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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SEGUNDA ESPECIALIDAD EN HEMOTERAPIA Y BANCO DE SANGRE CURSO

SEROLOGIA Y SEROPREVALENCIA

TEMA

:

PARTICIPANTE:

TECNICAS DE ELISA EN INMUNOSEROLOGIA PARA UN BANCO DE SANGRE

CARMITA ADELAIDA JORGECHAGUA SAAVEDRA MARLENE TALLEDO PANTA ELVIRA AVALOS CONTRERAS LILIANA MORI UBILLUS

DOCENTE:

LIC. WALTER PINILLOS.

LIMA 13 JUNIO 2015

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INTRODUCCION La salud es el regalo más preciado de la vida, sin esta es difícil disfrutar al máximo de todos los acontecimientos especiales en los que ríes, juegas, amas, sientes, sueñas, anhelas, viajas y demás momentos que se presentan en la vida. La transfusión de sangre o de sus derivados se ha convertido en una parte imprescindible en la actual asistencia sanitaria. El incremento de los accidentes de tránsito, las importantes necesidades de algunos enfermos que antes eran considerados irrecuperables son algunos de los elementos que han provocado esta demanda creciente de sangre. Estos y otros problemas también han hecho aumentar extraordinariamente las necesidades de derivados de la sangre, por lo tanto la necesidad contar con sangre se ha convertido en un factor importante de la salud pública. La transfusión de sangre y sus componentes, son una necesidad permanente y exige que se garantice la máxima calidad de ellos para garantizar la seguridad y eficacia de la transfusión, evitando en particular, la transmisión de agentes infecciosos transmitidos por la transfusionales como el Virus de la inmunodeficiencia adquirida, el HTLV I-II, la Hepatitis b, la Hepatitis C, El Sífilis y el Chagas. El desarrollo de técnicas de detección de estos agentes biológicos han evolucionado en el tiempo conociéndose varias de ellas, en lo que respecto a este trabajo nos ocuparemos de las técnicas de Elisa “Ensayo Inmunoenzimático para la detección de antígenos o anticuerpos de los microorganismos de importancia transfusional. En los últimos años se hecho necesario limitar al máximo la transfusión de sangre debido fundamentalmente a la posibilidad de transmitir por esta vía algún virus, bacteria o parasito de enfermedades infecciosas (SIDA, hepatitis B y C,) víricas y priónicas. (1). El desarrollado de nuevas medidas de diagnostico con el fin de reducir al mínimo la utilización de sangre y sus componentes, entre las que destacan diferentes modalidades técnicas de ELISA normalmente dentro de un programa multidisciplinario de transfusión de sangre son destinadas a la reducción de la transmisión de estos agentes patógenos. Estas medidas, aunque no limitan totalmente la contaminación por transfusiones, si disminuyen de manera importante las mismas. Si bien la seguridad biológica de los componentes sanguíneos se ha incrementado, el aspecto más reciente ha sido el desarrollo de las técnicas de detección por enzima inmuno ensayo y el empleo de equipos automatizados , lo que disminuye la posibilidad de obtener falsos resultados positivos por contaminación de las muestras en el proceso por manipulación humana del operador o mala interpretación de valores de lectura y sus posibles consecuencias en el aumento de las infecciones post transfusionales y el costo que implica la eliminación no solo de la sangre, del consumo de los reactivos sino de las consecuencias de la información generada tanto en los pacientes como en los donantes de sangre del que se cuestiona la relación costo-eficacia y que no está exento de riesgos. 2

Se han empleado diferentes sistemas de ELISAS en diferentes formatos dependiendo de las casas fabricantes de los reactivos y al metodología empleada y del tamaño de los equipos tanto automáticos como semiautomáticos para procesar dichas pruebas de ELISA las cuales constituyen un método eficaz y seguro, fácil de manejar y rápido de montar , de tal manera que en muchos hospitales constituye ya una técnica habitual y una pieza clave en los protocolos de de tamizaje para los donantes de sangre. En el futuro las estrategias detección de antígenos o anticuerpos de virus, parásitos o bacterias de importancia transfusional destinadas al tamizaje de donantes de sangre deberán tener presente el desarrollo tecnológico de estas pruebas y determinar cuál es el mejor método y de que formato para utilizarlo en un banco de sangre y así tener mayor seguridad y certeza de que por lo menos estamos haciendo lo mejor posible para reducir la trasmisión de enfermedades por vía transfusional , sin dejar de hacer una buena selección e indagación epidemiológica de los antecedentes de los donante para hacer una combinación de estos conocimientos y resultado en beneficio del paciente y al responsabilidad que nos toca a cada uno de los profesionales y técnicos de la salud que laboran en un banco de sangre o centro de hemoterapia. Que cada vez la edad avanzada es un grupo de la población creciente, además las estrategias de ahorro de sangre deben ir a incluir la cirugía de urgencias. (1)

MARCO TEORICO ANTECEDENTES El empleo de las enzimas como marcadores immunoquímicos en sustitución de los radioisiotopos , para su utilización en los análisis de enlace competitivo, fue descrito por primera vez en 1971 (Avrameas,1971). (1) Los nombres más utilizados son: ELISA: Enzyme –linked immunosorbent assay o análisis de inmunoabsorción enzimática; EIA: Enzyma immunoassay o inmunoanálisis enzimático, y EMIT: Enzyme-multiplied immunoassay technique o técnica de inmunoanálisis con multiplicación enzimática, que es una marca registrada de SYVA Co (D. Behering Inc. cupertino, CA 95041) (Rubestein, 1972).(1,2).

El EIA es capaz de detectar cantidades muy pequeñas de reactivos inmunológicos. (1). Esencialmente, los EIA heterogéneos son similares a los RIA, excepto que emplean enzimas como sonda. Las enzimas hacen posible desarrollar EIA homogéneos, eliminando los pasos de lavado para la separación de B/F que de otro modo son necesarios. Mejoras en los EIA han aportado muchos formatos innovadores con diferentes grados de rapidez, sensibilidad, simplicidad y precisión (2).

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL INMUNOENZIMOANALISIS. 3

Tabla 34.5 Ventajas y desventajas de un inmunoensayo enzimático VENTAJAS DESVENTAJAS 1. Pueden desarrollar análisis sensibles por 1. La medida de la actividad enzimática el efecto de amplificación de las enzimas. puede ser más compleja que la medida (a)(b) de la actividad de algunos tipos de 2. Los reactivos son relativamente baratos y radioisótopos (b). pueden alcanzar una larga vida media de 2. La actividad enzimática puede verse conservación en almacenaje. (a)(b) afectada por algunos componentes del 3. Pueden desarrollar múltiples análisis plasma(b) simultáneamente. (a)(b) 3. Los ensayos homogéneos actualmente, 4. Se puede realizar una amplia variedad de poseen una sensibilidad de 10-9M y no configuraciones analíticas. (a)(b) son tan sensibles como la que se 5. El equipo necesario no es necesariamente consigue con los radioinmunoensayos. caro (barato) y ampliamente disponible. (a, b). Asequible (a)(b) 4. Los EIA homogéneos para moléculas 6. No hay riesgo de radiación durante el proteicas grandes se han desarrollado, marcado ni en la eliminación de pero se requieren reactivos productos de desecho. (a) inmunoquimicos complejos.(a, b) 7. Se puede desarrollar un EIA rápido y simple, adaptable a la automatización.(a) 8. Se puede desarrollar un EIA homogéneo para los áptenos y las proteínas. (a) Fuente: a.Henry John Bernard. Diagnóstico y Tratamiento Clínicos por el Laboratorio. 9° Edición, edit. Masson-salvat Medicina. 1993. Pp. 887b. Henry John Bernard.. Laboratorio en el Diagnóstico Clínico. Tomo 2. Edición Homenaje a Todd –Stanfor & Davidsohn. Madrid : Marbán, c2007 pp833

La calificación de los EIAs depende de. a) El reactivo que hay que determinar es decir, b) El antígeno o el anticuerpo. c) El Reactivo marcado, la naturaleza competitiva o no del análisis, y d) El método de separación de los reactivos unidos libres. Existen varios criterios importantes para determinar la selección de un marcador enzimático en particular, entre otros: a) El número de recambio o de moléculas de sustrato que se convierten en productos por lugar enzimático/unidad de tiempo, b) Pureza c) Sensibilidad d) Facilidad de velocidad de detección e) Ausencia de factores que pueden interferir en el líquido que hay que analizar f) Grupos reactivos potenciales g) Estabilidad y 4

h) Idoneidad para un EIA homogéneo. (2) Existen dos tipos fundamentales de EIA: El heterogéneo y el homogéneo, en el primer sistema la reacción antígeno- anticuerpo no modifica la actividad del marcador enzimático. En el segundo, la interacción antígeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima, lo que hace que desaparezca la necesidad de un paso de separación. En la siguiente tabla se enumeran las enzimas empleadas con más frecuencia en los análisis heterogéneos y homogéneos: (1) Tabla 34.5 Enzimas de utilización más frecuente en los distintos EIA Enzimas usados en EIA heterogéneos Enzimas usados en EIA homogéneos  Peroxidasa de rábano  Lisozima  Fosfatasa alcalina  Malato-deshidrogenasa  Β-D-Galactosidasa  Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa  Glucosa-oxidas  Fosfolipasa-C  Glucoamilasa  Β-D-Galactosidasa  Anhidrasa carbonica  Acetil colin esterasa  Catalasa 

Fuente: a.Henry John Bernard. Diagnóstico y Tratamiento Clínicos por el Laboratorio. 9° Edición, edit. Masson-salvat Medicina. 1993. Pp. 888)

Tabla:35.6 Características de las Enzimas Típicas empleadas en los inmmunoensayos enzimáticos  Caracteristicas Persoxidasa(Ec1.11.1.7) Β-D-Galactosidasa Fosfatasa alcalina (EC: 3.2.1.23) Fuente Tamaño molecular Actividad específica Tasa de renovación* Medida de la enzima Medida de alta sensibilidad Método de marcaje de la enzima

EC 3.1.3.1)

Rábano E. coli intestino bovino ca. 40,000 ca. 530,000 140,000 250U/mg 600U/mg 1000 U/mg 10,000 318,000 250, 0000 colorimetría, fluorimetría, colorimetría, fluorimetría, colorimetría, fluorimetría Luminometría luminometría luminometría Luminometría Fluorimetría Luminometrí Oxidación del periodato método de la dimaleimina, método del glutaraldeído (método de Nakane) reactivo de entrecruzamiento 1 reactivo de entrecruzamiento 1

*Número de moléculas del sustrato producidas por una molécula en una reacción de un minuto/número de moléculas/min 1 el reactivo contienen grupos químicamente reactivos como la malemida y el succinamida . Henry John Bernard.. Laboratorio en el Diagnóstico Clínico. Tomo 2. Edición Homenaje a Todd –Stanfor & Davidsohn. Madrid : Marbán, c2007 pp834(2)

ENZIMA INMUNOENSAYO ENZIMATICO HETEROGENEOS

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El concepto de EIA heterogéneo lo presentó por primera vez miles (1968), quien describió el uso de anticuerpos marcados con isotopos en los RIA no competitivos y sugirió que las enzimas o coenzimas podrían reemplazar el marcador isotópico. Fueron engvall (1971) y van Weemen (1971) los que informaron sobre el uso de los conjugados enzima-antígeno y enzima-anticuerpo en el inmunoánalisis. El ELISA es un EIA heterogéneo basado en el mismo principio que el RIA. En el ELISA él, la actividad enzimática en la fracción unida y en la libre se cuantifica por la conversión, catalizada por la enzima, de un producto relativamente incoloro o no fluorescente. (1). Es decir, el principio de los ensayos EIA heterogéneos es similar a los del RIA, excepto que, lo que se mide es la actividad enzimática y no la radioactividad. Los EIA requieren de un proceso secundario para obtener señales mediante la reacción catalítica de las enzimas. (2). Todos lo es EIA heterogéneos tiene, al menos, un paso de separación para diferenciar entre el material que ha reaccionado y el que no lo ha hecho. En el sistema de EIA heterogéneo, la enzima sobre el antígeno o el anticuerpo marcados conservan su actividad, incluso después de la reacción con el anticuerpo o el antígeno recíprocos.(1) la elección de la fase de separación en este procedimiento sólo se encuentra limitada por el gran tamaño del marcador enzimático.(1)Como fase solida para separar los conjugados libres de los unidos, pueden utilizarse placas de microtiter, partículas de plástico, tubos de plástico, partículas magnéticas, y látex con filtros, entre otros. El uso de pequeñas partículas magnéticas y de látex permite acortar el tiempo total que requiere el ensayo. (2). El desarrollo de sustratos que escindan las enzimas, estuvo marcado por la introducción de sustratos colorimétricos y fluorimetricos, y más tarde de sustratos quimioluminiscentes, que incrementan la sensibilidad de la señal. Algunas de las enzimas más utilizadas en varios EIA heterogéneos son la peroxidasa de rábano, la fosfatasa alcalina, la β-galactosidasa, la glucosa oxida, la ureasa y al catalasa. Las enzimas más usadas junto con sus características aparecen en la tabla 35-6. La sensibilidad del ensayo cuando se utilizan enzimas puede determinarse por la tasa de recambio de cada enzima y por la selección de la medida de la señal, entre los que al quimioluminiscencia es el método más sensible. (2). El concepto del ensayo de los EIAs heterogéneos, al igual que de los RIA, se puede dividir entre ensayos competitivos y no competitivos (ver Fig. 35-14). Los ensayos competitivos (exceso de analito) usan conjugados de antígeno enzima 8fig.35-13ª)), mientras que los ensayos no competitivos (exceso de reactivo) incluyen los ensayos inmunométricos de sándwich de dos dianas y los ensayos indirectos para medir anticuerpos. (Figs. 35-13B y C). Los ensayos inmunométricos de sándwich han aumentado su popularidad para la determinación de antígenos como hormonas, marcadores tumorales, proteínas plasmáticas y agentes infecciosos. Los ensayos indirectos para al medida de anticuerpos (Fig.35-13C) se han adoptado para la detección de anticuerpos frente a antígenos infecciosos (p.e. VIH, HBV, HCV) y auto anticuerpos.(2). Tabla 34.6 Clasificación de las Técnicas de ELISA 6

Análisis competitivos empleados 1. Conjugado antígeno-enzima 2. Análisis de anticuerpo marcado con enzima Análisis no competitivos 1. Análisis inmunoenzimométrico sándwich de dos sitios 2. Análisis indirecto para medir el anticuerpo Fuente: a.Henry John Bernard. Diagnóstico y Tratamiento Clínicos por el Laboratorio. 9° Edición, edit. Masson-salvat Medicina. 1993. Pp. 888



Fuente: Henry John Bernard.. Laboratorio en el Diagnóstico Clínico. Tomo 2. pp833 (2)

U n EIA heterogéneo (Fig. 35-12) consta de los siguientes pasos. 1. La fase solida unida a los reactivos s e mezcla con el analito, independientemente de si el ensayo se basa en el formato competitivo o no competitivo. 2. Después de la adición del conjugado y la incubación, hay unos pasos de lavado con una solución tamponada que contiene un detergente, uno o dos pasos después de al inmunorreacción . La reacción inmunológica debe alcanzar determinados niveles para obtener un ensayo preciso y estable. 3. La fase solida, con el complejo inmune que contiene el antígeno conjugado a una enzima o un anticuerpo, se incuba a temperatura constante con la solución de sustrato enzimático.

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4. La reacción enzimática se detiene (no es necesario en el ensayo de las tasas) y el producto de la reacción se mide con varios detectores dependiendo del sustrato empleado. (2). Fig. 35-13. Principios del inmunoensayo enzimático (EIA) empleando la fase sólida, (A) ensayo de sándwich competitivo y (B y C) No competitivo. Fuente: (2)

ENSAYO ENZIMÁTICO COLORIMÉTRICO

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En este ensayo, la reacción enzimática se realiza utilizando sustratos, magnéticos para desarrollar un color mediante la reacción catalítica principal. Por ejemplo, la Peroxidasa de rábano, catalizando el ABTS (Sal de diamonio de 2,2’-azino-di (3-etil-benzotiazolina-6sulfonato) con H2O2 para dar un color verde y la fosfatasa alcalina, especifica para el pnitrofenil fosfato para da un color amarillo . Ambas son los tipos más utilizados en lso inmunoensayos enzimáticos colorimétricos. Se utiliza un espectofotómetro para medir la densidad óptima del cromógeno resultante. Existen diversos instrumentos posibles que permiten medir al densidad óptica en tubos o placas de microtiter pasando desde un sistema completamente automatizado que hace desde el pipeteo de al muestra hasta la o impresión de los resultados, hasta instrumentos manuales más sencillos. Cuando la reacción EIA se hace sobre una membrana de nitrocelulosa (método de transferencia western) u otras membranas, se emplean sustratos que generan tintes insolubles. U n test de embarazo para la hCG en un formato de inmune ensayo se vende sin receta médica, a menudo utiliza derivados de la bencidina que reacciona con la peroxidasa , o derivados del indoxil fosfato que reaccionan con la fosfatasa alcalina para generar precipitados coloreados. El precipitado de color que se acumula en la fase sólida por la acción de la enzima puede detectarse a simple vista. Teóricamente, la medida de la densidad óptica está limitada por un rango de entre 0 y2.0. Así, la determinación de la densidad óptica de los analitos que requieren un amplio rango puede resultar problemática, incluso cuando se emplean un exceso de conjugado y fase sólida con suficiente capacidad de captura en un ensayo de tipo sándwich. (2). Los esfuerzos para mejorar los EIA, u n punto clave en el desarrollo de los inmunoensayos no isotópicos, han sacado a la luz diversas desventajas de los RIAs como son los residuos radioactivos, radiolisis de lso analitos marcados, y la corta vida media del 125I. Ishikawa, (1989), desarrollo un EIA ultrasensible que puede detectar 3 moles de una IgG específica. Para alcanzar este nivel de sensibilidad se requieren pasos tediosos, como la transferencia del inmunocomplejo de una primera fase sólida a otra distinta para reducir las señales de fondo.(2) ELISA COMPETITIVO. ELISA COMPETITIVO CON EMPLEO DE ANTIGENO MARCADO POR ENZIMAS Este tipo de ELISA se sirve de un antígeno marcado enzimáticamente, con el anticuerpo especifico inmovilizado en una fase solida. Las concentraciones del producto sustrato son inversamente proporcionales a las del antígeno estándar o de pruebas añadidos. Este tipo competitivo de ELISA se ha aplicado para analizar una amplia gama de antígenos, incluidas IgG y gonadotropina corionica humana. Es particularmente útil para analizar haptenos o fármacos en los que el anticuerpo específico es univalente. El análisis consta de los siguientes pasos ( Fig. 34-15, 1): 9

1. El anticuerpo específico se adsorbe físicamente o se une de modo covalente a una fase sólida. 2. El anticuerpo no unido se elimina por lavado. 3. En antígeno marcado enzimáticamente se incuba en presencia de antígeno estándar o de prueba que se ha de analizar. 4. Lavado con tampón que contenga un agente humectante, después que la reacción antígeno-anticuerpo haya llegado a una situación de equilibrio. 5. La fase sólida con el complejo antígeno-anticuerpo marcado enzimáticamente, se incuba a temperatura constante con la solución de sustrato enzimático. 6. Se detiene la reacción enzimática y se mide el producto de la reacción del sustrato espectofotométrica o fluorométricamente. (1)

ELISA COMPETITIVO MEDIANTE CONJUGADO DE ENZIMAS-ANTICUERPO En esta técnica el antígeno esta unido a una fase sólida. La unión del anticuerpo marcado enzimáticamente y el antígeno en fase sólida disminuye competitivamente si se añade antígeno estándar o desconocido de prueba. 10

Los pasos en este análisis son similares a los del ELISA con antígeno marcado enzimáticamente. El producto medido de reacción es inversamente proporcional a al concentración del antígeno estándar o de prueba. El método puede usarse para analizar una amplia gama de antígenos y ah demostrado una especial utilidad en el análisis del antígeno carcinoma embrionario. (1). ELISA NO COMPETITIVO

Las 6tecnicas de ELISA no competitivo constituyen un ejemplo de los análisis de tipo I (con exceso de anticuerpo) . A menudo se denominan análisis inmunoenzimométricos, en los que el analizado, o antígeno, reacciona con un exceso estoiquiométrico de anticuerpo. , y el grado de reacción antígeno-anticuerpo se mide en un segundo paso. Los análisis de inmunoenzimométricos con anticuerpo marcado gozan de ciertas ventajas: 1) No es necesario aislar el analizado puro 2) Con un paso de separación suele eliminarse la interferencia no deseada de la muestra, antes de la reacción con el anticuerpo especifico marcado enzimáticamente, 3) El procedimiento analítico requiere menos tiempo de reacción que en el ELISA competitivo , y 4) Es posible que a la sensibilidad sea superior a la del ELISA competitivo comparable. 5) Los ELISA no competitivos se han de controlar cuidadosamente; de los contrario, puede haber dificultades en cuanto a la precisión y reproductibilidad del análisis. Existen ELISA no competitivos para antígenos y anticuerpos (1). ELISA TIPO SANDWICH NO COMPETITIVO

En este método, que se muestra en al Fig. 34-16, se conoce también con el nombre de análisis de inmunoezimométrico. Solo es aplicable a antígenos bivalente o polivalente. E estas técnicas, el anticuerpo inmovilizado en la fase sólida se incuba con el antígeno estándar o de prueba. Después del lavado, el complejo anticuerpo inmovilizado-antígeno se incuba con un exceso de anticuerpo marcado enzimáticamente, que se fija a uno de los sitios antigénicos restantes. Después de otro paso de lavado, se añade la solución de sustrato enzimático y se incuba. La reacción del producto de reacción enzimática es directamente proporcional a la concentración del antígeno estándar o analizado. El ELISA tipo sándwich se ha empleado para cuantificar de manera sensible los marcadores tumorales, como el antígeno carcinoma embrionario, la α- fetoproteina y muchos otros antígenos , incluidos proteínas y virus. Con el advenimiento de la tecnología los anticuerpos monoclonales, es posible realizar simultáneamente la incubación del anticuerpo inmovilizado en la fase solida con el analizado de prueba o antígeno. El anticuerpo monoclonal que se emplea para la fase sólida 11

debe reaccionar con un determinante del antígeno polivalente que sea diferente a aquel con el que reacciona el anticuerpo monoclonal específico marcado enzimáticamente.(1)

ELISA INDIRECTO PARA MEDIR EL ANTICUERPO Se trata de otro tipo de ELISA para medir la concentración de anticuerpo en las muestras de líquidos biológicos: En este procedimiento se emplea antígeno inmovilizado, que reacciona 12

con la muestra de anticuerpo (fig.34-16). El paso siguiente consiste en un lavado y la reacción posterior con anticuerpo marcado enzimáticamente y especifico para la inmunoglobulina de la especie que se trata de analizar. Con este método es posible cuantificar una amplia gama de anticuerpos específicos, particularmente víricos, como contra el virus del sarampión, citomegalovirus y virus Epstein-barr(1). La aplicación más frecuentemente citada del ELISA es probablemente la medición de los anticuerpos IgG e IGM en diversas infecciones y en enfermedades de causa inmunológica. Se ha usado múltiples variantes y técnicas. En el ELISA para los anticuerpos IgM existe un problema con respecto a la competencia de la IGG específica y de los factores reumatoides (1). CARACTERISTICAS DE LA FASE SOLIDA Los Principios en que se basan los EIA heterogéneos son similares a aquellos en que se funda los RIA.; sin embargo, en los primeros es importante elegir adecuadamente la fase de la separación ya que se afecta por el tamaño molecular de los marcadores enzimáticos. Los métodos de separación que e emplean más comúnmente en los EIA son los de fase sólida y a la precipitación inmunológica con un segundo anticuerpo: La inmovilización en fase sólida del antígeno o del anticuerpo se logra por unión covalentes. Se han empleado partículas de agarosa, poliacrilamida y poliestireno. También han usado partículas de oxido de hierro, que pueden separase en un campo magnético, (1). La inmovilización sobre la superficie de plástico ha conducido al desarrollo de EIA capaces de realizar un gran volumen de trabajo : El uso de placas de plástico para micro titulación ha servido para desarrollar una amplia gama de instrumentos en los EIA heterogéneos , que actualmente están reemplazando a los RIA.. LIMITACIONES Y SENSIBILIDAD DEL EIA HETEROGENEO Los factores de sensibilidad, especificidad, precisión o reproductibilidad de cualquier análisis dependen del diseño de configuración, la matriz de fase sólida, el anticuerpo, el conjugado enzima-anticuerpo, la enzima y el método de medición de ésta. (1). Otros factores de importancia son los siguientes: 1. Adsorción inespecífica, que influye significativamente sobre la medición de cantidades extremadamente pequeñas del analizado. 2. La naturaleza y al extensión de la reacción antígeno-anticuerpo son factores limitantes del análisis. En experimentos con EIA para IgE a concentraciones de 0,05 a 0,1 ng de IgE/ml, el factor limitante no fue la detección del nivel enzimático, sino la naturaleza de la reacción del anticuerpo(1). 3. El efecto prozona, o “gancho de dosis altas” , que puede conducir a una menor reactividad cuando están presentes niveles altos del analizado. En el desarrollo de un método determinado de ELISA hay que averiguar cuales son las condiciones óptimas para cada estadío de la prueba, por ejm: 13

a) Concentración óptima del antígeno o del anticuerpo para la inmovilización o recubrimiento de la fase solida. b) Tiempos de incubación óptimos para cada paso del análisis, los análisis competitivos requieren un tiempo mayor para el equilibrio; c) Tipo de sustrato, tiempo y temperatura óptimos para que a la reacción enzimática desarrolle el producto (1). d) Es posible desarrolla ELISA precisos y ultrasensibles. Con un ELISA, en el que se empleo el complejo de anticuerpo Fab-β-galactosidasa de conejo y el anticuerpo IgG de conejo unido a varias varillas de vidrio, pudieron detectarse 0.03 fmol de antígeno ornitin –transferasa de hígado de rata y 0,3 fmol de antígeno IgG humano. Ishikawa, en 1981, desarrollo un EIA ultrasensible que detecta 0,45 ng (3fmol) de anticuerpo IgG específico por mililitro de suero. Para lograr este grado de sensibilidad es necesario recurrir a varios pasos complejos de lavado, con el empleo de un anticuerpo enzimático. En el futuro, el uso de anticuerpo monoclonales altamente específicos y ávidos incrementará el grado de sensibilidad de los métodos EIA.

INMUNOENZIMA ENSAYOS HOMOGÉNEOS ORIGEN El término de inmunoanálisis homogéneo puede ser aplicado a cualquier sistema de reacción antígeno-anticuerpo, en el que sea posible medir el grado de reacción inmunológica sin separación de los componentes “libres” libres y marcados con anticuerpo. Estos métodos son menso sensibles que los heterogéneos, ya que estos últimos han conseguido igualar al sensibilidad de lso RIA en muchos casos. .Los EIA pueden precisar reactivos inmunoquimicos complejos, pero ofrecen la ventaja de ser rápidos, sencillos, y adaptables a la automatización. Lo stipo de EIA homogéneos se enumeran en la tabla 34.7. Tabla 34.7 Tipos de EIA homogéneos marcados 1. Análisis con antígeno o analizado marcados 2. Inmunoanalisis de fluorescencia con sustrato enzimático 3. Análisis con cofactor enzimático marcado 4. Análisis con grupo prostético marcado 5. EIA con avidin-biotina 6. Análisis con anticuerpo híbrido 7. Inmunoanalisis con enzima marcada con anticuerpo a) Análisis con fosfolipasa C b) Inmunoanalisis con refuerzo 8. EIA con inmunoanalisis de sustrato enzimático insoluble 9. Inmunoanalisis con donador enzimático clonado 10. Inmunoanalisi con modulador enzimático 14

11. Inmunoanalisis de canalización enzimática 12. Inmunoanalisis con liposomas enzimáticos 13. Inmunoanalisis electroquímico Fuente: a.Henry John Bernard. Diagnóstico y Tratamiento Clínicos por el Laboratorio. 9° Edición, edit. Masson-salvat Medicina. 1993. Pp. 890

Existen dos opciones para evitar procesos tediosos en el ensayo. Uno es diseñar instrumentos totalmente automatizados con acceso continuo a tipos heterogéneos de reactivos, y el otro es desarrollar reactivos innovadores que no requieren pasos de lavado complicados, como requieren los EIA heterogéneos. Las enzimas y sus cofactores son sondas ventajosas en los EIA homogéneos porque la actividad enzimática se puede modular fácilmente cambiando lso factores presnetes en el microambiente de la reacción Ag-Ab. Actaulamnete los EIA son menos sensibles que sus equivalentes heterogéneos. Los EIA heterogéneos convencionales tienen una sensibilidad equivalente a la de los RIA en muchas aplicaciones, mientras que el EIA homogéneo mantiene una sensibilidad de uno o dos órdenes de magnitud inferior. Los EIA homogéneos pueden necesitar reactivos inmunoquimicos complejos, pero los sistemas de ensayo son rápidos y sencillo, y se pueden adapatar a instrumentos convencionales . hay varios tipos de EIA homogéneos. En cada uno de estos ensayos, la interacción antígeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima o de la sonda acoplada a la enzima en presencia de sustrato. La modulación de la actividad enzimática refleja el grado de reacción inmunoquimkica . En la tabla 35-7 aparece una lista de características de los EIA homogéneos típicos.

Los EIA homogéneos se pueden clasificar en ensayos de unión competitivos o no competitivos. Los ensayos competitivos generalmente consisten en antígenos acoplados a una enzima que funciona como sonda . Sin embargo , en otros formatos de ensayo, el antígeno ( analito) se puede conjugar al sustrato o a un grupo protético de la enzima. Por el contrario, los ensayos de unió no competitivos emplean un conjugado compuesto por un 15

anticuerpo acoplado a una enzima. De entre los distintos tipos de métodos mencionados, s presta especial atención a cinco EIA homogéneos:

INMUNO ENSAYO DE MULTIPLICACIÓN ENZIMATICA (EMIT) EMIT, el primer EIA homogéneo, fue desarrollado por Rubesntein (1972). El sistema de EMIT esta esquematizado en al fig. 35-15. En el EMIT, la conjugación de las enzimas a haptenos no afecta a la actividad enzimática; sin embargo, la unión de anticuerpos específicos para haptenos y su ligando causa la inhibición de la actividad enzimática. Los haptenos libres presentes en al muestra o en el estándar liberan esta inhibición compitiendo por la unión a los anticuerpos. Así la actividad enzimática es proporcional a la concentración de haptenos libres. Como regla general, el anticuerpo inhibe a la enzima induciendo o impidiendo cambios conformacionales necesarios para la actividad enzimática. (2)

OTRAS CONSIDERACIONES A TENER EN CUENTA Principios de Diagnóstico Inmunológico Afinidad y avidez Afinidad: fuerza de interacción entre Ac y Ag en un solo determinante antigénico, en la mayoría de las circunstancias prácticas nos preocupamos por la interacción del antisuero con un Ag multivalente. Fuerza o intensidad de la unión entre un determinante antigénico y su sitio de unión al Ac.

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Avidez: fuerza con la que el Ac multivalente se une a un Ag multivalente. Fuerza total de la unión entre Ag‐Ac (suma de fuerzas de atracción y de repulsión).

Reproductividad: Es la capacidad del ensayo para ofrecer los mismos resultados cuando se repite su aplicación en circunstancias similares. • Sensibilidad: Capacidad de un método para detectar positivos. •

Especificidad : Capacidad para detectar negativos

•

Pruebas de tamizaje alta sensibilidad para poder captar a todos los enfermos

•

Pruebas confirmatorias : alta especificidad, para evitar falsos positivos

•

Valor de corte: cutoff: Máxima Sensibilidad + Máxima especifidad

•

PREVALENCIA: Número de casos de una infección/ enfermedad en un determinado punto en el tiempo, dentro de una población específica

•

A menor prevalencia poblacional, Resultados falso-positivos

•

VPP : Es la probabilidad de padecer la enfermedad si se obtiene un

mayor

probabilidad

:

resultado positivo en el ensayo

•

VPN : Es la probabilidad de que un sujeto con un resultado negativo en la prueba esté realmente sano

•

Sensibilidad y Especificidad : son propiedades intrínsecas a la prueba diagnóstica : definen su validez independientemente de cuál sea la prevalencia de la enfermedad en la población

•

ELISA: Además, algunos ensayos usan técnicas de amplificación para acelerar la reacción o para mejorar la señal y así aumentar la sensibilidad. El más común es usar un sistema de dos pasos: el conjugado primario es «etiquetado» con biotina. Un segundo componente consiste en anti-biotina marcado con enzima, o enzima marcada con estreptoavidina.

•

ELISA: ENSAYOS DE DETECCIÓN DE AG:

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Posteriormente se introdujo el ensayo de Ag p24 para HIV en USA para disminuir el período de ventana.

El ELISA fue el ensayo de elección para detectar HBsAg por muchos años. Las pruebas modernas son capaces de detectar niveles de menos de 0,2 IU/ml de muestra (0,1ng/ml).

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Más tarde se introdujo el ensayo de Ag de HCV para disminuir el período de ventana como alternativa al NAT, ELISA: ENSAYOS DE DETECCIÓN DE AC Se utilizan para detección de muchas infecciones. Para detección de infecciones recientes se requiere determinación de IgM. Para determinar si los donantes han estado expuestos previamente a un agente infeccioso se debe detectar IgG : Ensayo antiglobulina , Ensayo sandwich , Ensayo competitivo , Ensayo de captura

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ELISA: ENSAYOS DE DETECCIÓN DE AC ENSAYO ANTIGLOBULINA

•

Ag unido a fase sólida.

•

Incubación con la muestra diluida, el Ac se une al Ag.

•

Lavado para eliminar proteínas no unidas.

•

Adición de conjugado anti globulina humana unida a la enzima marcada que se une a los Ac unidos a la fase sólida.

•

Lavado de conjugado no unido

•

Sustrato (OPD o TMB)

•

Frenado de la reacción con ácido sulfúrico

•

Lectura VENTAJAS

•

Los reactivos son genéricos y reaccionarán contra todo Ac humano.

•

Buffers y sustratos pueden usarse en una gran variedad de ensayos diferentes.

•

Disminución de costos y procedimientos simplificados. DESVENTAJAS

•

La unión de Ac no específicos pueden dar resultados falsos positivos.

•

Los kits anti-IgM han sido propensos a dar interferencia con factor reumatoideo

18

ELISA: ENSAYOS DE DETECCIÓN DE AC ENSAYO SANDWICH

•

, Ag unido a fase sólida.

•

Incubación con la muestra, el Ac se une al Ag.

•

Lavado para eliminar proteínas no unidas.

•

Adición de conjugado: el mismo Ag que el unido a la fase solida pero en solución y unido a la enzima marcada que se une a los Ac unidos a la fase sólida: queda formado el sándwich Ag-Ac-Ag.

•

Lavado de conjugado no unido

•

Sustrato (OPD o TMB)

•

Frenado de la reacción con ácido sulfúrico

•

Lectura

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• • •

• • • • • • • • • • • •

VENTAJAS Altamente específicos Detectan IgG e IgM DESVENTAJAS Los antígenos conjugados son específicos a un solo tipo de test No son económicos Algunos antígenos son lábiles y no soportan la unión al conjugado ELISA: ENSAYOS DE DETECCIÓN DE AC ENSAYO COMPETITIVO Ag unido a fase sólida. El conjugado es el Ac unido a la enzima con la misma especificidad que el Ac que se quiere ensayar Tanto la muestra como el conjugado se agregan al mismo tiempo: incubación. Si no hay Ac en la muestra, el Ac conjugado se une al Ag de la fase sólida. Lavado de conjugado no unido. Sustrato (OPD o TMB). Frenado de la reacción con ácido sulfúrico. Lectura. Si en la muestra hay Ac, va a competir por unirse al Ag con el Ac conjugado y en este caso no hay desarrollo de color: ES REACTIVA

20

• • • • • • • • • • •

Ventajas el conjugado y la muestra se agregan al mismo tiempo reduciendo incubaciones y pasos de lavado. El método detecta tanto IgG como IgM. Desventajas Muchos falsos positivos (3) ELISA: ENSAYOS DE DETECCIÓN DE AC ENSAYO DE CAPTURA Anti gama globulina humana unida a fase sólida. (anti IgM, anti.IgG o ambas) Cuando se incuba con la muestra, los Ac se unirán, cualquiera sea la especificidad. Luego de incubación se lava la proteína no unida. El conjugado es antígeno específico marcado con la enzima que se unirá solo si hay Ac específico en la fase sólida. Lavado de conjugado no unido. Sustrato (OPD o TMB). Frenado de la reacción con ácido sulfúrico. Lectura.

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• • • • • •

Ventajas La placa es genérica (puede ser usada como la base para muchos ensayos, con buffers y cromógenos comunes pero con conjugados específicos). Puede detectar IgG o IgM Desventajas Falsos IgM positivos por la presencia de factor reumatoideo. Los Ags conjugados son caros y difíciles de producir. La sensibilidad es baja en muestras de seroconversión temprana por la pequeña cantidad de Ac presentes

ENSAYOS COMBINADOS • Varios fabricantes están produciendo kits para detectar individuos infectados recientemente: • HIV Ag/Ac • HCV Ag/Ac (3) • PERÍODO DE VENTANA Lapso durante el cual el donante está infectado pero los resultados de la pesquisa de marcadores son negativos Ventana HVC HCV AG: Anti- HCV 3° gen ventana 7-8 semanas ELISA PARA LA DETECCIÓN DE HEPATITIS B ELISA HBsAG La presencia del antígeno HBs en el suero indica una infección por el virus de la herpatitis B. es el primer marcador que aparece y puede preceder de 2 a 3 semanas a los signos clínicos y biológicos de la enfermedad. Su presencia puede ser muy breve. ( algunos días) o muy larga (varios años) . Cuando la persistencia del virus del Ag HBs supera los 6 meses, la hepatitis se considera “crónica”. La existencia de numerosos portadores crónicos asintomáticos hace que la hepatitis B represente un importante riesgo transfusional . La prevención dela transmisiones basa en la detección del AgHBs en cada donación. PRINCIPIO DE LA PRUEBA MONOLISA HBs AG ULTRA: Monolisa HBsAg Ultra es una técnica inmunoenzimatica de tipo “sándwich” en 1 tiempo utilizando anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales seleccionados por su capacidad de unirse a los diferentes subtipos del Ag Hbs actualmente reconocidos por la OMS y la mayoría de las cepas variantes de la hepatitis B. La fase solida del Monolisa HBsAg Ultra esta sensibilizada con anticuerpos monoclonales de ratón y de anticuerpos policlonales de cabra contra el Ag HBs. Estos anticuerpos están conjugados con peroxidasa. 22

Los estudio de sensibilidad que efectuaron en 428 muetras positivas procedentes del seguimiento de pacientes que presenta hepatitis B aguda, han demostrado una sensibilidad de 100%: Con Monolisa HBsAG Ultra se ah ensayado y se ha detectado totalmente un panel de 15 proteínas recombinantes reproduciendo las más importantes mutaciones en las secuencias de aminoácidos del Ag HBs. Se ha ensayado un total de 60 paneles de seroconversiones comerciales de hepatitis B (293muestars) y se ha comparado con las pruebas inmunoenzimaticas disponibles en el mercado. Monolisa AgHBs ha mostrado resultados equivalentes a Monolisa Plus en 29 seroconversiones. Monolisa AgHbs ha detectado las seroconversiones con 1 muestra de adelanto en 28 seroconversiones, con 2 muestras de adelanto de seroconversiones y 5 muestras de adelanto en 1 seroconversión. 25 muestras adicionales positivas y recién colectadas (con menos de 1 día) fueron analizadas y todas resultaron positivas. Precisión La precisión del ensayo Monolisa AgHBs Ultra se ha determinado con el análisis de 4 muestras: 1 muestra negativa, 2 muestars positivasen AgHBs(m.2 y 3) y una muestar muy positiva en AgHBs. La repetabilidad (intra ensayo) se ah evaluado con el análisis de estas 4 mismas muestars , que se han ensayado por duplicado durante 20 días a razón de 2 ensayos independientes cada día. La valoración incluye las siguientes etps: 1. Distribución de la muestra y de los sueros controles en los pocillos de la micro placa 2. Esta distribución puede controlarse visualmente. Puede diferenciarse entre un pocillo vacio y otro que contenga la muestra 3. Distribución del conjugado 4. Esta distribución también puede controlarse visualmente, tras añadir el conjugado de color rojo, el pocillo se colorea de rojo. 5. Tras la incubación durante una hora y media a 37°C, el conjugado no unido se elimina con el lavado. 6. Distribución de solución de revelado de la actividad enzimática. Esta distribución puede controlarse visualmente hay una clara diferencia entre un pocillo vacio y otro pocillo conteniendo sustrato color rosa. 7. Tras 30 minutos de incubación en presencia del sustrato, en oscuridad y a temperatura ambiente (18-30°C), la presencia de conjugado se demuestra con un cambio de color. 8. Distribución de solución de parada. Esta distribución también puede controlarse visualmente. La coloración del sustrato rosa da (para las muestras negativas) o azul (para las muestras positivas) , desaparece de los pocillos que se vuelven incoloros ( en el caso de muestras negativas) o amarillos en el caso de de muestras positivas) tras la adición de la solución de parada. 9. Lectura de densidades ópticas a 450/620-700 nm e interpretación de los resultados. LIMITES DE LA PRUEBA: 23



Un resultado negativo significa que la muestra no contiene el AgHBs detectable con la prueba Monolisa AgHBs ultra. No obstante, en la medida en al que no pueden detectarse valores muy bajos de Ag HBs, ese resultado negativo no excluye la posibilidad de una infección por el virus de la hepatitis B.  Según el equipo usado, (lavador, lector, procesador automatizado) se puede observar una variabilidad débil de los resultados.  Además, varios autores han comunicado en la literatura casos de hepatitis vírica B aguda o crónica, en los que es detectable DNA vírico e ausencia del Antígeno de superficie (pacientes HBsAG negativos). Estos perfiles anormales, si bien son raros, son consecuencia de una posible mutación genética, bien a nivel del gen S y pre-S (impidiendo el reconocimiento del Ag por algunos reactivos inmunológicos)o, normalmente a nivel del gen X y pol, induciendo una replicación vírica débil. Se recomienda ensayar marcadores adicionales (anticuerpos específicos del Hbs Ag, o si es posible DNA vírico amplificado) para establecer el diagnostico final de la infección en estos casos muy particulares.  Para comprobar la especificidad de la reacción , toda muestra que resulte positiva (según los criterios de interpretación del ensayo Monolisa AgHBs ultra ) deberá confirmarse mediante una técnica de neutralización de los Ag Hbs eventualmente presentes en la muestra.  El método colorimétrico de comprobación de la distribución de las muestras y/o de los conjugados/o de la solución de revelado no permiten comprobar la exactitud de los volúmenes dispensados .únicamente señala la presencia de muestras y/o conjugado. el grado de respuesta erróneas obtenidas con este método está relacionado a la precisión del sistema utilizado (los CV acumulados de pipeteo de lectura superiores al 10% pueden rebajar significativamente la calidad de esta comprobación). Trabajos comparativos respecto de los antígenos purificados y/o antígenos recombinantes empleados en diferentes kits comerciales de ELISA para el HBsAG han dado interesantes resultados, por ejemplo el prestigioso Journal de Microbiología Clínica del año 2008 donde se compara diferentes marcas y metodologías para el reconocimiento de los anticuerpos contra el antígeno de superficie de la hepatitis B -Comparison of Nine Commercially Available Assays for Quantification of Antibody Response to Hepatitis B Virus Surface Antigen- (7) en lo que se refiere a los antigenos purificados señala lo siguiente: Anfígenos purificados Con respecto al empleo de antígenos purificados y/o recombinantes, se ha tomado como referencia la reciente publicación independiente aparecida en

El pedido de una prueba que incluya antígenos recombinantes y/o purificados obedece al principio de trato igualitario y estudio de posibilidades de tecnologías automatizadas existentes para la prueba de anticuerpos contra el antígeno de superficie solicitada. En la Tabla 1 se observa que diferentes marcas usan antígenos o purificados o recombinantes;

24

Si bien es cierto que estas comparaciones se hicieron para el método de quimioluminiscencia, (tabla 7), los resultados presentados nos parecieron importantes para este trabajo porque nos permite tener una idea de cómo seleccionar un método de trabajo para tamizar el HBsAG en un banco de sangre , lo que se observa en esta tabla es que comparan los resultados para la especificidad entre el test de la marca Abbot Axsym y Roche Elecsys donde lo publicado señala que la especificidad de la tecnología MEIA (Axsym) , que es un ensayo EIA en su fase solida de micro partículas, es inferior a la del reactivo propuesto por Roche: 87.2% vs 93.6% respectivamente .

Por otro lado, en este mismo estudio, con respecto a la sensibilidad de ambas metodologías, se aprecian que son iguales a 100% (tabla 9), por lo que queda demostrado que el empleo de antígenos recombinantes o purificados para este tipo de análisis muestra que el empleo de antígenos purificados nos dan una mayor especificidad del reactivo y los antígenos recombinantes mayor sensibilidad.

25

Cabe indicar también que el grado de concordancia (tabla 13) entre las pruebas de Architect y Axsym (ambas de Abbott con antígenos recombinantes es de 0.730 mientras que este índice es superior si se compara la tecnología de Roche (antígenos purificados) con el mismo Architect (0.838) o con el Axsym (0.809), lo cual evidencia que el empleo de antígenos recombinantes para este tipo de análisis, aún perteneciendo a la misma casa comercial no garantiza una mejor concordancia entre los resultados obtenidos.

Por lo tanto, es que el empleo de antígenos recombinantes para la detección del HBsAg es más sensible y menos especifico que los antígenos purificados que son más específicos.

ANTICORE TOTAL El anticore total es un importante marcador para confirmar la presencia de una infección pasada(anti-HBc Total) o reciente (anti-HBc IgM) por el virus de la Hepatitis B. Los pacientes con infección crónica por el virus de la hepatitis B muestran niveles elevados anti HBc. Los anticuerpos pueden persistir durante largos periodos, y se han observado en al menos tres situaciones clínicas. Asociadas con el HBsAg , asociados con el anticuerpo antiHBcs y, algunas ocasiones solos.

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La comprobación de la sangre donada y los productos derivados para detectar anticuerpos anti-HBc constituye una herramienta útil para prevenir la transmisión del virus de la hepatitis B. PRINCIPIO DE LA PRUEBA Monolisa Anti-HBc Plus, es un inmunoanalisi enzimático (del tipo ELISAindirecto) para al detección simultánea de anticuerpos contra el nucleo del virus de la hepatitis B en suero o plasma humano. Monolisa Anti-HBc Plus se basa en el uso de una fase solida eleborada con antígeno HBc recombinante. Pasos de la manipulación: 1. Se añaden a los pocillos los sueros a comprobar y el control. Si existen anticuerpos anti-HBc, estos se unirán a los antígenos fijados en la fase sólida. 2. Tras un paso de lavado, se añaden los anticuerpos anti-IgG y anti_IgM humano, marcados por peroxidasa . estos, a su vez, se unen a los anticuerpos específicos capturados en la fase sólida. 3. Tras retirar el conjugado enzimático no unido, se revela el complejo antígenoanticuerpo mediante la adición de un substrato. 4. Una vez retenida la reacción , se leen los valores de la absorbancia utilizando un espectrofotómetro a 450/620-700nm. La absorbancia medida para una muestra permite determinar la presencia o ausencia de anticuerpos anti-HBc. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de anticuerpos anti HBc unidos en la fase sólida. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: Las muestras con una densidad óptica inferior al valor del punto de corte se consideran inicialmente positivas y deben ensayarse de nuevo, por duplicado, antes de su interpretación final. No obstante, los resultados que queden justo por debajo del valor de corte del p, Vs10%índice>1), tras la repetición de las pruebas, la muestra se considera positiva con la prueba Monolisa antiHBc Plus, si al menos una las dos mediciones resulta positiva, es decir, mayor o igual que el valor del punto de corte. La muestra se considera negativa con la prueba Monolisa antHBc Plus si ambos valores son inferiores al valor del punto de corte.

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ELISA PARA HEPATITIS C

Diagnóstico de la hepatitis C. La hepatitis C es una enfermedad que permanece desconocida y es raramente diagnosticada hasta la aparición de sus complicaciones crónicas. A partir de 1989 después de la secuenciación del genoma y la descripción del virus mediante técnicas de ingeniería genética (7) se hizo posible el diagnóstico de laboratorio de la infección por el VHC. Para la detección o diagnóstico de la infección por el VHC y el estado de progresión de la enfermedad, existen diferentes pruebas (1). Los ensayos serológicos, que detectan anticuerpos al VHC (anti-VHC), se subdividen en ensayos de escrutinio como los inmunoenzimáticos, principalmente los "Enzyme Linked Immunosorbent Assay" (ELISA) (20), que usan anticuerpos policlonales o monoclonales (para detectar antígenos) o virus completos, péptidos sintéticos o antígenos recombinantes (para detectar anticuerpos) (12,25,62) y ensayos suplementarios como los "Recombinant Immunoblot", entre ellos el de tercera generación para IgG (RIBA 3.0). Los ELISA de tercera generación son útiles en la detección de las regiones estructural y no estructurales del VHC, de la proteína GOR que se ha visto que está presente en algunos pacientes con VHC (63) y son sensibles y específicos para el estudio en pacientes con trasplante renal (64). En el diagnóstico del VHC en pacientes hemodializados, es útil el empleo de un ELISA con un péptido quimérico obtenido de la unión mediante Glicina-Glicina (Gly- Gly) de dos de los péptidos sintéticos de las regiones NS4 y NS5 y proteínas recombinantes (núcleo y NS3) (65). Las pruebas confirmatorias de anticuerpos para conocer qué antígenos virales son los responsables de la reactividad obtenida en una prueba ELISA, se realizan sobre un soporte de nitrocelulosa al que se adhieren péptidos en diferentes lugares, la adición de la muestra y su revelado pondrá de manifiesto la existencia de anticuerpos (25). En casos de hepatitis aguda, problemas en la interpretación de los resultados de los ensayos de ELISA, o pacientes inmunodeprimidos, es necesario analizar el ARN del VHC (27). Ensayos moleculares detectan, cuantifican y caracterizan el genoma del VHC (66). Mediante técnicas moleculares es posible incluso establecer el origen común de brotes epidémicos. Ello requiere, una vez establecido el genotipo, la amplificación y secuenciación de una región variable, y el análisis filogenético de las secuencias problema y los controles adecuados. Mediante estas técnicas se ha podido confirmar casos de transmisión materno-fetal, sexual y nosocomial 28

(26) y es el mejor método para detectar el ARN del virus en pacientes inmunosuprimidos después de trasplante de hígado (67). Los ensayos que permiten detectar, clonar y secuenciar genomas virales, son más sensible que las pruebas convencionales aun en pacientes con niveles bajos del ARN viral y permiten la detección precoz del virus (11, 13). Sin embargo, son altamente costosos, muy sofisticados, requieren de un seguimiento cuidadoso para reducir la contaminación, una correcta colección y almacenamiento de las muestras y con problemas especiales en la amplificación, debido a la variabilidad de la secuencia del ARN (9, 11). El diagnóstico molecular incluye (1): a) La detección cualitativa o cuantitativa del RNA viral en suero, plasma o tejido mediante técnicas de PCR o RT-PCR competitiva (SuperQuant, NGI, CA) o no (Amplicor HCV y Amplicor HCV Monitor, Roche Molecular Systems); de amplificación de señal por DNA ramificado (bDNA) (QuantiplexHCV RNA, Bayer Diagnostics), método quimioluminiscente, sencillo y rápido, que se basa en que la región 5´ (UTR) del ARN viral es híbrida con una sonda específica, a la que se unen moléculas quimioluminiscentes que permiten amplificar la señal, en vez del genoma (11, 12); de RT-PCR en tiempo real (Taqman, Roche Molecular Systems) (9,11); mediado por transcripción (TMA) que amplifica secuencias especificas del RNA viral y los PCR de única etapa (ss-PCR), uno basado en la detección de los productos de PCR por hibridación líquida con una sonda marcada de P32 (ss-PCR isotópico) y el otro un método colorimétrico (ss-PCR colorimétrico) que usa microplacas de hibridación con una sonda específica de ácido nucleico (Amplicor HCV PCR, Roche Diagnostics System), ambos con buena sensibilidad (68). Las pruebas de carga vírica miden la cantidad de virus que circula por la sangre. La más sensible es la del ARN del VHC mediante la RCP, que puede detectar hasta 50 partículas (copias) de virus por cada mililitro de sangre. Las únicas pruebas de carga vírica aprobadas por la FDA son Amplicor y Amplicor Cobalt para el VHC, ambas de Roche (1). b) La determinación del genotipo/subtipo mediante técnicas serológicas o moleculares. Las pruebas genotípicas se utilizan para determinar qué tipo de VHC se tiene. Esta información es muy útil en estudios de transmisión del VHC, imprescindible para establecer tipo y tiempo del tratamiento antiviral y es el primer paso en cualquier estudio de epidemiología molecular (1, 12). Existen diversas técnicas para la determinación del genotipo viral, unas basadas en la amplificación de secuencias (5'UTR, core, NS5b) con cebadores tipo-específicos, o seguidas de hibridación a sondas tipo-específicas, o de análisis de restricción de producto amplificado; y otras basadas en la determinación de anticuerpos frentes a péptidos tipo- específicos (12, 26, 69, 70). Estas últimas son sencillas y en pacientes inmunocompetentes tienen buena concordancia con las técnicas moleculares, pero su uso está limitado en pacientes inmunodeprimidos y en el análisis de determinados genotipos. La determinación del genotipo viral es 29

imprescindible para establecer la duración del tratamiento antiviral y es el primer paso en cualquier estudio de epidemiología molecular (26). Para la serotipificación existe un ELISA de detección de anticuerpos específicos de la Virus de la hepatitis C. región NS4 (70). Uno de los métodos más confiables, convenientes, específicos y reproducibles es un RIBA "immunoblot" en tiras, de cinco canales con péptidos serotipo-específicos inmovilizados de la región no estructural NS4 y de las regiones del núcleo de los tipos 1, 2 y 3 (69). c) La determinación de la complejidad de la cuasiespecie viral (26). Otras pruebas útiles para integrar la presunción diagnóstica de la infección por el VHC son las pruebas funcionales hepáticas. Lo más común es medir la aminotransferasa de alanina (ALT) y la aminotransferasa de aspartato (AST). Muchas personas portadoras del VHC muestran elevaciones ligeras o moderadas de estas enzimas, por lo que éstas suelen ser los primeros indicadores de la presencia del virus. Otras medidas son las de la fosfatasa alcalina (ALK) y las de la gamma-glutamil-transferasa (GGT), los resultados anormales pueden indicar cirrosis y bloqueo del tracto biliar, así como otras anomalías.

Evolución de los ensayos de detección del virus de la hepatitis C. En 1989 la compañía norteamericana Chiron clonó el genoma del VHC del plasma de chimpancés infectados con agentes etiológicos de la hepatitis no- A, no-B, y obtuvieron por el método de ADN recombinante en levadura una proteína (C100-3) codificada por la región correspondiente a NS4 que contiene la región 5-1-1. Esta proteína recombinante de 363 aminoácidos, fusionada a una molécula de superóxido dismutasa (SOD), fue la base del primer sistema diagnóstico (EIA-1) (11). Estos sistemas de primera generación mostraron baja sensibilidad y especificidad, debido a la alta diversidad genética de la secuencia nucleotídica (11,13) y a que no detectaban anticuerpos en la etapa temprana de la infección. Esto motivó el desarrollo de sistemas diagnósticos de segunda generación que incorporaron, además de la C100, una proteína recombinante del núcleo del virus (c22), ya que alrededor del 93-95% de las personas infectadas desarrollan anticuerpos contra la proteína del núcleo (anti-c22c), los que aparecen más temprano y continúan presentes por más tiempo (17), y otra de la región no estructural NS3 (c33c) ya que los anticuerpos anti-c33c aparecen primero y con más frecuencia que C100-3 (11,13). Se sustituyó, además, la SOD por la CKS

30

("citidin- monofosfato-2-ceto-3-desoxi-octanato-sintetasa"). Estos sistemas incrementaron la sensibilidad de detección a 99% (11). Actualmente existen ensayos de tercera generación que detectan los anticuerpos del núcleo y los antígenos de las regiones no estructurales NS3 y NS5 (11,13). El siguiente esquema muestra la evolución de los ensayos según Padrón y Morales, 1998 (figura 2).

Ensayos comerciales para el diagnóstico de la hepatitis C. Enzymun-Test® Anti-HCV de Boehringer Mannheim Immunodiagnostics (ES 700/ES 607/ES 600/ES 300) (1994). Ensayo inmunoenzimático para la determinación de anticuerpos contra proteínas estructurales y no estructurales del VHC. Es un ELISA tipo "sandwich" en dos pasos con tecnología de estreptavidina (71). MONOLISAanti-HCV,técnicainmunoenzimática indirecta para la detección de anticuerpos al virus de la hepatitis C. Utiliza una fase sólida con antígenos purificados: dos proteínas recombinantes producidas por Escherichia coli, de clones de la región no estructural del virus (NS3 y NS4) y dos péptidos codificados de la "capside" del genoma (9). UBI HCV EIA 4.0, ensayo inmunoenzimático cualitativo (EIA) para la detección in vitro de anticuerpos contra el VHC en suero o plasma humano. Utiliza péptidos sintéticos altamente antigénicos de las regiones estructural y no estructurales (NS4 y NS5) (9). Ensayo Quimioluminiscente, método alternativo para la detección de anticuerpos al VHC. Este ensayo tiene 100% de sensibilidad y 99.9% de especificidad (9).

Genoma de VHC

31

AxSYM HCV®, ensayo inmunoenzimático de micropartículas (MEIA), para la detección cualitativa de anticuerpos contra las proteínas estructurales y no estructurales del genoma de VHC, en suero o plasma humano. Utiliza las proteínas recombinantes c200 (de los aminoácidos 1192-1931 de las regiones NS3 y NS4, es quimérica de fusión con 154 aminoácidos de la SOD), c22-3 (aminoácidos 2-120, del "core", es una proteína de fusión con 154 aminoácidos de la SOD), HC-34 (239 aminoácidos de la proteína CMP- KDO sintetizada en Escherichia coli, 7 aminoácidos de enlace y los aminoácidos del 1-150 de "core") y HC-31 (proteína recombinante quimérica, de fusión con 239 aminoácidos de la CKS de Escherichia coli, 8 aminoácidos de enlace, los aminoácidos 1192-1457 de NS3, los aminoácidos 1676-1931 de NS4 y 10 aminoácidos de enlace agregados en el grupo carboxilo terminal). Los coeficientes de variación intra e inter-ensayo son menores del 6%, la sensibilidad de 99.69% y la especificidad de 99.69% (79). ABBOTHCVEIA3.0,ensayoinmunoenzimático, que utiliza los siguientes antígenos recombinantes: HC- 34 (contiene secuencias de la proteína estructural), HC- 43 (contiene secuencias de la proteína estructural y de NS3), c100-3 (contiene secuencias de NS3 y NS4) y NS5 (secuencias de NS5). Posee coeficientes de variación inter e intra-ensayo menores del 12.5% y una especificidad de 99.6% (80). RIBA 3.0, ensayo "Recombinant Immunoblot" de tercera generación para la detección de IgG, que en la fase sólida utiliza antígenos recombinantes de la región estructural C22-3 (core) y de las regiones no estructurales NS4 (C100-3), NS3 (C33C) y NS5 (66,81,82). Murex anti-HCV (Versión III), ensayo inmunoenzimático para la detección de anticuerpos del VHC, en plasma o suero humano. Utiliza antígenos recombinantes de la región estructural ("core"), y de las no estructurales NS3, NS4 y NS5. Su especificidad para muestras de donantes es 99.85% y en muestras clínicas es 100% (83). (9)

32

Monolisa HCV Ag-Ab ultra es una prueba inmunoenzimatica cualitativa para poner de manifiesto la infección por el VHC que se basa en la detección de los anticuerpos y del antígeno de capsida asociados a una infección por el virus de la hepatitis C en el suero o en el plasma humano.(9)

PRINCIPIO DE LA PRUEBA La microplaca se sensibiliza mediante:  Un anticuerpo monoclonal dirigido contra la capsida de la hepatitis C.  2 proteínas de recombinación correspondiente a la región NS3: genotipo 1 y 3a.  Una proteína de recombinación correspondiente a la región NS4.  Un péptido mutado correspondiente a la región capsida de la hepatitis C. Los conjugados utiliados son:  Conjugado 1: Un Ac monoclonal murino biotinado dirigido contra la capside del VHC . este

anticuerpo

monoclonal

no

reacciona contra el péptido mutado cápsida

utilizado en la fase sólida.



Conjugado 2: es una mezcla de anticuerpos murinos anti-IgG humanos revelados de manifiesta afinidad por la peroxidasa y de estretavidina revelada por la peroxidasa.

La realización de la prueba comprende las etapas de reacción siguientes. 1. En los pocillos de microplaca se distribuyen el conjugado 1, las muestras que se vayan a estudiar y los sueros de control. Si los anticuerpos anti- VHC están presentes, se unen a los antígenos fijados en la fase solida. Si los antígenos de la capside de la hepatitis C están presentes , se unirán con los anticuerpos monoclonales de al fase solida y los anticuerpos monoclonales biotinados del conjugado1. 2. Después de una incubación de 90 minutos a 37°C y una etapa de lavado, el conjugado 2, que contienen los anticuerpos anti-IgG humano afines a al peroxidasa y a al estreptavidina revelada por la peroxidasa, se añade a cada pocillo de microplaca. En el caso de la presencia de IgG humanoque reacciones con la fases sólida, el conjugado anti-IgG humano se unirá anticuerpos humanos. El conjugado peroxidasa/estreptavidina queda fijado a la biotina del conjugado 1 en el caso de que exista presencia del antígeno de capsida del virus de la hepatitis C en la muestra. 3. Transcurridos 30 minutos de incubación a 37°C y eliminados los conjugados enzimáticos que no se hayan unido a causa del lavado, al presencia de complejos antígeno-anticuerpo-peroxidasa se pone de manifiesto. 4. Al cabo de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente del laboratorio y cuando se interrumpe al reacción, se efectua ñla lectura en el espectrofotómetro a 450/620-700 nm . La absorbancia medida por una muestra permite sacar conclusiones respecto de la presencia o ausencia de3 anticuerpos anti-VHC y/o 33

antígeno de capsida de la hepatitis C en la muestra analizada. La intensidad de coloración es proporcional a la cantidad de anticuerpos anti-VHC y/o antigeno cápsida de la hepatitis c que se haya unido en la fase sólida. 5. El Monolisa anti- HVC detecta de promedio de 24 días antes la infección por VHC , esta ventaja se debe principalmente a la detección del antígeno de al capside del VHC que se utiliza en el kit. LIMITES D ELA PRUEBA El motivo de la diversidad de respuesta inmunológicas de pacientes afectados por la hepatitis C (principalmente durante al seroconversión) , se puede n observar las reacción entre distintas pruebas en función de la naturaleza de las proteínas analizadas. Un resultado analítico negativo durante un diagnostico precoz no excluye la posibilidad de exposición o de una infección por el virus de la hepatitis C. Cualquier técnica de ELISA puede producir reacciones falsamente positivas. Se aconseja ver la especificidad de la reacción para cualquier muestra que de positivo repetidas veces, según la interpretación del reactivos Monolisa HCV Ag-Ab Ultra , mediante un método de confirmación de un test ELISA de detección de los anticuerpos anti-HCV solo, o me inmunoblot de detección de los anticuerpos antiHVC para probar la presencia de anticuerpos. Si e necesario, utilizar un test de búsqueda del genoma viral del VHC o un test de confirmación de los antígenos del VHC seguido de neutralización.

•

1° GENERACION: c-100-3 PERIODO DE VENTANA: 150 DIAS

•

2° GENERACIÓN :NS-3 NS-4 PERIODO DE VENTANA: 82 DIAS

3° GENERACION NS 5 : 70 DIAS.

•

Resultados de ELISA dispares • La reactividad baja indicaría una infección temprana o una tardía resolviéndose. • baja especificidad: falso positivo

Con respecto al NS5: Curr Stud Hematol Blood Transf. Basel, Karger, 1998, No 62, pp 64–75

34

En lo que se refiere a los ensayos de Screening , que en 1992, se notificó de una nueva generación de ensayo denominado de tercera generación y que fue introducido por Ortho, Abbott and Sanofi Diagnostics Pasteur . Estos ensayos fueron llamados Sistema de ensayo ELISA Ortho anti –HCV 3.0, Abbott HCV EIA 3rd generation and Monolisa anti-HCV new antigens , respectivamente, En comparación con los ensayos de segunda generación the main improvement fue la reactividad incrementada del antígeno NS3. En adición, el antígeno de la región NS5 fueron incluidos en los ensayos de Ortho y Abbot

•

El agregado del NS5 no define que el kit sea de 3ra generación, como podemos apreciar sanofi no lo tiene en el documento y es considerado de tercera generación. Adicionalmente, lo único que ha aportado el NS5 es incrementar la tasa de falsos positivos con el consiguiente sobrecosto para los laboratorios, pero en los bancos de sangre si importaría que esta sensibilidad sea incrementada, no así en el caso del diagnostico.: La especificidad de los ensayos de tercera generación fueron también improved by a decrease por un decremento de falsos positivos del core y del NS4 reactions. SDin embargo, la reactividad de falsos positivos con ensayos escrening y confirmatorios aun remain y la adicion del antígeno NS5 ha resultado en un nueva variedad de sueros falso positivos. Specificity of the third-generation assays was also improved by a decrease of false-positive core and NS4 reactions. However false-positive reactivities with screening and confirmatory assays still remain and the addition of the NS5 antigen has resulted in a new variety of false-positive sera.

Adicionalmente, en el inserto del reactivo Roche observamos lo siguiente: 35

Inserto de reactivo de Abbott (Axsym) para USA:

•

http://www.abbottdiagnostics.com/webapp/index.cfm? event=getPDF&controlNumber=345497R8

•

En su más reciente tecnología (Architect) no consideran el NS5 a nivel mundial

Reactividad que persiste de muestra a muestra  Se debe a la presencia de Acs, no específicos para el agente infeccioso pero específicos para componentes del ensayo.  Los diluyentes, buffers, etc usan albúmina animal o productos séricos. Los Acs microbianos también son comunes y pueden reaccionar con las proteínas de los vectores recombinantes.

VENTANA SEROLÓGICA PARA INFECCIÓN DE HIV, HBV Y HCV • Riesgo: 1:103.000 por unidad transfunida •

36

Ref. Schreiber GB et al. N Engl J Med, 1996;334: 1685 (4 en 3)

•

CARACTERSITICAS DE Los ELISA • No distingue entre infección aguda, crónica o resuelta • No mide la presencia de virus circulante • En poblaciones de bajo riesgo la tasa de resultados falsos positivos es alta • 95% en población de riesgo P y PPV VALORES DE RP ALTOS CON VPP > 95%

ENSAYO

FABRICANTE

RP

ORTHO 3.0 ELISA

Ortho

≥ 3.8

ABBOTT HCV ELISA 2.0 Abbott

≥ 3.8

VITROS ANTI HCV CLIA Ortho

≥ 8.0

ARCHITECT HCV CLIA

Abbott

≥ 5.0

ADIVIA CENTAUR HCV

Siemmens

≥ 11.0

OMS

Para minimizar el riesgo de transmisión de HCV por transfusión:  Una prueba de tamizaje altamente sensible y específica para HCV o una combinación Ag -Ac (ELISA/CLIA). El ensayo debe ser capaz de detectar genotipos específicos del país o región  Un ensayo de tamizaje rápido altamente sensible y específico en laboratorios de baja cantidad de muestras en áreas remotas o en situaciones de emergencia.

SIFILIS: TREPONEMA PALLIDUM (SÍFILIS) 37

La Sífilis, llamada también chancro duro, enfermedad de Lues, es una infección producida por Treponema pallidum sub especie pallidum, bacteria en forma espirilada, ampliamente distribuida en el mundo. En los Estados Unidos, en el año 2002, se registraron 32,000 casos de sífilis, de los cuales 6,862 eran casos de sífilis primaria y secundaria, asimismo, se reportaron 412 casos de sífilis congénita ( fuente ), El PRONAHEBAS, para el año 2005 reporto reactividad en 1.30 % El hombre es el único huésped para esta bacteria la cual produce lesiones ulcerativas indoloras de evolución crónica, la infección suele presentarse en 3 fases definidas: primaria, secundaria y terciaria, sin embargo puede aparecer un periodo de latencia (sífilis latente) pudiendo ésta ser temprana o tardía dependiendo del tiempo en que aparecen las lesiones. La principal vía de transmisión de esta enfermedad es la sexual, puede haber otras formas de transmisión: madre - niño, transfusión sanguínea, manipulación de lesiones sifilíticas y todo tipo de muestras biológicas de pacientes sifilíticos. El tamizaje para sífilis se realiza mediante pruebas serológicas, utilizándose antígenos no treponémicos (RPR, USR). Las pruebas de ELISA son pruebas treponémicas utilizadas en Centros de Hemoterapia y Bancos de sangre donde existe gran demanda de muestras por día, por lo que estas pruebas son procesadas por equipos automatizados SIFILIS

SIFILIS

ELISA- recombinante v.4.0

ELISA – anticuerpos totales

MARCA WIENER

MARCA FORESIGHT

METODO:

METODO: Inmunoensayo enzimático (EIA) para la detección cualitativa de Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para anticuerpos totales (IgG, IgA e IgM) contra la detección de anticuerpos anti- Treponema Pallidum (TP) en suero o Treponema pallidum plasma humano FUNDAMENTO DEL METODO:

PRINCIPIO:

Los pocillos de la policubeta están recubiertos con antígenos recombinantes de la bacteria Treponema pallidum (p15, p17 y p47). La muestra diluida se incuba en los pocillos. Si los anticuerpos contra la bacteria están presentes en la muestra, éstos se unen a

La prueba ELISA de Sífilis de Anticuerpos Totales es un inmunoensayo enzimático cualitativo de fase sólida basado en el principio sándwich para la detección de anticuerpos totales (IgG, IgM, IgA) a Treponema Pallidum en suero o plasma humano. Los micro pozos de la placa vienen

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los antígenos del pocillo. El material no unido es removido por lavado. En el paso siguiente se agrega el conjugado, que consiste en un anticuerpo monoclonal antiIgG humana conjugado con peroxidasa. Este se une a los complejos antígeno-anticuerpo, formados previamente. El conjugado no unido se remueve por lavado. Posteriormente, se agrega una solución conteniendo tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno. Las muestras reactivas desarrollan color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reacción con ácido sulfúrico.

recubiertos de antigenos recombinantes de T. Pallidum. Para efectuar la prueba se agrega el espécimen y los antigenos T. Pallidum conjugados a enzima a los micro pozos recubiertos de antigenos y se incuban en seguida. Si el espécimen contiene anticuerpos TP estos se acoplan a los antigenos recubiertos en la placa de micro pozos y simultáneamente al conjugado formando complejos inmovilizados de antígeno TP - conjugado. En ausencia de los anticuerpos TP estos complejos no se forman. Después de la incubación inicial se procede con un lavado de la placa de micro pozos para efectos de remover cualquier material no acoplado. Terminada la incubación inicial se agregan el Substrato A y el Substrato B y se incuban se formará un color azul indicando la cantidad de anticuerpos T. Pallidum presentes en la muestra. Finalmente se agrega una solución de acido sulfúrico a los micro pozos para detener la reacción lo que hace virar el color de azul a amarillo. La intensidad del color amarillo que va en función de la cantidad de anticuerpos T. Pallidum presente en la muestra se mide por medio de un lector ELISA de micro placas a 450 / 630-700 nm ó 450 nm.

MUESTRA: Suero o plasma. Para las muestras de plasma se puede emplear heparina, citrato o EDTA como anticoagulante.

MUESTRA : Suero o plasma .Pueden usarse los tubos de recolección con EDTA, heparina sódica y ACD . El preservante azido de sodio causa resultados erróneos ya que desactiva a la peroxidasa de rábano

ESPECIFICIDAD : 99.4%

ESPECIFICIDAD: 99.9%

SENSIBILIDAD

SENSIBILIDAD : 99.9%

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PRESENTACIÓN: Kit de Elisa de doble antígeno “sándwich” para la detección de anticuerpos totales (IgG+IgM) para el Treponema pallidium en suero o plasma, en pozos fraccionables con código de color; con reactivos líquidos y listo para su uso, con sistema de verificación de adición de muestra por el cambio de color del diluyente; en cantidad suficiente para el procesamiento; en empaque de 96 o más pruebas. MÉTODO: Enzimoinmunoensayo (ELISA), inmunoensayo Fluorescente, inmunoquimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia, tipo sándwich de doble antígeno, para la detección de anticuerpos totales (IgG+IgM) para el T. pallidium (Sífilis) en la muestra, con antígenos recombinantes en E. coli, tipo p15 y p17 impregnados en los pozos y como reactivo conjugado listo par su uso. Sensibilidad: 100% y Especificidad: 100%

ESPECIFICACIONES TECNICAS Y CONDICIONES DE CALIDAD Denominación: ANTICUERPO ANTI-TRYPANOSOMA CRUZI (CHAGAS) ELISA PRESENTACIÓN: Kit de Elisa indirecto para la detección de anticuerpos totales (IgG+IgM) para el Tripanosoma cruzi en suero o plasma, en pozos fraccionables, con reactivos líquidos, en cantidad suficiente para el procesamiento; en empaque de 96 o más pruebas. MÉTODO: Enzimoinmunoensayo (ELISA), inmunoensayo Fluorescente, inmunoquimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia, tipo indirecto, para la detección de anticuerpos para el Trypanosomacruzi, con antígenos recombinantes TcF impregnados en los pozos y como conjugado una anti-IgG y anti-IgM de suero de conejo. MUESTRA BIOLÓGICA: Suero o plasma Sensibilidad: 100% y Especificidad: >99.4%

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PRESENTACION: Microplacas recubiertas con Antigenos Recombinantes de Treponema Pallidum de 96 pocillos c/una. METODOLOGIA: Micro ELISA que detecta anticuerpos totales (IgG + IgM) con microplaca recubierta de antígenos recombinantes de Treponema Pallidum (p15, p17, p47). Sensibilidad no menor de 99% y especificidad no menor al 99.5%. Protocolos deben ser validados para autoanalizadores automáticos. ACCESORIOS: Equipo Analizador automatizado de Inmunoensayos en microplaca según cuadro de listado de equipos. Reactivos, complementos en cantidad suficiente para la realización completa de la prueba y sus controles. Incluir 10% de pruebas adicionales para los controles, asimismo suero control de 2da opinión (marca diferente) en volumen suficiente para procesar 01 control por placa; o control de calidad externo (de 03 a 04 por año). MUESTRA BIOLOGICA: Suero ó Plasma. REQUERIMIENTO : 1 EQUIPO N° 29 PRESENTACION: Microplacas recubiertas con Antigenos Recombinantes de Trypanosoma Cruzi de 96 pocillos cada una. METODOLOGIA: Micro ELISA tipo sandwich con antigeno recombinante para detectar 4 epitopes como mínimo del Trypanosoma cruzi, detección de anticuerpo Total (IgG + IgM). Sensibilidad 100% y especificidad no menor al 99.5%. El reactivo debe adjuntar guía de resolución de problemas. Protocolos deben ser validados para autoanalizadores automáticos. ACCESORIOS: Equipo Analizador de Inmunoensayos en Microplaca según cuadro de listado de equipos. Reactivos, complementos en cantidad suficiente para la realización completa de la prueba y sus controles. Incluir 10% de pruebas adicionales para los controles, asimismo suero control de 2da opinión (marca diferente) en volumen suficiente para procesar 01 control por placa; o control de calidad externo (de 03 a 04 por año). MUESTRA BIOLOGICA: Suero ó Plasma. REQUERIMIENTO : 1 EQUIPO N° 29

Técnica ELISA Es una de las pruebas serológicas más utilizadas en el tamizaje de las unidades de sangre en los Centros de Hemoterapia y Bancos de Sangre. ELISA (EnzymeLinkedInmunoSorbentAssay) es una técnica sensible que nos permite detectar antígenos o anticuerpos en fluidos biológicos. Este inmunoensayo involucra la fijación de antígeno o anticuerpos sobre una fase sólida. En ambos casos se formará el complejo antígeno–anticuerpo, el cual será unido por una antiinmunoglobulina marcada inmunoenzimaticamente. Las enzimas son fosfatasa alcalina o peroxidasa, estas enzimas son capaces de modificar un sustrato en presencia de un cromógeno (componente productor de color) produciendo un 41

producto coloreado que puede ser medido utilizando un espectrofotómetro (lector de ELISA), es directamente o inversamente proporcional a la concentración del antígeno o anticuerpo presente en la muestra, dependiendo del tipo de ELISA.. Una reacción típica enzima-sustrato puede ser la siguiente: H2O2

+

(sustrato)

OPD/TMB (cromógeno) O-

(radical)

Peroxidasa de rábano

+

(enzima) OPD/TMB

H2O+

O-

(agua) (radical) Producto coloreado

(cromógeno oxidante)

El exceso de reactantes en cada paso es eliminado con los sucesivos lavados. El producto coloreado detectado por el espectrofotómetro debe ser medido en una específica longitud de onda lumínica en la que el color absorbe la luz incidente. Esto resulta en una señal que con el instrumento se convierte usualmente en unidades de densidad óptica (DO). Existen una variedad de pruebas ELISA, las más utilizadas son: ELISA Directo Esta prueba es generalmente de tipo sándwich, con revelado enzimático, utilizando un anticuerpo monoclonal ligado a una fase sólida (pocillo, esfera plástica) el cual capta al antígeno presente en el suero. A continuación se agrega un anticuerpo policlonal marcado con una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina) y se promueve el desarrollo de color tras la adición de substrato cromogénico. ELISA Indirecto Se basa en la fijación de un antígeno en la fase sólida, el cual atrapa los anticuerpos de la muestra que posteriormente son identificados con un anticuerpo anti Inmunoglobulina humana específico marcado con una enzima. En estos casos la cantidad de Anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado, por lo cual se produce más color a medida que la concentración de anticuerpos aumenta en la muestra dando lecturas de DO altas, y viceversa.

ELISA Competitivo: Se basa en la competencia que se establece entre el anticuerpo de la muestra y el conjugado (que es un anticuerpo dirigido contra el antígeno) para ocupar sitios reactivos en el antígeno fijado. En este ELISA de tipo competitivo tanto la muestra que contiene el anticuerpo como el conjugado se agregan al mismo tiempo. Si la concentración de anticuerpos en la muestra es alta muy poco conjugado puede fijarse en los antígenos inmovilizados, por lo tanto habrá ausencia de coloración por la poca fijación de la enzima 42

con el sustrato. Inversamente con muestras que contienen poco o nada de anticuerpos, más conjugado se fijará al antígeno y la posterior adición de sustrato producirá la presencia de color. En estos casos la cantidad de anticuerpos en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado (producto coloreado). ELISA de Captura de Anfígeno

La prueba ELISA de captura puede ser de tipo indirecto o competitivo y solo difiere en la etapa inicial de fijación del antígeno en la fase sólida. Un anticuerpo monoclonal (anticuerpo muy específico dirigido sólo a un determinante antigénico) es fijado al soporte sólido para “capturar” a un antígeno específico. Esto tiende a disminuir la cantidad de sustancias contaminantes adheridas al soporte sólido resultando una menor fijación no específica. Estas pruebas son consideradas más específicas que las pruebas indirectas que incorporan proteínas totales del microorganismo. Aunque las pruebas de ELISA utilizadas para detectar los anticuerpos son sumamente sensibles, específicas y reproducibles, ninguna es infalible; por lo tanto se requiere que las pruebas de tamizaje tengan una sensibilidad 100 % y no menor de 98% de especificidad. Consideraciones generales previas al desarrollo de la Técnica a) Toda muestra de sangre debe ser considerada como material potencialmente infeccioso y seguir las medidas de bioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad vigente. b) Las muestras a procesar no deben presentar hemólisis ni turbidez. Deben estar rotuladas con el código y fecha de obtención de muestra y ser conservadas en refrigeración (4°C), hasta su procesamiento. c) Utilizar kits con fecha de vencimiento vigente. No mezclar reactivos procedentes de diferentes lotes. d) Conservar los kits a temperaturas especificadas por el fabricante.

e) Dejar que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiental (18-25ºC) antes de empezar el ensayo. f) Mezclar suavemente los reactivos líquidos antes de su uso. g) Diluir la solución de lavado concentrada según lo indicado por el fabricante, empleando agua destilada. Rotular el frasco con fecha de preparación y el kit al que 43

pertenece. Debido a su alta concentración en algunos kits, pueden formar cristales por lo cual se debe homogenizar previamente a la dilución. El remanente de la solución diluida debe conservarse según las indicaciones del fabricante, h) Seguir estrictamente las instrucciones proporcionadas por el fabricante y descritas en el inserto del kit tanto para el procesamiento de las muestras como para analizar la validez. Incluir todos los sueros controles positivos, negativos, pocillo blanco indicados en el inserto. i) La validez del ensayo debe de hacerse de acuerdo a las indicaciones del kit más el suero control de calidad interno. j) Calcular el valor de corte y la zona indeterminada según indicaciones del kit. Todo kit debe indicar la zona gris o indeterminada k) Utilice protocolos de trabajo de acuerdo a la técnica a utilizar (ver Anexo F y G) l) Emplear equipos e instrumentos en buenas condiciones de operatividad con mantenimiento preventivo y calibrado (incubadora, potenciómetro, lector ELISA, lavador de placas, micropipetas, termómetro ambiental). m)Seguir los instructivos de uso de cada equipo, chequear los filtros del lector ELISA antes de iniciar los ensayos y llevar el registro de tiempo de uso. n) Preparar los protocolos de trabajo o mapas de distribución de muestras que serán procesadas. o) Realizar y registrar el control diario de la temperatura ambiental del laboratorio y de los siguientes equipos: Refrigerador donde se conservan los kits, incubadora empleada para los pasos de incubación 37 °C y congeladora donde se conservan los sueros controles y otros reactivos. p) Utilizar agua destilada o desionizada, de alta calidad. Procedimiento de la Técnica de ELISA a) Determinar el número total de pocillos teniendo en cuenta todos los controles que indica el inserto del kit y control de calidad interna. Retire las tiras necesarias. b) Dispensar los microlitros indicados (según el inserto) de sueros controles positivos y negativos, sueros problema y sueros control interno en los respectivos micropocillos, mezclar suavemente.

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c) Incubar a la temperatura indicada por el tiempo necesario, generalmente en esta etapa se cubren los micropocillos con papel adhesivo que acompaña al kit, para evitar su evaporación. d) Retirar el material adhesivo y proceder con los ciclos de lavado teniendo en cuenta el volumen dispensado y el tiempo de remojo indicados en el instructivo. Después del último lavado secar la microplaca sobre un papel absorbente dándole pequeños golpes para remover cualquier exceso de líquido de los pocillos. e) Colocar la cantidad necesaria de conjugado en cada pocillo, la dilución del conjugado debe realizarse durante el último ciclo de lavado. f) Cubrir la placa con el papel adhesivo e incubar a la temperatura indicada por el tiempo necesario. g) Retirar el material adhesivo y proceder con los ciclos de lavado de acuerdo al paso 4. h) Durante el lavado prepare el volumen requerido de la solución substrato-cromógeno, la cual debe estar a temperatura ambiente y debe ser incolora, si se observa alguna coloración descartar la solución. i) Colocar la cantidad necesaria de substrato en cada pocillo e incubar en oscuridad a temperatura ambiente por el tiempo indicado. j) Detener la reacción agregando la cantidad indicada de solución de parada en la misma secuencia que se agregó el substrato. k) Leer la absorbancia de los pocillos en un lector de ELISA teniendo en cuenta los filtros indicados. Es recomendable una lectura bicromática teniendo como filtro de referencia 620-630 nm. l Leer la microplaca en el tiempo indicado por el inserto. l) Evaluar la prueba teniendo en cuenta los criterios de validación que se indican en el instructivo del kit y suero control interno. Si la prueba es válida calcular el valor de corte e interpretar los resultados. m)Las muestras con resultados no reactivos se informan como tales. n) Las unidades de sangre cuyas muestras tienen resultados reactivos deberán eliminadas.

ser

o) Los donantes cuyos resultados son reactivos deben ser remitidos a la unidad de epidemiología.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

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REACTIVO

: Se detecta la presencia de antígeno y/o anticuerpo del agente

etiológico correspondiente. NO REACTIVO

: No se detecta la presencia de antígenos y/o anticuerpos del agente

etiológico correspondiente. ZONA GRIS : Valores comprendidos inmediatamente por debajo del valor de corte de la prueba de acuerdo a lo indicado en el inserto. Observación: En la técnica ELISA competitiva inversa los resultados NO REACTIVO son mayores al cut-off, y las lecturas menores que el cut-off son REACTIVO.

TRYPANOSOMA CRUZI (ENFERMEDAD DE CHAGAS) La enfermedad de Chagas, es causada por un parásito flagelado el Trypanosoma cruzi. El mecanismo natural de transmisión al ser humano, es mediante un insecto que funciona como vector, situación que se observa en el 80% de los casos de enfermedad. La transmisión por transfusión ocurre en el 16% de los casos; mientras que la vía congénita que ocurre hasta en el 10% de las madres afectadas y en proporción menor al 1% de los casos se dan por transplante de órgano de un sujeto portador proveniente del area endémica o la transmisión accidental en laboratorios por la ingesta oral de tripomastigotes metacíclicos. La etapa crónica del paciente con enfermedad de Chagas dura el resto de la vida. Aproximadamente el 65 – 80 % de los sujetos expuestos se comportará aparentemente sano y son potenciales transmisores de la parasitosis mediante la transfusión. El sujeto chagásico crónico asintomático funciona como vector, que migra desde las zonas endémicas hacia las áreas urbanas, es requerido para donar sangre y es ahí donde puede ser detectado. El paciente receptor de la transfusión que recibe la sangre no tiene ningún patrón epidemiológico especial salvo el haber recibido sangre de un sujeto infectado con el flagelado La Organizanización Panamericana de la Salud, defina al caso con infección por T. cruzi, sea mediante la positividad con dos pruebas serológicas con distinto principio (hemaglutinación indirecta, ELISA, fijación de complemento inmunofluorescencia indirecta, entre otras). El ensayo Inmunoenzimático ELISA, es la técnica de elección para realizar el tamizaje de la infección, por presentar la mayor sensibilidad y tener la capacidad de detectar anticuerpo

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anti - Trypanosoma cruzi después de los 20 días de ocurrida la infección. Así mismo puede evaluar mayor número de sueros por corrida. La sensibilidad y especificidad de la técnica está en función de la calidad del antígeno, los extractos antigénicos totales del parásito muestran una alta sensibilidad; y los recombinantes y péptidos sintéticos, buena especificidad. Se estima que en el Perú existen 24,170 infectados por Tripanosoma cruzi, de los cuales 1,209 corresponden a formas agudas u oligosintomáticas y 22,962 a formas crónicas de la enfermedad. La infección por sexo es equitativa y el grupo de edad más afectado está entre los 20 a 50 años. (MINSA/OGE-1998). La seroprevalencia de la infección en áreas de riesgo oscila entre 1,3% y 12%, en donantes de sangre a nivel nacional entre 0.14% y 0.5%. En el 2005 el porcentaje de unidades que resultaron reactivas en el tamizaje para Chagas alcanzó el 0.57%. (PRONAHEBAS). ENFERMEDAD DE CHAGAS Y TRANSFUSIÓN La transfusión constituye la segunda causa más frecuente de transmisión de la enfermedad después de la transmisión vectorial. La capacidad de infección a través de la sangre y componentes depende de varios factores: tipo y cantidad del componente transfundido, de la cepa del propio parásito, de la presencia de parasitemia en el momento de la donación, del estado inmune del receptor, y de la realización o no, de las pruebas de cribado. Existe la posibilidad, de que casos de Chagas postransfusionales no sean diagnosticados.

MICROELISA CHAGAS La enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, se estima afecta en la actualidad cerca de 8 a 10 millones de personas, siendo uno de los principales problemas de salud pública que confrontan los pobladores de países latinoamericanos (OMS/TDR, 2007). En general, el diagnóstico para la detección de la dolencia se basa en el análisis de variables diversas, entre las cuales destacan la presunción clínica, los datos epidemiológicos y los resultados de laboratorio, incluyendo pruebas parasitológicas, serológicas, bioquímicas y/o moleculares (López et al., 2000). En relación con el diagnóstico serológico existe consenso en recomendar, al menos, dos técnicas con la finalidad de tener un alto grado de confiabilidad en el despistaje de la dolencia, sugiriéndose una tercera prueba confirmatoria en caso de conflicto de diagnóstico entre ellas (OMS, 2002). Las técnicas mas comúnmente utilizadas incluyen, entre otros, procesos de hemaglutinacion (HAI), fluorescencia (IFI), Aglutinación (TAD) y ensayos inmunoenzimáticos (ELISA). Aunado a éstos, recientemente se han desarrollado poderosas herramientas moleculares como la prueba de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y otras metodologías serológicas (TESA- blot), las cuales han contribuido a la obtención de un

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despistaje más certero de la enfermedad de Chagas En Venezuela, el sero-diagnóstico de la enfermedad de Chagas es comúnmente realizado en centros públicos y privados utilizándose principalmente pruebas expendidas comercialmente por varios laboratorios nacionales y extranjeros, la mayoría de los cuales están basados en ensayos inmunoenzimáticos cualitativos (Vielma, 2005). En este respecto, algunos investigadores han informado sobre resultados inconsistentes registrados en pacientes diagnosticados en estos centros, cuando se comparan con los obtenidos en laboratorios especializados en el estudio de la enfermedad de Chagas (DíazBello et al., 2008). Esta información parece corroborarse en nuestro laboratorio donde se ha detectado que diagnósticos provenientes de laboratorios privados, arrojan falsos positivos cuando se cotejan con pruebas específicas. (12) En el presente estudio se evalúan simultáneamente métodos serológicos usados de forma rutinaria en el despistaje de la enfermedad de Chagas en Venezuela, con la finalidad de detectar técnicas confiables para el diagnóstico preciso en muestras de pacientes de áreas endémicas las cuales, a su vez, resulten de utilidad general y corrijan la inconsistencia diagnóstica registrada en algunos centros. Se utiizaron técnicas de diagnostico Los métodos serológicos convencionales utilizados para detectar anticuerpos circulantes anti-T. cruzi incluyeron las pruebas de aglutinación directa (TAD), inmunofluorescencia indirecta (IFI) y el ensayo inmunoenzimático (ELISA), siguiendo procedimientos previamente publicados (Vattuone & Yanovsky, 1971; Camargo, 1966; Voller et al., 1975). Las condiciones y procedimientos de estos métodos han sido indicados en previas publicaciones (Añez et al., 1999a,b; 2001). Las pruebas serológicas denominadas comerciales incluyeron los tests inmunoenzimáticos Pharmatest® (Laboratorios Pharmatest, Miranda-Venezuela); Chagatest ELISA® (Laboratorios Wiener, Rosario- Argentina); Chagatest ELISA Recombinante V.3.0® (Laboratorios Wiener, Rosario-Argentina); Test ELISA para Chagas III® (Laboratorios BiosChile, SantiagoChile); y el ensayo inmunocromatográfico comercial Chagas stat-pak assay® (Laboratorios Chembio, New York-USA). Cada prueba fue ejecutada e interpretada según indicaciones del fabricante La evaluación comparativa de la sensibilidad detectada entre los diferentes métodos serológicos convencionales ensayados en el presente trabajo, reveló valores de 77% para la prueba TAD y 100% para las pruebas IFI y ELISA y sobre el 85% en los restantes tests comerciales utilizados. La comparación estadística de la sensibilidad entre los métodos ensayados no arrojó diferencias significativas (P>0.05). En relación con la variable especificidad, valores similares fueron detectados en los diferentes métodos comparados con un rango que osciló entre 68% para Chagatest ELISA y 86% para TAD. Similar a lo observado en la variable sensibilidad, los valores de especificidad tampoco

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arrojaron diferencias estadísticamente significativas entre las pruebas (P>0.05). Detalles particulares sobre cada método se muestran en la Tabla III.

La estimación de los valores predictivos positivos (VPP) permitió, en general, detectar cifras superiores al 85% en la mayoría de los métodos serológicos, lo cual sugiere que las pruebas utilizadas tienen estadísticamente alta probabilidad de detectar las muestras seropositivas. Esta similitud se mantiene cuando se comparan los valores de razón de verosimilitud positiva (RVP), es decir, cuantas veces más probable es la detección de un seropositivo. En este caso los mayores valores obtenidos oscilaron entre 4,40 (IFI, ELISA) y 5,64 (TAD), resultando el método menos confiable el Chagatest ELISA® el cual arrojo un valor de RVP de 2,77.Detalles sobre la comparación estadística de variables entre los métodos son presentados en la Tabla III.

Relación costo-beneficio de las técnicas serológicas evaluadas

Siguiendo parámetros similares a los señalados por Bulcao & Yasuda (2003) en el presente trabajo se detectó que los menores requerimientos en equipo, recurso humano especializado e infraestructura fueron precisados para la prueba de TAD y el kit de diagnóstico inmunocromatográfico comercial Chagas Stat Pak Assay®. En relación con el tiempo de ejecución, los métodos más rápidos fueron el kit inmunocromatográfico (Chagas Stat Pak Assay®) e inmunoenzimáticos comerciales con un rango de 15 minutos a 2 horas, mientras que los más consumidores de tiempo fueron las técnicas serológicas convencionales (TAD, IFI y ELISA). Al considerar el costo por prueba, los métodos más costosos resultaron los kits de diagnóstico serológico comerciales Chagatest ELISA Recombinante V.3.0® y Chagas Stat Pak Assay®, con estimados entre Bs.F. 38,5 (USA $ 17,90) y Bs.F. 40 (USA $ 18,6) por muestra respectivamente. Las pruebas más económicas fueron las técnicas serológicas convencionales (TAD, IFI, ELISA) y los kits de diagnóstico serológico comerciales Pharmatest®, Chagatest ELISA® y Test ELISA para Chagas III®. Los costos incluyeron estimaciones de gastos operativos, equipos y reactivos para finales del año 2009. Detalles sobre la relación costo-beneficio se muestran en la Tabla IV.

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Pérdida de reactividad en pruebas diagnósticas

El efecto de sucesivos cambios de temperatura en el tiempo sobre los resultados obtenidos con un kit serológico comercial (Test ELISA para Chagas III®BiosChile) fue evaluado en 99 muestras de sueros de individuos previamente diagnosticados por otros métodos como seropositivos o seronegativos a T. cruzi. Los resultados revelaron que los rangos de densidades ópticas entre muestras de pacientes seropositivos o seronegativos a T. cruzi, fueron disminuyendo progresivamente en el tiempo. Este hecho reveló el acercamiento de los valores de seropositivos y los seronegativos, incrementando el número de muestras con un resultado impreciso, determinado por valores cercanos al 10% del punto de corte recomendado, según especificaciones de los fabricantes del test. Detalles sobre el resultado comparativo en el tiempo se muestran en la Fig. 1, en la cual se nota que la reactividad del antígeno se mantiene por alrededor de 30 días cuando se somete a cambios de temperatura entre 8ºC y 22ºC.

DISCUSION

En el presente trabajo todos los métodos seleccionados para la detección de seropositividad a T. cruzi en muestras de pacientes escogidos aleatoriamente fueron capaces de detectar tal condición, cumpliendo con los requisitos aquí establecidos. Este propósito se refleja en el análisis de los resultados obtenidos, el cual reveló valores de sensibilidad y especificidad Tabla III. Evaluación estadística comparativa de pruebas serológicas empleadas en el despistaje de la enfermedad de Chagas en el occidente de Venezuela.

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Relación costo-beneficio de las técnicas serológicas evaluadas Siguiendo parámetros similares a los señalados por Bulcao & Yasuda (2003) en el presente trabajo se detectó que los menores requerimientos en equipo, recurso humano especializado e infraestructura fueron precisados para la prueba de TAD y el kit de diagnóstico inmunocromatográfico comercial Chagas Stat Pak Assay®. En relación con el tiempo de ejecución, los métodos más rápidos fueron el kit inmunocromatográfico 51

(Chagas Stat Pak Assay®) e inmunoenzimáticos comerciales con un rango de 15 minutos a 2 horas, mientras que los más consumidores de tiempo fueron las técnicas serológicas convencionales (TAD, IFI y ELISA). Al considerar el costo por prueba, los métodos más costosos resultaron los kits de diagnóstico serológico comerciales Chagatest ELISA Recombinante V.3.0® y Chagas Stat Pak Assay®, con estimados entre Bs.F. 38,5 (USA $ 17,90) y Bs.F. 40 (USA $ 18,6) por muestra respectivamente. Las pruebas más económicas fueron las técnicas serológicas convencionales (TAD, IFI, ELISA) y los kits de diagnóstico serológico comerciales Pharmatest®, Chagatest ELISA® y Test ELISA para Chagas III®. Los costos incluyeron estimaciones de gastos operativos, equipos y reactivos para finales del año 2009. Detalles sobre la relación costo-beneficio se muestran en la Tabla IV. DISCUSION

En el presente trabajo todos los métodos seleccionados para la detección de seropositividad a T. cruzi en muestras de pacientes escogidos aleatoriamente fueron capaces de detectar tal condición, cumpliendo con los requisitos aquí establecidos. Este propósito se refleja en el análisis de los resultados obtenidos, el cual reveló valores de sensibilidad y especificidad. cercanas al 100% en casi todas las técnicas evaluadas. Asimismo, el análisis estadístico comparativo no reveló diferencias significativas entre ellas, lo cual pareciera indicar que cualquiera de las técnicas podrían ser de utilidad para llevar a cabo el diagnóstico serológico en individuos sospechosos de padecer infección por T. cruzi. Por otra parte, este hecho pareciera simplificar la escogencia para implementar la ejecución de más de un método para realizar un diagnóstico serológico de certeza en la enfermedad de Chagas. En este caso, la primera prueba a ser implementada, la cual puede considerarse como prueba de rutina, debería caracterizarse por poseer alta sensibilidad permitiendo detectar los casos sospechosos de infección. Esta propuesta coincide con una similar de previos autores (Enciso et al., 2004., Avila et al., 1993) y corrobora la opinión de otros quienes sostienen que la misma podría resultar particularmente importante en bancos de sangre, evitando transmisiones de T. cruzi por la vía transfusional (Krauts et al., 1995., Affrachino et al., 1989). La segunda prueba a ser implementada o prueba confirmatoria debería garantizar una alta especificidad, permitiendo discriminar entre reacciones cruzadas ocurridas con otras infecciones, evitando así alarmas innecesarias a causa de un falso resultado positivo. Si existiera discordancia entre ambas pruebas, debería ejecutarse una tercera técnica diagnóstica, tal como ha sido sugerido para estudios epidemiológicos en áreas de Colombia y Venezuela donde la enfermedad

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de Chagas es endémica (Guhl et al., 2002; Añez et al., 1999a).

Siguiendo las sugerencias anteriormente mencionadas, y basados en el análisis de los resultados obtenidos en este estudio, los métodos serológicos convencionales IFI y ELISA, los cuales arrojaron un 100% de sensibilidad, así como 3 de los kits de diagnóstico serológico comerciales (Pharmatest®, Chagatest ELISA® y Chagatest ELISA Recombinante V.3.0®) con valores de sensibilidad entre 88% y 9 2 % , pu d ier an p r o p o n er s e co mo p r u eb as d e r u tina, mientras que las pruebas comerciales (Pharmatest, Chagatest ELISA Recombinante V.3.0® , test ELISA para Chagas III y Chagas Stat Pak Assay®) además de la prueba convencional TAD, las cuales arrojaron especificidad de 82% y 86% respectivamente, podrían ser utilizadas como métodos confirmatorios para el diagnóstico serológico. Esta propuesta pareciera corresponderse en parte, con la práctica rutinaria de diagnóstico serológico en Venezuela, considerando que los kits serológicos comerciales Pharmatest® y Chagastest ELISA® se encuentran entre las pruebas más usadas para realizar el despistaje de la enfermedad de Chagas en el país (Vielma, 2005). No obstante esto, fue la prueba Chagatest ELISA la que arrojó el menor valor de RVP en el análisis estadístico realizado. Esto indica que la mencionada técnica presenta una mayor probabilidad de generar resultados erróneos. En consecuencia, se recomienda que en centros donde se emplee esta prueba, debería haber un estricto control de calidad antes de emitir algún resultado diagnóstico de pacientes que resulten seropositivos, lo cual podría lograrse implementando la ejecución de alguna de las pruebas confirmatorias sugeridas aquí (Pharmatest, Chagatest ELISA Recombinante V.3.0® , Test ELISA para Chagas III, Chagas Stat Pak Assay® y TAD).

El análisis comparativo de la relación costo-beneficio entre las pruebas ensayadas, indicó que los métodos con menores requerimientos en equipos, personal e infraestructura fueron la técnica de aglutinación directa (TAD) y el kit de diagnóstico inmunocromatográfico comercial Chagas Stat Pak Assay®. Considerando los bajos requerimientos de la técnica de aglutinación directa (TAD) sumado a su relativamente alta sensibilidad y a su alta especificidad y bajo costo, podría sugerirse su uso potencial como prueba de rutina a ser implementada en áreas rurales donde no se cuenta con infraestructura adecuada ni equipos requeridos para ejecutar los complejos protocolos de la mayoría de las técnicas empleadas en el despistaje de la enfermedad de Chagas, lo cual coincide con previas recomendaciones 53

(Roddy et al., 2008; Wendel & Gonzaga, 1993). Además de esto, el kit de diagnóstico inmunocromatográfico comercial Chagas Stat Pak Assay® resultaría, a pesar de su relativamente alto costo unitario, ideal en centros públicos y privados, rurales y urbanos del país por su eficiencia como prueba de alta especificidad y bajos requerimientos, ofreciendo ventajas para ser utilizada en estudios poblacionales de levantamientos epidemiológicos, dada la facilidad para obtener resultados in situ en pocos minutos, sin requerir personal especializado (Luquetti et al., 2003; Ponce et al., 2005).

A pesar de los requerimientos, las técnicas basadas en ELISA presentan la posibilidad de automatización simplificando su ejecución y permitiendo el procesamiento de un gran número de muestras en cortos periodos de tiempo (Wendel & Gonzaga, 1993; Knecher et al., 1994; Guhl et al., 2002). Adicionalmente, estas técnicas en formato cuantitativo podrían eliminar la subjetividad característica de la mayoría de las pruebas serológicas (Zicker et al., 1991). Por estas razones, y dada su alta sensibilidad, las técnicas basadas en ELISA resultan particularmente útiles como pruebas de rutina en centros públicos y privados del país, en especial en aquellos donde se requiera el procesamiento de un gran número de muestras diarias, como ocurre en

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54

bancos de sangre de centros hospitalarios, opinión esta compartida con previos autores (Winkler et al., 1995; Guhl et al., 2002).

La prueba diagnóstica con mayores requerimientos en equipos, personal e infraestructura fue la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Aún así, algunos autores señalan que esta técnica es tr ad ic io n almen te u s ad a d ad a s u alta s en s ib ilid ad (Oelemann et al., 1998; Malan et al., 2006) lo cual se corrobora en el presente estudio. Sin embargo, su uso se ha restringido a laboratorios debidamente equipados con microscopios de fluorescencia, requiriéndose para su ejecución de técnicos capacitados, ya que la interpretación de los resultados por personal inexperto puede llegar a ser cuestionable (Malan et al., 2006; Andrade et al., 1989). Por estas razones, la técnica de IFI se recomienda sólo como prueba de rutina en centros especializados, para los casos en los que se requiera determinar la fase de la infección chagásica en individuos en los que se deba tomar la decisión de aplicar algún tratamiento tripanocida (Camargo et al., 1986; Luquetti & Rassi, 2000; Añez et al., 2001).

Otro aspecto valorado en el presente trabajo fue la demostración de la pérdida de reactividad de un test comercial (Test ELISA para Chagas III®- BiosChile) luego de haber sido sometido a sucesivos cambios de temperatura por cortos periodos de tiempo. Como resultado fue detectado un progresivo estrechamiento entre las densidades ópticas de los sueros de pacientes seropositivos y seronegativos con el consecuente aumento de diagnósticos erróneos o inconsistentes. La razón de la escasa o nula reactividad pudiera deberse a la pérdida de estabilidad y la consecuente degradación del antígeno como c o n s e c u e n c ia d e l o s s h o c k t é r m i c o s r e c i b i d o s e n e l t i e m p o , a rg u m e n t o e s t e c o m p a r t i d o c o n D e L i m a et al. (2001) en sistemas inmunodiagnósticos aún tratados con inhibidores de proteasas. Estos hallazgos plantean la necesidad de que cada prueba empleada en el despistaje de la enfermedad de Chagas en centros públicos y/o privados sea ejecutada en su totalidad en un tiempo breve, con la finalidad de garantizar un resultado confiable en la detección de la infección chagásica.

En conclusión, tomando en consideración 55

los aspectos analizados en el presente estudio, podría proponerse una combinación de pruebas candidatas a ser utilizadas como técnicas de rutina y/o métodos confirmatorios de acuerdo a las condiciones presentes en cada centro diagnóstico(11)

PRINCIPIO DEL MÉTODO: Se basa en la utilización de una enzima como marcador de la reacción Ag-Ac. El complejo formado tiene actividad enzimática sobre un sustrato específico que se manifiesta por el desarrollo de un color. El antígeno solubles fijado a materiales de fases sólidas como microplacas plásticas de fondo plano. En cada experimento deben incluirse controles adecuados para descartar la hidrólisis espontánea del sustrato, adsorción inespecífica del antígeno, del suero y del conjugado. Los antígenos utilizados en el IVIC son producto de la purificación de aminoácidos de cepas de T. cruzi autóctonas, mientras que los utili zados en Banco de Sangre provienen de un "Kit" comercial (Labotec Chagas).

PROCEDIMIENTO: Para la realización de esta prueba se utilizaron placas de plástico de 98 pozos (Inmunolon n, Dynatech Laboratories). En cada pozo se colocaron 1, 5 Y 10 ug de antígeno respectivamente incubando a 372C toda la noche a fin de evaporar el solvente y fijar totalmente el antígeno al plástico encontrándose que la cantidad de 5ug produjo el valor óptimo de densidad óptica a 405nm en la reacción serológica, por lo cual fue la cantidad de antígeno utilizada en la prueba. En experimentos previos se pudo constatar que la mayor reproducibilidad de los resultados y el máximo en la actividad de la reacción de ELISA se obtuvo adhiriendo el antígeno a la placa e incubándolo por toda la noche a 372C. Una vez adherido el antígeno se lavaron las placas tres veces con SST (solución salina tamponada)0.05% (v/v) Tween-20 con un lavador automático de placas, y luego se bloquearon los sitios que en la placa no reaccionaron con el antígeno con 1% (p/v) de albúmina sérica bovina en SST por 30 mino a temperatura ambiente. Posteriormente se incubaron con los sueros humanos diluidos en SST 1:1000 una hora a 372C al término de la cual, se lavaron 3 veces con SST-Tween-20 y se les añadió (Fab') 2 anti-inmunoglobulinas humanas marcadas con peroxidasa de rábano diluidas 1:1000 en SST (0.01 M P04, 0.15M NaCl, pH 7.4), por toda la noche a 42C (Amersham). Seguidamente se lavaron 3 veces con SST Tween-20 colocándose 56

100 ul del sustrato de la enzima consistente de ABTS (2.2' - amino-di-3-etnyl benzothiazoline sulphonate) en el "buffer" que suministra la casa comercial. La reacción de la ABTS con la peroxidasa produjo un color verde que se cuantificó a 405 nm en un lector de placas de ELISA Titerteck, con sustracción automática del valor del color producido por todos los reactivos presentes en el pozo a excepción del antisuero positivo usado Estudio comparativo de las Técnicas de Machado Guerreíro y Elisa... en la reacción. Todos los experimentos se hicieron por duplicado, ~ encontrándose que la desviación estándar osciló, entre 0.1 - 0.2% del valor del promedio. De la evaluación a la cual fueron sometidas las 241 muestras de sueros sanguíneos provenientes de donantes voluntarios del Banco de Sangre del Estado Zulia, se obtuvo que con la técnica de Machado Guerreiro, 7 fueron positivos y 234 negativos, con ELISA (Banco de Sangre) 21 positivos y 220 negativos. Con ELISA (IVIC) 32 positivos y 209 negativos. (10) Como se puede observar, utilizando la Tabla de Contingencia 2 x 3 (Tabla No. 1) Y el método de análisis Ji-cuadrado modificado por Brand-Snedecor, hubo diferencia significativa entre las técnicas evaluadas. Estudio comparativo de las Técnicas de Machado Guerreiro y Elisa reveló que las diferencias observadas entre los resultados de ambas técnicas fueron significantes; igual análisis demostraron los resultados obtenidos de la evaluaci6n entre Machado Guerreiro y ELISA (IVIC) (10) La reacción de Fijaci6n de Complemento (Machado Guerreiro) por su alta sensibilidad y especificidad, es tradicionalmente considerada como prueba patr6n para el diagn6stico de la enfermedad de Chagas, es por ello que la hemos utilizado para evaluar la técnica inmunoenzimática de ELISA. Numerosos autores confinan la sensibilidad de la reacci6n de Fijaci6n de Complemento empleando un extracto proteico de T. cruzi, exento de fosfolípidos por extracci6n con éter o benzol(10). Históricamente corresponde a Engval y Perlmann2s la descripción de la primera técnica de Ensayo Inmunoenzimático específico para proteínas séricas, siendo un ensayo muy promisor para el diagn6stico de Chagas. (10) Kagan y cols.S afmnan que la prueba de ELISA es altamente sensible y específica para cuantificar anticuerpos circulantes de T. cruzi en el suero. Entre las modificaciones a la técnica de ELISA, Castilla y col. en 1988, se utilizaron el Ensayo Inmunoenzimático por Difusión en Gel (DIG-ELISA), comparándola con Hemaglutinación Indirecta (HAO ) alcanzando mayor porcentaje de positividad de casos para ELISA al realizar la evaluación de ambas pruebas. (10) 57

En 1991, Lorca y Thiermann27 realizaron un estudio comparativo entre la técnica de ELISA por anticuerpos IgG e IgM contra T. cruzi y la prueba de Anticuerpos Inmunofluorescentes (IFA1), confirmando que ELISA es mucho más sensible que la prueba IFAT por anticuerpos IgM. (10) Contreras y cols. en 1992 estudiaron sueros por ELISA-IgG y por pruebas de Hemaglutinación Indirecta, demostrando que ambos métodos presentaron concordancia de 93,3% y 100,0%, respectivamente. (10) Figueredo y cols.29 realizaron un estudio de la prevalencia de infección por T. cruzi en 265 individuos utilizando examen microscópico, hemocultivo, InmunofluorescenciaIndirecta(IFI), ELISA yELISA competitiva (C-ELISA), arrojando una seropositividad de 14.3% por IFI, 14.7% por ELISA y 13.2% por C-ELISA. (10) Estudios comparativos de cuatro métodos serológicos de diagnóstico de la enfermedad, de Chagas fueron aplicados por Schattschneider y cols. en 1992, reportando que las pruebas de Aglutinación por Látex, IFAT Y ELISA identificaron el 81 % de los pacientes con infección aguda, la prueba de Fijación de Complemento no presentó un diagnóstico potencial en esta fase de la enfermedad. En estados tardíos la prueba de Fijación de Complemento mostró una sensibilidad del 69% compa rado con ell00% para pruebase aglutinación por látex, IFATy ELISA. Requejo y cols.,31 en 1991 realizaron comparaciones entre las pruebas serológicas convencionales, tales como Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), Hemaglutinación Pasiva (PHA), Fijación de Complemento y DIG-ELISA, concluyendo que esta última representa una técnica alternativa para la detección de infecciones chagásicas. Estudio comparativo de las Técnicas de Machado Glierreiro y Elisa... Basados en la utilidad reconocida de Machado Guerreiro para eldiagnóstico de la infección T. eruzi, se tomó como parámetro esta prueba, para determinar si hay diferencia significativa de sus resultados con los obtenidos al utilizar la prueba de ELISA. En este estudio se obtuvo una diferencia significativa entre Machado Guerreiro y ELISA confirmando la superioridadde esta últimaen ladetecciónde anticuerpos anti-T. eruzi. (10) La sensibilidad de EUSA permite detectar anticuerpos que han persistido durante más tiempo que aquéllos detectados por Machado Guerreiro, además la facilidad y rapidez para el montaje de la misma y lo sencillo del equipo a utilizar, hacen de ésta una prueba útil en los laboratorios de bancos de sangre, ya que no requiere de infraestructura compleja, ni aparatos costosos ni personal altamente especializado. (10) La positividad de EUSA (Banco de Sangre) y EUSA-IVIC no mostró una diferencia significativa en relación a la encontrada en ambas técnicas con la de Machado Guerreiro, a pesar de que por ELISA-IVIC se obtuvo un mejor resultado, ya que se utilizaron antígenos 58

de cepas puras de T. eruzi por lo que en relación a futuros trabajos se debe hacer hincapié en la necesidad de emplear antígenos puros para obtener resultados óptimos en la ejecución de dicha prueba. (10)

Anez y colb realizaron el trabajo Valoración comparativa de pruebas serodiagnósticas utilizadas para detectar enfermedad de Chagas en Venezuela , la Se presenta la valoración comparativa de 8 técnicas de uso común en el despistaje serológico de la enfermedad de Chagas utilizando muestras de pacientes de diversas procedencias del occidente de Venezuela. En el estudio fueron utilizados métodos serológicos convencionales (TAD, IFI, ELISA) y pruebas de diagnóstico comercialmente expendidas en el país (Pharmatest®, Chagatest ELISA®, Chagatest ELISA Recombinante V.3.0®, Test ELISA para Chagas III® y Chagas Stat PakTM Assay®). La comparación de los resultados no reveló diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de sensibilidad y especificidad de las técnicas evaluadas (P>0.05). Se sugiere, para la obtención de un diagnóstico preciso, la implementación de pruebas de rutina y pruebas confirmatorias. El análisis de la relación costo-beneficio reflejó diferencias entre las técnicas evaluadas, sugiriendo su uso de acuerdo a las condiciones de servicio presentes en cada centro diagnóstico, para lo cual se proponen pruebas candidatas para la rutina y la confirmación diagnóstica. Se demuestra la disminución progresiva de reactividad, con el consecuente incremento de resultados erróneos, en una prueba comercial sometida a sucesivos cambios de temperatura en el tiempo. (12) Los ensayos de Wiener y Biokit utilizan tecnología de proteínas recombinantes y son capaces de detectar inmunoglobulinas de tipo IgG e IgM. Los otros dos ensayos, el de BiosChile y Biomerieux, utilizan extractos totales y son capaces de detectar sólo IgG.(13) Los resultados obtenidos muestran que la sensibilidad y especificidad es mejor en el caso de los ensayos basados en extractos totales. De ellos el que dio los mejores resultados fue el de BiosChile, con un 100% de sensibilidad y especificidad(13)

Test Elisa para Chagas III

59

METODO: Ensayo inmunoenzimático in vitro para la detección cualitativa de anticuerpos de la clase IgG dirigidos contra el Trypanosoma cruzi en muestras de suero o plasma humano BiosChile Ingeniería Genética S.A. ha desarrollado el ensayo Test ELISA para Chagas III pensando en aportar al Banco de Sangre un producto confiable, seguro y fácil de usar. Es así como el ensayo se presenta en placas de 96 pocillos desmontables, cada solución y control tiene un color diferente, la solución de dilución cambia de color al agregar la muestra, diferenciando claramente los pocillos que contienen muestras de los que contienen controles y de los que aún no han sido cargados. Además, el sustrato viene premezclado, lo que permite disminuir el número de pasos a realizar FUNDAMENTOS DEL ENSAYO El Test ELISA para Chagas III es un ensayo inmunoenzimático en fase sólida para la detección cualitativa de anticuerpos contra T. cruzi. Se realiza en placas cuyos pocillos han sido activados con extractos totales de las cepas de T. cruzi Tulahuén y Mn (6), incluyendo antígenos de membrana altamente inmunogénicos. El recubrimiento de los pocillos se realiza mediante una novedosa tecnología consistente en la utilización de un adhesivo biológico que facilita la inmovilización de los antígenos y aumenta la estabilidad de la placa activada (7). Si las muestras analizadas contienen anticuerpos específicos para T. cruzi, éstos formarán un complejo estable con los antígenos que recubren los pocillos. El material unido en forma inespecífica será eliminado por medio del lavado. Durante la incubación con el conjugado, los anticuerpos anti-IgG humana marcados con peroxidasa se unirán al complejo formado. Finalmente, en la etapa de incubación con el sustrato cromogénico, la peroxidasa unida al complejo producirá una coloración que permitirá detectar las muestras reactivas para T. cruzi. La reacción enzimática se detendrá por la adición de ácido sulfúrico, midiéndose luego la intensidad del color en un lector colorimétrico para placas de ELISA.

ADVERTENCIA: Muestras hemolizadas o turbias alterarán el color final sin afectar el resultado. El cambio de color es proporcional al volumen de muestra agregado. Un viraje de menor intensidad, indicará que se dispensó un volumen inferior o que la muestra no se encuentra en las condiciones adecuadas.

DETERMINACION DE LOS RERSULTADOS: Una muestra será positiva cuando su absorbancia sea mayor que el «cut off». Un suero será negativo cuando su absorbancia sea menor que el «cut off». Las muestras cuya absorbancia 60

se encuentre en un rango de «cut off» ± 10%, deben considerarse dudosas y deberán ser analizadas nuevamente en duplicado. Si al menos uno de los replicados mantiene una lectura en esta zona, considere la muestra como positiva. En casos excepcionales en los que no se cuente con un lector colorimétrico, se puede realizar un lectura visual. Los pocillos positivos serán de color amarillo y podrán diferenciarse de los pocillos negativos, los que serán incoloros o presentarán una leve coloración amarilla. Este tipo de lectura no permite verificar los criterios de validación, por lo que se recomienda sólo en situaciones excepcionales. Estudio de especificidad: se analizaron 1060 plasmas frescos provenientes de Bancos de Sangre, de los cuales tres fueron reactivos. Estas muestras fueron confirmadas como positivas, indicando que el ensayo tiene un 100% de especificidad Estudio de sensibilidad: se analizó un total de 100 plasmas positivos para Chagas obtenidos en la Fundación Pro Sangre del Hemocentro de Sao Paulo, Brasil, obteniéndose un 100% de sensibilidad Tabla IV: resultados estudio comparativo Ensayo BiosChile

Ensayo B

Ensayo C

Ensayo D

Neg.

Neg.

Neg.

Neg.

Pos.

Pos.

Pos.

Pos.

Resultados

353/353 271/271 342/353 269/271 351/353 271/271 350/353 270/271

Falsos positivos*

0/16

11/16

2/16

3/16

Falsos negativos+

0/3

2/3

0/3

1/3

97,9%

99,7%

99,4%

Concordancia 100,0%

(*) 16 muestras fueron reactivas sólo en uno de los ensayos. Estas muestras fueron negativas por Western Blot. (+) 3 muestras fueron reactivas sólo en tres de los ensayos y además fueron positivas por Western Blot. Los ensayos de BiosChile y Ensayo C utilizan extractos del parásito y detectan IgG. Los ensayos B y D utilizan antígenos recombinantes y detectan IgG e IgM. Chagatest 61

Tipo de ensayo: ELISA indirecto Antígeno: Lisado parasitario Muestra: Suero o plasma humano Conjugado: Anti-IgG monoclonal/Peroxidasa Tiempo de reacción: 90 minutos Lectura: Monocromática 450nm/ bicromática 450/620-650nm METODO: Ensayo inmunoenzimático (ELISA) para la detección de anticuerpos antiTrypanosoma cruzi FUNDAMENTOS DEL METODO Chagatest ELISA lisado es un ensayo inmunoenzimático "in vitro" para la detección cualitativa de anticuerpos anti-T. cruzi en muestras de suero o plasma humano. La muestra se diluye en la policubeta, cuyos pocillos se encuentran sensibilizados con antígenos de T. cruzi, correspondiente a zonas altamente conservadas entre distintas cepas. Si la muestra contiene anticuerpos específicos, estos forman un complejo con los antígenos y permanecen unidos a la fase solida. La fracción no unida se elimina por lavado y luego se agrega el conjugado (ant icuerpo monoclonal anti-IgG humana conjugado con peroxidasa) el cual reacciona específicamente con los anticuerpos anti-T. cruzi inmunocapturados. El conjugado no unido se elimina por lavado. La presencia de peroxidasa unida al complejo se revela mediante el agregado del sustrato cromogénico, tetrametilbencidina. Las muestras reactivas desarrollan color celeste. La reacción enzimática se detiene mediante el agregado de acido sulfúrico, produciendo un viraje del color celeste al amarillo. La densidad óptica se mide en forma bicromática a 450/620-650 nm o a 450 nm.

62

Chagatest ELISA recombinante v. 4.0 Método: Ensayo inmunoenzimático (ELISA) recombinante para la detección de anticuerpos antiTrypanosoma cruzi.

CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS Tipo de ensayo: ELISA indirecto Antígeno: Mezcla de 6 antígenos recombinantes conservados de fases epi y tripomastigote (SAPA, 1, 2, 13, 30 y 36) Muestra: Suero o plasma humano Conjugado: Anti-IgG monoclonal/Peroxidasa Tiempo de reacción: 120 minutos Lectura: Monocromática 450nm/ bicromática 450/620-650nm Presentación: 96 determinaciones

FUNDAMENTOS DEL METODO Chagatest ELISA recombinante v. 4.0 es un ensayo inmunoenzimático "in vitro" para la detección cualitativa de anti cuerpos anti-T. cruzi en muestras de suero o plasma humano La muestra se diluye en la policubeta, cuyos pocillos se encuentran sensibilizados con seis antígenos recombinantes (SAPA, 1, 2, 13, 30 y 36) específicos de los estadios epimastigote y tripomastigote del T. cruzi correspondientes a zonas altamente conservadas entre distintas cepas. Si la muestra contiene anticuerpos específicos, éstos formarán un complejo con los antígenos permanecerán unidos a la fase sólida. La fracción no unida se elimina por lavado y luego se agrega el conjugado (anticuerpo monoclonal anti-IgG humana conjugado con peroxidasa) el cual reacciona específicamente con los anticuerpos anti-T. cruzi inmunocapturados. El conjugado no unido se elimina por lavado. La presencia de peroxidasa 63

unida al complejo se revela mediante el agregado del sustrato cromogénico, tetrametilbencidina. Las muestras reactivas desarrollan color celeste. La reacción enzimática se detiene mediante el agregado de acido sulfúrico, produciendo un viraje del color celeste al amarillo. La densidad óptica se mide en forma bicromática a 450/620-650 nm o a 450 nm. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reacción es estable durante 10 minutos, por lo que los resultados deben leerse dentro de ese lapso

PARA CONOCIMIENTO PERSONAL: 

SAPA (Shed Acute Phase Antigen)

el antígeno SAPA (Shed Acute Phase Antigen) fue propuesto como marcador de fase aguda de la infección, el diagnóstico de la infección congénita y el seguimiento del tratamiento etiológico específico6-9. Diversos estudios evidenciaron diferentes resultados en cuanto a la proporción de reactividad de SAPA frente a sueros de pacientes chagásicos en las fases indeterminada y crónica de la infección9-12. La proteína TS-SAPA (trans-Sialidase-SAPA) se encuentra en la superficie de los trypomastigotes y cumple un rol importante en la invasión a la célula huésped. Esta proteína cuenta con dos dominios: uno enzimático (TS) y otro repetitivo (SAPA). El dominio repetitivo induce una acentuada y permanente respuesta inmunológica tanto humoral como celular6, 14, 15. Chagatest ELISA recombinante v. 4.0

64

Chagatest ELISA recombinante v.3.0 Método de 3ª generación para la detección de anticuerpos contra el Trypanosoma cruzi

FUNDAMENTOS DEL METODO En esta técnica cualitativa para la detección de anticuerpos anti-T. cruzi, la muestra se diluye en el soporte en el que se encuentran inmovilizados antígenos recombinantes (1, 2, 13, 30, 36 y SAPA), obteniéndose un método de 3ª generación. Estos antígenos se obtienen por técnica de ADN recombinante a partir de proteínas específicas de los estadios epimastigote y tripomastigote del T. cruzi, correspondientes a zonas altamente conservadas entre distintas cepas. La tecnología empleada permite asegurar una mezcla antigénica de composición conocida y constante lote a lote, brindando resultados reproducibles, específicos y con una elevada sensibilidad. Si la muestra contiene los anticuerpos específicos, éstos formarán un complejo con los antígenos y permanecerán unidos al soporte. La fracción no unida se elimina por lavado tras lo que se agregan anticuerpos antiinmunoglobulina humana conjugados con peroxidasa. Si se produjo la reacción en la primera etapa del proceso, se unirá el conjugado. Luego de un nuevo lavado se agrega el sustrato enzimático. En los casos en que se haya unido el conjugado habrá aparición de color celeste. La reacción se detiene con ácido sulfúrico, con lo que el color celeste vira al amarillo Chagatest ELISA recombinante v.3.0

65

CONCLUSIONES 1. 2.

ELISA para HTLV I/II El Enzimoinmunoalisis HTLV I/II cualitativo para la detección de los anticuerpos frente al virus T-linfotrópico humano de tipo I y II (HTLV-I y HTLV-II) en suero o plasma. Se considera al HTLV-I como el causante de la leucemia de las células T del adulto, de la mielopatía relacionada con el HTLV-I, parapesia espástica tropical y la uveítis HTLV. La infección por HTLV-II no se asocia con una enfermedad definida. La transmisión es por vía sexual, sanguínea o perinatal. El tamizaje debe ser realizado a través de técnicas de ELISA. Los ensayos que emplean lisados virales o proteínas recombinantes presentan un alto índice de inespecificidad y reacción cruzada con el HTLV II. 66

Los reactivos que emplean péptidos sintéticos específicos permiten diferenciar las infecciones HTLV-1 de las HTLV-2 como es el caso de las pruebas confirmatorias. La primera generación de ensayos HTLV que utilizaban un diseño de anticuerpos antihumanos y proteínas del HTLV-1 solo detectaban anticuerpos IgG y dependían de un número limitado de epítopos con reactividad cruzada para detectar HTLV-II. Un ensayo ELISA de tipo “sandwich” que utiliza proteínas recombinantes derivadas de proteínas transmenbranales del HTLV-I y HTLV-II y péptidos sintéticos de las proteínas de la membrana exterior del HTLV-I y del HTLV-II. Los antígenos se han elegido para maximizar la sensibilidad y especificidad para el HTLV-I y el HTLV-II y se utilizan con un diseño seleccionado para permitir la detección de los anticuerpos IgA, IgG e IgM Principios del Ensayo -Se han recubierto las microplacas con antígenos inmunodominantes

sintéticos específicos de HTLV I/II derivados de gp46-I, gp46-II y gp21-I. -La fase solida se trata primero con la muestra y se capturan los anticuerpos anti HTLV I/II, si existen, mediante los antígenos recubiertos en la microplaca. -Después del lavado, se elimina el resto de los componentes de la muestra. -En la segunda incubación se detectan los anticuerpos totales anti HTLV I/II unidos mediante la adición de antígenos sintéticos específicos derivados de gp46-I, gp46-II y gp21-I, marcados con peroxidasa (HPR). -La enzima capturada en la fase sólida, combinada con la mezcla substrato/cromógeno, genera una señal óptica proporcional a la cantidad de anticuerpos anti HTLV I/II presentes en la muestra. -Tras bloquear la reacción enzimática, su densidad óptica se mide mediante un lector ELISA. -La versión ULTRA resulta especialmente adecuada para cribados automatizados. 67

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La interpretación de los resultados se realiza como la relación entre el valor de D.O. 450 nm de la muestra (M) y el valor de corte (Co o M/Co). -Un resultado NEGATIVO indica que el paciente no está infectado por HTLV I/II o que la unidad de sangre se puede transfundir. -Las pacientes cuya muestra resulte equivoca deben someterse a una nueva prueba con una segunda muestra tomada del paciente 1 o 2 semanas después. La unidad de sangre no se puede transfundir. -Un resultado positivo indica infección por HTLV I/II y, por lo tanto, el paciente debe ser tratado en consecuencia o la unidad de sangre debe descartarse.

ELISA HIV I/II TIPO SANDWICH: Los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2) son retrovirus ARN con envoltura se transmiten por vía sexual, sanguínea y perinatal, primariamente infectan a los linfocitos.. El tamizaje para VIH tiene por objetivo la detección de anticuerpos y/o antígenos de este virus en el donante. A pesar que las pruebas de tamizaje son muy sensibles, la ausencia de anticuerpos contra el virus no descarta totalmente la infección ya que durante la primera infección, existe replicación viral sin que haya una expresión serológica de los anticuerpos contra el VIH. Esta etapa denominada “período ventana” puede prolongarse por varias semanas. Las pruebas de tamizaje con resultados reactivos indican la probabilidad de que la sangre esté infectada. Toda muestra reactiva debe repetirse por lo menos una vez con la misma prueba de tamizaje. Aunque las pruebas utilizadas para detectar los anticuerpos anti-VIH son sumamente sensibles, específicas y reproducibles, se debe requerir que las pruebas de tamizaje tengan una sensibilidad 100% y 68

por lo menos, un 97% de especificidad. La prueba de tamizaje mas utilizada en los Centros de Hemoterapia y Bancos de Sangre para la detección de anticuerpos y/o antígeno antiVIH es la técnica ELISA. Las primeras pruebas desarrolladas utilizaron lisados virales (antígenos utilizados en estas pruebas se prepararon a partir de viriones del VIH). Estas técnicas son conocidas como ELISA de primera generación las cuales tienen alta sensibilidad pero poca especificidad. Posteriormente se desarrollaron las ELISA de segunda generación las cuales utilizaron antígenos recombinantes preparados por ingeniería genética, luego las ELISA de tercera generación cuyos antígenos son péptidos sintéticos obtenidos por síntesis química y finalmente las ELISA de cuarta generación que además de detectar anticuerpos detecta el antígeno p24 del VIH-1 mediante la introducción de anticuerpos monoclonales en el soporte sólido.

PRINCIPIO DEL TEST El test Genscreen ULTRA VIH Ag-Ac es un inmunoanálisis enzimático basado en el principio de la técnica de intercalado para la detección del antígeno del HIV y de varios anticuerpos anticuerpos asociados con el VIH1 Y EL VIH-2 en el suero o el plasma humanos. La fase sólida está recubierta de: -Anticuerpo monoclonales contra el antígeno VIH-1 p24. -Antígenos purificados: proteína biotecnología gp160, un péptido sintético, totalmente artificial, que imita a un epítopo específico del VIH-1 del grupo O (es decir, un virus codificado, pero inexistente) y un péptido que imita el epítopo inmunodominante de la proteína de la envoltura del VIH-2. Los conjugados se basan en el uso de: -Anticuerpos policlonales biotinilados con el Ag VIH (conjugado 1)

69

-Estreptavidina y antígenos VIH –conjugado de peroxidasa (péptidos gp41 y gp36, que imitan los epítopos inmunodominantes de las glucoproteínas de envoltura del VIH-1 y del VIH-2, y el mismo péptido sintético, totalmente artificial, que imita el epítopo del VIH-1 del grupo O específico usado para la fase solida) (2 conjugado). El procedimiento del ensayo incluye los siguientes pasos de la reacción: 1. El conjugado 1(anticuerpo policlonal biotinilado contra el Ag VIH-1 p24) se añade en los pocillos de la microplaca. 2. Las muestras de suero que se han de analizar y los controles se pipetean en los pocillos. -Los anticuerpos del VIH, si están presentes, se ligan con el anticuerpo monoclonal fijado a la fase sólida y al conjugado 1. -Los anticuerpos de los VIH-1 y VIH-2, si están presentes, se ligan a los antígenos inmovilizados en la fase sólida. -La disposición del conjugado 1 y de la muestra se valida mediante un cambio de color, desde amarillo verdoso a azul. 3. Tras la incubación a 37°C y el lavado, se añade el conjugado 2: -La estreptavidina reacciona con los complejos biotinilados Ab-Ag-Ab. -La peroxidasa marcada, los antígenos VIH-1 y VIH-2 purificados se fijan a su vez a los anticuerpos IgG, IgM o IgA capturados en la fase sólida. 4. Después de la incubación a 18-30°C, la fracción libre del conjugado 2 se elimina mediante el lavado. Tras la incubación, en presencia del sustrato a temperatura ambiente (18-30°C), se muestra la presencia del complejo conjugado por un cambio de color. 5. Se detiene la reacción y se leen las absorbancias por medio de un espectrofotómetro a 450/620-700 nm. La absorbancia obtenida en una muestra determina la presencia o ausencia de Ag VIH o de anticuerpos contra el VIH-1 o el VIH-2. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 70

Las muestras con valores d absorbancia inferiores al calor discriminatorio se consideran negativos. Los resultados justo inferiores al valor discriminatorio se deberían interpretar con precaución (se debe repetir el test en las muestras correspondientes) Las muestras con valores de absorbancia iguales o superiores al valor discriminatorio se consideran inicialmente positivas. Se debería repetir el test antes de una interpretación final. Si después del nuevo test de una muestra, los valores de absorbancia de los 2 duplicados son menores que el valor discriminatorio, el valor inicial no es repetible y la muestra se considera negativa. Si después de un nuevo test la absorbancia de uno de los duplicados es igual o mayor que el valor discriminatorio, el resultado inicial es repible y la muestra se considera positiva.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

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13. 14.

73

74

ANEXO: tabla comparativa de diferentes métodos de ELISA para tamizaje de HBsAG que existente en el mercado para proveer reactivos a los bancos de sangre ENSAYO FABRICAN MÉTODO TE

Fase solida

MONOLI BIORAD Inmunoensa SA yo de tipo HBsAg sándwich en ultra 3.0 1 tiempo ELISA

Pocillos sensibilizada con acs monoclonales anti –HBs (raton)

ABBOT 2.0

Abbott

≥ 3.8

VITROS

Ortho

≥ 8.0

ARCHITE Abbott CT

≥ 5.0

ADIVIA

≥ 11.0

Siemmens

Conjug Diluyente deControl ado conjugado positivo:

Enzima

Ac Inmunoglobuli SAB adicionadoperoxidasa monoclonales na de buey ycon una mezcla anti-Hbs dede ratón +de AgHBs ratón y acs.indicador purificado de los Policlonales subtipos ad y ay, anti-Hbs de (humanos) conjugados con peroxidasaca bra contra el Ag HBs

75

Tampón Solución Sustrato deelavado la peroxidas

dCromogeno Solucion parada

deSensibil Especificida idad d

Solución deTampón Tris,Cloredo enSoklucion de100% Acido cítricoNaCl, Ph=7.4 rosa .Acido y acetato de solución quesulfúrico 1N sodio pH contiene 4,0 que tetrametilben contienen cidina 0,015% de (TMB) H2O2 y 4% de dimetilsulfoxido (DMSO)

ANEXO: tabla comparativa de diferentes métodos de ELISA para tamizaje de HBc Total que existente en el mercado para proveer reactivos a los bancos de sangre

ENSAYO

FABRICAN MÉTODO TE

Fase solida microplaca

Conjugado

Anticuerpos deTampón PBS conSuero humanoperoxidasa cabra marcadosun control deque contiene por peroxidasacolor para laanticuerpos anticontra el IgG ydeposición delHBc el IgMmuestra(púrpura) humanos 8verde) .

MONOLI BIORAD SA Monolisa Anti-HBc Plus . AgAc ultra 3.0 ELISA

Inmunoanlisis enzimático ELISA indirecto para al detección simultanea del de anticuerpos contra el nucleo del virus de la hepatitis. B

Pocillos sensibilizada con acs monoclonales anti –Hbc y de antígenos de recombinación purificado (sistema de expresión E.coli)

Bioelisa anti-HBc

Inmunoenzim aensayo competitivo para determina acs contra el HBcAg. Competencia entre Acs humanos presentes y Acs IgG de conejo antiHBc conjugado con peroxidasa. Pocillos separables individuales

Microplaca cubierta coin HBCAg recombínate (E.coli)

biokit

Acs IgG de conejo antiHBc conjuga dos on peroxida sa.

Diluyente conjugado

deControl positivo:

Acs IgG de coinejo anti-HBc diluidos en tampon fosfato.

76

Enzima

Tampón Sustrato de laSolución peroxidas elavado

dCromogeno

Solucion deSensibilidadEspecifici parada dad

Solución de AcidoTampón Tris,Cloredo en rosa .Soklucion de100% cítrico y acetato de NaCl, Ph=7.4 solución queAcido sodio pH 4,0 que contiene sulfúrico 1N contienen 0,015% de tetrametilbencidi H2O2 y 4% de dimetilsulfoxido na (TMB) (DMSO)

Tampón de citrato acetato que contienen peróxido de hidrogeno.

Tampon fosfato concentrad o

Tetrametil bencidina. TMB disiuelta en dimetilsulf oxido(DM SO).

Acido sulfuri co 1N

ANEXO: tabla comparativa de diferentes métodos de ELISA para tamizaje de HCV Total que existente en el mercado para proveer reactivos a los bancos de sangre

ENSAY FABRICAN METODO O TE MONO BIORAD LISA HCV Ag-Ac ultra 3.0 ELISA

Fase solida microplaca

Enzimainmunoen Pocillos sayo cualitativo sensibilizada con acs monoclonales anti –capsida del VHC y de antígenos de recombinación purificados (NS3, NS4) y un péptido mutado de la región capsida del VHC. NS3: genotipo 1 y 3a.

ABBOT Abbott T HCV ELISA 2.0

≥ 3.8

VITRO Ortho S ANTI HCV CLIA

≥ 8.0

ARCHI TECT HCV CLIA

Abbott

≥ 5.0

ADIVI A

Siemmens

≥ 11.0

Conjugado

Diluyente conjugado

deControl positivo: Enzima

Conjugado 1: AcInmunoglobulin Suero humano queperoxidasa monoclonal murinoa de buey y decontienen dirigido contra laratón +anticuerpos anti – capside del VHCindicador VHC y negativo revelado por l apra el HBs y los biotina. Coloreado acs anti HIV1 y de violeta. HIV2 diluido en Conjugado 2: regulador SAB. Anticuerpos Control antígeno murinos anti-IgG positivo sintetico humanos revelados de control que por la peroxidasa y contienen un estreptoavidina péptido de la señalada por la capside peroxidasa. liofilizado. SAB Coloreada de verde.

77

Tampón SustratoSolución de la peroxidas elavado

dCromogeno

Solucion parada

deSensibilid Especifici ad dad

Solución de AcidoTampón Tris,Cloredo enSoklucion de100% cítrico y acetato deNaCl, Ph=7.4 rosa . solución Acido sulfúrico sodio pH 4,0 que que contiene1N contienen 0,015% de tetrametilbenci H2O2 y 4% de dimetilsulfoxido dina (TMB) (DMSO)

CENTA UR HCV

ANEXO: tabla comparativa de diferentes métodos de ELISA para tamizaje de HIV 1,2 que existente en el mercado para proveer reactivos a los bancos de sangre

ENSA FABRICANTE Fase solida YO microplaca Genscreen BIO-RAD ULTRA HIV Ag-Ab

Conjugado

Diluyente conjugado

deControl positivo: Enzima

Pocillos recubiertosCONJUGADO 1DILUYENTE CONTROL con anticuerposAnticuerpos policlonalesCONJUDO 2POSITIVO Ab monoclonales contrabiotinilados frente al p24solución deVIH plasma p24 VIH-1(ratón) yVIH-1(carnero) leche desnatada humano antígenos purificadosCOJUGADO 2 peroxidasa inactivado al calor VIH-1 y VIH-2 liofilizada etiquetada positivo frente al estreptavidina y antígenos Ag HBs,al Ag purificados VIH 1 y VIH 2 VIH, al los Acs anti VIH-1,antiVIH-2,y antiVHC en diluyente sintetico CONTROL POSITIVO Ag VIH Diluyente sintetico que contiene antígeno VIH-1 purificado inactivado en presencia de un agente disociamte

78

Tampón SustratoSolución de la peroxidas elavado

dCromoge Solucion no parada

Citrato sódico yTampón Tris-Solución H2SO4 1N solución de acetatoNaCl pH 7.4 que de sodio pH 4.0 que contiene contiene tetrametilb H2O2(0.015%) y enzidina DMSO (4%) (TMB)

deSensibilid Especificid ad ad 100%

98.72%

Muerx HIV DiaSorin Ag/Ab Conbination

Recubiertas recubiertos de antigenos del VIH y anticuerpos monoclonales

Antígenos del VIHSolución y anticuerposamarilla moniclonales compuesta por conjugados conproteína bovina peroxidasa desoponina y rabano y liofilizados detergente

Control 1 para antiVIH 1 suero humano inactivado en tampón con proteína bovina Cnntrol Positivo para antiVIH-2 suero humano inactivado en tapon de proteína bovina Control Positivo para p24 del VIH-1 contiene p24(antigen o recombinan te en tampón de proteína bovina

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Tetrametilben zidina TMB

Borato glicina

Tetr H2SO4 1N ame tilb enzi dina en solu ción de citr ato tris odic o y per oxi dos o de hidr oge no

100 %

99.7 8%

ANEXO: tabla comparativa de diferentes métodos de ELISA para tamizaje de HTLV I-II que existente en el mercado para proveer reactivos a los bancos de sangre ENSAYO

FABRICANT Fase solida E microplaca

Conjugado

Diluyente conjugado

HTLV I/II AbDIA.PRO versión ULTRA

Pocillos recubiertosContiene mezcla de con Agsantígenos sintéticos de inmunodominantes HTLV,marcados con HRP, sntéticos específicos5% de BSA, tampón Tris de HTLV I/II10mM a pH 6.8 +/- 0.1, derivados de gp46-0.3 mg/ml de sulfato de 1,gp46-II y gp21-1. gentamicina y Kathon GC al 0.1% como conservantes

HTLV I+II Wienner-lab ELISA recombinante

Pocillos recubiertos con antígenos recombinantes y péotidos de los virus HTLV IyII

deControl positivo: Enzima

Anticuerpo Buffer sálino monoclonal anti-Igcon proteínas humana conjugado con peroxidasa

Contiene 5% de BSA, tampón fosfato 10mM a pH 7.4 +/- 0.1, azida sódica 0.09%, suero humano positivo a anticuerpos HTLV inactivado Kathon GC al 0.1%.

Suero humano inactivado conteniend o anticuerpos contra HTLVI y/o HTLV ii

80

Tampón SustratoSolución dCromogeno Solucion de la peroxidas elavado parada

deSensibilid Especifici ad dad

Solución Contiene Acido 100% tampón tampón sulfúrico fosfato10m citratoH2SO4 0.3M M a pH 7.0fosfato y Tween 2050mM a pH al 0.05% 3.5-3.8, dimetilsulfo xido 4%, tetra-metilbenzidina (TMB) 0.03%, y peróxido de hidrogeno Buffe r Salin o tensio activo

Soluci Acido ón desulfurioco 2N teram etilbe nzidin a (TMB ) con peroxi do de hidrog eno

99.5%

100 %

99%

ANEXO: tabla comparativa de diferentes métodos de ELISA para tamizaje de Sifilis que existente en el mercado para proveer reactivos a los bancos de sangre ENSAYO

FABRICANT Fase solida E microplaca

Conjugado

Diluyente conjugado

deControl positivo: Enzima

81

Tampón SustratoSolución dCromogeno Solucion de la peroxidas elavado parada

deSensibilid Especifici ad dad

ANEXO: tabla comparativa de diferentes métodos de ELISA para tamizaje de Chagas que existente en el mercado para proveer reactivos a los bancos de sangre

ENSAYO

FABRICANT Fase solida E microplaca

Conjugado

Diluyente conjugado

deControl positivo: Enzima

82

Tampón SustratoSolución dCromogeno Solucion de la peroxidas elavado parada

deSensibilid Especifici ad dad

83