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• Nesther Adolfo Oseguera Zavala

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Universidad Nacional Autónoma de Honduras Escuela de Microbiología Internado rotatorio II Periodo académico 2012 MB 344 Pasantía en Serología y Pruebas Especiales

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Presentado por: Susan Denice Flores Mario Roberto Mendoza Catedrático supervisor: Dra. Gina Laitano.

Tegucigalpa M.D.C., 28 de Junio de 2012 1

Principio Esta técnica utiliza una enzima para analizar reacciones antígeno-anticuerpo sobre una fase sólida o inmunoabsorbente.

ELISA utiliza un anticuerpo o un antígeno conjugado a una enzima, la cual reacciona con su sustrato para formar un producto coloreado que absorbe luz. Puede ser utilizado para medir tanto el antígeno como el ELISAanticuerpo. (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Ag o Ac fijado a una fase sólida

Ag o Ac en la muestra

Conjugado (Anticuerpo unido a enzima)

Sustrato

COLOR 2

ELISA SANDWICH

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

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Preparación del conjugado enzimático, soluciones de lavado y sustratos  Conjugado enzimático: 1. Purificación de los anticuerpos 2. Marcación de los anticuerpos con la enzima mediante un agente puente (Glutaraldehído u otra sustancia) Enzimas utilizadas: • Fosfatasa alcalina • Peroxidasa ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

 Solución de Lavado: • Solución salina con Tween 20 como agente tensoactivo: ClNa + Tween 20 +Agua destilada.

 Sustratos: • Nitrofenil-fosfato (FA) • Ortofenilendiamina (P)

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Fase de Lavado Lavar la placa con el buffer de lavado, para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo libre (Eliminar interferencias y evitar falsos positivos). Remover el exceso de líquido golpeando la placa invertida sobre papel absorbente.

Automático

Manual

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¿Qué es el cut-off? ¿Cómo se obtiene? Valores considerados positivos

CUTOFF Valores considerados negativos

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

El cut-Off o punto de corte, se refiere al valor mínimo de confianza. Se utiliza para distinguir entre los resultados positivos y negativos. Cálculo: El método para determinarlo no siempre es el mismo, ya que existen diferentes criterios según el productor de la prueba. 6

Informe de Resultados (lectura visual e instrumental) Automático: Lector de ELISA (espectrofotometría).

COLOR

Visual: observar el cambio de color.

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

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Diferencias entre Pruebas de Primera, Segunda, Tercera y Cuarta Generación Primera Generación

Detección de anticuerpos mediante EIA indirecto con antígeno obtenido de lisado vírico y anticuerpos policlonales. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Segunda Generación

Detección de anticuerpos mediante EIA indirecto con antígeno obtenido de lisado vírico y anticuerpos monoclonales. 8

Diferencias entre Pruebas de Primera, Segunda, Tercera y Cuarta Generación Cuarta Generación

Tercera Generación

Detección de anticuerpos mediante EIA tipo sandwich o de inmunocaptura, con antígeno obtenido de proteínas recombinantes y/o péptidos sintéticos y detección conjunta de anticuerpos específicos IgG, IgM e ELISA IgA. Linked Immunosorbent Assay) (Enzyme

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Disponibles en el mercado desde 1997, permiten la determinación simultánea de antígenos y anticuerpos (HIV con el objetivo de bajar el período ventana mediante un solo ensayo). 9

Gracias por su Atención... 10