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• Juan Lopa

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PRÁCTICA N° 4 CITOESQUELETO Y MOTILIDAD CELULAR

I.

OBJETIVOS   

II.

Reconocer y analizar los centrosomas y centriolos. Determinar la función de los cilios y fragelos. Observar en el microscopio los cilios del epidídimo y los flagelos de espermatozoides.

INTRODUCCIÓN

La observación del interior de la célula en tres dimensiones revela interconexiones entre estructuras de proteínas filamentosas dentro del citoplasma de células eucarióticas. Estas estructuras forman un esqueleto celular, el citoesqueleto, que mantiene la organización de la célula, le permite moverse, posiciona sus orgánulos y dirige el tránsito intracelular de vesículas y distintos materiales. La motilidad celular es uno de los grandes logros de la evolución y el citoesqueleto, un sistema de fibras citoplasmáticas, esencial como componente de soporte para este proceso y guía del transporte de organelos intracelulares y otros elementos. Su aparición temprana en la evolución puede comprobarse por la similitud genómica y estructural, en Bacteria y Archaea, de las proteínas MreB y MB1 con la actina de eucariotes. Las células eucariotas tienen la capacidad de organizar movimientos directos para migrar, alimentarse, dividirse y dirigir coordinadamente el transporte de materiales intracelulares. El mecanismo y dirección del movimiento se realiza de diferentes maneras y está asociado con disipación de la energía. Los motores moleculares son los prototipos de máquinas protéicas que transportan organelos a lo largo de microtúbulos y filamentos de actina, convirtiendo la energía libre derivada de la hidrólisis del ATP en movimiento dirigido. Otro tipo de movimiento direccionado y que consume ATP está mediado por el ensamblaje polarizado de polímeros, principalmente actina.

FUNDAMENTO TEÓRICO

El citoesqueleto es un componente fundamental del citoplasma de las células eucarióticas; esta estructura ayuda a establecer la forma de la célula brindando resistencia mecánica a la membrana y permitiendo la organización espacial de los tejidos. Junto con otras proteínas motoras asociadas, el citoesqueleto determina un amplio rango de funciones celulares que incluyen: la migración celular, el movimiento de las organelas intracitoplasmáticas y la división celular. El citoesqueleto está constituido por tres tipos principales de filamentos de proteína: filamentos de actina, filamentos intermedios y microtúbulos, que se mantienen juntos y unidos a los orgánulos intracelulares y a la membrana plasmática mediante varias proteínas accesorias. A. Microfilamentos (filamentos de actina) De unos 7 - 5 nm (nanómetros) de diámetro. Están formados por una proteína globular llamada actina que puede presentarse de dos formas:  Actina no polimerizada: la actina se encuentra asociada a la profilina que evita su polimerización. Representa la mitad de la actina de la célula y es utilizada para polimerizar microfilamentos cuando es necesario.  Actina polimerizada: es una doble hélice dextrógira de dos hebras de actina no polimerizada. Esta actina se puede encontrar asociada a otras proteínas:  Proteínas estructurales: que permiten la unión de los filamentos de actina  Proteínas reguladoras: la más importante es la miosina que permite la contracción muscular al permitir que la actina se desplace sobre ella. Muchas veces, la actina va asociada a otro tipo de proteínas locomotoras, como es el caso de las miosinas. Las funciones de los microfilamentos de actina son: la contracción muscular, la formación de pseudópodos, el manteni-miento de la morfología celular, la endo y exocitosis, la fusión de lisosomas y, en la citocinesis de células animales, forma un anillo contráctil que divide la célula en dos. B. Filamentos intermedios Son filamentos de proteína fibrosa de unos 12 nm de diámetro, son los componentes del citoesqueleto más estables, dando soporte a los orgánulos (por sus fuertes enlaces), y heterogéneos. Para su dinámica se requiere la fosforilación y defosforilación de sus componentes por medio de cinasas y fosfatasas, respectivamente.

Los filamentos intermedios son muy resistentes a la tracción, al aire, al agua y a las bacterias, además, coexisten varios en una misma estructura celular. La función principal es la organización de la estructura tridimensional interna de la célula (por ejemplo, forman parte de la envuelta nuclear y de los sarcómeros) También participan en algunas uniones intercelulares (desmosomas). Los filamentos intermedios se clasifican de acuerdo a la proteína que los compone. Algunos de los tipos conocidos son: Queratinas Forman parte de todas las células epiteliales. Pueden ser ácidas o básicas. Se encuentran en el citoplasma, próximas al núcleo. Vimentina Está presente en las llamadas células mesenquimatosas que forman los fibroplastos, los músculos lisos y estriados, condrocitos, Se encuentran alrededor del núcleo. Desmina Forma parte de las células musculares lisas, cardíacas y esqueléticas y de los miofibroblastos. Participan en la embiogénesis (ensamblaje de microtúbulos). Proteína ácida fibrilar glial (GFAP) Se encuentra en las prolongaciones celulares formando haces paralelos. Neurofilamentos En neuronas del sistema nervioso central y periférico. Les dan soporte, y participan en el transporte celular. Láminas nucleares Le dan rigidez al núcleo celular y participan en la regulación de la transcripción. Nestina Está presente en las neuronas ambrionarias y en las células musculares. Láminas Son las únicas que se encuentran dentro del núcleo. Participan en la formación de la membrana nuclear durante la mitosis. C. Microtúbulos Los microtúbulos son estructuras tubulares huecas de 25 nm de diámetro que se originan en los centros organizadores de microtúbulos y que se extienden a lo largo de todo el citoplasma. Se encuentran en todas las células animales exceptuando algunas como los eritrocitos humanos. Se pueden polimerizar y despolimerizar

según las necesidades de la célula. Se hallan en las células eucariotas y están formados por la polimerización de un dímero de dos proteínas globulares, la alfa y la beta tubulina. Cada microtúbulo está compuesto de 13 protofilamentos formados por los dímeros de tubulina. La tubulina gamma se encuentra en los centrosomas. Tipos  Lábiles: tienen funciones dinámicas. Constituyen vías de transporte citoplasmático de organoides y macromoléculas. Mantienen en posición al aparato de Golgi y al retículo endoplasmático celular determinando así la polaridad (huso mitótico).  Estables: se encuentran siempre presentes en las células. (centríolos, cilios y flagelos). Funciones Intervienen en diversos procesos celulares que involucran desplazamiento de vesículas de secreción, movimiento de orgánulos, transporte intracelular de sustancias, así como en la división celular (mitosis y meiosis). Además, constituyen la estructura interna de los centriolos,cilios y los flagelos. Los microtúbulos son más flexibles pero más duros que la actina. Centriolos Están ubicados cerca del núcleo, reunidos en pares, perpendiculares entre sí y rodeados por una matriz centrosómica. Se encuentran sólo en células eucariontes animales. Cilios y flagelos Están formados por 9 pares de microtúbulos. Tienen la función de desplazar las células en un medio líquido o movilizar los fluidos sobre la superficie de células fijas  Los flagelos e encuentran en forma individual y largos. Son los responsables de la locomoción en los espermatozoides. Tienen un movimiento ondulatorio. Los flagelos son más largos que los cilios y suelen estar asociados a mitocondrias o fibras.  Los cilios y flagelos presentan un cuerpo basal y un anoxema (de la que depende el movimiento) tal y como se muestra en la figura de la izquierda. Centrosoma Al centrosoma se le conoce como el centro organizador de microtúbulos de la célul eucariota animal. Está formado por dos centriolos colocados perpendicularmente.

Sus funciones están relacionadas con la motilidad celular y con la organización del citoesqueleto. Durante la división celular los centriolos se dirigen a polos opuestos de la célula, organizando el huso mitótico(o acromático). En el periodo de anafase los microtúbulos del áster estiran la célula y contribuyen a la separación de los cromosomas a cromátidas y a la división del citoplasma. Proteínas motoras Existen proteínas que aprovechan la hidrólisis de ATP para generar energía mecánica y desplazar sustancias sobre microtúbulos. Éstas son la dineína, transportador anterógrado, y la kinesina, transportador retrógrado. Dineína Las dineínas son una familia de proteínas motoras que median el transporte intracelular retrogrado sobre los microtúbulos. La dineína es una molécula de estructura similar a la kinesina: consta de dos cadenas pesadas idénticas que conforman dos cabezas globulares y de un número variable de cadenas intermedias y de cadenas ligeras. Se sugiere que la actividad de hidrólisis de ATP, fuente de energía de la célula, se encuentra en las cabezas globulares. La dineína transporta vesículas y orgánulos, por lo que debe interaccionar con sus mem branas, y, para interactuar con ellas, requiere de un complejo proteico, de cuyos elementos cabe destacar la dinactina. Kinesina Las kinesinas o cinesinas son una familia de proteínas motoras que median el transporte intracelular anterógrado sobre los microtúbulos. La mayoría de las kinesinas intervienen en el transporte anterógrado de vesículas, es decir, que implican un movimiento hacia la parte más distal de la célula o la neurita, hacia el extremo (+) de los microtúbulos, sobre los que se desplazan. Por contra, otra familia de proteínas motoras, las dineínas, emplean los mismos raíles pero dirigen las vesículas a la parte más proximal de la célula, por lo que su tranportes es retrógrado. III.

MATERIALES

a)  

Material biológico Lámina de intestino delgado Lámina de espermatozoides de vacuno



Equipos Microsocopio

b)

c)

Reactivos  Aceite de inmersión

IV.

METODOLOGÍA

4.1.- Observación de cilios del Epididimo e Intestino  

 

Observar al microscopio óptico láminas ya preparadas de muestras de intestino y epidídimo coloreado con la técnica de hematoxilina eosina. Reconocer en los cortes transversales del conducto del epidídimo las células cilíndricas, en cuyo polo apical a mayor aumento observará pequeñas prolongaciones correspondientes a los estereocilios. Identificar en los cortes del tubo intestinal las células cilíndricas en cuyos ápices se encuentran cilios del tipo cinocilios. Dibujar, colorear y colocar los nombres de lo observado en los resultados de la práctica.

4.2.- Observación de Flagelos en espermatozoides   

V.

Observar al microscopio óptico láminas ya preparadas de muestras de flagelos en espermatozoide vacuno. Observar a diferentes aumentos del microscopio óptico, la morfología de los espermatozoides y de sus flagelos. Dibujar, colorear y colocar los nombres de lo observado en los resultados de la práctica.

RESULTADOS

5.1.- Dibujar, colorear y describir las láminas observadas al microscopio. a) Cilios

b) Flagelos

VI.

CUESTIONARIO 1. Indicar las funciones del citoesqueleto 2. Mencionar las diferencias de los microtúbulos, filamentos intermedios y filamentos de actina. 3. ¿Cuáles son las diferencias entre cilios y flagelos? 4. ¿A qué se debe el mecanismo de locomoción de cilios y flagelos? 5. ¿Cómo se regula la locomoción ciliar y flagelar?

6. ¿Cuál es la función de la misoina con respecto a la actina? 7. ¿Cómo se produce la contracción muscular? Indicar las funciones del citoesqueleto Las principales funciones del citoesqueleto son: • Proporcionar el medio para el movimiento celular y del movimiento intracelular de organelos y otros componentes del citosol. • Proporcionar el soporte estructural para la membrana plasmática y los orgánulos celulares. • Proporcionar el soporte para las estructuras celulares móviles especializadas, como cilios y flagelos, responsables de la propiedad contráctil de las células en tejidos especializados como el músculo

Mencionar las diferencias de los microtúbulos, filamentos intermedios y filamentos de actina. Diferencias de las estructuras del citoesqueleto Microtúbulos Filamentos Filamentos de actina intermedios Subunidades Heterodímero GTOVarias proteínas Monómeros ATPincorporadas en tubulina αβ globulares Actina un polímero Sitio preferencial Extremo (+) Interno Externo (+) de la (tubulina-β) (barbado) incorporación Polaridad Si No Si Actividad GTP-asa Ninguna ATP-asa enzimática Proteínas Cinesinas, dineinas Ninguna Miosinas motoras Principal grupo MAP Plaquinas Proteínas de unión de proteínas con actina relacionadas Estructura Tubo rígido y hueco Fibras gruesas Filamento helicoidal flexible Dimensiones 25 nm de diámetro 10 nm de diámetro 8 nm de diámetro externo Distribución Todos los Animales Todos los eucariotas

Funciones principales

eucariontes Soporte, transporte intracelular

Soporte estructural

Motilidad, contractilidad.

¿Cuáles son las diferencias entre cilios y flagelos? Diferencias entre cilios y flagelos Cilio Tamaño Prolongaciones cortas Número Elevado número en la célula Movimiento Baten como un látigo

Estructura Interna

Movimiento

Flagelos Largos Pocos en la célula Se mueven con un trazo ondulante (parecido a las serpientes) Formados por 9 parejas de microtúbulos dispuestos alrededor de un eje en el que aparecen otros 2 microtúbulos, conectados con los adyacentes por 2 proteínas llamadas dineína y nexina., La dineína genera el movimiento, la nexina mantiene la estructura en forma cilíndrica. Movimiento de Movimiento de locomoción celular locomoción en protozoos ciliados. Producen movimiento en medio extraceluar para atraer la comida a la célla

¿A qué se debe el mecanismo de locomoción de cilios y flagelos? Cuando los cilios o flagelos se separan artificialmente de las células continúan moviéndose hasta que se les acaban las reservas de ATP. Esto implica que tienen movilidad intrínseca. El movimiento se produce por deslizamientos de unos microtúbulos sobre otros. Las proteínas nexinas y los radios proteicos son los que impiden que el flagelo se desorganice. El movimiento de los microtúbulos está producido por la dineína, un motor molecular, puesto que es donde se produce la hidrólisis de ATP y si se elimina el movimiento cesa, aún en presencia de ATP. La dineína se ancla con su zona globular al microtúbulo B y con la zona motora al microtúbulo A del par vecino. El proceso es similar al que se utiliza para el transporte de orgánulos en el citoplasma celular pero en este caso la carga que transporta es otro microtúbulo. Cuando la dineína se activa produce un

desplazamiento de un par respecto al otro. Para permitir un movimiento eficiente se necesita una coordinación entre las dineína de los dobletes externos de microtúbulos. El control del movimiento parece depender de las concentraciones de calcio y permite a la célula variar el movimiento de estas estructuras. Una cuestión interesante es que no todas las dineínas se pueden activar a la vez sino de manera sincrónica. ¿Cómo se regula la locomoción ciliar y flagelar?  Para seguirlos, alcanzarlos, poner su estoma o "boca celular" en posición, retrocediendo si es necesario, para luego comérselos, es menester controlar la natación. Este control se logra por medios eléctricos. Los valores del campo eléctrico en la membrana exterior del protozoo, de donde emergen los cilios o cilias, "dibujan" los movimientos de la presa cercana. Estos le son revelados por las presiones del agua, que interfieren con las oscilaciones u ondas eléctricas que realizan el control.

¿Cuál es la función de la miosina con respecto a la actina? Los filamentos de actina, generalmente asociados con la miosina, son los responsables de muchos tipos de movimientos celulares. La miosina es el prototipo de motor molecular, una proteína que convierte energía química en forma de ATP en energía mecánica, generando de esta manera fuerza y movimiento. El tipo de movimiento más sorprendente es la contracción muscular, que ha proporcionado el modelo para comprender las interacciones actina-miosina y la actividad motora de las moléculas de miosina. Sin embargo, las interacciones entre la actina y la miosina son las responsables no sólo de la contracción muscular sino también de diversos tipos de movimientos de las células no musculares, incluyendo la división celular, por lo que estas interacciones desempeñan un papel central en la biología celular. Más aun, el citoesqueleto de actina es el responsable del movimiento de arrastre de las células a lo largo de una superficie, que parece que está dirigido directamente por la polimerización de la actina así como por interacciones actinamiosina. Además de la miosina II (miosina "convencional", de dos cabezas), en las células no musculares se encuentran otros tipos de miosinas. A diferencia de la miosina II, estas miosinas «no convencionales" no forman filamentos y por tanto no están implicadas en la contracción. Sin embargo, pueden estar implicadas en otros tipos de movimientos celulares, tales como el transporte de vesículas de membrana y orgánulos a lo largo de los filamentos de actina, la fagocitosis y la extensión de los pseudópodos en las amebas. Las miosinas no convencionales mejor estudiadas son miembros de la familia de la miosina I. Las proteínas miosina 1 contienen un grupo de cabeza globular que actúa como un motor molecular, al igual que en la miosina II. Sin embargo, los miembros de la familia de la

miosina I son moléculas mucho más pequeñas (aproximadamente 110 kDa en las células de mamíferos) que carecen de la cola larga de la miosina II y no forman dímeros. Sus colas pueden no obstante unirse a otras estructuras, como a las vesículas de membrana o a orgánulos. El movimiento de la miosina I a lo largo de un filamento de actina puede entonces transportar la carga que lleve unida. Una función de la miosina I, vista anteriormente, es la formación de los brazos laterales que unen a los filamentos de actina con la membrana plasmática de las microvellosidades intestinales. En estas estructuras, la actividad motora de la miosina I puede mover la membrana plasmática a lo largo de los haces de actina hacia la punta de la microvellosidad. La miosina I podría intervenir también en el transporte de las vesículas y de los orgánulos a lo largo de los filamentos de actina y en el movimiento de la membrana plasmática durante la fagocitosis y la extensión de pseudópodos. Además de las miosinas I y II, al menos otras 12 clases de miosinas no convencionales (III hasta XIV) han sido identificadas. Algunas de estas miosinas no convencionales tienen dos cabezas como la miosina II, mientras que otras presentan una cabeza como la miosina I. Las funciones de la mayor parte de estas miosinas no convencionales no se han determinado, pero se ha demostrado claramente que algunas desempeñan un papel importante en el movimiento de los orgánulos (miosinas V y VI) y en funciones sensoriales tales como la visión (miosina III) y la audición (miosinas VI y VII). ¿Cómo se produce la contracción muscular? Aunque los mecanismos moleculares no están todavía completamente dilucidados, se ha proporcionado un modelo plausible de la actividad de la miosina a partir de estudios in vitro del movimiento de la miosina a lo largo de filamentos de actina (un sistema desarrollado por James Spudich y Michael Sheetz) y a partir de la determinación de la estructura tridimensional de la miosina por Ivan Rayment y sus colaboradores. El ciclo comienza con la miosina (en ausencia de ATP) unida fuertemente a la actina. La unión de ATP disocia el complejo miosina-actina y la hidrólisis del ATP induce un cambio conformacional en la miosina. Este cambio afecta a la región del cuello de la miosina que une las cadenas ligeras, que actúa como un brazo de palanca desplazando la cabeza de miosina aproximadamente 5 nm. Los productos de la hidrólisis (ADP y P) permanecen unidos a la cabeza de miosina, diciéndose que está en posición «ladeada». La cabeza de miosina se vuelve a unir al filamento de actina en una nueva posición, produciéndose la liberación de ADP y Pj y disparando el "golpe de potencia», por el cual la cabeza de miosina retorna a su conformación inicial, deslizando de esa manera los filamentos de actina hacia la línea M del sarcómero. La contracción del músculo esquelético es disparada por impulsos nerviosos que estimulan la liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplásmico - una red especializada de membranas internas, similar al retículo

endoplasmático, que almacena: Asociación de la tropomiosina y la troponinas a los filamentos de actina. (A) La tropomiosina se une longitudinalmente a lo largo de los filamentos de actina, en el músculo estriado, se asocia con un complejo de tres troponinas troponina I (Tn I) troponina C (Tn C) y troponina T (Tn T). En ausencia de Ca2+, el complejo de tropomiosina.troponina bloquea la fijación de la iosina a la actina. La 2+ 31 una elevada concentración de iones Ca2+,_ . La liberación del Ca2+, desde el retículo sarcoplásmico incremento la concentración de Ca2+ en el citosol desde, aproximadamente, 10-7 a 10-5 M. El aumento de la concentración de Ca2+ es la señal para la contracción muscular, interviniendo dos proteínas accesorias unidas a los filamentos de actina: la tropomiosina y la troponina. La tropomiosina es una proteína fibrosa que se une a lo largo del surco de los filamentos de actina. En el músculo estriado, cada molécula de tropomiosina se une a la troponina, la cual es un complejo de tres polipéptidos: troponina C (de unión a Ca2+), troponina I (inhibidora), y troponina T (de unión a la tropomiosina). Cuando la concentración de Ca2+ es baja, el complejo de las troponinas con la tropomiosina bloquea la interacción de la actina y la miosina, por lo que el músculo no se contrae. A altas concentraciones, la unión del Ca2+ a la troponina C altera la disposición del complejo, retirando la inhibición y permitiendo que se produzca la contracción.