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• Caro Hinojosa

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TÉCNICA DE DIAGNOSTICO ELISA (ensayo inmuno absorbente ligado a enzimas) Es un método para detectar y cuantificar una proteína específica en una mezcla compleja, descrito por Engvall y Perlmann (1971), se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto reflejara un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro (Cultek, 2006). La prueba ELISA se basa en varias teorías:

1. El antígeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie portadora insoluble y retener su reactividad inmunológica 2. Las enzimas tienen actividad específica alta y convierten una cantidad relativamente grande de sustrato en producto detectable, lo que permite detectar concentraciones muy bajas del ligando 3. La actividad enzimática o reactividad inmunológica de los conjugados se preserva y permanece estable durante el análisis y el almacenamiento 4. Las enzimas no están presentes en el líquido biológico que se va a analizar (Cultek, 2006).

Figura 1.Curva de precipitación tras la unión antígeno-anticuerpo (Manzanares y et-al, 2014).

En la actualidad existen muchas variantes de ELISA que se han desarrollado y utilizado en diferentes situaciones, todas dependen de la misma base elementos:

1. Recubrimiento / captura: inmovilización directa o indirecta de antígenos en la superficie de pozos de microplacas de poliestireno. 2. Bloqueo de placa: adición de proteína irrelevante u otra molécula para cubrir todos los sitios de unión a superficie insaturados de los pozos de microplaca. 3. Sonda / Detección: incubación con anticuerpos específicos de antígeno que se unen por afinidad a los antígenos. 4. Medición de señal: detección de la señal generada a través de la etiqueta directa o secundaria en el anticuerpo específico (Thermo SCIENTIFIC, 2005) TIPOS DE ELISA 1. ELISA DIRECTO: Se utiliza para la detención de antígenos Etapas 1. El antígeno es inmovilizado sobre la fase sólida en los pocillos de la placa de ELISA. 2. Se realiza un lavado con solución salina Tween 20 de pH 7.2 para eliminar los antígenos no fijados. 3. Se adiciona anticuerpos marcados con una enzima (peroxidasas o fosfatasas) si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. 4. Se nuevamente el lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. 6. Se realiza la lectura colorimétrica del producto final coloreado (Cultek, 2006).

Figura 2. Técnica de Elisa directo

2. ELISA INDIRECTO: se basa en la detección de anticuerpos, el sistema de detección emplea dos anticuerpos, un primario contra el antígeno y un secundario marcado contra el primario, la detección posee mayor sensibilidad por la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario y es la base para el examen de V.I.H (Hnasko, 2015), Etapas 1. La Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado con solución salina Tween 20 de pH 7.2 para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados. 2. Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. 3. Lavado con solución salina Tween 20 de pH 7.2 para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 4. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado con solución salina Tween 20 de pH 7.2 para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. 6. Lectura visual del producto final coloreado.

Figura 3. Método indirecto de ELISA

BIBLIOGRAFÍA Cultek,

S.

(2006). Fundamentos y tipos de Elisas. Obtenido http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISAprotocolos.pdf

de

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