• Author / Uploaded
• Ray Seminario

Citation preview

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

DETERMINACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS INTRODUCCIÓN: La familia micrococcaceae comprende cocos positivos, no exigentes, catalasa positivos, con agrupación en racimos aerobios o anaerobios facultativos. De los tres géneros que la integran, micrococcus, planococcus y staphylococcus, este último es el único de importancia en médica. Se caracteriza por ser aerobio- anaerobio facultativo, capaz de fermentar la glucosa en anaerobiosis; posee ácido teitoico en su pared, y es sensible a las enzimas lisostafina. Dentro de los géneros de staphylococcus se conocen en la actualidad 35 especies y 17 subespecies, muchas de las cuales se encuentran en los humanos. Del punto de vista de sus factores de virulencia, tanto bioquímicos como estructurales, se puede definir como un “patógeno perfecto”, magníficamente equipado para colonizar, invadir, diseminarse y causar enfermedad grave. No obstante normalmente, normalmente convive en armonía con el huésped humano o animal, formando parte de su flora sin causar daño. Inclusive en algunos casos se encuentra personas sanas pesadamente colonizadas, definiéndose como “portadores” y pudiendo en ocasiones ser reservorio y fuente de infección. Los alimentos sujetos a contaminación post-proceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus representan un riesgo por la ausencia de flora competitiva que normalmente restringe el crecimiento del Staphylococcus aureus y la producción de enterotoxinas. Los alimentos comúnmente asociados a intoxicaciones y vómitos al poco tiempo de ser ingeridas, alimentos cocinados con alto en proteínas (ejemplo: jamón cocido, ensaladas, productos de pastelería, productos lácteos etc.).

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

OBJETIVO:  Realizar el recuento de colonias de staphylococcus aureus de muestras de queso fresco por el método de baird Parker.  Familiarizarse con el método s.aureus y conocer su importancia en los alimentos.

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

FUNDAMENTO TEÓRICO: Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas cocáceas de 0,8-1,0 mm de diámetro, que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmóviles y no forman esporas. Son Gram positivas. Es una especie muy sensible a la acción del calor y de los desinfectantes. Más del 50 % de las personas son portadoras de S. aureus en fosas nasales, garganta, forúnculos, manos o pelo. Por eso su presencia en determinados niveles en los alimentos es un signo evidente de falta de higiene en la manipulación. Además algunas cepas de S. aureus son patógenas para el hombre porque producen entero toxinas que dan lugar a la intoxicación estafilocócica. La dosis infectiva es alta ya que es necesario un número de al menos 106 ufc/g para producir cantidad suficiente de entero toxina para producir la enfermedad en el consumidor. En resumen, la presencia de un número elevado de Staphylococcus aureus en un alimento refleja higiene defectuosa por mala manipulación. Si, además, el S. aureus aislado son cepas enterotoxigénicas, suponen un riesgo para la salud. Puede ocurrir que no se detecte S. aureus en un alimento, que el número detectado sea pequeño y que, sin embargo, exista cantidad detectable suficiente de entero toxina estafilocócica. En este caso, los microorganismos que originaron la toxina han ido descendiendo en número e, incluso, desapareciendo, mientras que la toxina, por su mayor resistencia, permanece en el alimento. El método de recuento en placa se utiliza cuando se sospecha que el alimento por analizar contiene más de 100 S. aureus por gramo.

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

1. MÉTODO DE BAIRD PARKER: Se utilizan diversos medios para el aislamiento de Staphylococcus aureus, que desempeña un papel muy importante en los casos de intoxicación por alimentos e infecciones clínicas humanas. La fórmula del presente agar BairdParker fue publicada en 1962. Es un medio parcialmente selectivo que utiliza la capacidad de los estafilococos de reducir el telurito y detectar la lecitinasa a partir de la lecitina del huevo. El agar Baird-Parker se utiliza ampliamente y se incluye en numerosos procedimientos estándar para el análisis de alimentos, cosméticos o agua de piscinas con el fin de detectar la presencia de Staphylococcus aureus2-6. Asimismo, puede utilizarse para el aislamiento de S. aureus a partir de muestras clínicas y también se denomina agar huevo-telurito-glicina-piruvato (ETGPA) 7,8. BD Baird-Parker Agar contiene las fuentes de carbono y nitrógeno necesarias para el crecimiento. La glicina, el cloruro de litio y el telurito potásico actúan como agentes selectivos. La yema de huevo constituye el sustrato para determinar la producción de lecitinasa y, además, la actividad de lipasa. Los estafilococos producen colonias de color de gris oscuro a negro debido a la reducción del telurito; los estafilococos que producen lecitinasa descomponen la yema de huevo y crean zonas transparentes alrededor de las colonias correspondientes. Es posible que se forme una zona de precipitación debido a la actividad de lipasa. El medio no debe utilizarse para el aislamiento de estafilococos diferentes de S. aureus.

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

MATERIALES, EQUIPOS: -

Espátula de Grigalsky

-

Pipetas de 10 mL y 1 mL

-

Placa Petri

-

Propipeta

-

Tubo de ensayo

-

Vaso Precipitado

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

-

Espátula

-

Agua Peptonada

-

2 Yemas de Huevo

-

Sal

-

Agar Baird Parker

-

Muestra Queso

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

-

Telurito de Potasio

-

Bagueta

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

PROCEDIMIENTO: 1. PREPARACION DEL BAIRD PARKER  Se prepara 120 mL de Beird Parker (Instrucciones en el frasco para su preparación en relación al agua destilada).

2. PREPARACION DE LA MUESTRA  Se prepara 90 mL de Agua Peptonada (las Instrucciones en el frasco para su preparación en relación al agua destilada).  Se añade 10 g de muestra de Queso.  Se añade 0.5 g de sal (Se añade para hacer rebotar a los Staphylococcus).

3. PREPARACION DE LA PLACA  Se hace un pequeño orificio por la cámara de aire del huevo para retirar las claras.  Se retira las yemas y se vierte en un Vaso Precipitado.  Se mueve las yemas con la ayuda de una bagueta o varilla de agitación.  Se añade las yemas a la preparación de Baird Parker y 0.9 g de sal.  Se añade 1 mL de Telurito de Potasio.  Se añade una pastilla de Tetraciclina.  Mover la solución y mantenerla por encima de los 50 °C para remover.

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

 La preparación ya está lista para verter en la placa Petri. (Se hace rápido no pasando de los 15 minutos)

4. INCUBACIÓN DE PLACAS  Debido a que la preparación de la muestra contiene trozos de queso que pueden ser molestos para este proceso, separamos parte de la preparación de la muestra en un tubo de ensayo para hacerlo más fácil.

 Una vez preparada la placa se añade 0.1 mL de la preparación de la muestra con ayuda de una pipeta y una propipeta.

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

 Con ayuda de la Espátula de Grigalsky se expande la muestra para terminar de sembrar.

 Una vez terminada la siembra sellamos las placas y las dejamos incubar a 37 °C durante 48 horas.

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

RESULTADOS: Después de la siembra en el agar y transcurrido 24 – 48 horas se obtuvo el siguiente recuento:

DILUCIONES 10−1

10−2

10−3

DILUCIONES

# DE COLONIAS

PROMEDIO

175

175

171

171

149

149

10−1 A

10−2 A

10−3 A

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

Dividimos los promedios de las diluciones 10-2 y 10-3 y obtenemos los siguientes resultados: 171 = 1.15 149 El resultado es menor que 2, entonces tomamos como valor para el conteo de colonias al promedio de ambos valores. Obteniendo así el resultado siguiente:

17100 + 149000 = 16000 = 16.000 𝑥 103 𝑈𝐹𝐶/𝑔 2

CONCLUSIONES: -

La cantidad de S. aureus en la muestra de queso fresco es 16.000 𝑥 103 𝑈𝐹𝐶/𝑔.

DISCUSION: -

La Norma Técnica Peruana NTP 202.087 establece requisitos microbiológicos no mayores de 10 a 102 UFC/g para Staphylococcus aureus. Los valores reportados en este estudio están por encima del límite máximo permitido, por lo cual nos indica el alto grado de contaminación alcanzado por este alimento.

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

RECOMENDACIONES; PARA LA PREPARACIÓN DEL MEDIO BAIRD PARKER El medio base puede ser almacenado hasta 1 mes en refrigeración. El medio completo no debe usarse:  Si se ha almacenado a temperatura ambiente (20°C a 25° C) por más de 5 días.  Si el medio plaqueado ha perdido la opalescencia inicial.

SECADO DE PLACAS CON AGAR BAIRD PARKER Las placas a usar deben estar secas a fin de prevenir la extensión y mezcla de colonias.  El secado de las placas se puede efectuar colocando las placas:  En un horno o incubadora a 50 º C por 30 minutos, quitando la tapa y colocando la superficie del agar hacia abajo.  En un horno o incubadora a 50ºC por 2 horas con la tapa puesta y la superficie del agar hacia arriba.  En una incubadora a 37 º C por 4 horas con la tapa puesta y la superficie del agar hacia arriba.  En la mesa del laboratorio por cerca de 16 horas a la temperatura ambiente, con las tapas puestas y la superficie del agar hacia arriba.

DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS MICROBIOLOGIA GENERAL

BIBLIOGRAFÍA: o

Avalos-Flores, G. S. (diciembre de 2014). microbiologia general staphylococcus aureus : generalidades, patogenicidad y metodos de identificacion. Recuperado el 18 de julio de 2018

o

Cornejo, D. G. (28 de febrero de 2008). Recuento e Identificación de Staphylococcus aureus, 2da . edicion. Recuperado el 19 de julio de 2018

o

INDECOPI. (2010). Norma Tecnica Peruana (NTP- 202.687) leche y productos lacteos. Recuperado el 19 de julio de 2018

o

NOM-115-SSA1-1994. (1994). Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. Recuperado el 29 de julio de 2018