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• Rudy Fukuda

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Universidad Alas Peruanas

IX CICLO

Elaborado por: Pichilingue Cruz Milagros Reyes Rojas Yuriko Gutiérrez Ambrosio Dasly Romero Solís Pedro Meneses Fukuda Rudy

INTRODUCCIÓN Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos presentes en muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas más comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, así como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintéticos sólidos o líquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimación por el método del Número Más Probable (NMP), la cual emplearemos en esta practica. El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este método es aplicable para estimar el número de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Dentro de los organismos patógenos se encuentran los coliformes que es un grupo que comprende todos los bacilos gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 horas a 35 ºC. El grupo coliforme está formado por los siguientes géneros: 1. Escherichia. 2. Klebsiella. 3. Enterobacter. 4. Citrobacter

OBJETIVO • • •

MUESTRAS

Familiarizarse con los métodos NMP. Detectar bacterias coliformes totales . Detectar si la muestra traída es apta para el consumo humano.

MATERIALES Agua Destilada Tubos de ensayo tapa rosca Pipetas de 1ml Probetas Incubadora Asa de siembra Gradilla Mecheros Espátulas campana Durham

MEDIO DE CULTIVO •

Caldo bilis verde brillante

Campana Durham

Caldo bilis verde brillante

• • • • • • • • • •

•

Leche fresca (sin refrigerar )

Cultivo Usados en la practica Caldo bilis verde brillante

CALDO BILIS VERDE BRILLANTE AL 2%

FORMULA

Este medio está recomendado para el recuento de coliformes totales, por la técnica del número más probable. Formula (gramos por litro)

Bilis de buey desidratada ………………20.0 Lactosa ………………………………………….10.0 Peptona ………………………………………..10.0 Verde brillante……………………………….0.0133 ph final: …………………………………………7.2 +- 0.2

En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas.

TOMA DE MUESTRA TOMA DE MUESTRA DE LA LECHE: Añadir la muestra directamente en un frasco con tapa, se debe analizar al instante o en un periodo de tiempo que no exceda la media hora ya que puede contaminarse con otras sustancias.(no refrigerar) EN ESTE MÉTODO SE PUEDE UTILIZAR DIFERENTES MUESTRAS COMO: TOMA DE AGUA ESTANCADA: Introducir el frasco destapado con la boca hacia abajo sosteniéndolo por la base. Girar el frasco e impulsarlo suavemente hacia arriba de tal manera que al salir a la superficie se haya llenado ¾ partes de su volumen. Tapar el frasco. AGUA EMBOTELLADA: Tomar varios envases de agua , de preferencia poco después de haber sido embotellada.

AGUA CORRIENTE: Se efectuara la maniobra ejecutando el desplazamiento del frasco en dirección opuesta a la corriente. TOMAR DE MUESTRA DE LLAVES, FILTRO, ETC. : Limpiar perfectamente la salida del agua , hasta que no haya suciedad u oxido . Abrir la llave y dejar correr el agua durante un minuto .Disminuir la velocidad de salida y llenar el frasco 2/3 partes de su capacidad. Al destapar el frasco y durante toda la practica se debe evitar contaminar la boca del frasco ni el interior del tapón . Marcar el frasco con los datos de identificación fecha y hora de muestreo y se debe conservar a una temperatura de 4 a 10 º C

MÉTODO En esta practica empleamos el método del numero mas probable (NMP). La cual tiene una base estadística para expresar cuantitativamente la densidad de microorganismos en una muestra.

La prueba consiste en inocular unas series de tubos que contienen un medio de cultivo que permitía manifestar un microorganismo o grupo de ellos en particular. Esta estimación estadística se basa en el hecho de que cuanto mayor sea el número de bacterias en una muestra mayor será la disolución necesaria para reducir la densidad hasta el punto en cual no se desarrolle ninguna bacteria en los tubos de una serie de disoluciones. El método es el mas útil cuando se utiliza el crecimiento en un medio liquido diferencial para identificar el microorganismos (como el caso de las bacterias coliformes, que fermentan selectivamente la lactosa con producción de acido) El Número mas Probable, es solo un informe de que existe un 95% de probabilidades de que la población bacteriana disminuya dentro de ciertos limites y de que numero mas probable es el numero estadísticamente más probable.

FUNDAMENTO La producción de leche se hace con la expresa intención de proporcionar un alimento de alto valor nutritivo para el ser humano. Cada día se reconocen más las cualidades de este producto en la alimentación de niños, adultos y personas de la tercera edad. Pero para que la leche cumpla con esas expectativas nutricionales debe reunir una serie de requisitos que definen su calidad: su composición físicoquímica, cualidades organolépticas y número de microorganismos presentes. Después que la leche sale de la vaca ya no se puede cambiar su composición fisicoquímica a no ser en algunos ajustes permitidos para mejorar su aspecto (Homogenizar), disminuir algunos de sus componentes para hacerla más atractiva para algún consumidor especial (deslactosar, desgrasar), todo ello mediante tecnologías permitidas y declaradas. Pero en la cadena de producción de este preciado producto desde la finca lechera hasta la planta procesadora es necesario cuidar todos aquellos factores que si no se manejan adecuadamente van a provocar deterioro del mismo con pérdidas para el productor y disminución de volúmenes hábiles para la industria. La leche por ser un producto altamente perecedero debe ser manejado correctamente desde su obtención. La planta procesadora es responsable de la calidad desde la recepción en las receptoras o centros de acopio hasta que el producto llegue al consumidor final. En este informe emplearemos el método del numero mas probable (NMP), para detectar organismos patógenos llamados coliformes totales, en muestras de leche fresca, la cual son obtenidas directamente de establos ganaderos que abastecen a empresas dedicadas en la producción de lácteos, para el consumo humano.

PROCEDIMIENTO Nota: Cada medio de cultivo, trae en su envase, las cantidades determinas, para poder prepararlas en el laboratorio.

Suspender 40 g del cultivo en 1 litro de agua destilada, en un Erlenmeyer de 1,5 L de capacidad, agitando frecuentemente para disolverlo por completo

1

agregamos 10 ml del medio de cultivo a 6 tubos de ensayos con su respectiva campana Durham.

2

Bacterias que crecen en este medio

Escherichia coli Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante 15minutos 3

Dejamos reposar y procedemos a realizar la inoculación

4

Crecimiento

Gas

Muy buena

+

Enterobacter aerogenes Escherichia coli / Muy buenaBuena

+

Staphylococcus aureus

Inhibido

-

Enterococcus faecalis

Inhibido

5

DILUCIÓN

Volumen de la muestra problema, para cada conjunto de 2 tubos

10⁻1

Dilución

A B

Tubos con 10mL de medio nutritivo (conjunto de 2 tubos)

1ml

Como se ve en la imagen dividimos tres conjuntos de la cual cada conjunto esta conformado por 2 tubos de ensayo, previamente preparada . • •

10⁻²

1ml

10⁻³

1ml

•

En cada tubo del primer conjunto recibe 10-1 del la muestra problema + agua destilada En cada tubo del segundo conjunto recibe 1 ml de la dilución anterior + 9 ml de agua destilada. Y en cada tubo del tercer conjunto recibe 1ml de la dilución anterior + 9 ml agua destilada y procedemos a realizar la inoculación Incubar las tres series a una temperatura entre 30 y 37ºC haciendo lecturas a las 24 y 48h.

En el primer conjunto había suficientes bacterias en la muestra de modo que los 2 tubos demostraron crecimiento bacteriano y se registraron como positivo. El segundo conjunto, en el que los tubos recibieron la decima parte de la muestra problema, los 2 tubos fueron positivos. El tercer conjunto, en el que los tubos recibieron la centésima parte de la muestra problema, los 2 resulto positivo.

TABLA NÚMERO MÁS PROBABLE PARA COMBINACIONES DE 2 TUBOS RESULTADOS DE LAS DILUCIONES 10-1 (A)

10-2(B)

10-2 (A)

10-2(B)

10-3(A)

10-3(B)

+

+

+

+

+

+

2

2

2

La muestra traída por nuestro grupo fue de leche cruda. Al hacer un comparativo de nuestros resultados vemos, por ejemplo, que “La Norma para Lácteos” da como valores límites los sgtes. valores:

Interpretación de los Resultados Por lo tanto, se puede decir que el resultado del número más probable de la serie de : 2–2–2, ubicadas en la tabla de NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba. nos da un valor de >1100 bacterias/mL de leche. Ahora, Al hacer un comparativo de nuestros resultados, con “La Norma para Lácteos establecida” da como límites los sgtes. Valores para coliformes totales:

El límite dado para Coliformes Totales en leche cruda está dada en UFC/ml (unidad formadora de colonias/mililitro), mayores a 5.000, esto quiere decir que estamos ante una leche de tercera ya que supera las cantidades totales de coliformes presente en dicha muestra.

DISCUSIÓN observamos que la muestra en este caso la leche fresca presento coliforme s(totales), >1100 bacterias/mL de leche. lo cual nos indica que no hay una buena limpieza y desinfección del área de trabajo, como la mala higiene tanto del manipulador y del almacenamiento la cual conllevó a la contaminación con estos microorganismos.

CONCLUSIONES Aprendimos a realizar pruebas con método de recuento de número más probable y que aspectos nos indican que hay presencia de coliformes totales.

La calidad higiénica de la leche ocupa en estos momentos un papel preponderante , en los criterios de aceptación y pago de la leche por parte de ¡a industria procesadora. La información oportuna al productor, se hace cada día más necesaria para el logro un solo objetivo: leche de alta calidad, para un consumidor más conocedor y exigente.

BIBLIOGRAFIA Introduccion a la microbiologia/ Microbiology: An Introduction Escrito por Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case (capitulo 6, pagina 179)

Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica para Alimentos y Bebidas Escrito por María del Rosario Pascual Anderson,Vicente Calderón y Pascual (pagina 110) http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/verdebribilis.htm http://ocw.um.es/cc.-de-la-salud/higiene-inspeccion-y-control-alimentario/practicas-1/practica-1-microorganismosmarcadores-recuento http://es.scribd.com/doc/105162815/Caldo-Bilis-Verde-Brillante http://es.scribd.com/doc/130628171/Manual-de-Practicas-Microbiologias-2013