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• Laura Zuluaga

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Guía Laboratorio de Virología

Inducción del Profago λ por Radiación Ultravioleta El primer aislamiento de lambda fue reportado en 1951 por Esther Lederberg (1951) y un estudiante de doctorado de la Universidad de Wisconsin. Luego Esther, junto a su esposo Joshua Lederberg lo describió con mayor detalle en un artículo publicado en 1953. El descubrimiento fue un evento accidental, cuando una cepa de E. coli K12 sensible a lambda (W518, obtenida después de radiación con UV) se cruzó con su parental. La mezcla dio lugar a placas donde el origen de los virus era el parental K12. Las células W518 que sobrevivieron se convirtieron en lisógenos estables que, al igual que los parentales K12, eran inmunes a la superinfección. En un principio, se pensó que el fago se encontraba en un plásmido, de hecho se le llamó lambda de acuerdo al descubrimiento de los endosimbiontes intracelulares kappa (llamados cuerpos R) (Pond et al., 1989). Sin embargo los cruces entre lisógenos y cepas sensibles, demostraron que el profago lambda era cromosomal y se encontraba ligado al gen gal (Lederberg, 1953). La idea de tener un fago a manera de profago resultó de cierta forma controversial. Sin embargo esta idea se reforzó al descubrir que al irradiar con luz UV células de una población lisógena de Bacillus megaterium producían fagos; posteriormente se demostraría el mismo fenómeno para lambda (Weigle, 1951). Al infectar las células, los fagos enfrentan dos decisiones fundamentales: replicarse y lisar la célula o entrar en un ciclo latente o lisogénico, en el cual el fago se integra al cromosoma de la célula (Fig.1). Ya que el profago se convierte en parte de la célula, su supervivencia depende de ella. Por tanto, para sobrevivir, los fagos deben tener la capacidad de escapar de la célula cuando su existencia este en juego.

Fig. 1. Modos alternativos de infección del fago λ. El fago Lambda puede multiplicarse dentro de su hospedero y lisarlo para la liberación de la progenie (ciclo lítico), o puede integrar su ADN al genoma del hospedero (ciclo lisogénico), donde permanece en estado de latencia hasta un evento de inducción. Imagen modificada de Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L & Clarke ND. Biochemistry. Fifth Edition. En el Sitio Web de NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=stryer

El establecimiento y mantenimiento de un bacteriófago en una célula depende de la función de una proteína represora del fago, la cual impide la trascripción de enzimas

líticas o en otros casos enzimas de transcripción temprana (Fig. 2). Estos represores son los responsables de hacer una célula lisogénica inmune a una infección con un fago similar al profago. Una de las formas de escape del fago de la célula es inactivar las proteínas represoras induciendo de esta forma la lisis. Uno de los mecanismos responsables de esta inactivación permanente es la respuesta SOS de la célula. Más específicamente el papel de la proteína RecA que detona una autoproteólisis de la proteína represora (Craig, 1980; Little, 1984). En el laboratorio, se puede observar la liberación de los fagos, utilizando dos cepas de bacterias una de las cuales debe poseer el profago y otra debe funcionar como cepa indicadora. Tras realizar varias siembras (en 3 a 6 cajas, en forma de cruz utilizando ambas bacterias), estas son expuestas a la irradiación ultravioleta en tiempos cortos (segundos a minutos), que aumentan gradualmente, con excepción del control que se mantiene en la oscuridad.

Fig. 2. Versión simplificada del sistema de regulación de los ciclos del fago Lambda en su hospedero E. coli. En el ciclo lisogénico el bacteriófago sintetiza una proteína represora (cI), la cual activa su propia síntesis y apaga la transcripción de otras proteínas virales, incluida la proteína Cro. Por el contrario, en el ciclo lítico se sintetiza la proteína Cro, la cual apaga la transcripción del represor cI, dando paso a la síntesis de otras proteínas virales requeridas para la replicación del genoma del fago y producción de nuevas partículas virales. Imagen modificada de Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K & Walter P. Molecular Biology of the Cell 4th ed, en el Sitio Web de NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=Lambda&rid=mboc4.figgrp.1330

La luz ultravioleta generará lesiones en el ADN de las bacterias y detonará la respuesta SOS. Además se ha demostrado que la luz ultravioleta (y compuestos como la mitomicina C) produce un clivaje directo en el represor a nivel de la unión entre el dominio de acople a ADN (N terminal) y el dominio de interacción con proteínas (C terminal). El efecto mayoritario de esta ruptura es la pérdida de interacción entre los dímeros de los represores y por tanto su habilidad de mantenerse acoplados al operador e inhibir. Las cajas son incubadas a 37°C por aproximadamente 18 a 24 horas para observar los resultados. La producción de fagos se determina gracias a la presencia de lisis en la zona donde se sembró la cepa indicadora, la cual para lograr un resultado visible debe ser sensible al fago.

Objetivos 

Inducir la escisión del profago lambda (paso del ciclo lísogénico al lítico), mediante el uso de un agente físico (la radiación ultravioleta).



Observar el efecto producido por la luz UV en la inducción del profago, a diferentes tiempos de exposición.

Procedimiento I. Cultivo de bacterias Preparar un subcultivo de E. coli W3104 (lisogénico para lambda) y uno de E. coli C600 (cepa indicadora sensible a lambda) en 5ml de caldo triptona e incubarlos a 37ºC durante 24 horas. II. Prueba de inducción del profago Lambda 1. Sobre un área limpia y con el mechero prendido o en cámara de flujo laminar, ubicar los elementos de trabajo necesarios para la prueba. 2. Prepare 6 cajas con agar base triptona, marcándolas del 1 al 6, y trazándoles en la base dos líneas de diferente color, que formen un ángulo recto. Cada color identificará una cepa de E. coli. 3. Utilizando un asa de 3mm de diámetro, remojarla en el cultivo de E. coli C600 y realizar una línea en el agar de cada caja, siguiendo una de las dos líneas anteriormente trazadas. 4. Con un asa diferente, mojarla con el cultivo E. coli W3104 y hacer una línea perpendicular a la ya realizada con la cepa de E coli C600 en cada caja. 5. Destapar las cajas marcadas del número 1 al 5 e irradiarlas con luz ultravioleta (UV), de acuerdo al tiempo establecido en la tabla 1. La irradiación puede llevarse a cabo con una lámpara de 30 watts o la lámpara de una cámara de flujo laminar a una distancia de aproximadamente 40cm de la fuente. La distancia debe ser constante para cada una de las cajas irradiadas. La caja 6 no se debe irradiar ya que corresponde al control negativo. Nota: Para el caso de lámpara de otro tipo la prueba debe ser estandarizada de acuerdo con la distancia de la fuente. 6. Después de irradiar las cajas de acuerdo con las instrucciones, cerrarlas e incubarlas invertidas a 37°C por un período de 18 a 24 horas.

Tabla 1. Tiempos de exposición recomendados para una lámpara UV de 30 watts o una lámpara de una cámara de flujo laminar, a una distancia aproximada de 40cm de la fuente. Tiempo de Caja número exposición 1 5” 2 10” 3 20” 4 30” 5 40”

Material de Referencia El material acá listado pudo o no haber sido usado en parte para la construcción de esta práctica, lo invito a que revise algún artículo, no es necesario que los lea, pero ojeándolos puede llegar a comprender más los conceptos y objetivos de esta práctica. Chen J, Anderson JB, DeWeese‐Scott C, Fedorova ND, Geer LY, He S, et al. MMDB: Entrezʹs 3D‐structure database. Nucleic Acids Res. 2003; 31(1): 474‐7. Craig, N. L., and J. W. Roberts. 1980. E. coli recA protein‐directed cleavage of phage lambda repressor requires polynucleotide. Nature 283:26‐30. Muestran el clivaje del represor de lambda mediado por recA y su dependencia en ATP y polinucleótidos. [Medline ‐ Abstract Dispinible en web ‐ Artículo disponible en Hemeroteca Universidad] Lederberg, E. M. 1951. Lysogenicity in E. coli K‐12. Genetics 36:560. Lederberg, E. M., and J. Lederberg. 1953. Genetic studies of lysogenicity in Escherichia coli. Genetics 38:51–64. Primeros estudios realizados a partir de cruces con cepas lisogénicas de E.coli. Determina la localización cromosomal del profago y describe la técnica para estudiar cruces entre cepas lisogénicas y sensibles que se usa en esta práctica. [Texto completo disponibl en Genetics] Little, J. W. 1984. Autodigestion of lexA and phage lambda repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. 81:1375‐1379. Metodología para demostrar la digestión de lexA y el represor del fago lambda y su correlación con la respuesta de SOS [Texto completo disponible en PNAS] Pabo CO, Lewis M. 1982. The operator‐binding domain of lambda repressor: structure and DNA recognition. Describe la estructura de acople entre el represor y el operador del fago lambda mediante cristalografía de rayos X. Nature. Jul 29;298(5873):443‐7. [Abstract PMID:7088190 ‐ Disponible en hemeroteca Universidad] Pond, F. R., I. Gibson, J. Lalucat, and R. L. Quackenbush. 1989. R‐bodyproducing bacteria. Microbiol. Rev. 53:25–67. Review que describe los cuerpos R ‐ cuerpos

de inclusión bacteriales inusuales llamados kappa. Leyendo este artículo se puede ver la correlación entre la nominación impuesta para el fago y kappa impuesta para estos cuerpos R acorde al conocimiento sobre ambas partículas en dicho tiempo. [Texto completo disponible a través de Pubmed. PMID:372716] Weigle, J. J., and M. Delbrück. 1951. Mutual exclusion between an infecting phage and a carried phage. Describe y estudia la metodología de inducción del profago lambda por UV teniendo en cuenta los conocimientos sobre lisogenia de la época (tenga en cuenta los conocimientos en dicha época). J. Bacteriol. 62:301–318 [Texto completo disponible a través de PubmedCentral. PMID:386128] Walker, G. C. 1984. Mutagenesis and inducible responses to deoxyribonulceic acid damage in Escherichia coli. Review sobre los caminos metabólicos de la respuesta SOS, genes de choque térmico y su relación con mutagénesis. Microbiol. Rev. 48(1), 60‐93. [Texto completo disponible a través de Pubmed. PMID: 373003]