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Grupo 2 Equipo 7 Integrantes: Morón Vázquez Felipe de Jesús. Sánchez Nexpanco Jonathan. Tizo Canseco Ángel

P5. MICOORGANISMOS PATÓGENOS. Deteccion de Staphylococcus aureus en alimentos. 

Objetivo:

Determinar la presencia o ausencia de Staphylococcus aureus en 10g de muestra de “Arroz con leche”. Comparar resultado con la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS. y FDA para decidir si el alimento es aprobado o no. 

Etiqueta

Nombre del analista: Morón V. Felipe de Jesús, Sánchez N. Jonathan y Tizo C. Ángel Fecha y hora de compra: 31/03/13 8:45 pm Muestra: Arroz con leche Descripción: Un vaso de arroz con leche sometido a refrigeración 24hrs antes del análisis 

Técnica analítica

10-1 1ml

Pesar 10g de muestra en zona de asepsia.

Homogenizar la muestra con 90ml de diluyente.

10-2

10-3 1ml

10-4 1ml

Realizar disoluciones decimales empleando tubos con 9.0ml de solución diluyente.

Depositar 0.1ml de cada disolución en Agar Baird Parker.

Grupo 2 Equipo 7 Integrantes: Morón Vázquez Felipe de Jesús. Sánchez Nexpanco Jonathan. Tizo Canseco Ángel

Homogenizar con una varilla de vidrio estéril.

Enriquecimiento: Contar aquellas colonias de color negro con halo. Caracterizar número de colonias de acuerdo a Tabla 1.

Incubar 37°C/48hrs

Inocular cada colonia en cada tubo de caldo BHI

Incubar 37°C/48hrs

Pruebas Bioquímicas para cada tubo de caldo BHI -Coagulasa Incubar 37°C/6hrs. Revisando cada hora.

0.2ml de plasma

0.2ml de cultivo

Formación de coagulo, prueba positiva.

-Catalasa

Prueba positiva: burbujeo. Gota de cultivo.

-Manitol

Gota de agua oxígenada.

1 asada de cultivo y aceite mineral.

Incubar 37°C/48hrs

Grupo 2 Equipo 7 Integrantes: Morón Vázquez Felipe de Jesús. Sánchez Nexpanco Jonathan. Tizo Canseco Ángel -Termonucleasa A cada perforación agregar una gota de cultivo Incubar 37°C/48hrs

Hervir todos los tubos de BHI durante 15min. Dejar enfriar

Agregar HCl 0.1N ó Azul de otoloudina.

Dividir la caja de DNA de acuerdo al número de tubos BHI. En cada división perforar el agar con ayuda de pipeta pasteur estéril.

Resultados y análisis de resultados Tabla 1. Número de colonias de S. aureus a evaluar Cuenta total de colonias sospechosas en una caja representativa.

Colonias sospechosas a caracterizar bioquímicamente. 3 5 7

Se realizó una tinción de Gram a una colonia sospechosa para verificar si tenía las características microscópicas de S. aureus

Fecha: 3/04/13 Tipo de tinción: Gram Descripción: Se observan cocos Gram + en forma de racimos y algunos solos.

Grupo 2 Equipo 7 Integrantes: Morón Vázquez Felipe de Jesús. Sánchez Nexpanco Jonathan. Tizo Canseco Ángel La tinción de Gram nos indicó que las colonias probablemente son de S. aureus y por lo tanto se continuó de inmediato con las pruebas bioquímicas. Conteo de colonias de color negro con halo: 90 UFC Tabla 2. Resultados de las placas y características de las colonias típicas de S. aureus. Dilución 10-1 10-2 # colonias >150 >150 sospechosas Características Macroscópicas

10-3 >150

10-4 90

Microscópicas

medio Hagar Parker

Baird Colonias color negro con halo Bacterias Gram +, agrupadas blanco alrededor en racimos, unos cuantos en pares e individuales.

De acuerdo a la tabla 1 y tomando en cuenta el conteo total de colonias se caracterizaron 5 colonias. Tabla 3. Pruebas Bioquímicas Prueba Termonucleasa Coagulasa CMRF Catalasa

Colonia 1 + + + +

Colonia 2 + + + +

Colonia 3 + + + +

Colonia 4 + + + +

Colonia 5 + + + +

Para estas pruebas bioquímicas las más importantes y que determinan la presencia de S. aureus son las de termonucleasa y coagulasa, ya que estas dan positivas e indican la presencia de enterotoxina según la NOM-115-SSA1-1994 y este fué el caso con nuestra muestra.

Grupo 2 Equipo 7 Integrantes: Morón Vázquez Felipe de Jesús. Sánchez Nexpanco Jonathan. Tizo Canseco Ángel De las 5 colonias analizadas, las 5 dieron prueba positiva para termonucleasa y coagulasa. Por lo tanto:

Total de colonias sospechosas (UFC/g) 90 UFC X

0.00001g (caja sembrada con 0.1ml de la disolución 10-4) 1g

X = 90x105 UFC/g Análisis de resultados En los medios de Baird Parker se observaron colonias típicas de S. Aureus, colonias de color

negro característico del género de staphylococcus, ya que estos reducen el telurito a telurio. Posteriormente se seleccionaron las colonias sospechosas de S. aureus, son aquellas que presentaron un halo blanco alrededor de la colonia debido a la hidrolisis de la lecitina., tomando la

placa que contenía entre 51-100 UFC para tipificar las 5 colonias, correspondiente a la dilución 10-4 g muestra/ml, además se realizó una tinción Gram para observar las características microscópicas del microorganismo. Cada calonia se inoculo en caldo BHI, después de incubar a 35°C durante 24h, para cada tubo se realizaron las cuatro pruebas bioquímicas. Después de 24h de haber inoculado en medio BHI, se agregó plasma de conejo a los caldos inoculados para verificar la producción de coagulasa, los cuatro tubos resultaron positivos para esta prueba después de 3 horas. En las otras 3 pruebas bioquímicas restantes fueron positivas lo cual nos indica la presencia de S. aureus, a excepción de la prueba de termonucleasa la cual nos proporciona información acerca de la producción DNAsa, para llevar a cabo esta prueba se necesita inactivar el cultivo calentando en baño María con el propósito de liberar DNAsa. y al momento de realizar la prueba con el HCl, la formación de halo fue percibido porque la formación excesiva de colonias lo permitió.

Grupo 2 Equipo 7 Integrantes: Morón Vázquez Felipe de Jesús. Sánchez Nexpanco Jonathan. Tizo Canseco Ángel Conclusión: De las 90x105 UFC/g el 100% de las colonias son enterotoxigenicas tomando en cuenta la primera consideración (prueba de termonucleasa y coagulasa) Resultado: 90x105 UFC/g de Staphylococcus aureus enterotoxigenica De acuerdo a los límites establecidos (106 UFC/g) en la NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. Este alimento “Arroz con leche” es aprobado. De acuerdo a los límites establecidos (105 UFC/g) en FDA este alimento “Arroz con leche” es rechazado por sobrepasar dichos límites. Para este caso se tomará en cuenta las especificaciones señaladas en FDA por lo que el alimento es rechazado. Bibliografía: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS. Catherine M. C. et al. 2008; Micriobiological Analysis of Food Contact Surfaces in Child Care Centers; Appl. Environ. Micriobiol 74(22); 6918-6922