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I.

Marco teórico 1. Enzimoinmunoensayo (ELISA) 1.1 Definición El ELISA es una técnica que se basa en el uso de un antígeno o un anticuerpo marcado con una enzima; al estar uno estos componentes marcado y fijado a un soporte, se interrumpe la reacción antígenoanticuerpo, posteriormente se le agrega un sustrato específico sobre la enzima que producirá un color determinado observable a simple vista o cuantificable por un espectrofotómetro o analizar la reacción antígeno anticuerpo. Existen diversos tipos de ELISA los que se marca el anticuerpo: directo, indirecto, sándwich: Doble, Heterólogo. 1.1.1 Antígeno Un antígeno es una molécula capaz de producir una respuesta del sistema inmune adaptativo mediante la activación de linfocitos. Esta definición amplía el concepto de antígeno más allá del concepto clásico que definía antígeno como la sustancia que desencadena la producción de anticuerpos. Así dentro de esta definición de antígeno se incluyen las moléculas que, previa presentación antigénica, son capaces de desencadenar la activación de células T citotóxicas capaces de destruir las células diana sin la participación de anticuerpos. La mayoría de los antígenos son de naturaleza peptídica, aunque también pueden actuar como antígenos moléculas de distintos tipos como lipopolisacáridos e incluso ADN. Los antígenos pueden ser moléculas enteras pero generalmente son el resultado del procesamiento por células presentadoras de antígenos. 1.1.2 Anticuerpo Los anticuerpos constituyen glicoproteínas plasmáticas globulares, llamadas Inmunoglobulinas. Son moléculas formadas por los linfocitos B maduros. La función del anticuerpo consiste en unirse al antígeno y presentarlo a células efectoras del sistema inmune para su destrucción. Esta función está relacionada con la estructura de los distintos tipos de inmunoglobulinas, las cuales son: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM. Los ELISA detectan principalmente dos tipos de inmunoglobulinas:

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Inmunoglobulina M (IgM): representa el 6% del total de inmunoglobulina. Aparece en los linfocitos B unida a su membrana plasmática. Se manifiesta en la respuesta primaria activando el sistema del complemento.

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Inmunoglobulina G (IgG): Es la más abundante (80% del total de inmunoglobulinas). Se une rápidamente con macrófagos y neutrófilos, provocando la destrucción del microorganismo. Puede atravesar la barrera placentaria y se secreta en la leche materna. Por ello, es responsable de la inmunidad fetal y la del recién nacido. Es la mayoritaria en la respuesta inmune secundaria. Asimismo, los anticuerpos que se utilizan en la técnica de ELISA pueden ser de origen monoclonal o policlonal, en ocasiones, ambos: -

Anticuerpos de origen monoclonal: anticuerpos homogéneos producidos por una célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y una célula plasmática tumoral, por lo tanto su especificidad es única.

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Anticuerpos de origen policlonal: son anticuerpos derivados de diferentes líneas de células B. Los anticuerpos policlonales son una mezcla de inmunoglobulina, secretados en contra de un antígeno específico, cada una reconociendo diferentes epítopes

1.2 Clasificación de ELISAS 1.2.1 Detección -

ELISA directo: detección de antígenos ELISA indirecto: detección de anticuerpos

Si los antígenos están unidos a la placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (Elisa directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y uno secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto), esto permite amplificar la señal pues uno o más anticuerpos secundarios pueden unirse a cada anticuerpo primario. 1.2.2 Diseño -

Competitivo: los anticuerpos o los antígenos son inmovilizados sobre la fase sólida y su unión con el conjugado antígeno-enzima o anticuerpoenzima, es inhibida por la presencia de analito no marcado en la

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muestra. Las incubaciones entre muestras y conjugados pueden ser simultáneas o secuenciales. No competitivo: se enfrenta la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si se produce la unión antígeno – anticuerpo, al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color.

1.2.3 ELISA “sándwich” Es el ejemplo clásico de métodos para la detección de antígenos, el primer anticuerpo captura el antígeno de la muestra que es detectado a través del conjugado anticuerpo-enzima o amplificado con un conjugado dirigido contra el segundo anticuerpo (sándwich doble anticuerpo modificado) u otros procedimientos. Los ensayos sándwich doble antígeno, son usados para la detección de anticuerpos y sonmuy útiles para la evaluación de la respuesta inmune inducida por vacunas; en estos ensayos, al igual que en los indirectos, los antígenos capturan los anticuerpos, pero en esta ocasión en lugar de un conjugado anti-inmunoglobulina-enzima, usamos antígeno-enzima, de esta forma se alcanza la máxima sensibilidad y detectabilidad al no ser necesario diluir las muestras; sin embargo, detectamos todas las clases de inmunoglobulinas, lo que en ocasiones no es conveniente. En general, los ensayos sándwich son más apropiados para la automatización de los sistemas ELISA, ya que puede disminuirse un paso de reacción añadiendo simultáneamente muestras y conjugado, aunque hay que prever las posibles interferencias del conjugado a elevadas concentraciones de antígenos o anticuerpos en la muestra.