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PRACTICA N° 03: ESTUDIO DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS: SEGUIMIENTO DEL CRECIMIENTO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE I.

Objetivos  Determinar la curva de crecimiento en microorganismos como levaduras cultivados en aerobiosis utilizando diferentes fuentes de carbono.  Determinar la velocidad de fermentación utilizando un medio definido con diferentes fuentes de carbono.  Comparar las tasas de crecimiento específico durante la fermentación de Saccharomyces cerevisiae con diferentes fuentes de carbono.  Controlar la fermentación por producción de CO2 y decrecimiento en peso del medio de cultivo.

II.

Marco teórico

2.1. Metabolismo de azúcares por levaduras Bajo condiciones de crecimiento estrictamente anaeróbicas, la fosforilación a nivel del substrato en la glucólisis es la única fuente de ATP en Saccharomyces cerevisiae y posibilita un rendimiento neto de 2 ATP por cada molécula de glucosa convertida en dos moléculas de piruvato. La disimilación de glucosa a piruvato vía la glucólisis está unida a la reducción de NAD+ en la reacción catalizada por la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa. Un balance redox cerrado en disimilación es logrado por descarboxilación de piruvato a acetaldehído, el cuál (NAD+) subsecuentemente actúa como un aceptor de electrones para la reoxidación de NADH2.1 El NADH2 y el NADPH tienen diferentes funciones en la red metabólica de Saccharomyces cerevisiae. El NADPH es preferentemente usado en vías asimilatorias. La glucólisis juega un rol esencial en la disimilación de azúcar, pero también genera bloques constituyentes para la biosíntesis. Además, aunque muchas reacciones biosintéticas usan NADPH como un reductor, algunas reducciones unidas a NADH ocurren en la conversión de metabolitos centrales (piruvato, oxalacetato, acetil CoA) a monómeros celulares, por ejemplo en la biosíntesis de aminoácidos. Durante el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae sobre azúcar, la preferencia del NADH en reducciones disimilatorias (en la reducción de acetaldehído a etanol y la reducción del pool de quinona de la cadena respiratoria) es muy fuerte. En Saccharomyces cerevisiae, el mantenimiento de las condiciones de cultivo aeróbico no es suficiente para lograr metabolismo respiratorio de azúcar. Incluso cultivos totalmente aeróbicos exhiben un metabolismo mixto respiro-fermentativo, a menos que ellos sean desarrollados con un suplemento limitado de azúcar a tasas bajas de crecimiento específico.2, 3 Este fenómeno de fermentación aeróbica (frecuentemente referido como efecto de la “glucosa” o “Crabtree”) es parcialmente

debido a la represión de la síntesis de enzimas respiratorias por exceso de glucosa.4, 5 Durante el crecimiento respiratorio sobre azúcares, la reoxidación del NADH2 formado en la glucólisis puede ocurrir vía respiración mitocondrial, de esta manera rinde ATP adicional vía fosforilación oxidativa. Además por otra parte, la reoxidación respiratoria de NADH2 glucolítico implica que el piruvato no tiene que ser convertido en acetaldehído (aceptor de electrones), pero puede ser posteriormente oxidado. La oxidación de piruvato a acetil coenzima-A, ocurre predominantemente vía el complejo mitocondrial piruvato-deshidrogenasa, y subsecuentemente el acetil-CoA es oxidado a CO2 y H2O por las enzimas del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA).6 Los análisis cuantitativos de culturas respiratorias, han concluido que la eficiencia in vivo de este proceso en Saccharomyces cerevisiae es menor que en muchos otros microorganismos, esta baja estequiometría de fosforilación oxidativa está relacionado con la ausencia de un protón de translocación NADH deshidrogenasa en Saccharomyces cerevisiae, la disimilación respiratoria completa de glucosa rinde aproximadamente 16 ATP por molécula de glucosa (cuatro ATP desde la fosforilación a nivel del substrato y cerca de 12 a partir de la fosforilación oxidativa). Gay-Lussac fué el primero en mostrar que la fermentación de la glucosa rinde aproximadamente pesos iguales de etanol y CO2 (45 partes de glucosa rinden 23 partes de alcohol y 22 partes de CO2). Pasteur encontró que 100 partes de sucrosa rinden 105.4 partes de azúcar invertida, el cual fué fermentada a 51.1 partes de etanol, 49.4 partes de CO2, 3.2 partes de glicerol y 1.7 partes de ácido succínico. El rendimiento de etanol en fermentaciones de vinos no alcanza el valor teórico, el cual debe ser 51.1% por peso basado en glucosa fermentada. Este rendimiento se debe a la formación de sub-productos durante la fermentación alcohólica y a la asimilación de azúcar por la levadura, además de esto el rendimiento es afectado por diversas variables incluyendo la temperatura, pH, cantidad de inóculo y presencia ó ausencia de O2, en la práctica 47.0 – 47.5 gramos de etanol son usualmente obtenidos por cada 100 gramos de azúcar fermentado. III.

Culturas, reactivos y materiales Levadura Saccharomyces cerevisiae Glucosa, sucrosa Extracto de levadura KH2PO4 MgSO4.7H2O (NH4)2SO4 Agua destilada HCl al 10% Matraces Erlenmeyer de 1L Matraces Erlenmeyer de 250ml

10 g

Bagetas

02

20g c/u 5.0 g/L 4 g/L 2 g/L 5 g/L 5L 50ml 02 06

Pinzas Chapitas Espectrofotómetro Balanza analítica Potenciómetro Algodón Cinta mazkin Rotulador Papel aluminio

01 30 01 01 01 01 rollo 01 01 01 rollo

Pipetas de 10 ml Vasos de precipitación 200ml Espátulas Pizeta Pipetas 5ml, 10ml IV.

02 de 04

Tijera Pabilo

01 01 rollo

02 01 02 c/u

Metodología

Preparación de inóculo: Preparar 100 ml de una solución que contenga: Glucosa ó sacarosa 2 g, extracto de levadura 0.1 g, KH2PO4 0.5 g, MgSO4.7H2O 0.04 g, ajustar el pH a 3.8. Luego de esterilizarlo a 121 ºC por 20 minutos a 15 libras/pulg2, inocular asépticamente con la levadura Saccharomyces cerevisiae usando una asa de siembra y cultivar por 24 horas en agitación a 28ºC. Medio de fermentación: Preparar 250 ml de una solución que contenga: Glucosa ó sacarosa 5 g, extracto de levadura 0.25 g, (NH4)2SO4 0.5 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4.7H2O 0.1 g.

V.

Procedimiento En cada uno de 3 matraces Erlenmeyer de 400 ml se adicionan 250 ml de medio de fermentación de composición citada anteriormente, el pH se ajusta a 3.8 con HCl al 10%. Luego se esteriliza a 121 ºC por 20 minutos a 15 libras/pulg2, seguidamente se deja enfriar hasta alcanzar los 28 ºC (temperatura de cultivo con Saccharomyces ncerevisiae). Luego asépticamente se inocula con el 5% del inóculo cultivado anteriormente. El inóculo a utilizar debe centrifugarse previamente a 3 000 rpm x 10min., y enjuagado con agua destilada antes de inocular al medio de fermentación.

Tratamiento del inóculo:

Agitación

24 horas

150rpm, 24h, 28ºC 100 ml de medio estéril glucosa ó sacarosa

Inocular con levadura

Pipetear 5% del volumen de fermentación

Centrifugaci ón Inoculo enjuagado y centrifugado

Centrifugaci ón

Enjuagar con H2Od

3000 rpm x 10min

Proceso de cultivo: 250 ml de medio de cultivo estéril – glucosa ó sucrosa DO

Inóculo tratado

μglucosa ó sacarosa

Espectrofotometría Tiempo (h) mg biomasa seca/ml Agitación 150 rpm

μglucosa ó sacarosa

Inóculo tratado

Tiempo (h) 28ºC, tiempo: a criterio

Medición: Biomasa total (biomasa seca/L) Etanol: picnometría

Agitación 150 rpm

Inóculo tratado 28ºC, tiempo: a criterio

Anaerobiosis

VI.

Mediciones:

Medición: Biomasa total (biomasa seca/L) Etanol: picnometría Control de la fermentación: Pesado

Para determinar la curva de crecimiento en el cultivo aerobio se realizará por dos métodos indirectos: 1º. Determinación del crecimiento por gravimetría: Con una pipeta se extrae asépticamente 2 – 3 ml de medio cada 4 horas, se centrifuga y las células se vierten en una placa metálica previamente tarada. Seguidamente la biomasa centrifugada se coloca en la estufa para secarlo durante 1hora a 100 ºC. Con los datos obtenidos: peso seco de las células y el intervalo de tiempo en el que se tomo la muestra se construye una gráfica tiempo – peso seco de biomasa (mg de biomasa seca/ml). Luego se determinará la tasa de crecimiento específico al inicio de la fase logarítmica con la siguiente formula: Ln X1 – Ln Xo μ = ---------------------t1 – to 2º. Determinación del crecimiento por densidad óptica: Se tomará muestras del medio de fermentación (2ml aprox.) cada 4 horas para medir la densidad óptica del medio a 620nm. Con estos datos se construye una curva de crecimiento de la levadura ploteando densidad óptica y tiempo de toma de muestras.

Para controlar el tiempo de fermentación (en anaerobiosis), se toma el peso inicial del medio de cultivo correspondiente a 250ml (no olvidar descontar el peso del matraz y el tapón) y cada 4 horas se vuelve a pesar el matraz para determinar la velocidad de fermentación, se anota el intervalo en que se toma cada medida y el peso neto del medio de cultivo en ese instante, y se construye una grafica tiempo – peso. Se determinará el etanol producido al final de la fermentación por picnometría, con los datos obtenidos se calculará la eficiencia de cada fermentación

VII.

Cuestionario Cuál es la importancia de controlar el desprendimiento de CO2 en una fermentación? Cómo esta caracterizada la fase exponencial de crecimiento microbiano? Qué es la fase lag y que factores influye en su duración? Qué rendimientos en etanol ha encontrado utilizando diferentes azúcares? Realice una discusión respecto a los valores encontrados de producción de etanol y biomasa bajo condiciones aerobias y anaerobias

VIII.

Referencia bibliográfica

 Bisson, L. F. Metabolismo de azúcares por levaduras, en la microbiología y biotecnología del vino. Chur, Suiza: Ed. Harwood Academic Publishers, 1993, p. 55-75.  De Deken, R. H. El efecto Crabtree: Un sistema regulatorio en levaduras., 1966. Revista: Gen. Microbiol. Vol. 44, p. 149-156.  Estela, W. D. Evaluación del comportamiento fisiológico de levaduras Saccharomyces y no-Saccharomyces bajo diferentes condiciones de crecimiento. Reporte anual, VSCHT, Praga – República Checa, 2001.