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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5698-1 2009-08-19

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. METODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS. PARTE 1: TÉCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS EN PRODUCTOS CON ACTIVIDAD ACUOSA (Aw) SUPERIOR A 0,95

E:

MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS - WITH HORIZONTAL METHOD FOR THE ENUMERATION OF YEASTS AND MOULDS. PART 1: COLONY COUNT TECHNIQUE IN PRODUCTS WATER ACTIVITY GREATER THAN 0,95.

CORRESPONDENCIA:

esta norma es idéntica (IDT) con respecto a su documento de referencia, la norma ISO 21527-1:2008.

DESCRIPTORES:

microbiología de alimentos; método horizontal; enumeración de levaduras; enumeración de mohos; recuento de colonias.

I.C.S.: 07.100.30 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproducción

Editada 2009-09-01

PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 5698-1 fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-08-19. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología. 3 M COLOMBIA ALIMENTOS POLAR COLOMBIA S.A. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. ANNAR DIAGNÓSTICA IMPORT LTDA. ARCHIVO DE BOGOTÁ – ALCALDÍA MAYOR DE BOGOTÁ ASBIOQUIM LTDA. BIANÁLISIS BIOCONTROL LTDA. BIOQUILAB LTDA. BIOTRENDS LABORATORIOS LTDA. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. CARULLA VIVERO S.A. CONGELAGRO S.A. CASA LUKER S.A. CREPES & WAFFLES S.A. CONGELAGRO CORPOLAC - CORPOICA ECOKAPKA ENZIPÁN LABORATORIO S.A. INDUSTRIAS ALIMENTICIAS ZENÚ S.A. INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES RENOVABLES INSTITUTO DE GENÉTICA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. KOYOMAD S.A. LABCONTROL E.U. LABFARVE – LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA VEGETAL LABORATORIOS ERMA S.A. LABORATORIOS GRAM LABORATORIOS MICROLAB LTDA. LABORATORIO SFC LTDA. MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. MICROBIÓLOGOS ASOCIADOS NULAB LTDA. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS LTDA. QUALA S.A. SECRETARÍA DISTRITAL DE SALUD DE BOGOTÁ SUIZO S.A. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA VECOL S.A. VILASECA LTDA. VITROFARMA S.A.

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas:

ACEGRASAS S.A. ACUAGYR S.A. E.S.P. ALGARRA S.A. ALIMENTOS CÁRNICOS S.A. PLANTA SUIZO AQUALAB AREPAS DOÑA ALEJA ASEBIOL ASINAL ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA COSMÉTICA – ACCYTEC ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGÍA BAVARIA S.A. BECTON DICKINSON DE COLOMBIA LTDA. CERVECERÍA LEONA S.A. COLOMBINA S.A. CORPORACIÓN PARA EL AVANCE DE LA MICROBIOLOGÍA Y LA MICROSCOPIA -MICROSDUPONT QUALICON

EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ E.S.P. FÁBRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY S.A. FRUGAL S.A. INSTITUTO DE GENÉTICA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA JOHNSONDIVERSEY KLIK S.A LABORATORIO A.B.B.A LABORATORIO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR LA CAMPIÑA MULTIDIMENSIONALES S.A. NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. QUIK LTDA. ROCHE DIAGNOSTICS SERVICIOS DE LABORATORIO CLÍNICO LTDA. UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5698-1

CONTENIDO

Página INTRODUCCIÓN......................................................................................................................1

1.

ALCANCE ....................................................................................................................2

2.

REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................2

3.

TÉRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2

4.

PRINCIPIO....................................................................................................................3

5.

DILUYENTE Y MEDIO DE CULTIVO...........................................................................3

5.1

DILUYENTE..................................................................................................................3

5.2

MEDIO DE CULTIVO ...................................................................................................4

6.

EQUIPO Y MATERIAL DE VIDRIO..............................................................................6

7.

MUESTREO..................................................................................................................6

8.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.......................................................7

9.

PROCEDIMIENTO........................................................................................................7

9.1

PORCIÓN DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES .............................7

9.2

INOCULACIÓN E INCUBACIÓN .................................................................................7

9.3

RECUENTO Y SELECCIÓN DE LAS COLONIAS PARA LA CONFIRMACIÓN ........8

10.

EXPRESIÓN DE RESULTADOS Y LÍMITES DE CONFIANZA...................................8

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5698-1

Página

11.

INFORME DE ENSAYO ...............................................................................................8

BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................10

DOCUMENTO DE REFERENCIA..........................................................................................11

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5698-1

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS PARTE 1: TÉCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS EN PRODUCTOS CON ACTIVIDAD ACUOSA (Aw) SUPERIOR A 0,95

Esta norma consta de las siguientes partes, bajo el título general de Microbiología de alimentos y productos de alimentación animal. Método horizontal para la enumeración de mohos y levaduras : -

Parte 1: Técnica de recuento de colonias en productos con actividad acuosa (Aw) superior a 0,95.

-

Parte 2: Técnica de recuento de colonias en productos con actividad acuosa (Aw) inferior o igual a 0,95.

INTRODUCCIÓN Debido a la gran variedad de alimentos y productos para alimentación, las aplicaciones del método horizontal que se especifica en esta parte de la norma y en la NTC 5698-2 pueden no ser adecuadas para determinados productos. En este caso, se pueden utilizar métodos diferentes específicos para estos productos, si es absolutamente necesario por razones técnicas justificadas. Sin embargo, se debe hacer todo el esfuerzo para aplicar el método horizontal que se especifica en esta parte de la norma y en la NTC 5698-2 , en la medida de lo posible. ADVERTENCIA Es esencial que la enumeración de los mohos se realice con el máximo cuidado para proteger al operario y evitar la contaminación de la atmósfera con las esporas de mohos.

1 de 11

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 1.

NTC 5698-1

ALCANCE

La NTC 5698-1 especifica un método horizontal para la enumeración de levaduras y mohos viables en productos destinados para consumo humano o alimentación de animales, que tienen una actividad de agua superior a 0,95 (huevos, carne, productos lácteos (excepto la leche en polvo), frutas, verduras, pastas frescas, etc.), por medio de la técnica de recuento de colonias a una temperatura de 25 °C ± 1 ºC (referencias [1] y [2]). Esta parte de NTC no permite la enumeración de las esporas de mohos, ni la identificación de la flora de hongos, el examen de los alimentos para determinar micotoxinas tampoco está dentro del alcance de esta norma. El método que se especifica en esta parte no es adecuado para la enumeración de hongos resistentes al calor, como el Byssochlamys fulva o Byssochlamys nivea, en frutas y verduras enlatadas o embotelladas.

2.

REFRENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado (incluida cualquier corrección). NTC 4491 (todas las partes), Microbiología de alimentos y alimentos para animales. preparación de muestras para ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 1: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales. NTC 4092 Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. reglas generales para el análisis microbiológico. NTC 5698-2, Microbiología de alimentos y productos de alimentación animal. Método horizontal para la enumeración de levaduras y mohos. Parte 2: Técnica de Recuento de colonias en productos con Actividad Acuosa (Aw) inferior o igual a 0,95. GTC 171, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Guía para la preparación y producción de medios de cultivo. Guía general para los ensayos de desempeño de medios de cultivo. ISO 8261, Milk and Milk Products. General Guidance for the Preparation of Test Samples, Initial Suspensions and Decimal Dilutions for Microbiological Examinations.

3.

TÉRMINOS Y DEFINICIONES

Para los propósitos de este documento, se aplican los siguientes términos y definiciones. NOTA Existen algunas formas intermedias y la distinción entre una levadura (véase el numeral 3.1) y un moho (véase el numeral 3.2) puede ser arbitraria.

3.1 Levadura. Microorganismo aeróbico mesofílico que, a 25 ºC usando un medio de agar micológico bajo las condiciones descritas en esta NTC, desarrolla colonias (véase el numeral 3.4) redondas brillantes o mate sobre la superficie del medio, que usualmente tienen un contorno regular y una superficie más o menos convexa. 2

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NOTA

NTC 5698-1

Las levaduras dentro, en lugar de sobre un medio, desarrollan colonias redondas, lenticulares.

3.2 Moho. Microorganismo filamentoso aeróbico mesofílico que, sobre la superficie de un medio de agar micológico bajo las condiciones que se describen en esta NTC, usualmente desarrolla gérmenes/propágulas de proliferación planas o esponjosas (véase el numeral 3.3) o colonias (véase el numeral 3.4) con estructuras con color fructíferas o que forman esporas. NOTA

3.3

Los mohos dentro, en lugar de sobre un medio, pueden desarrollar colonias redondas, lenticulares.

Propágula. Germen. Entidad viable capaz de crecer en un medio nutritivo.

EJEMPLO Células vegetativas, grupos de células, esporas, cúmulos de esporas o una porción de micelio de hongos.

[NTC 3650-6] 3.4 Colonia. Acumulación visible localizada de masa microbiana, desarrollada sobre o dentro de un medio nutritivo sólido a partir de una partícula viable. [NTC 3650-6]

4.

PRINCIPIO

4.1 Se preparan placas inoculadas en su superficie utilizando un medio de cultivo selectivo específico. Dependiendo de la cantidad esperada de colonias, se utiliza una cantidad específica de la muestra (si el producto es líquido), una suspensión inicial (en el caso de otros productos) o diluciones decimales de la muestra/suspensión. Se pueden preparar placas adicionales bajo las mismas condiciones, utilizando diluciones decimales de la muestra de ensayo o de la suspensión inicial. 4.2 Las placas se incuban después de forma aeróbica a 25 °C ± 1 ºC durante 5 d. Si es necesario, las placas de agar se dejan en reposo en luz natural difusa durante 1 d a 2 d. 4.3 Las colonias/propágulas se cuentan posteriormente, y si así se requiere (para diferenciar las colonias de levaduras de las colonias de bacterias) se confirma la identidad de las colonias dudosas mediante examen con microscopio. 4.4 Se calcula el número de levaduras y de mohos por gramo o por mililitro de muestra a partir del número de colonias/propágulas/gérmenes que se obtuvieron sobre las placas seleccionadas en niveles de dilución que producen colonias contables. Si es necesario, los mohos y las levaduras se cuentan independientemente.

5.

DILUYENTE Y MEDIO DE CULTIVO

Con respecto a la práctica actual de laboratorio, véase la NTC 4491(todas las partes). 5.1

DILUYENTE

5.1.1

Generalidades

Véase la NTC 4491 (todas las partes), ISO 861 y las normas específicas que tratan de los productos en cuestión. 3

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5698-1

NOTA Es posible adicionar agentes tensoactivos como poli(oxietileno)sorbatitan monooleato1) sódico [0,05 % (concentración de masa)] a los diluyentes para reducir la formación de grumos de esporas de mohos y conidias (referencia [2]). Excepto para la preparación específica de la muestra de ensayo, se recomienda utilizar como diluyente caldo de agua de peptona al 0,1 % (concentración de masa).

5.1.2

Composición del caldo de agua de peptona al 0,1 % (concentración de masa) Productos de la digestión enzimática de tejidos animales o vegetales Agua

5.1.3

1,0 g 1 000 ml

Preparación del caldo de agua de peptona al 0,1% (concentración de masa)

Disuelva los componentes en agua, mediante calentamiento, si es necesario. Si es necesario, ajuste el pH de manera que, después de la esterilización, esté en 7,0 ± 0,2 a 25 °C. 5.2

MEDIO DE CULTIVO

5.2.1

Agar de Dicloran rosa de bengala y cloranfenicol (DRBC) (referencias [3] y [4])

5.2.1.1 Composición Producto de la digestión enzimática de tejidos animales y vegetales D -Glucosa (C6H12O6) Dihidrogeno fosfato de potasio (KH2PO4) Sulfato de magnesio (MgSO4 · H2O) Dicloran (2,6-dicloro-4-nitroanilina) Rosa de bengala Agar Cloranfenicol Agua, destilada o desionizada a Dependiendo de la resistencia de gel del agar.

5,0 g 10,0 g 1,0 g 0,5 g 0,002 g 0,025 g 12 g a 15 g a 0,1 g 1 000 ml

NOTA Teniendo en cuenta la legislación nacional vigente se puede considerar la utilización de medios de cultivo de la GTC 125; para reportar según las indicaciones de esta Norma Técnica Colombiana se debe utilizar el medio de cultivo referenciado en el mismo.

5.2.1.2 Preparación 5.2.1.2.1 Generalidades Elabore una suspensión en agua de todos los ingredientes, excepto el cloranfenicol, y lleva a ebullición hasta disolverlos completamente. Si es necesario, ajuste el pH (véase el numeral 6.4) de modo que después de la esterilización esté en 5,6 ± 0,2 a 25 ºC. Agregue 10 ml de una solución al 1 % (concentración de masa) de cloranfenicol en etanol y mezcle. Dispense el medio en cantidades en recipientes (6.5) con capacidad adecuada. Esterilice llevando a autoclave a 121 ºC durante 15 min.

1)

Tween 80 es un ejemplo de un producto adecuado disponible en el comercio. Esta información se brinda para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye una aprobación de este producto por parte de ISO.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5698-1

Enfríe inmediatamente el medio en un baño de agua (6.3) conservado a una temperatura entre 44 °C y 47 °C. Enfríe hasta alcanzar temperatura inferior a 50 °C y dispense en cantidades de 15 ml en cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.6). Permita que el medio se solidifique y, si es necesario, seque la superficie de las placas tal como se describe en NTC 4092 y GTC 171 (todas las partes). Utilice inmediatamente o almacene en un lugar oscuro, según la GTC 171 (todas las partes) hasta que se necesite. PRECAUCIÓN evite la exposición del medio a la luz ya que los productos de la ruptura citotóxica pueden dar como resultado una subestimación de la micoflora en las muestras.

5.2.1.2.2 Adición opcional de clortetraciclina hidroclórica Cuando el exceso de crecimiento bacteriano puede ser un problema (por ejemplo en carnes crudas), se recomienda cloranfenicol (50 mg/l) y clortetraciclina (50 mg/l). En este caso, prepare el medio básico tal como se describe arriba, solamente con 50 mg de cloranfenicol, dispénselo en cantidades de 100 ml y esterilice. Preparé también una solución al 0,1% (concentración de masa) de clortetraciclina hidroclórica en agua (relativamente inestable en solución, se debe preparar fresco) y esterilice mediante filtración. Justo antes de la utilización, adicione 5 ml de esta solución, en forma aséptica, a 100 ml del medio básico y vierta en las placas. No se recomienda la gentamicina ya que se ha reportado que causa inhibición de algunas especies de levaduras. 5.2.1.2.3 Adición opcional de elementos traza Para que los mohos exhiban su morfología total, en particular algunos pigmentos que normalmente producen, necesitan de elementos traza que pueden no estar presentes en el agar DRBC. Para identificar los mohos en este medio, adicione la siguiente solución de elementos traza en 1 ml por litro de medio, antes de llevar al autoclave: ZnSO4 7H2O 1g; CuSO4· 5H2O 0,5 g; agua destilada o desionizada 100 ml (referencia [1]). 5.2.1.2.4 Adición opcional de Tergitol2) Con el fin de evitar el exceso de crecimiento de Mucorales sobre las placas de agar, se recomienda la adición de Tergitol (1 ml/l) al medio de cultivo. 5.2.1.3 Ensayo de desempeño para el aseguramiento de la calidad del medio de cultivo 5.2.1.3.1 Generalidades El agar DRBC es un medio sólido. La productividad y la selectividad se deben someter a ensayo de acuerdo con la GTC 171 según las siguientes especificaciones 5.2.1.3.2 Productividad Incubación: Cepas:

2)

5 d a 25° C ± 1° C Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 Candida albicans ATCC 10231 Aspergillus niger ATCC 16404

Ejemplo de un producto disponible en el comercio. Esta información se suministra para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye una aprobación del producto por parte de ICONTEC .

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NTC 5698-1

Mucor racemosus ATCC 42647 o cepas registradas como colecciones de hongos. Medio de referencia: Método de control: Criterios: Reacción característica:

equivalentes

en

otras

Lote del medio SDA (agar de dextrosa Sabouraud) ya validado. Cuantitativo Relación de productividad, PR ≥0,5 Colonias/propágulas/gérmenes característicos de acuerdo con cada especie.

5.2.1.3.3 Selectividad Incubación: Cepas:

5 d a 25 °C ± 1 °C Escherichia coli ATCC 24922 o Bacillus subtilis ATCC 6633 o cepas registradas como equivalentes en otras colecciones de bacterias.

Método de control: Criterios:

Cualitativo Inhibición total

6.

EQUIPO Y MATERIAL DE VIDRIO

El equipo desechable es una alternativa aceptable para el siempre que tenga las especificaciones correctas.

material de vidrio reutilizable,

Equipo común de laboratorio de microbiología (véase la NTC 4092) y, en particular, el siguiente: 6.1

Incubadora, con capacidad para funcionar a 25 °C ± 1 °C.

6.2 Pipeta o micropipeta de descarga total, estériles, con capacidad nominal de 1 ml y graduadas en divisiones de 0,1 ml. 6.3

Baño de agua, o equipo similar, con capacidad de funcionar entre 44 °C y 47 °C.

6.4

pHmetro, con exactitud de 0,1 unidades de pH a 25 °C.

6.5 Frascos, matraces y tubos, para ebullición y almacenamiento del medio de cultivo y para hacer las diluciones. 6.6

Cajas de Petri, estériles, de vidrio o plástico, con un diámetro de 90 mm a 100 mm.

6.7 Microscopio, para diferenciar las levaduras de las células bacterianas (campo luminoso, amplificación de 250 veces a 1 000 veces). 6.8 Esparcidores, de vidrio o plástico (diámetro inferior a 2 mm y longitud de 80 mm). Es recomendable que el diámetro no exceda 2 mm con el fin de minimizar la cantidad de muestra que se adhiere a ellos al final del procedimiento de esparcido.

7.

MUESTREO

Es recomendable enviar al laboratorio una muestra representativa. Dicha muestra no debe haber sufrido daños ni cambios durante el transporte ni el almacenamiento. La muestra de 6

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NTC 5698-1

laboratorio no debe estar congelada. El muestreo no es parte del método que se especifica en esta NTC. El muestreo debería llevarse a cabo de acuerdo con la norma específica, adecuada al producto en cuestión. Si no existe norma específica, se recomienda que las partes involucradas lleguen a un acuerdo sobre este tema.

8.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Prepare la muestra de ensayo según la NTC 4491(todas las partes), NTC 4092 y la norma específica que trate del producto en cuestión. Si no existe norma específica, se recomienda que las partes involucradas lleguen a un acuerdo sobre este tema.

9.

PROCEDIMIENTO

9.1

PORCIÓN DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES

Prepare la porción de ensayo, la suspensión inicial (dilución primaria) y las diluciones adicionales según NTC 4491 (todas las partes de la NTC 4092 y la norma específica que trate del producto en cuestión. Excepto para la preparación específica de la muestra de ensayo, se recomienda usar caldo de agua de peptona al 0,1 % (véase el numeral 5.1.3) como diluyente. Utilice un homogenizador peristáltico de preferencia a un mezclador o un agitador. Debido a la rápida sedimentación de las esporas en la pipeta o micropipeta, Agite la suspensión inicial y las diluciones con el fin de evitar la sedimentación de partículas que contenga microorganismos. 9.2

INOCULACIÓN E INCUBACIÓN

9.2.1 Sobre una placa de agar DRBC (véase el numeral 5.2.1), utilizando una pipeta o micropipeta estéril (véase el numeral 6.2), transfiera 0,1 ml de la muestra de ensayo, si es líquida, o 0,1 ml de la suspensión inicial, en el caso de otros productos (véase el numeral 8). Sobre una segunda placa de agar DRBC, utilizando una pipeta o micropipeta estéril, transfiera 0,1 ml de la primera dilución decimal (10-1) (producto líquido) o 0,1 ml de la dilución de 10-2 (otros productos). Para facilitar la enumeración de poblaciones bajas de levaduras y mohos, sobre tres de las cajas se pueden dispersar volúmenes de hasta 0,3 ml de una dilución de 10-1 de la muestra, o de la muestra de ensayo, si es líquida. Repita estas operaciones con diluciones posteriores utilizando una pipeta o micropipeta estéril para cada dilución decimal. NOTA

Si se sospecha la presencia de mohos de crecimiento rápido, utilice la norma ISO 21527-2[6].

9.2.2 Disperse el líquido sobre la superficie de la placa de agar con un esparcidor estéril (véase el numeral 6.8) hasta que el líquido se absorba por completo en el medio. También se puede utilizar la inoculación de las placas mediante el método de vertido en placa, pero en este caso la equivalencia de los resultados se debe convalidar en comparación a la 7

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inoculación sobre la superficie, y la discriminación y diferenciación de mohos y levaduras no son admisibles. El método de esparcido sobre la superficie puede dar enumeraciones superiores. La técnica de esparcido de la placa facilita la exposición máxima de las células al oxígeno atmosférico y evita el riesgo de desactivación térmica de las propágulas de hongos. Los resultados pueden depender del tipo de hongos. 9.2.3 Incube aeróbicamente en posición invertida las placas preparadas (véanse los numerales 9.2.2 y 6.1) a 25 °C ± 1 °C durante 5 d. Si es necesario, deje las placas de agar en reposo en luz natural difusa durante los 2 primeros días. Se recomienda incubar las cajas (véase el numeral 6.6) en una bolsa plástica abierta con el fin de no contaminar la incubadora en el caso de diseminación de los mohos fuera de las cajas. 9.3

RECUENTO Y SELECCIÓN DE LAS COLONIAS PARA LA CONFIRMACIÓN

Seleccione y cuente las cajas que tienen menos de 150 colonias/propagulas/gérmenes. Si el crecimiento rápido de los mohos causa problemas, realizar conteo a los 2 d y luego a los 5 d. NOTA 1 Los métodos de enumeración para levaduras y, en especial para los mohos, son imprecisos dado que consisten en una mezcla de micelio y esporas sexuales y asexuales. Las cantidades de unidades formadoras de colonias dependen del grado de fragmentación del micelio y de la proporción de esporas capaces de crecer en el medio en la placa. NOTA 2 A menudo se presenta la no linealidad de los recuentos de las placas que contienen la dilución, es decir, las diluciones de 10 veces de la muestra con frecuencia no dan como resultado reducciones de 10 veces en los números de colonias recuperadas del medio en la placa. Esto se ha atribuido a la fragmentación del micelio y a la ruptura de los cúmulos de esporas durante la dilución además de la inhibición competitiva cuando hay un gran número de colonias sobre las placas. PRECAUCIÓN las esporas de los mohos se dispersan en el aire con gran facilidad. Manipule las cajas de Petri con cuidado para evitar el desarrollo de colonias satélites que ocasionarían una sobreestimación de la población en la muestra.

Si es necesario, realice un examen (véase el numeral 6.9) con microscopio (véase el numeral 6.7) con el fin de diferenciar entre células de levaduras o de mohos y bacterias provenientes de las colonias. Cuente las colonias de levaduras y las colonias/propágulas de mohos independientemente, si es necesario. Para la identificación de levaduras y mohos, seleccione áreas de crecimiento de hongos y retírelas para examen con microscopio o realice la inoculación en un medio adecuado de aislamiento o de identificación.

10.

EXPRESIÓN DE RESULTADOS Y LÍMITES DE CONFIANZA

Registre las colonias de levaduras y las colonias/propágulas de mohos independientemente, si es necesario. Véase la NTC 4092

11.

INFORME DE ENSAYO

El informe de ensayo debe incluir por lo menos la siguiente información: a)

toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra, 8

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b)

el método de muestreo utilizado, si se conoce;

c)

el método de ensayo utilizado, con referencia a esta NTC;

d)

todos los detalles operativos que no se especifican en esta norma o que se consideran opcionales, junto con los detalles de todos los incidentes que hayan podido tener influencia en los resultados de ensayo,

e)

resultados de ensayo obtenidos.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 5698-1 BIBLIOGRAFÍA

[1]

Bell, C., Neaves, P., Williams, A.P. Food Microbiology and Laboratory Practice. Blackwell, Oxford, 2005. 324 p.

[2]

Beuchat, L.R. Media for Detecting and Enumerating Yeasts and Moulds. In: Corry, J.E.L., Curtis, G.D.W., Baird, R.M., Editors. Handbook of Culture Media for Food Microbiology, pp. 369-386. Elsevier, Amsterdam, 2003. (Progress in Industrial Microbiology, Vol 37).

[3]

Beuchat, L.R., Frändberg, E., Deak, T., Alzamora, S.M., Chen, J., Guerrero, A.S., López-Malo, A., Ohlsson, I., Olsen, M., Peinado, J.M., Schenurer, J., De Siloniz, M.I., Tornai-Lehoczki, J. (2001) Performance of Mycological Media in Enumerating Desiccated Food Spoilage Yeasts: An Interlaboratory study. Int. J. Food Microbiol. 2001, 70, pp 8-96.

[4]

King Jr., A.D., Hocking, A.d., Pitt, J.I. (1979) Dichloran-Rose Bengal Medium for Enumeration and Isolation of Moulds from Foods. Appl. Environ. Microbiol. 1979, 37, pp. 959-964.

[5]

ISO 6107-6:2004, Water Quality. Vocabulary. Part 6.

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DOCUMENTO DE REFERENCIA INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of Food and Animal Feedings Stuffs. Horizontal Method for the Enumeration of Yeasts and Moulds. Part 1: Colony Count Technique in Products with Water Activity Greater than 0,95. Gèneva: ISO, 2004, 8 p (ISO 21527-1:2008 (E).

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