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Facultad de Ciencias Naturales e Ingeniería Departamento de Ciencias Básicas Química Organica Pre informe 6 Extracción y verificación de la actividad de las enzimas: succínico deshidrogenasa y citocromo oxidasa y estudio del efecto de algunos inhibidores

Ivonne Pamela Moreno Aguilar

1. INTRODUCCION En esta práctica de laboratorio se va a realizar la extracción y posterior verificación enzimática de enzimas que intervienen en el ciclo de Krebs Y la fosforilacion oxidativa (succínico deshidrogenasa y citocromo oxidasa) y también inhibidores que bloquean dichas enzimas. Ciclo de Krebs : El ciclo de Krebs (conocido también como ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo del ácido cítrico) es un ciclo metabólico de importancia fundamental en todas las células que utilizan oxígeno durante el proceso de respiración celular. En estos organismos aeróbicos, el ciclo de Krebs es el anillo de conjunción de las rutas metabólicas responsables de la degradación y desasimilación de los carbohidratos, las grasas y las proteínas en anhídrido carbónico y agua, con la formación de energía química. El ciclo de Krebs es una ruta metabólica anfibólica, ya que participa tanto en procesos catabólicos como anabólicos. Este ciclo proporciona muchos precursores para la producción de algunos aminoácidos, como por ejemplo el cetoglutarato y el oxalacetato, así como otras moléculas fundamentales para la célula. (Merchealari, 2013)

Ilustración 1 Dentro de las mitocondrias (Merchealari, 2013)

Version simplificada : -El proceso comienza con la oxidación del piruvato, produciendo un acetil-CoA y un CO2. -El acetil-CoA reacciona con una molécula de oxaloacetato (4 carbonos) para formar citrato (6 carbonos), mediante una reacción de condensación. -A través de una serie de reacciones el citrato se convierte en oxaloacetato. El ciclo consume netamente 1 acetil-CoA y produce 2 CO2. También consume 3 NAD+ y 1 FAD, produciendo 3NADH y 3H+ y 1 FADH+. -El resultado de un ciclo es (por cada molécula de acetil-CoA): 1 ATP, 3 NADH, 1 FADH2, 2CO2 -Cada molécula de glucosa produce (vía glucolisis) dos moléculas de piruvato, que a su vez producen dos acetil-CoA, por lo que por cada molécula de glucosa en el ciclo de Krebs se produce: 2 ATP, 6 NADH, 2 FADH2, 4 CO2

Ilustración 2 ciclo de Krebs (Montenegro , 2014)

Enzimas que intervienen en la ruta: Succinato deshidrogenasa: Ruta: Ciclo de Krebs Entrada

EC 1.3.5.1

Enzyme

Nombre

succinato deshidrogenasa; succinato deshidrogenasa (quinona); succinato deshidrogenasa (ubiquinona); succínico deshidrogenasa; complejo II (ambigua); complejo succinato deshidrogenasa; SDH; succinato: ubiquinona oxidorreductasa

Clase

Oxidorreductasas; actúan en el grupo CH-CH de los donantes; Con una quinona o compuesto relacionado como aceptor

nombre_sis succinato: quinona oxidoreductasa t

La reacción succinato + una quinona = fumarato + un quinol (IUBMB) La reacción (KEGG)

sustrato

succinato; quinona

Producto

fumarato ; quinol

Comentario Un complejo flavoproteına (FAD) que contiene centros hierro-azufre. La enzima se encuentra en la membrana mitocondrial interna en eucariotas y la membrana plasmática de muchas bacterias y arqueas aeróbicos o facultativos. Cataliza la oxidación de succinato en el ciclo del ácido cítrico y transfiere los electrones a quinonas en la membrana, lo que constituye una parte de la cadena respiratoria aeróbica (conocido como complejo II).

Tomado de DBGET ENZYME Citocromo oxidasa: Ruta: Fosforilacion oxidativa Entrada

EC 1.9.3.1

Enzyme

Nombre

oxidasa del citocromo-c; citocromo oxidasa; citocromo a3; citocromo Aa3; de Warburg respiratoria enzima; indofenol oxidasa; indophenolase; complejo IV (transporte electrónico mitocondrial); ferrocitocromo c oxidasa; NADH citocromo c oxidasa

Clase

Oxidorreductasas; Actuando por un grupo hemo de los donantes; con el oxígeno como aceptor

nombre_si ferrocitocromo-c: oxígeno oxidorreductasa st La reacción (IUBMB)

4 ferrocitocromo C + O2 + 4 H + = 4 ferricitocromo c + 2 H2O

La reacción (KEGG)

sustrato

ferrocitocromo c ; O2 ; H+

Producto

ferricitocromo c; H2O

Comentari Un citocromo de la que contiene cobre un tipo. La reducción de O2 a agua está o acompañado por la extrusión de cuatro protones del compartimiento intramitocondrial. Varias bacterias parecen contener oxidasas análogas.

Tomado de DBGET ENZYME 2. CONSULTA 1. La ecuación de las reacciones que catalizan las enzimas a utilizar en la práctica. Succinato deshidrogenasa succinato + una quinona = fumarato + un quinol Citocromo oxidasa 4 ferrocitocromo C + O2 + 4 H + = 4 ferricitocromo c + 2 H2O 2.Para los órganos a utilizar mencione brevemente si su metabolismo es más fermentativo (anaerobio) o aerobio, tenga en cuenta el color característico de los citocromos que hacen parte de la fosforilación oxidativa. Tejido muscular: La contracción muscular requiere grandes cantidades de energía. La energía que impulsa la contracción muscular proviene del ATP. La velocidad de la hidrólisis del ATP aumenta más de 100 veces en un músculo esquelético que se somete a la contracción máxima en comparación con ese mismo músculo en reposo. Se estima que el músculo esquelético humano promedio tiene suficiente ATP disponible para impulsar una explosión de contracción vigorosa durante dos a cinco segundos. Las células musculares contienen una reserva de fosfato de creatina (CrP), uno de los compuestos con mayor potencial de transferencia de fosfato que el ATP, por lo que puede usarse para generar ATP en la reacción siguiente:

CrP + ADP → Cr + ATP Los músculos esqueléticos humanos están formados de dos tipos generales de fibras, las fibras rápidas se ven casi carentes de mitocondrias, lo cual indica que estas células son incapaces de producir mucho ATP mediante la respiración aeróbica. Por otro lado, las fibras lentas contienen grandes cantidades de mitocondrias. Estos dos tipos de fibras de músculo esquelético son adecuadas para distintos tipos de actividades. Las fibras rápidas producen casi todo su ATP en forma anaeróbica mediante la glucólisis. Aunque la glucólisis sólo produce cerca de 5% de ATP por cada molécula de glucosa oxidada en comparación con la respiración aeróbica, por consiguiente, la velocidad de producción anaeróbica de ATP es mayor que la alcanzada por la respiración aeróbica. (Fanith, 2012) Tejido hepático: El hígado es la central metabólica del cuerpo, sus funciones son mantener los niveles apropiados de nutrientes en la sangre para ser utilizados por el cerebro, músculos y otros tejidos periféricos. Su misión es tan importante, que todos los nutrientes absorbidos por el intestino excepto los ácidos grasos son vertidos directamente a la vena porta la cual drena en este órgano. Los hepatocitos, a diferencia de las células musculares y adipocitos, son permeables a la glucosa, lo cual facilita sus tareas y por tanto la insulina no tiene efecto en la incorporación de glucosa en este órgano. Cuando la concentración de glucosa en sangre es normal (por debajo de la Km de la hexocinasa), la velocidad de fosforilación de la glucosa en hígado es más o menos proporcional a la concentración de glucosa en sangre. Además de glucosa, la dieta contiene otros azúcares (fructosa, galactosa y manosa), las cuales son también convertidas a G6P en este órgano. En el hígado, el destino de la G6P puede ser diferente, según los requerimientos del cuerpo, en general, la G6P puede: Convertirse en glucosa, almacenarse en forma de glucógeno,transformarse en Ac-CoA y degradarse por la vía de las pentosas. En el hígado también se lleva a cabo el ciclo de la urea, en el cual el cuerpo desecha el excedente de nitrógeno que viene de los aminoácidos y el lactato, producto del metabolismo anaerobio de la glucosa en músculo, es utilizado en el hígado para la gluconeogénesis, lipogénesis y fosforilación oxidativa. (Vasquez, 2003) Tejido cardiaco: La actividad cardiaca requiere un elevado y continuo aporte de energía, por lo cual, a diferencia del músculo esquelé- tico, presenta permanentemente un metabolismo aeróbico; esto explica que las mitocondrias representen aproximadamente la mitad del volumen celular cardiaco .En la matriz mitocondrial ocurre la ruta por excelencia aeróbica del metabolismo energético, es decir el ciclo de Krebs o ciclo del ácido cítrico, proceso que es alimentado por acetil CoA. En cada vuelta del ciclo desaparece una molécula de acetilo (CH3 -CO-) y aparecen dos moléculas de bióxido de carbono al tiempo que en cinco reacciones se generan coproductos de alto potencial energético (figura 1). En tres de ellas el cofactor enzimático NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) se reduce (capta hidrógeno); en una se reduce el cofactor FAD (flavina

adenina dinucleótido), y en una más se forma GTP a partir de GDP y fosfato inorgá- nico. Los cofactores reducidos NADH y FADH2 transfieren su hidrógeno a la cadena respiratoria, localizada en la membrana mitocondrial interna, con lo cual se activa un mecanismo complejo que concluye con la síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico con la participación de la ATP sintasa . (Mendoza Medellín & Torres, 2002) 3 .tabla con los valores de potencial redox para todos los componentes de la cadena respiratoria, así como del azul de metileno y la p-fenilendiamina, compuesto que se usarán para evidenciar la actividad de las enzimas citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa. Cadena respiratoria:

Ilustración 3 potencial redox cadena respiratoria (Vasquez R. , 2002)

4- De acuerdo con el fundamento teórico de la guía y la bibliografía describa brevemente los cambios de color en el azul de metileno y la p-fenilendiamina cuando: a- La citocromo oxidasa y la succínico deshidrogenasa se encuentran sin inhibidores. En ninguno de los casos existirá prueba cualitativa dado que no hay forma de reconocer las enzimas ya que ambas siguen el curso de su reacción correspondiente y no se generara acumulación de las mismas. b- La citocromo oxidasa y la succínico deshidrogenasa se encuentran con los inhibidores (cianuro, azida, malonato u oxalato). La presencia de inhibidores bloqueara ambas enzimas y no seguirán el curso de su reacción por tanto existirá acumulación de las mismas y se podrá realizar su identificación con las pruebas correspondientes: Citocromo oxidasa con p-fenilediamina: Los colorantes p-fenilediamina son aminas aromáticas primarias derivados diamino del benceno, la citocromo oxidasa no reacciona directamente con el reactivo , pero oxida el citocromo c , el que a su vez oxida el reactivo. (McFaddin, 2003) El reactivo pasa de azul oscuro a granate al ser oxidado, y se vuelve transparente al ser reducido.

Ilustración 4 prueba p-fenilediamina (McFaddin, 2003)

Succínico deshidrogenasa con azul de metileno: La enzima succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa del ácido succínico es una Oxidorreductasa que cataliza la oxidación del succinato para formar fumarato siendo la coenzima el FAD. Esta enzima se localiza en eucariontes en la membrana mitocondrial interna. El H2 cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el azul de metileno que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa. (Alvarado, Davila, Ramos, Garcia, & Flores, 2008)

Ilustración 5 reacción azul de metileno (Alvarado, Davila, Ramos, Garcia, & Flores, 2008)

Cuando éste indicador de oxido – reducción se encuentra en contacto con el O 2 del aire se reoxida tomando de nuevo la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno. Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire, se reoxida tomando la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno, por esta razón el sistema se aísla mediante una capa de aceite mineral.

3. FICHAS TECNICAS NOMBRE FORMULA

pFENILENDIA MINA

C6H8N12

AZUL DE C16H18ClN3 METILENO S.xH2O

Buffer de fosfatos

PO4-3

ASPECTO

Cristales, entre blancos y ligeramente rojos, vira a oscuro por exposición al aire.

Sólido verde oscuro con lustre bronceado

Claro, líquido coloreado Amarillo

PELIGROSIDAD

Inhalación: tos, vértigo, dolor de cabeza, dificultad respiratoria. Piel: irritaciones cutáneas. Ojos: enrojecimiento, visión borrosa, pérdida de visión incluso permanente. Ingestión: dolor abdominal, labios o uñas azulados, piel azulada, vómitos, debilidad, convulsiones, coma, muerte

Inhalación: irritaciones vías respiratorias Piel: irritaciones cutáneas. Ojos: irritaciones ocular grave. Ingestión: Nocivo

Contacto visual: puede Causar Irritación leve. Inhalación: no es peligroso por inhalación. Contacto de la piel: puede Causar Irritación leve. Ingestión: náusea, Vómito, diarrea y Puede Causar calambres.

PRIMEROS AUXILIOS -Contacto con los ojos: enjuagar inmediatamente con abundante agua, durante 15 minutos. Requiere atención médica inmediata. -Contacto con la piel: quítese inmediatamente la ropa y zapatos contaminados. Lavar inmediatamente con abundante agua durante al menos 15 minutos. -Ingestión: enjuáguese la boca. No provocar el vómito. Inhalación Sacar al aire libre. Si la respiración es difícil, darle oxígeno. ¡CONSULTAR AL MEDICO EN TODOS LOS CASOS! Proporcionar a la victima En caso de inhalación: aire limpio, reposo, respiración artificial si estuviera indicado y someter a atención médica. En caso de contacto de la piel: quitar las ropas contaminadas, aclarar la piel con agua abundante o ducharse. En caso de contacto de los ojos: enjuagar con agua abundante durante varios minutos (quitar las lentes de contacto si puede hacerse con facilidad), después consultar a un médico. En caso de ingestión: enjuagar la boca y someter a atención médica. Contacto visual: lave inmediatamente con grandes cantidades de agua por lo menos 15 minutos. Llame a médico si presenta irritación. Inhalación: coloque en un lugar con ventilación. Si la respiración es difícil coloque el oxígeno. Contacto de la piel: limpie con agua lo menos 15 minutos. Llame al médico si presenta

irritación. Ingestión: tomar agua o leche. Llame al médico en caso de ser necesario.

Sodio Succinato anhidro

4

Solido blanco incoloro

Inhalación: irritación en las vías tractorespiratorias Piel: irritación y enrojecimiento de la piel Ojos: irritación y ardor en los ojos, puede causar conjuntivitis. Ingestión: es muy peligroso puede ser mortal si son grandes cantidades.

KCN

Cristales higroscópic os o sólido en diversas formas, de olor característic o. Inodoro seco

Inhalación: dolor de garganta. Dolor de cabeza. Confusión mental. Debilidad. Jadeo. Convulsiones. Pérdida del conocimiento Piel: ¡PUEDE ABSORBERSE! enrojecimiento. dolor. Ojos: enrojecimiento. dolor. Ingestión: sensación de quemazón. Náuseas. Vómitos. Diarrea

C4H4Na2O

Cianuro de potasio

Aire limpio, reposo. Ojos: enjuagar con agua abundante durante varios minutos (quitar las lentes de contacto si puede hacerse con facilidad). Reposo y someter a atención médica. Ingestion: de a beber inmediatamente agua, si las molestias persisten Solicite atención medica Inhalación: aire limpio, reposo. No realizar respiración boca a boca. Administrar oxígeno por personal especializado. Proporcionar asistencia médica. Piel: quitar las ropas contaminadas. Aclarar la piel con agua abundante o ducharse. Proporcionar asistencia médica. Ojos: enjuagar con agua abundante durante varios minutos (quitar las lentes de contacto si puede hacerse con facilidad), después proporcionar asistencia médica. Ingestión: provocar el vómito (¡UNICAMENTE EN PERSONAS CONSCIENTES!). Úsense guantes de protección para inducir vómito. No realizar respiración boca a boca. Administrar oxígeno por personal especializado. Proporcionar asistencia médica. Aire limpio, reposo.

Oxalato de Sodio

(COONa)2

Cristales blancos

Inhalación: irritación en las vías tractorespiratorias Piel: irritación y enrojecimiento de la piel Ojos: irritación y ardor en los ojos, puede causar conjuntivitis. Ingestión: es muy peligroso puede ser mortal si son grandes cantidades.

Ojos: enjuagar con agua abundante durante varios minutos (quitar las lentes de contacto si puede hacerse con facilidad). Reposo y someter a atención médica. Ingestion: de a beber inmediatamente agua, si las molestias persisten Solicite atención medica

Azida sódica

NaN3

Cristales incoloros de forma hexagonal, inodoros.

Inhalación: tos, dolor de cabeza, congestión nasal, visión borrosa, jadeo, pérdida de conocimiento. Enlentecimiento de la frecuencia cardíaca, descenso de la tensión arterial. Piel: enrojecimiento, ampollas. Ojos: enrojecimiento, dolor. Ingestión: dolor abdominal, náusea, dolor de cabeza, sudoración, pérdida de conocimiento.

Aire limpio, reposo. Ojos: enjuagar con agua abundante durante varios minutos (quitar las lentes de contacto si puede hacerse con facilidad). Reposo y someter a atención médica. Ingestion: de a beber inmediatamente agua, si las molestias persisten Solicite atención medica

*Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F), extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N). Pictogramas SGA

4. PROCEDIMIENTO Extracción y preparación de las enzimas y coenzimas. Procedimiento para el monitor: pesar una muestra de aproximadamente 6 g de tejido libre de sangre y colocarla en un mortero con arena lavada, enfriada previamente en un baño de hielo. Proceder a macerar cuidadosamente hasta formar una pasta suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5 mL) de buffer fosfato pH 7,4, hasta completar un volumen de aproximadamente 18 mL. Transferir la mezcla a un erlenmeyer de 150 mL y mantenerlo en un baño con hielo durante 15 minutos, mezclando ocasionalmente. Pasar la muestra a tubos de centrífuga y centrifugar a 1500 rpm por 7 minutos. Transferir el sobrenadante a otro erlenmeyer de 150 mL y marcarlo como extracto enzimático; mantenerlo en baño de hielo hasta su uso posterior a. Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa: Resultado esperado: Aquellos tubos que contengan la presencia de aceptores fuertes inhibidores de dicha enzima, son aquellos que reaccionaran con la p-fenilendiamina para su reconocimiento formando pigmentos oscuros en las muestras .En este caso serán los tubos que contengan Azida de sodio y Cianuro de potasio que corresponden a los tubos 2 y 4. Diagrama:

Preparar tubos según tabla

Incubar a 37°C POR 10 min Sin retirarlos del baño

Extracto enzimático y fenilendiamina

Mezclar bien Este momento corresponde al tiempo cero

Observar y registrar el tiempo en que aparece el complejo coloreado

También el color final y la intensidad

del color. Tabla 1. Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa Tubos Blanco

1

2

3

4

Reactivos (mL) Buffer fosfatos pH 7,4

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

Malonato de sodio

0,0

0,0

0,0

1,0

0,0

Cianuro de potasio

0,0

0,0

1,0

0,0

0,0

Azida de sodio

0,0

0,0

0,0

0,0

1,0

Agua destilada

2,0

1,0

0,0

0,0

0,0

Extracto enzimático

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

p-fenililendiamina

0,0

1,0

1,0

1,0

1,0

b. Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa Resultado esperado: Aquellos tubos que contengan inhibidores de dicha enzima tales como malonato, oxalacetato y oxalato son aquellos que van a generar acumulación de succinato por lo cual el azul de metileno actuara para su reconocimiento produciendo una coloración azul.Esto ocurrirá en los tubos

Preparar tubos según tabla

Incubar a 37°c por 10 min Sin retirarlos del baño

Extracto enzimático

Mezclar bien Acetite mineral

Tiempo cero (momento en que colocó el extracto enzimático)

Observar y registrar el tiempo en que aparece el complejo coloreado

También el color final y la intensidad

del color. Tabla 2. Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa

Tubos Reactivos mL Buffer fosfato pH 7.4 Succinato de sodio 1% Azul de metileno Malonato de sodio 1%. Oxalato de sodio Extracto enzimático Aceite mineral

Blanco

1

2

3

4

5

3,0 0,0 0.5 0,0 0,0 1,0 1.0

2,5 1,0 0.5 0,0 0,0 0,5 1.0

2,0 1,0 0.5 0,0 0,0 1,0 1.0

1,5 1,0 0.5 0,0 0,0 1,5 1.0

1,0 1,0 0.5 1,0 0,0 1,0 1.0

1,0 1,0 0,5 0,0 1,0 1,0 1,0

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