• Author / Uploaded
• Nestor Motolo

Citation preview

Métodos generales de análisis de alimentos Bioq. Ruth Wolfgor Farm. Viviana Rodríguez Dra. Carola B. Greco Dr. Néstor Pellegrino Dr. Luis Dyner NUTRICIÓN y BROMATOLOGÍA

2017

ANÁLISIS DE ALIMENTOS

¿Con qué finalidad se realiza?

A nivel de la utilidad Pública Verificar adecuadas condiciones higiénico-sanitarias Evaluar sus características organolépticas Determinar su valor nutritivo Determinar su composición en macro y micronutrientes Verificar el cumplimiento de la legislación vigente (CAA y REGLAMENTO MERCOSUR)

Como parte de programas de investigación y desarrollo Caracterizar las propiedades de productos naturales, procesados e industrializados Estudiar su estabilidad y vida útil Diseñar nuevos alimentos Estudiar sus características toxicológicas y microbiológicas

ANÁLISIS DE ALIMENTOS ¿Quiénes son los responsables? Laboratorios Oficiales de Contralor (Bromatologías municipales, provinciales, INAL, SENASA, RENALOA). Laboratorios Oficiales que no son de Contralor (INTA, INTI, Universidades) Laboratorios de Control de Calidad de las industrias o empresas. Laboratorios particulares independientes. Métodos basados en: CAA (Código Alimentario Argentino) IRAM (Instituto Argentino de Normalización y Certificación) AOAC (Association of Official Analytical Chemists) Métodos independientes validados con estudios intra e inter laboratorios

MUESTREO ¿Qué cantidad de muestra se debe tomar?
Muestreo basado en métodos estadísticos (Norma IRAM N° 15, ISO 3951, etc.)
Muestreo no estadístico, solo para muestras homogéneas (√n)

¿De dónde se debe obtener la muestra? Muestreo Muestreo Muestreo Muestreo

aleatorio sistemático estratificado arbitrario

MUESTREO ¿Con qué se realiza el muestreo?

¿Qué se realiza luego del muestreo? Debe reducirse el tamaño de la muestra a una cantidad manipulable (muestra de laboratorio). En el caso de semillas, granos y polvos habitualmente se realizan cuarteos con equipos o en forma manual.

A C

B D

Rifle de Cuarteo

¿Cómo se guardan las muestras? ¿Qué precauciones se deben tomar?
Para optimizar la conservación de las muestras se deberán tener en cuenta sus características organolépticas y su composición.
Deben guardarse en recipientes herméticamente cerrados para prever la evaporación o absorción de agua o en recipientes cerrados y al abrigo de la luz para evitar la oxidación de componentes.
Si es una muestra perecedera, conservarla en freezer hasta su análisis o en heladera si el análisis es a corto plazo.
Prever la posible evaporación de sustancias volátiles.
Prever cambios por actividad enzimática.
Prever el desarrollo de microorganismos.
Si la muestra es parte de una transacción comercial o de una inspección sanitaria se guardará por triplicado en sobres o envases lacrados y firmados (Formalización del muestreo – Acta de toma de muestra) hasta el momento de ser analizada.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Establecer la presencia o no de materiales extraños (pelos, pelusas, huesos, plumas, piedras, arena, etc.) La fracción de muestra sobre la que se realizarán todas las determinaciones debe ser HOMOGÉNEA Por la heterogeneidad de los productos alimenticios es fundamental la aplicación del SENTIDO COMÚN para decidir el mejor método de homogeneización (inversión, agitado, molienda, rallado, picado, secado y rallado, licuado, congelado y rallado, fundición, etc.)

ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN CENTESIMAL DE UN ALIMENTO CONTENIDO DE AGUA CONTENIDO DE MINERALES TOTALES CONTENIDO DE GRASA CONTENIDO DE PROTEÍNAS CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS CONTENIDO DE FIBRA DIETARIA

Se calcula el VALOR ENERGÉTICO usando los FACTORES DE ATWATER

Determinación del contenido de agua En tejidos animales y vegetales y en alimentos procesados

agua libre agua ligada

Los alimentos en general pueden considerarse integrados por dos fracciones

Agua o Humedad

+

Sólidos totales, Materia seca o Extracto seco

Determinación del contenido de agua Métodos a utilizar Calor solamente

INDIRECTOS

DIRECTOS

Calor y presión reducida

Físicos Químicos

Índice de refracción Por destilación: Dean Stark Karl Fischer

MÉTODOS INDIRECTOS

.

Son métodos por desecación en estufa que se basan en la determinación gravimétrica del residuo que queda luego de evaporar el agua del alimento. Ese residuo corresponde a los sólidos totales y se considera que se ha evaporado totalmente el agua cuando se alcanza un peso constante.

MÉTODOS INDIRECTOS Calor solamente: Se utilizan estufas con circulación de aire que trabajan a presión atmosférica normal y temperatura regulada a 100–105 ºC. Se aplica a productos que no se descomponen a elevadas temperaturas. Ej: harinas, fideos, leches, productos cárnicos, etc. Muestra homogénea en cristalizador (~ 5 g) Calentar en estufa a 100–105 ºC Enfriar en desecador hasta temperatura ambiente y pesar Repetir hasta alcanzar peso constante Si la muestra que se analiza es líquida, antes de llevarla a la estufa debe evaporarse a baño María hasta sequedad aparente

MÉTODOS INDIRECTOS Calor y presión reducida: Se utilizan estufas de vacío y se trabaja a una presión entre 25 y 50 mm de Hg y a una temperatura no mayor de 70 ºC. Se aplica en alimentos con alto contenido en azúcares, como fructosa, o con principios volátiles. Ej: miel, mermeladas, jugos de fruta, frutas secas, etc.

EXPRESIÓN DE RESULTADOS

HUMEDAD: alimentos sólidos y semisólidos (% Agua)= Peso de agua en la muestra (g) x 100 Peso de muestra húmeda (g)

EXTRACTO SECO: alimentos con alto contenido acuoso (% Sólidos totales)= Peso de muestra seca (g) x 100 Peso de muestra húmeda (g)

Son métodos rápidos y en algunos alimentos se han estandarizado las condiciones. Ej.: harinas

MÉTODOS DIRECTOS Método por destilación: Dean Stark  Se realiza una destilación a reflujo con solventes no miscibles con el agua, de similar punto de ebullición y de menor peso específico (Ej: tolueno, heptano, benceno, xilol, etc.)  Se aplica a una gran cantidad de alimentos. Es recomendado para determinar el contenido de agua en productos con bajo contenido de humedad, como son los productos deshidratados o bien en alimentos que contienen alto contenido de compuestos volátiles como las especias, pimentón, cebolla, margarina, manteca.

Sv. H2 O

H2O+Sv.

M+Sv.

MÉTODOS DIRECTOS Métodos químicos: Karl Fischer  Se fundamenta en la oxidación del dióxido de azufre con yodo en una solución de piridina en metanol (reactivo de Karl Fischer) en presencia de agua. Se cuantifica el exceso de I2 de forma volumétrica o potenciométrica.  Es útil en alimentos con muy bajo contenido de agua tales como chocolate, aceites, especias, productos deshidratados, melazas, etc.

Determinación del contenido de minerales Métodos a utilizar para la oxidación de la materia orgánica

DIGESTIÓN POR VÍA SECA DIGESTIÓN POR VÍA HÚMEDA DIGESTIÓN POR MICROONDAS

Para establecer el contenido total de minerales

Para cuantificar uno o más minerales de forma individual

MINERALIZACIÓN POR VÍA SECA: CENIZAS

Son métodos gravimétricos que involucran la oxidación total de la materia orgánica mediante el empleo de calor, sometiendo a la muestra a una carbonización en mechero y luego a una calcinación en mufla (500550°C), hasta la obtención de cenizas de aspecto blanquecino y peso constante.

MINERALIZACIÓN POR VÍA SECA: CENIZAS

Muestra homogénea en cápsula de porcelana (~ 2 g) Calentar sobre mechero hasta que cese el desprendimiento de humos blancos Llevar la cápsula con la muestra carbonizada a mufla a 500-550°C Enfriar en desecador hasta temperatura ambiente y pesar Repetir hasta obtener cenizas blanquecinas de peso constante Si la muestra que se analiza es líquida, debe evaporarse a baño María hasta sequedad aparente antes de carbonizarla

EXPRESIÓN DEL RESULTADO

% Cenizas = Peso cenizas x 100 Peso muestra

Determinación del contenido de grasa Las grasas o aceites son sustancias de origen animal o vegetal, insolubles en agua y solubles en éter u otros solventes no polares como cloroformo, hexano. Compuestos que se extraen:  Ésteres de ácidos grasos con glicerol  Fosfolípidos, lecitinas, esteroles  Ceras  Ácidos grasos libres  Carotenos, clorofila, pigmentos

Métodos a utilizar Extracción continua (Butt, Twisselman)

Más drástica Formación de canales

DIRECTOS Extracción discontinua (Sohxlet)

Más suave Sifón

CON ATAQUE PREVIO

Butirométricos o volumétricos

Gerber Babcock

Gravimétricos

Hidrólisis básica Hidrólisis ácida Hidrólisis mixta

MÉTODOS DIRECTOS

Extractor Discontinuo- Soxhlet

Extractor Continuo

MÉTODOS DIRECTOS Método de extracción discontinua: Soxhlet

 Se debe trabajar sobre muestra seca y el solvente de extracción debe ser anhidro  Es aplicable a alimentos en los cuales la grasa está disponible. Ej.: cereales, carnes y derivados, vegetales, etc.  Es un método gravimétrico EXPRESIÓN DEL RESULTADO % grasa (base seca) = Peso grasa extraída x 100 Peso muestra seca

EXPRESIÓN DE RESULTADOS EN BASE SECA Y EN BASE HÚMEDA % Base húmeda (BH) = % Base seca (BS) x (100 - % agua) 100 % Base seca (BS) = % Base húmeda (BH) x 100 100 - % agua Cuando el análisis de un componente del alimento se realice a partir de una muestra seca, el resultado final quedará expresado en base seca. Luego, con el dato de contenido de agua del alimento, el resultado deberá expresarse en base húmeda.

MÉTODOS CON ATAQUE PREVIO

Implican la liberación del glóbulo de grasa por acción de agentes ácidos o básicos permitiendo la coalescencia y medida volumétrica de la grasa o bien su extracción con solventes y la posterior medida gravimétrica del residuo graso.

MÉTODOS CON ATAQUE PREVIO Método butirométrico: Gerber Se colocan en el butirómetro el H2SO4, la muestra y el alcohol amílico. El H2SO4 digiere las proteínas, genera calor, libera la grasa. El alcohol amílico favorece la separación de la grasa y la protege de la acción del ácido. Por centrifugación se separa la capa de grasa y se lee directamente en el vástago del butirómetro el % de grasa (p/v) .

Método butirométrico: Babcock (H2SO4 + agua)

MÉTODOS CON ATAQUE PREVIO Método gravimétrico: Hidrólisis básica (Rose Gottlieb) Se realiza una hidrólisis en frío con NH4OH y etanol. Luego se extrae con éter etílico y éter de petróleo. Aplicación: principalmente alimentos ricos en carbohidratos tales como leche y derivados lácteos, helados, dulce de leche, etc.

Método gravimétrico: Hidrólisis ácida

Aplicación: huevos, harinas, panificados, quesos (Norma FIL), mayonesa, pescado, cacao y derivados.

Método gravimétrico: Hidrólisis mixta Se realiza una hidrólisis con NH4OH y HCl combinados. Aplicación: quesos (AOAC), etc. EXPRESIÓN DEL RESULTADO % grasa (BH) = Peso grasa extraída x 100 Peso muestra

Método gravimétrico: Hidrólisis ácida (con HCl) Se aplica a todo tipo de alimentos: carnes, embutidos, quesos, mayonesa, huevos, pan, galletas, harinas, alimentos formulados, chocolate, alimentos fritos, horneados, extrudidos, etc. Puede haber limitaciones en alimentos muy ricos en azúcar. 2 o 3 g de muestra + 2 mL etanol + 10 mL HCl (7+3) Baño a 80°C durante 30 min. con agitación Enfriar, trasvasar a mojonier y realizar un lavado con 10 mL de etanol Agregar 25 mL de éter sulfúrico y agitar durante 1 min. en mojonier Agregar 25 mL de éter de petróleo y agitar durante 1 min. en mojonier Trasvasar la fase etérea a un balón seco y tarado. Usar torunda de algodón Repetir la extracción con 50 mL de éter mezcla Evaporar el solvente en rotavapor Secar balón con grasa en estufa hasta peso constante Pesar balón con la grasa extraída

Determinación de proteínas MÉTODOS INDIRECTOS Determinan el contenido de nitrógeno A partir de este se calcula el contenido de proteínas utilizando un factor de conversión Método de Kjeldhal Método de Dumas Métodos radioquímicos El contenido de nitrógeno se multiplica por un factor para llegar al contenido de proteínas asumiendo dos supuestos: a) los carbohidratos y las grasas no contienen nitrógeno, y que casi todo el nitrógeno presente en la dieta está presente en los aminoácidos que forman parte de las proteínas. b) que el contenido medio de nitrógeno de las proteínas se encuentra alrededor del 16 por ciento, lo que lleva al uso del factor genérico de 6,25.

16 g de nitrógeno ------ 100 g de proteína 1 g de nitrógeno -------- 6,25 g de proteína

MÉTODOS DIRECTOS

Método de Biuret Método de Lowry Otros métodos

Este factor general de conversión no es exacto ya que para diferentes proteínas con diferente composición de aminoácidos el contenido de nitrógeno puede variar entre 13 y 19 %. Esto equivaldría a factores de conversión de nitrógeno de 5,26 a 7,69. Factores para la conversión de los valores de nitrógeno en proteínas (por g de N)*

Producto alimenticio

Factor

albúmina

6,32

Productos animales carne y pescado Gelatina

6,25

5,83

5,55

Trigo entero salvado

Leche y productos lácteos

6,38

Arroz y harina de arroz

5,95

Caseína

6,40

5,83

Leche humana

6,37

Centeno y harina de centeno Cebada y harina de cebada Avena Maíz

Huevos enteros

6,25

Soja

5,71

6,31

6,25

Determinación de proteínas por método de Kjeldahl El análisis se compone de los siguientes pasos de trabajo: • Digestión de muestras con ácido sulfúrico (CHNO) + H2SO4 ----> CO2 + SO2 + H2O + (NH4)2SO4 + H2SO4 • Destilación de la solución de digestión con vapor de agua Agregado de NaOH 13 N Se recoge sobre solución H3BO3 4% + mezcla de indicadores (rojo de metilo y verde de bromocresol) Valoración con H2SO4 0,1N

Determinación del contenido de fibra dietaria Es cualquier material comestible que no es hidrolizado por las enzimas endógenas del tracto digestivo humano Celulosa

Fibra dietaria total

Fibra insoluble

Hemicelulosa Lignina Pectina

Métodos a utilizar Gravimétricos

Fibra soluble

Gomas Mucílago

Fibra cruda

Enzimático-gravimétricos

Fibra dietaria total

Método gravimétrico: fibra cruda Recupera parte de la fibra insoluble y se pierde toda la fibra soluble. Su uso se limita a ciertas muestras como granos de cereales, té, alimentos para animales.

No se emplea para determinar el contenido de fibra de un alimento a los fines del rotulado nutricional.

Método enzimático-gravimétrico: fibra dietaria Recupera todos los componentes de la fibra. Implica el tratamiento enzimático de la muestra y posterior pesada y análisis del residuo como fibra dietaria, previa corrección por cenizas y proteína.

Se emplea para determinar el contenido de fibra de un alimento a los fines del rotulado nutricional.

Método de fibra dietaria total (por duplicado) Muestra con menos del 10% grasa y seca + Buffer fosfatos pH= 6 α-amilasa termoestable (hidrólisis uniones α-1,4) 15 min. Baño María en ebullición

Ajustar pH a 7,5 con NaOH 0,275 N Proteasa (hidrólisis de proteínas) 30 min a 60°C con agitación

Ajustar pH a 4,5 con HCl 0,325 N Amiloglucosidasa (hidrólisis uniones α 1,4 y α 1,6) 20 min a 60°C con agitación

Agregar 280 mL de etanol 96° y dejar en reposo 1 hora a temp. ambiente Fibra soluble precipita con etanol 78º

Filtrar a través de crisol con celite Lavar el residuo Secar a 100 - 105°C Pesar el crisol filtrante + residuo RESIDUO: RESTOS DE PROTEÍNAS + MINERALES + FIBRA DIETARIA

%FDT= Peso residuo x 100 – (% proteína residuo + % cenizas residuo) Peso muestra Proteínas por Kjeldahl Cenizas a 500 - 550°C

Determinación del contenido de carbohidratos o glúcidos Son todos los mono, di y polisacáridos, incluidos los polialcoholes presentes en el alimento, que son digeridos, absorbidos y metabolizados por el ser humano.

Métodos a utilizar % HC= 100 – (% Humedad + % Proteínas + % Grasas totales + % Cenizas + % Fibra dietaria)

POR DIFERENCIA (Trabajo Práctico) QUÍMICOS FÍSICOS

Polarimetría Densitometría Refractometría Espectroscopía

MICROBIOLÓGICOS ENZIMÁTICOS

Para soluciones puras de azúcares

Método químico por reducción R-C=O + Cu2+ H OH - / calor

R-C=O + Cu+ Se determina por OH

Gravimetría Volumetría Colorimetría

Método Fehling – Cause Bonnans Como la solución de ensayo se vierte desde la bureta, sobre el reactivo de Fehling en ebullición, es una valoración inversa. Reactivos SO4Cu Cu2+ NaOH OH- exalta las propiedades reductoras Tartrato de Na y K compleja al Cu2+ Ferrocianuro de K compleja al Cu+ Cálculo del Título del reactivo *15 mL reactivo son reducidos por A ml de solución de glucosa anhidra con T g de glucosa (concentración conocida). Cuantificación de la muestra (solución a analizar): *15 mL reactivo son reducidos por V mL de solución a analizar (concentración desconocida). V mL T gr de glucosa 100 mL T x 100 = gr glucosa en 100 mL de sol. a analizar V