayoritarios mediante la comparación de sus espectros de masas con los de la biblioteca del equipo y los que se encuentran en el sitio de internet de la National Institute of Standards and Technology (NIST) [http://webbook.nist.gov/chemistry/]. Estos siete compuestos representan el 50.34 % del porcentaje total de componentes presentes en la esencia. En el Cuadro 8.6 se resumen los tiempos de retención y la proporción en la esencia de cada uno de estos componentes.

900000

800000

700000

6 600000

5 500000

7 8

400000

9 11

300000

200000

10

100000

0 Time (s)

100

200

300

400

AIC

500

600

Figura 8.6 Cromatograma de gases obtenido del aceite esencial del fruto de P.serotina 53

Cuadro 8.6 Constituyentes del aceite esencial del fruto de P. serotina Compuesto

O

Nombre

Cantidad (%)

tR (seg)

Fórmula

benzaldehído

8.25

52

C7H6O

14.76

150

C7H8O

13.50

155

C8H10O

5.80

220

C9H12O

3.40

260

C9H10O

2.67

347

C9H10O

1.96

405

C11H16O

(5)

alcohol bencílico OH

(6) α-metoxytolueno O

(7)

bencil-etil éter O

(8)

alcohol cinámico OH

(9)

Cinamaldehído O

(10)

bencil-butil éter O

(11)

54

8.6 Evaluación del efecto de los componentes del aceite esencial sobre el tono de la aorta intacta aislada de rata

El alcohol bencílico, el benzaldehído, el cinamaldehído y el alcohol cinámico, compuestos identificados en el análisis del aceite esencial del fruto de P. serotina, fueron evaluados

para determinar su participación en el efecto

vasorrelajante del aceite esencial.

El Cuadro 8.7 muestra los valores de Emax y de EC50 de estos cuatro componentes, del aceite esencial del fruto y del YC-1, un activador de la guanilato ciclasa (GC), como control positivo. Los resultados muestran que los cuatro compuestos, al igual que la esencia, inducen una relajación, dependiente de la concentración, de la aorta aislada de rata. En todos los casos el efecto máximo inducido por estas sustancias de prueba fue mayor a 97%. Las EC50 de los cuatro componentes estudiados resultaron menores a la del aceite esencial, siendo el alcohol cinámico el compuesto que produjo el efecto vasorrelajante más potente (EC50= 48.1 ± 5.4 μg/ml). Las curvas concentración-respuesta del efecto vasodilatador de estos compuestos se muestran en la Figura 8.7.

Cuadro 8.7 Valores de EC50 y Emax del efecto vasorrelajante del aceite esencial, el alcohol cinámico, el cinamaldehído, el alcohol bencílico, el benzaldehído y el YC-1 sobre aorta intacta aislada de rata Compuesto

EC50 (μg/ml)

Emax (%)

Aceite esencial

297.3 24.7

97.2 0.7

Alcohol cinámico

48.1 5.4

98.7 0.8

Cinamaldehído

71.8 9.4

100.0 0.1

Alcohol bencílico

303.9  28.8

100.0 0.1

Benzaldehído

73.5 3.7

100.0 0.1

YC-1

1.6 ± 0.2

100.0 0.1

55

100

Relajación (%)

80

YC-1 Aceite esencial

60

Alcohol cinámico Cinamaldehído

40

Benzaldehído 20

Alcohol bencílico

0 -2

-1

0

1

2

3

4

Log concentración (g/ml)

Figura 8.7 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante del aceite esencial obtenido a partir del fruto de P. serotina, del alcohol bencílico, del benzaldehído, del cinamaldehído, del alcohol cinámico y del YC-1

8.7 Evaluación del efecto del alcohol bencílico, el benzaldehído, el cinamaldehído y el alcohol cinámico sobre el tono de la aorta aislada de rata libre de endotelio

Considerando que los compuestos analizados presentan una relajación significativa de la aorta aislada de rata, el primer paso en la secuencia metodológica para determinar su mecanismo de acción consistió en evaluar la participación del endotelio en la relajación de la musculatura lisa arterial.

Como se observa en las Figuras 8.8 a 8.10, la ausencia de endotelio no modificó la respuesta vasorrelajante del alcohol bencílico, el benzaldehído y el cinamaldehído, de acuerdo a la comparación hecha de las curvas concentraciónrespuesta sin endotelio y con endotelio intacto. 56

100

Relajación (%)

80

60

E+ E-

40

20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.8 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el alcohol bencílico en ausencia (E-) y en presencia de endotelio (E+)

100

Relajación (%)

80

60

E+ E-

40

20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.9 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el benzaldehído en ausencia (E-) y en presencia de endotelio (E+) 57

100

Relajación (%)

80

60

E+ E-

40

20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.10 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el cinamaldehído en ausencia (E-) y en presencia de endotelio (E+)

En contraste, la curva concentración-respuesta del efecto vasodilatador inducido por el alcohol cinámico se desplazó hacia la derecha, sugiriendo la participación de factores endoteliales tales como el NO, en el mecanismo de acción de este compuesto (Figura 8.11). En una curva concentración-respuesta, un desplazamiento hacia la derecha implica una disminución de la potencia de la sustancia de prueba debido principalmente al bloqueo de los receptores involucrados en la respuesta biológica. En este caso, el desplazamiento señalado en ausencia de endotelio sugiere un abatimiento en la respuesta debido probablemente a la ausencia y/o disminución en la liberación de algún factor endotelial vasorrelajante.

58

100

Relajación (%)

80

60

E+ E-

40

20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.11 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el alcohol cinámico en ausencia (E-) y en presencia de endotelio (E+)

8.8 Evaluación de la participación de la vía del NO/GMPc

Con el objeto de evaluar si el efecto vasorrelajante producido por los cuatro compuestos involucraba la activación de la vía del NO/GMPc a nivel del musculo liso arterial, específicamente activando a la GC, receptor intracelular del NO, se evaluó el efecto de los compuestos en presencia de ODQ, un inhibidor de la GC

Los resultados obtenidos para el alcohol bencílico se muestran en la Figura 8.12. Puede observarse que la presencia del bloqueador no modificó la actividad vasorrelajante de este compuesto. Resultados similares se obtuvieron para el benzaldehído, cuyas curvas concentración-respuesta, en ausencia y en presencia de ODQ, no presentan una diferencia estadísticamente significativa (Figura 8.13). 59

100

Relajación (%)

80

60

ODQ Control

40

20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.12 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el alcohol bencílico en ausencia de endotelio y en presencia del bloqueador ODQ

100

% Relajación

80

60

ODQ 40

Control

20

0 1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.13 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el benzaldehído en ausencia de endotelio y en presencia del bloqueador ODQ 60

Por otra parte el análisis estadístico, utilizando la prueba de Tukey, indicó una diferencia significativa entre las curvas concentración-respuesta en ausencia y en presencia del ODQ para el cinamaldehído (Figura 8.14). Este mismo comportamiento se observó en el caso del alcohol cinámico, cuya curva concentración-respuesta en presencia de ODQ presentó un desplazamiento hacia la derecha más significativo que el observado para la respectiva curva del cinamaldehído (Figura 8.13).

100

Relajación (%)

80

60

ODQ 40

Control

20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.14 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el cinamaldehído en ausencia de endotelio y en presencia del bloqueador ODQ

61

100

Relajación (%)

80

60

40

ODQ Control

20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.15 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el alcohol cinámico en ausencia de endotelio y en presencia del bloqueador ODQ

8.9 Evaluación de la participación de la activación de los canales de potasio

Con el objeto de determinar la participación de la activación de los canales de potasio en el mecanismo vasorrelajante inducido por los compuestos de prueba se evaluó su efecto en presencia de glibenclamida, un bloqueador de canales de potasio dependientes de ATP (KATP) y de cloruro de tetraetilamonio, TEA, un bloqueador de canales de potasio voltaje dependientes (BKCa). Los resultados obtenidos para el alcohol bencílico y el benzaldehído se presentan en las Figuras 8.16 y 8.17, respectivamente. Estas gráficas muestran el desplazamiento significativo de las curvas concentración-respuesta en presencia de los dos bloqueadores. En el caso del alcohol bencílico observamos un desplazamiento de la EC50 de 303.9 ± 52.3 hasta una EC50 de 851.2 ± 125.8 y de 62

1170 ± 120.8 en presencia de TEA y glibenclamida, respectivamente. De igual manera, ambos bloqueadores indujeron un desplazamiento hacia la derecha de la curva concentración-respuesta del benzaldehído. En este caso la EC50 que presentó un valor de 116.5 ± 13.6 en ausencia de los bloqueadores se desplazó hasta valores de 231.5 ± 24.5 en el caso del TEA y 342.0 ± 31.5 en presencia de glibenclamida.

100

Relajación (%)

80

Control TEA

60

Glibenclamida 40

20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.16 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el alcohol bencílico en ausencia de endotelio y en presencia de los bloqueadores TEA y glibenclamida

63

100

Relajación (%)

80

60

Control TEA

40

Glibenclamida 20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.17 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el benzaldehído en ausencia de endotelio y en presencia de los bloqueadores TEA y glibenclamida

Con respecto al cinamaldehído, no se observó una variación significativa en la curva concentración-respuesta en presencia de glibenclamida. En el caso de la curva concentración-respuesta del compuesto en presencia del TEA se observa que la EC50 modificó su valor de 45.5 ± 5.6 a 78.2 ± 7.3

en presencia del

bloqueador. Sin embargo, el análisis estadístico realizado mediante la prueba de Tukey indicó que esta variación no es estadísticamente significativa (Figura 8.18).

64

100

Relajación (%)

80

Control

60

TEA Glibenclamida

40

20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.18 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el cinamaldehído en ausencia de endotelio y en presencia de los bloqueadores TEA y glibenclamida

Finalmente, la curva concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el alcohol cinámico presentó un desplazamiento significativo en presencia de glibenclamida y del TEA. Las gráficas de los resultados de este compuesto muestran que para ambos bloqueadores de canales de potasio, las curvas concentración-respuesta presentan desplazamiento significativo hacia la derecha. La EC50 aumentó de 128.8 ± 14.0 en el control a 382.5 ± 46.1 para el TEA y a 272.8 ± 33.0 para la glibenclamida (Figura 8.19)

65

100

Relajación (%)

80

Control

60

TEA Glibenclamida 40

20

0 0

1

2

3

4

Log concentración (µg/ml)

Figura 8.19 Curvas concentración-respuesta del efecto vasorrelajante inducido por el alcohol cinámico en ausencia de endotelio y en presencia de los bloqueadores TEA y glibenclamida

66

IX. DISCUSIÓN

Considerando como antecedente, la capacidad de inducir relajación de la musculatura lisa vascular de los extractos orgánicos y el aceite esencial obtenidos a partir del fruto de P. serotina (Villa de la Torre, 2008), el presente estudio abordó la caracterización química y farmacológica de los compuestos no polares que pudieran ser responsables de este efecto vasoactivo.

La selección del solvente empleado para la obtención de los extractos se realizó con base en los resultados obtenidos en el ensayo farmacológico y el análisis cromatográfico preliminar. Las curvas concentración-respuesta obtenidas para los extractos de diclorometano (EC50 de 282.3 ± 19.2 µg/mL) y hexánico (EC50 de 222.6 ± 29.3 µg/mL) mostraron que ambos tienen un efecto relajante de la aorta aislada de rata similar. Sin embargo, el análisis cromatográfico mostró que el extracto de diclorometano extrajo un mayor número de componentes que el extracto hexánico y además, presentaba una mayor resolución en los diferentes sistemas de elución evaluados.

Por tanto, en el presente trabajo se decidió realizar el estudio fitoquímico biodirigido del extracto de diclorometano, preparado a partir del fruto P.serotina, con el objeto de purificar y caracterizar los compuestos no polares bioactivos presentes. Adicionalmente, el aceite esencial se analizó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, a fin de identificar sus principales componentes y evaluar el efecto farmacológico de algunos de los compuestos mayoritarios. El abordar ambos estudios se realizó para considerar un amplio rango de metabolitos secundarios no polares que pudieran ser los responsables de la actividad farmacológica.

El estudio fitoquímico biodirigido consistió en la obtención a gran escala del extracto de diclorometano del fruto de P. serotina, su fraccionamiento por cromatografía en columna y la purificación de los compuestos bioactivos por 67

técnicas

cromatográficas.

En

la

etapa

del

fraccionamiento

la

actividad

farmacológica se monitoreó mediante el ensayo de aorta aislada de rata. Este ensayo mostró que la actividad relajante de la musculatura lisa vascular

se

concentró en las fracciones primarias PD-III, PD-IV y PD-V y en menor medida en la fracción PD-VI. A partir de estos resultados, se decidió enfocar el análisis en las fracciones con mayor actividad, PD-III y PD-IV. Las fracciones PD-V y PD-VII serán abordadas en un estudio posterior.

El análisis de las fracciones PD-III y PD-IV, utilizando técnicas cromatográficas, permitió el aislamiento y la purificación de tres triterpenos pentacíclicos de tipo ursano. En la figura 9.1 se muestra el núcleo ursano. En todos los casos, los metabolitos aislados fueron identificados por comparación de sus datos espectroscópicos y espectrométricos con los previamente descritos en la literatura. A partir de la fracción PD-III se obtuvieron el ácido ursólico y el uvaol de las sub-fracciones 2 y 11 respectivamente. De la fracción PD-IV se purificó el aldehído ursólico.

Figura 9.1 Núcleo ursano

El ácido ursólico, ya se había identificado en otras especies del género Prunus (Wolbis et al., 2001; Shegmin et al., 2002; Amico et al., 2006) y específicamente en P. serotina, nuestro grupo de trabajo ya lo había purificado a partir de las hojas (Ibarra-Alvarado et al., 2009b). Por otra parte, el aldehído 68

ursólico, también había sido aislado previamente de las hojas de P. serotina (Biessels et al., 1974). Sin embargo, este trabajo constituye el primer reporte de la presencia del ácido ursólico y del aldehído ursólico en el fruto del capulín. Por otra parte en la literatura no existe ningún reporte de la presencia del uvaol en alguna especie del género Prunus.

Desde el punto de vista farmacológico se ha reportado que el ácido ursólico y el uvaol poseen diversas propiedades farmacológicas, entre las que se encuentran su capacidad antiinflamatoria (Vasconcelos et al., 2006; Natarauyu et al., 2007), protectora en daño hepático (Liu et al.,1994; Herrera et al.,2006) y antiproliferativa en algunos tipos de cáncer (Trumbull et al.,1976;; Martin et al.,2009). Adicionalmente, estudios previos demostraron que tanto el uvaol (Rodríguez-Rodríguez et al., 2006) como el ácido ursólico (Aguirre-Crespo et al., 2006) inducen una relajación de la musculatura lisa arterial y poseen efecto cardiotónico (Somova et al., 2004). Con respecto al aldehído ursólico, sólo existe un trabajo en el que se reporta que este triterpeno inhibe la actividad de la acilCoA-colesterol acil transferasa (ACAT) (Kim et al., 2005). En la presente investigación, considerando la cantidad de muestra disponible, solo fue posible evaluar el efecto farmacológico del ácido ursólico. Nuestros resultados corroboraron el efecto vasorrelajante de este compuesto demostrado con anterioridad por el grupo de Aguirre-Crespo (2006). Las evidencias experimentales y los datos reportados en la literatura indican que el ácido ursólico y el uvaol constituyen unos de los principios activos vasorrelajantes contenidos en el fruto del capulín. Adicionalmente, a partir de la fracción no activa PD-I, se obtuvo el βsitosterol, un esterol que aunque se encuentra ampliamente distribuido en el reino vegetal, no se había detectado previamente en P. serotina. Diversos estudios han mostrado que este compuesto, al igual que otros fitosteroles, es capaz de disminuir los niveles de colesterol sérico (Beveridge et al., 2002; Fierro, 2004).

69

Esta acción hipocolesterolemiante podría contribuir al efecto benéfico del fruto del capulín en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares. Por otra parte, el estudio de los aceites esenciales obtenidos a partir de diversas plantas alimenticias y medicinales actualmente tiene un gran auge debido a que se ha demostrado que las esencias constituyen un gran reservorio de compuestos bioactivos.

Los aceites esenciales son líquidos oleosos aromáticos que se obtienen generalmente por hidrodestilación a partir de la corteza, las ramas, las raíces, las hojas o los frutos de las plantas. Estos aceites representan una mezcla compleja de metabolitos secundarios volátiles, entre los que se encuentran mono y sesquiterpenos, alcoholes, éteres, aldehídos y cetonas, responsables no sólo de las características aromáticas, sino también de las propiedades medicinales que se les han atribuido a muchas esencias (Kalemba y Kunicka, 2003).

Los estudios realizados sobre la actividad biológica de los aceites esenciales se han centrado principalmente en la determinación de su actividad antimicrobiana e insecticida (Daferera et al., 2000; Burt, 2004). Aunque también se ha demostrado que diversos aceites esenciales y/o sus componentes poseen propiedades antiinflamatorias (Iscan et al., 2006), antioxidantes (Sacchetti et al., 2004; Singh y Marimuthu, 2006; El-Massry et al., 2009), antitumorales (Kalemba y Kunicka, 2003) y vasorrelajantes (Yanaga et al.,2006; Caldas-Magalhaes et al.,2008; Pinto et al.,2009), lo que ha contribuido a incrementar el interés en las propiedades funcionales de las esencias y su posible aplicación medicinal.

Específicamente, en cuanto a aceites esenciales obtenidos de especies del género Prunus con actividad biológica, sólo se ha reportado la actividad antifúngica del aceite de la hoja de P. persica (Tripathi et al., 2008). Recientemente, nuestro grupo de trabajo reportó que el aceite esencial obtenido a

70

partir de las hojas de P. serotina presenta una actividad vasorrelajante (IbarraAlvarado et al., 2009b).

En el presente trabajo, el análisis del aceite esencial del fruto de P. serotina indicó la presencia de 58 compuestos, de los cuales pudieron ser identificados 7 que representan el 50.34 % del total de componentes presentes en la esencia. Cuatro de estos compuestos se identificaron como el alcohol bencílico (14.76 %), el benzaldehído (8.25 %), el alcohol cinámico (3.40 %) y el cinamaldehído

(2.67

%).

Estos

compuestos

también

son

componentes

mayoritarios, aunque en diferente proporción, del aceite esencial de las hojas (Ibarra-Alvarado et al., 2009b).

Estos metabolitos secundarios se han detectado en una gran variedad de aceites esenciales de diversas especies vegetales. Sin embargo, los estudios farmacológicos realizados sobre

éstos son escasos. Se ha demostrado, por

ejemplo, que aceites esenciales que contienen alcohol bencílico poseen actividad antibacteriana (Thangadurai et al, 2002; Al-Reza et al.,2009). Este mismo tipo de actividad se ha encontrado para el benzaldehído (Bowles y Juneja, 1998) y el cinamaldehído (Burt, 2004), el cual posee además, efectos antioxidantes (Sivakumar, 2006), antiinflamatorios y quimioprotectores (Liao et al., 2008). Por otra parte, en la literatura no existe ningún reporte acerca de la actividad farmacológica del alcohol cinámico. Con respecto a estudios relacionados con el efecto de estos compuestos sobre el sistema cardiovascular, existe un trabajo realizado hace mas de 80 años en el que se reporta que el benzaldehído induce una relajación de la musculatura lisa arterial (Macht,1922), sin embargo este estudio no hace ninguna referencia acerca del mecanismo de acción involucrado en el efecto vasorrelajante. Recientemente, Yanaga et al. (2006) demostraron que el cinamaldehído relaja la musculatura lisa arterial, mediante mecanismos dependientes e independientes de endotelio. Considerando que no existen estudios previos que aborden el efecto del alcohol bencílico y el alcohol cinámico sobre la musculatura lisa arterial, y tomando en cuenta que el estudio realizado en 71

este sentido sobre el benzaldehído, además de ser muy antiguo no proporciona ninguna información sobre el mecanismo de acción, se decidió realizar la evaluación farmacológica de los cuatro compuestos identificados en el aceite esencial del fruto de P. serotina, empleando el modelo de aorta aislada de rata.

El aceite esencial del fruto y los cuatro componentes analizados indujeron una vasorrelajación significativa, dependiente de la concentración, de la aorta aislada de rata. El mayor efecto vasodilatador fue observado para el alcohol cinámico (48.1 5.4 µg/ ml), el cual fue aproximadamente 30 veces menos potente que el YC-1, empleado como control positivo. El cinamaldehído y el benzaldehído fueron 45 veces menos potentes que este control, mientras que la potencia del alcohol bencílico fue aproximadamente 200 veces menor que la del control. Finalmente, el aceite esencial resultó ser 180 veces menos potente que el YC-1. Sin embargo, tanto los cuatro compuestos de prueba como la esencia presentaron un efecto máximo comparable al del control.

Respecto a la elucidación del mecanismo de acción involucrado en el efecto vasorrelajante de los cuatro compuestos, el primer paso del diseño experimental consistió en determinar si estos metabolitos actuaban a nivel de las células endoteliales o a nivel de las células del músculo liso arterial. Con este objeto se realizaron experimentos en ausencia de endotelio, los cuales indicaron que .el alcohol bencílico, el benzaldehído

y el cinamaldehído presentan un

mecanismo vasodilatador independiente de endotelio.

A diferencia de los compuestos anteriores, las curvas concentraciónrespuesta para el alcohol cinámico, en ausencia y presencia de endotelio, muestran una diferencia significativa, lo cual sugiere que este metabolito actúa, en parte, sobre las células endoteliales.

Los resultados obtenidos en los experimentos realizados en ausencia de endotelio sugieren que el alcohol bencílico, el benzaldehído y el cinamaldehído 72

actúan en las células del músculo liso, bien sea activando alguno de los pasos del mecanismo de transducción iniciado por factores endoteliales que inducen vasorrelajación, tales como el NO y/o la PGI2, o activando canales de potasio localizados en las membranas de las células musculares. En tanto que el alcohol cinámico, posiblemente está promoviendo la liberación de factores endoteliales, aunque también es muy probable que esté actuando en las células musculares mediante alguno de los mecanismos recién descritos. Vale la pena mencionar que los

resultados

obtenidos

en

la

presente

investigación

con

relación

al

cinamaldehído difieren de lo reportado anteriormente por Yanaga et al. (2006), quienes propusieron que este compuesto posee un mecanismo vasodilatador que depende, al menos en parte, de la liberación de factores endoteliales.

El siguiente paso en la elucidación del mecanismo de acción de los compuestos objeto de estudio, consistió en determinar si éstos activaban al receptor intracelular del NO, la guanilato ciclasa (GC), o bien actuaban sobre canales de potasio activados por ATP o voltaje dependientes, localizados en la membrana muscular. En el primer caso, se realizaron experimentos en presencia de ODQ, un inhibidor específico de la GC. Los resultados derivados de estos experimentos mostraron que el efecto vasodilatador producido por el benzaldehído y el alcohol bencílico no involucra la activación de la GC. En contraste, el desplazamiento

hacia

la

derecha

de

las

curvas

concentración-efecto

vasorrelajante del cinamaldehído y del alcohol cinámico, en presencia del ODQ, sugieren que ambos compuestos relajan la musculatura lisa arterial, mediante un mecanismo que involucra al menos en parte, la activación del receptor intracelular del NO. Los resultados obtenidos en estos ensayos para el cinamaldehído, en este caso sí concuerdan con los reportados por Yanaga et al. (2006).

Finalmente, a fin de determinar si los compuestos activaban canales de potasio, se evaluó su efecto en presencia de TEA, un bloqueador de canales de potasio voltaje dependientes, y de glibenclamida, un bloqueador de canales de potasio activados por ATP. Las curvas concentración-respuesta del alcohol 73

cinámico, del alcohol bencílico y del benzaldehído mostraron un desplazamiento hacia la derecha, en presencia de los dos bloqueadores de canales de potasio. Por lo tanto, estos compuestos deben en parte su efecto vasorrelajante a la activación de los canales de potasio activados por ATP y voltaje dependientes. A diferencia de lo encontrado para los dos alcoholes y el benzaldehído, la curvas concentración-efecto vasodilatador del cinamaldehído no se modificaron en presencia del TEA ni de la glibenclamida, indicando que su mecanismo de acción no involucra la activación de canales de potasio. Estos resultados coinciden con las observaciones previamente hechas por Yanaga et al. (2006).

En resumen, los experimentos realizados para determinar el mecanismo de acción de los compuestos objeto de estudio indicaron que el efecto vasodilatador del alcohol bencílico y del benzaldehído es inducido mediante un mecanismo independiente de endotelio, relacionado, al menos en parte, con la activación de los canales de potasio voltaje dependientes y activados por ATP. En contraste, el alcohol cinámico provoca una vasorrelajación que involucra la liberación de factores endoteliales y la acción directa sobre la musculatura lisa arterial. En este último caso, estimulando la GC y activando ambos tipos de canales de potasio. Finalmente, el cinamaldehído presenta un mecanismo independiente de endotelio, relacionado con la activación tanto de la GC, como de los canales de potasio activados por ATP y voltaje dependientes.

En este estudio se reporta por primera vez el efecto vasorrelajante del alcohol bencílico y del alcohol cinámico y su mecanismo de acción, así como el mecanismo de acción del benzaldehído. Nuestro trabajo confirma algunos de los resultados obtenidos previamente por el grupo de Yanaga con relación al mecanismo de acción del cinamaldehído. Sin embargo, se encontraron discrepancias con los reportes de dichos investigadores, quienes propusieron que este compuesto también promueve la liberación de factores endoteliales. Indudablemente es necesario realizar más experimentos a fin de descartar completamente la participación de dichos factores. 74

Estos hallazgos son relevantes ya que estos compuestos, además de tener una amplia distribución en diferentes especies vegetales (Macht, 1922; Feron et al.,1991; Bickers et al, 2005) y de emplearse de manera ordinaria como ingredientes de fragancias en la industria cosmética y como aditivos en alimentos (Krings y Berger,1998; Bickers et al., 2005), presentan un bajo nivel de toxicidad (Nair 2001; Adams et al, 2004; Anderson 2006; Bickers et al, 2005), lo cual, aunado a su efecto vasodilatador abre la perspectiva de su posible utilización como moléculas prototipo para el desarrollo de fármacos útiles en el tratamiento de la hipertensión arterial.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo constituyen una sólida evidencia del potencial nutraceútico que posee el fruto de P. serotina. Desde el punto de vista nutricional, este fruto representa una fuente importante de carbohidratos y además brinda un mayor aporte de proteínas con relación a otros frutos provenientes de otras especies del género Prunus (Villa De la Torre, 2008). Además de estas propiedades nutricionales, el fruto del capulín constituye una fuente de compuestos vasorrelajantes no polares. La actividad farmacológica demostrada para los compuestos identificados en el presente trabajo, sugiere que el fruto del capulín puede emplearse para el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares. Esta nueva aplicación nutracéutica del fruto representa un beneficio adicional que se suma a los efectos curativos que se le atribuyen en la medicina tradicional para tratar enfermedades respiratorias y gastrointestinales.

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X. CONCLUSIONES

- El estudio fitoquímico biodirigido del extracto de diclorometano obtenido a partir del fruto de P. serotina condujo al aislamiento de tres triterpenos pentacíclicos de tipo ursano: el uvaol, el ácido ursólico y el aldehído ursólico. Adicionalmente, se obtuvo el β-sitosterol . Este trabajo constituye el primer reporte de la presencia del uvaol y del β-sitosterol en P. serotina. Por otra parte, aunque el ácido ursólico y el aldehído ursólico ya se habían aislado de las hojas de esta especie, no se había reportado su presencia en el fruto.

- Considerando la cantidad de muestra disponible, sólo fue posible evaluar el efecto farmacológico del ácido ursólico. Este metabolito presenta una relajación significativa de la aorta, dependiente de la concentración. Esta evidencia experimental y los datos reportados en la literatura indican que el ácido ursólico y el uvaol constituyen unos de los principios activos vasorrelajantes contenidos en el fruto del capulín.

- El análisis del aceite esencial del fruto de P. serotina indicó la presencia de 58 compuestos, de los cuales pudieron ser identificados 7 que representan el 50.34% del total de componentes presentes en la esencia. Cuatro de estos compuestos se identificaron como el alcohol bencílico, el benzaldehído, el cinamaldehído y el alcohol cinámico.

- La evaluación farmacológica del alcohol bencílico, el benzaldehído, el cinamaldehído y el alcohol cinámico indica que los cuatro compuestos inducen una vasorrelajación significativa, dependiente de la concentración, de la aorta aislada de rata. El compuesto con la mayor potencia vasodilatadora fue el alcohol cinámico.

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- El efecto relajante de la musculatura lisa arterial inducido por el alcohol bencílico y el benzaldehído involucra un mecanismo independiente de endotelio, relacionado, al menos en parte, con la activación de los canales de potasio voltaje dependientes y activados por ATP. Por otra parte, en la vasorrelajación inducida por el alcohol cinámico intervienen la activación de la GC y la activación de ambos tipos de canales de potasio. Finalmente, el cinamaldehído presenta un mecanismo independiente de endotelio, relacionado con la activación, tanto de la GC como de los canales de potasio activados por ATP y voltaje dependientes.

- Este trabajo constituye el primer reporte acerca del efecto vasorrelajante y la elucidación del mecanismo de acción del alcohol bencílico, el benzaldehído y el alcohol cinámico. Considerando su amplia distribución en diferentes especies vegetales y su bajo nivel de toxicidad, estos compuestos pueden proponerse como moléculas prototipo para el desarrollo de fármacos útiles en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, tales como la hipertensión arterial.

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XI. BIBLIOGRAFÍA

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88

ANEXO 1

Espectro 1. Espectro de RMN1H del ácido ursólico.

89

Espectro 2. Espectro de RMN1H del uvaol.

90

Espectro 3. Espectro de RMN1H del aldehído ursólico.

91