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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO

FACULTAD DE QUÍMICA

“METROLOGÍA Y CALIBRACIÓN DE ESPECTROFOTÓMETROS UV-VISIBLE Y ESPECTRÓMETROS FT-IR”

MEMORIAS DE TRABAJO QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

PRESENTA

ALEJANDRO NÚÑEZ VILCHIS

DIRIGIDA POR

M. en C. GUSTAVO PEDRAZA ABOYTES SANTIAGO DE QUERÉTARO, QUERÉTARO, 2014

ÍNDICE GENERAL

Contenido

Página

ÍNDICE GENERAL.

i

ÍNDICE DE CUADROS.

iii

ÍNDICE DE FIGURAS.

iv

RESUMEN. 1. INTRODUCCIÓN.

1

1.1 Metrología. Conceptos e importancia.

1

1.2 Institutos Nacionales de Metrología, Centro Nacional de Metrología y laboratorios secundarios.

3

1.3 Sistema Internacional de Unidades.

4

1.4 Incertidumbre.

8

1.5 Entidad mexicana de acreditación y Norma ISO 17025.

12

2. ANTECEDENTES.

12

2.1 Metrología Óptica.

12

2.2 Espectrofotometría UV-Visible.

15

2.3 Calibración de la escala fotométrica.

20

2.4 Calibración de la escala de longitud de onda.

21

2.5 Espectroscopia Infrarroja.

24

2.6 Calibración de la escala de número de onda.

30

3. OBJETIVOS.

31

3.1 General

31

3.2 Específicos

31

4. METODOLOGÍA.

31

4.1 Material de referencia certificado.

31

4.2 Procedimiento de calibración.

31

4.3 Calibración de espectrómetros de Infrarrojo medio.

31

4.4 Calibración de espectrofotómetros UV-Visible.

32

5. RESULTADOS.

32

5.1 Película de poliestireno.

32 i

5.2 Procedimiento de calibración de espectrómetros FT-IR y parámetros espectrales.

34

5.3 Resultados de la calibración de un espectrómetro FT-IR medio.

36

5.4 Resultados de la calibración de un espectrofotómetro UV-Visible.

41

6. DISCUSIÓN.

48

7. CONCLUSIONES.

59

8. REFERENCIAS

61

ANEXOS

64

ii

ÍNDICE DE CUADROS.

Cuadro

Página

1

Magnitudes, nombres y símbolos de las unidades del SI.

5

2

Factores de cobertura (k) asignados a niveles de confianza.

11

3

Valores certificados de número de onda (σ) e incertidumbres con k = 2 de la película de poliestireno.

33

4

Parámetros espectrales usados en la calibración del FT-IR.

35

5

Resultados de la calibración del FTIR-PE (valores en cm-1).

36

6

Error normalizado en la medición del material de referencia.

38

7

Resultados de ANOVA para los errores sistemáticos.

39

8

Resultados de la calibración de la escala de longitud de onda del UV/VIS-HP (valores en nm).

42

9

Resultados de la calibración de la escala fotométrica.

45

10

Resultados de la calibración de la escala fotométrica (cont.)

46

11

Resultados de la calibración a 750 nm.

57

12

Calores certificados del filtro 3 a 750 nm de longitud de onda.

58

iii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura

Página

1

Distribución normal y sus niveles de confianza.

2

Representación gráfica de la relación entre reflectancia (ρ) y color.

3

13

Sistema transparente (arriba) y de reflexión (abajo) para medición de índice de refracción.

4

11

14

Espectro electromagnético en longitud de onda en metros (escala superior) y en frecuencia en Hz (escala inferior)

15

5

Esquema de un espectrofotómetro UV-Visible de haz simple.

18

6

Instrumento patrón del Sistema Nacional de Espectrofotometría.

19

7

Espectro de los FDN en el intervalo visible.

21

8

Filtros óxido de didimio (derecha) y óxido de holmio en solución (izquierda).

9

22

Espectros del óxido de holmio (arriba) y del óxido de didimio (abajo) a un ABE = 1 nm

24

10

Distribución de la radiación IR en el espectro electromagnético.

25

11

Vibraciones moleculares ocasionadas por radiación IR.

26

12

Diseño óptico de un espectrómetro infrarrojo dispersivo.

27

13

Diseño óptico de un espectrómetro FT-IR.

28

14

Representación gráfica del funcionamiento del ATR.

29

15

Material de referencia certificado por el CENAM.

32

16

Espectro infrarrojo del material de referencia certificado.

34

17

Espectro infrarrojo de la película de poliestireno obtenido en el FTIR-PE.

37

18

Distribución de los errores sistemáticos.

39

19

Diagramas de caja y bigotes de las mediciones en el FT-IR/PE.

40

20

Diagramas de caja y bigotes de las mediciones en el FT-IR/PE (cont.)

41

iv

21

Espectro visible del filtro de didimio (arriba) y ultravioleta visible del óxido de holmio obtenidos en el UV/VIS-HP.

43

22

Distribución del error y la incertidumbre expandida.

44

23

Curva simulada del error sistemático del instrumento.

44

24

Distribución del error sistemático en escala fotométrica.

47

25

Unidad fundamental del poliestireno.

48

26

Tacticidad del poliestireno.

49

27

Método del Centro de gravedad para determinar posición de picos.

50

28

Carta de trazabilidad de la película de poliestireno.

51

29

Descripción gráfica de la prueba de error normalizado.

53

v

RESUMEN

Este trabajo explicará el concepto y las aplicaciones de la metrología en la sociedad desde sus inicios hasta la época actual. Particularmente tocará el tema de la metrología óptica y la calibración de los instrumentos de medición de ésta área, específicamente espectrofotómetros UV-Visible y Visible, así como de los materiales de referencia que se utilizan para los mismos fines. Todo esto, a manera de exponer las actividades que he realizado, desde febrero de 2013, en la empresa HEEL Laboratoire, S. de R. L. de C. V., la cual es un laboratorio secundario de metrología dedicado a la calibración de los equipos y materiales antes mencionados. Contendrá, además, parte de un proyecto de ampliación del alcance para poder ofrecer el servicio de calibración de espectrómetros FT-IR.

1. INTRODUCCIÓN. 1.1 Metrología. Conceptos e importancia. La metrología se define como la ciencia encargada del estudio, el procesamiento y la interpretación de las mediciones. Esta ciencia abarca diversas actividades como son: realizar mediciones con instrumentos analíticos (desde su fundamento físicoquímico), cálculo y corrección de errores sistemáticos, determinación de incertidumbres de medida, normalización de magnitudes, entre otras. La metrología puede dividirse en diversas áreas dependiendo del uso que se le dé, estas son: metrología industrial, metrología legal y metrología científica. La metrología industrial se refiere a al uso de instrumentos de medición en el campo de la industria. La metrología legal es aquella encargada de la protección del consumidor y por lo mismo va ligada indirectamente a la metrología industrial. Ambas dependen ampliamente de la metrología científica, ya que es la encargada de mantener las mediciones a través de los patrones de referencia, por definición es de carácter internacional y realiza actividades de investigación y reproducción de las magnitudes (Cárdenas, 2011). En torno a la clasificación, a partir de este momento, al decir metrología en estas memorias de trabajo se entenderá como metrología científica a menos que se indique lo contrario. Al hablar de metrología se deben conocer diversos conceptos que se aplican de manera universal, con la finalidad de normalizar estos conceptos en el año de 1997 se formó una comisión que estaría encargada de la redacción de dos importantes documentos, la comisión era el Comité Común para Guías de la Metrología (Joint Committee for Guides in Metrology o JCGM) y los documentos eran la Guía para la Expresión de Incertidumbre en la Medición (Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement o GUM) y el Vocabulario Internacional de Términos Básicos y Generales en Metrología (International Vocabulary of Basic and General Terms in Metrology o VIM). Dicho comité se conformó por representantes de diversas instituciones entre las que se encuentran la Oficina Internacional de Pesos y Medidas (BIPM), la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) y la Organización Internacional de Estandarización (ISO), entre otras.

1

El VIM, actualmente en su tercera edición, expone un conjunto de conceptos (básicos y generales) asociados con la metrología, también contiene diagramas e información adicional que ayuda a complementar los conceptos principales. Además, dichos conceptos están identificados con un sencillo sistema con el objetivo de facilitar su lectura y búsqueda. De acuerdo a este documento, la “metrología” se define como la ciencia de la medición y sus aplicaciones, incluidos sus aspectos teóricos y prácticos. Si bien el concepto de “magnitud” no está indicado en este documento, se le relaciona con el de “cantidad” y lo define como la propiedad de un fenómeno, cuerpo o sustancia a la cual se puede asignar un número con relación a una referencia. Ligado a este concepto, tenemos también el de “mensurando” que viene a ser la magnitud propuesta para medirse. Pero el concepto más importante es el de “medición” definida como el proceso que consiste en obtener experimentalmente uno o varios valores que pueden atribuirse razonablemente a una magnitud. Entiéndase la palabra “proceso” como todo lo que va desde la preparación del fenómeno, cuerpo a sustancia a medir hasta la interpretación y corrección de errores de medida. Una medición está fundamentada en un principio de medición , que es la base científica o fundamento teórico del método, y deriva en un procedimiento de medida definida como la descripción detallada de una medición conforme a uno o más principios de medida y a un método dado y que incluye los cálculos necesarios para obtener un resultado de medida. La importancia de la metrología reside en que, de manera universal, se deben utilizar patrones de referencia con los cuáles se puedan comparar todos los instrumentos de medición y, con ellos, realizar mediciones metrológicamente normalizadas. Esta comparación entre patrón e instrumento se conoce como calibración y está definida como la operación que, bajo condiciones específicas, establece una relación entre el valor obtenido de una magnitud con las incertidumbres de medida provistas por estándares de medición (patrones de referencia) y que además sirve, usando esta relación, para obtener un resultado de

2

medida correspondiente a una indicación (Joint Comittee for Guides in Metrology, 2008).

1.2 Institutos Nacionales de Metrología, Centro Nacional de Metrología y laboratorios secundarios. Existen, en todo el mundo, instituciones cuya función es la de estandarizar las mediciones (es decir, calibrar los instrumentos) de empresas, públicas y privadas, con la finalidad de normalizar las mediciones, Los laboratorios de metrología se clasifican en primarios y secundarios. Un Laboratorio Primario es aquella organización poseedora de los patrones nacionales (o en su defecto de un grupo de países) de medida. Las incertidumbres de sus equipos y materiales son, por definición, las más pequeñas de toda el área a la que representa. Los Institutos Nacionales de Metrología (INM) deben formar parte del Comité Internacional de Pesos y Medidas (CIPM) el cuál se reúne cada 4 años para discutir y decidir asuntos en contexto de metrología, esta reunión es la Conferencia General de Pesos y Medidas (CGPM). La incorporación al CIPM, implica firmar el Acuerdo de Reconocimiento Mutuo (CIPM MRA), los objetivos de este acuerdo son: -

Establecer el grado de equivalencia entre los estándares nacionales de medida de cada INM.

-

Proporcionar el reconocimiento mutuo de los certificados de calibración y medición emitidos por los INM’s.

-

Proporcionar al gobierno y otras entidades un fundamento teórico seguro que permita realizar acuerdos más amplios en cuanto a negocios comerciales, de viaje y de regulación. (Wallard y Hänsch, 2007)

Una subdivisión del CIPM es la Oficina Internacional de Pesos y Medidas (BIPM por sus siglas en francés) quien mantiene los patrones primarios, incluido el del kilogramo. Cabe mencionar que la masa actualmente es la única magnitud cuyo patrón es un objeto y no un fenómeno de elevada reproducibilidad. México cuenta, desde Julio de 1992, con el Centro Nacional de Metrología (CENAM) quien se incorpora al CIPM MRA en Octubre de 1999. Es el laboratorio nacional de referencia en materia de mediciones y fue creado con el fin de apoyar 3

al Sistema Metrológico Nacional. Es responsable de establecer y mantener los patrones

nacionales,

ofrecer

servicios

metrológicos

como

calibración

de

instrumentos y patrones, certificación y desarrollo de materiales de referencia, cursos especializados en metrología, asesorías y venta de publicaciones, cumpliendo con todo esto las responsabilidades de un INM. Además, en concordancia con el Acuerdo de Reconocimiento Muto, mantiene un estrecho contacto con otros laboratorios nacionales y con organismos internacionales con el fin de asegurar el reconocimiento internacional de los patrones nacionales de México y promover la aceptación de los productos y servicios del mismo. Antes mencionaba que existían laboratorios primarios y secundarios de metrología, siendo los primarios los INM’s. Los secundarios, son empresas dedicadas a la calibración de instrumentos y materiales de referencia pero que no cuentan con los patrones primarios de medición. Sus estándares (instrumentos y materiales) son calibrados por un INM, en México corresponde al CENAM y poseen un certificado emitido por el mismo. Esto les otorga la facultad de ofrecer el servicio de calibración transmitiendo el correspondiente error e incertidumbre de medida de sus patrones certificados. Las ventajas principales de los laboratorios secundarios son el costo y la disponibilidad, los INM tienen una agenda apretada y si se quiere obtener un servicio de calibración del mismo la lista de espera es de varios meses, además de que sus costos son elevados puesto que se garantiza que la incertidumbre es la más baja del país. Actualmente, las normas nacionales e internacionales, solicitan a laboratorios de ensayo y prueba, es decir aquellos que realizan cualquier tipo de medición como parte de sus actividades cotidianas, que sus instrumentos de medida tengan trazabilidad a los patrones nacionales por lo que no es necesario que éstos sean calibrados por el CENAM pero si por Laboratorios Secundarios que posean esta trazabilidad y por lo mismo se les transmita.

1.3 Sistema Internacional de Unidades. A lo largo de la historia se han tenido que establecer patrones de medida en conformidad con las necesidades de la sociedad, se tiene evidencia que la unidad patrón más antigua es la del pie del príncipe de Gudea de Lagash, esta medida 4

consiste en una regla sobre el regazo de una estatua que representa al príncipe y data del año 2050 a. C. La regla está dividida en 16 partes (llamadas “dedos”) y fue utilizada en la antigua Persia durante muchos años (Cardenas-Espinosa, 2001). Así como este, se pueden mencionar distintos ejemplos de patrones. Por lo mismo, uno de los objetivos de la Revolución Francesa fue la de trabajar con un sistema de unidades único, lo cual se logra en el año de 1875 al formar el Comité Internacional de Pesos y Medidas (CIPM) y, con la firma del tratado llamado “La Convención del Metro”, se establece al Sistema Métrico Decimal como universal, sin embargo, en el siglo XX existía un caos científico debido a que cada área del conocimiento había establecido su propio sistema de medición (CGS, MKS, MKSA y MTS), por lo que en el año de 1960 el CIPM realiza la XI Conferencia General de Pesos y Medidas que efectuó dos mejoras en el área de metrología. La primera es cambiar el patrón de longitud (metro) que hasta entonces era una barra de aleación platino-iridio, por la longitud de onda luminosa del isótopo 86 del Kriptón. La segunda mejora fue adoptar al Sistema Internacional de Unidades (SI) para uso universal. El SI contempla siete unidades/magnitudes fundamentales las cuáles se muestran en el Cuadro 1 (Nava-Jaimes y col., 2001).

Cuadro 1. Magnitudes, nombres y símbolos de las unidades del SI Magnitud

Unidad

Símbolo

Longitud

metro

M

Masa

kilogramo

Kg

Tiempo

segundo

S

Corriente eléctrica

ampere

A

kelvin

K

Intensidad luminosa

candela

Cd

Cantidad de sustancia

mol

mol

Temperatura termodinámica

5

Cada magnitud fundamental se obtiene mediante un patrón universal que son mantenidos y reproducidos de manera constante por la BIPM, que viene a ser el brazo científico del CIPM y que además calibra los patrones nacionales de los INM’s. Antes se mencionó que actualmente el único patrón material es el kilogramo, que es la masa igual a la del prototipo internacional (un artefacto hecho de platino – iridio resguardado por la BIPM), desde la 1ª CGPM en 1889 este ha sido el patrón universal y la única modificación realizada ha sido la de adicionar el término “masa” para evitar la confusión con el término “peso” que es una magnitud distinta. La masa es la cantidad de materia contenida en un objeto, dicho objeto es afectado en todo momento por una aceleración gravitacional provocando una fuerza de atracción, dicha fuerza se conoce como peso. Todos los demás patrones están basados en fenómenos físicos de elevada reproducibilidad con la finalidad de disminuir su incertidumbre ya que, por definición, un patrón o material de referencia debe ser lo suficientemente homogéneo y estable como para poder ser utilizado para asignar valores a fenómenos u objetos. A continuación se enumeran y exponen de manera general los principios que establecen el valor de cada una de las 6 unidades base restantes del SI: -

El valor del metro (m), que es la unidad base de la magnitud de masa, ha cambiado a lo largo de la historia, desde ser definido como la diezmillonésima fracción del meridiano cero hasta la actual (17ª CGPM – 1983) que es la distancia recorrida por la luz en el vacío en una fracción de 1/299792458 de segundo, fundamentado en la velocidad de la luz en el vacío. Reproducida por medio de un láser estabilizado en un vacío.

-

El segundo, unidad de tiempo, es la duración de 9192631770 periodos de la radiación correspondiente a la transición entre los dos niveles hiperfinos del estado fundamental del átomo de Cesio 133, debido a que la frecuencia de transición del Cesio 133 en su estado base es de 9192631770 Hz. Esta es, desde la 13ª CGPM celebrada en 1967, la definición del segundo y muy importante para establecer el Tiempo Universal Coordinado (UTC). El UTC 6

es la escala de tiempo atómico que es usado para la coordinación de actividades científicas y tecnológicas a nivel mundial, constituye la base de todos los sistemas de tiempo civil y es el tiempo transmitido por radio señales. A diferencia de la escala del Tiempo Universal (UT), que está referido

al

Meridiano

de

Greenwich

y

que

se

obtiene

mediante

observaciones astronómicas, el UTC se obtiene mediante las mediciones de los relojes atómicos de los INM’s alrededor del mundo. A pesar de esto, ambas escalas deben coordinarse de manera que la diferencia entre ellas sea menor a 0.9 segundos. -

La unidad base de corriente eléctrica es el ampere y está definida, desde 1948 (9ª CGPM), por la cantidad de corriente que, mantenida entre dos conductores rectilíneos paralelos de longitud infinita y de sección circular despreciable colocados a un metro de distancia en el vacío, producirá una fuerza de 2*10-7 N/m. Surge a partir de la constante magnética μ0=1.256637*10-6 N/A2 y se reproduce por el efecto Josephson.

-

La definición de la unidad de temperatura termodinámica fue adoptada desde la 10ª CGPM en 1954 y, al igual que con el kilogramo, solo ha sido modificada en la redacción y forma de la definición en la 13ª CGPM donde se cambió de “grado Kelvin” a “Kelvin” el cual es la fracción 1/273.16 de la temperatura termodinámica del punto triple del agua (con una composición isotópica definida). En principio, es debido a que experimentalmente la temperatura en el punto triple del agua es de exactamente 273.16 K.

-

Un mol es la cantidad de sustancia de un sistema que contenga tantas entidades elementales como átomos hay en 0.012 kilogramos de Carbono 12 (14ª CGPM – 1971). Se llega a esta definición sabiendo (mediante espectrometría de masas) que la masa molar del

12C

es exactamente 12

g/mol. Un mol equivale exactamente al Número de Avogadro que es 6.022*1023. -

Finalmente la candela (unidad base de la intensidad luminosa) se define en la 16ª CGPM en el año de 1979 como la intensidad luminosa, en una dirección dada de una fuente que emite una radiación monocromática de 7

frecuencia 540*1012 Hz y cuya intensidad energética en esa dirección es de 1/683 watt por esterradián. Además el SI contempla unidades y magnitudes derivadas de las fundamentales como el área (m2), la fuerza (N), la potencia (W), etcétera (Martínez-Benjamín, 2001; Wilson y Buffa, 2003; Bureau International des Poids et Mesures, 2006).

1.4 Incertidumbre. El resultado de una medición es de poca utilidad si no se acompaña de algún indicador de la calidad de esa medición, para dicho propósito se emplea el término incertidumbre. Existen múltiples definiciones de Incertidumbre, incluso el Vocabulario Internacional de Metrología (VIM) ha mencionado distintas de ellas en cada una de sus tres ediciones. Sin embargo, antes de indicar un significado generalizado de Incertidumbre, es necesario conocer otros conceptos que nos ayudan a comprenderla. Error de medida es el valor obtenido de una medición menos el valor de referencia. El error sistemático es una componente del error de medida que, tras realizar mediciones repetidas, permanece constante o varía de manera predecible, a diferencia del error aleatorio que, al igual que el anterior en mediciones repetidas, será el que varía impredeciblemente. Durante una medición se pueden obtener distintos valores de la magnitud medida conocidos como Resultados de Medición, el más certero de ellos es el Valor Verdadero que es aquel valor de una magnitud consistente con la definición de la magnitud, a grandes rasgos es el valor que no posee incertidumbre ni error. Es imposible dar con este valor pero es importante para comprender la incertidumbre. La indicación y el Valor Nominal van de la mano ya que ambas son valores proporcionados por el instrumento de medición pero el primero es aquel que se muestra al realizar el procedimiento y el segundo es el que sirve de guía para su utilización apropiada. Finalmente el Valor Medido es el valor de la una magnitud que representa un resultado de medición, de acuerdo a la GUM es el resultado que ha sido corregido de todos los efectos sistemáticos significativos reconocidos. 8

El VIM, en sus diferentes ediciones, ha definido Incertidumbre de Medida de la siguiente manera: -

VIM 3ª edición, concepto 2.26: Parámetro no negativo que caracteriza la dispersión de los valores atribuidos al mensurando, basado en información usada.

-

VIM 2ª edición, concepto 3.9: Parámetro asociado con el resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían razonablemente atribuirse al mensurando.

-

VIM 1ª edición, concepto 3.09: Una estimación que caracteriza el intervalo de valores dentro de los cuales se halla el valor verdadero de un mensurando.

De cada significado podemos extraer información importante. Por ejemplo, de acuerdo al VIM 2ª edición sabemos que la incertidumbre de medida debe estar asociado al resultado de una medición, es decir al Valor Medido, resultado de la corrección del error sistemático al Valor Nominal o Indicación. Aprovechando el concepto, es importante mencionar que todo Valor nominal o indicación a la que no se le aplique una corrección, se reporta el valor con la incertidumbre correspondiente a la cual se le adicionará el error sistemático que no se corrigió. En cuanto al término “razonablemente” quiere decir que debe tener un fundamento matemático que garantice que esa dispersión es adecuada al mensurando, esto se reafirma en la definición del VIM 3ª edición al mencionar “basado en información usada”. A pesar de reportarse como “±incertidumbre” eso no implica que sea un parámetro negativo, significa que el valor verdadero puede estar por encima o por debajo del valor medido (o valor nominal). Tomando en cuenta la definición del VIM 1ª edición, acerca de que es un intervalo, es decir que tiene límites establecidos, en donde podemos encontrar al valor verdadero. Si bien no podemos encontrar al valor verdadero de un mensurando, si podemos afirmar que se encuentra en el intervalo que representa a la incertidumbre. Existen varias clasificaciones de incertidumbre (inclusive una desviación estándar es una incertidumbre estándar), pero todas ellas pueden clasificarse en dos grupos principales: 9

-

La Incertidumbre tipo A es aquella incertidumbre estándar de medida que se ha obtenido mediante un análisis estadístico de los valores obtenidos bajo condiciones de medición definidas. Ejemplos: repetibilidad, reproducibilidad, precisión.

-

La Incertidumbre tipo B es aquella incertidumbre estándar determinada por medios distintos a la incertidumbre tipo A. Ejemplos: valores publicados, el certificado del material de referencia, exactitud de un instrumento de medición.

Toda medición tiene fuentes de incertidumbre y ellas deben clasificarse dependiendo la manera en que fueron obtenidas en A o B, para después formar parte de la Incertidumbre Combinada que es aquella incertidumbre obtenida usando todas las anteriores mediante un cálculo matemático. Este cálculo se refiere a una función que correlaciona las incertidumbres estándar y es conocida como Ley de propagación de incertidumbres y es la que se muestra a continuación:

𝑢𝑐 (𝑦) = √𝑢2 (𝑥𝑖 ) + ⋯ + 𝑢2 (𝑥𝑁 ) Pero podemos notar que para obtener este parámetro, las incertidumbres estándar deben estar en las misma unidades que el mensurando, en muchas ocasiones, las incertidumbres tipo A y B pueden no estar expresadas en la misma escala que el mensurando, por ejemplo si se evalúa la incertidumbre causada por la temperatura en la medición de un material de metal, o la generada al realizar cambios de unidades de un sistema a otro. Cuando entre las fuentes de incertidumbres existen ejemplos de esto, debe realizarse un presupuesto de incertidumbre que es la declaración de una incertidumbre de medida, de los componentes de esa incertidumbre y de su cálculo y combinación. Con este documento, se pueden observar todas las fuentes de incertidumbre, el valor numérico de su incertidumbre, las unidades, el modelo matemático que se usa para la conversión, el valor obtenido de la incertidumbre asociada y el porcentaje de impacto que tiene cada fuente en la incertidumbre combinada. Con todo esto, podemos afirmar que la Incertidumbre finalmente es un parámetro estadístico, por tanto, la expresión de ésta debe poseer un nivel de confianza 10

conocido como probabilidad de cobertura que es la probabilidad de que el conjunto de los valores verdaderos de un mensurando estén contenidos en un intervalo de cobertura especificado. Este intervalo es equivalente a la Incertidumbre expandida y será igual al producto de una incertidumbre estándar combinada por un factor numérico entre uno y tres conocido como factor de cobertura (Internation Joint Comittee for Guides in Metrology, 2008). El factor de cobertura será elegido en función del nivel de confianza, suponiendo distribución normal (Figura 1), que se quiera asignar al valor de incertidumbre expandida (Cuadro 2).

Cuadro 2. Factores de Cobertura (k) asignados a niveles de confianza.

68.27%

Factor de Cobertura (k) 1

90%

1.645

95%

1.960

95.45%

2

99%

2.576

99.73

3

Nivel de Confianza

Figura 1. Distribución normal y sus niveles de confianza. 11

1.5 Entidad mexicana de acreditación y Norma ISO 17025. Con la finalidad de asegurar que los servicios de calibración sean seguros, confiables y de alta calidad para el cliente, la Organización Internacional de Estandarización (ISO) a través de la Comisión Electrotécnica Internacional emiten la Norma: ISO/IEC 17025:2005 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. En México, la norma equivalente es la NMX-EC-17025IMNC-2006 Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración. Siendo el punto de “requisitos técnicos” el apartado que expone todos aquellos lineamientos que un laboratorio de calibración debe tomar en cuenta para poder ser acreditado en esta norma. La entidad mexicana de acreditación, a. c. (ema) es la primera entidad que tiene como objetivo acreditar a los laboratorios de calibración y otros Organismos de la Evaluación de la Conformidad en esta norma. Una acreditación es el acto por el cual una entidad de acreditación reconoce la competencia técnica y confiabilidad de los laboratorios.

2. ANTECEDENTES. 2.1 Metrología Óptica. La Optical Society (OSA) define a la óptica como el estudio de la luz, de la manera como es emitida por los cuerpos luminosos, de la forma en que se propaga a través de los cuerpos transparentes y de la forma en que es absorbida por otros cuerpos. La luz ocupa un sitio en el espectro electromagnético intermedio entre las ondas largas de radio y los rayos cortos X y gamma que va desde la luz infrarroja hasta la radiación ultravioleta. Sin embargo, todo este rango está regido por las mismas leyes básicas, y por tanto, el estudio de la radiación electromagnética se aplica de alguna manera a otras partes del espectro (Smith y Thompson, 1979). En base a estas aseveraciones, la metrología óptica es la encargada del estudio de las mediciones que impliquen la interacción de la materia con la radiación electromagnética. Actualmente, existen muchos instrumentos analíticos que utilizan como fundamento teórico la incidencia de radiación electromagnética (visible, ultravioleta o infrarroja), proveniente de una fuente emisora, sobre una sustancia, 12

para obtener la medida de un mensurando. Por ejemplo, los espectrocolorímetros emiten radiación visible (dentro del intervalo entre 400 y 750 nm en longitud de onda) sobre una superficie no transparente y miden el mensurando conocido como reflectancia difusa (ρ), fundamentado en que todo objeto o sustancia colorida absorberá cierta cantidad de esta radiación y reflejará la restante, de esta manera el color que el ojo percibe es el correspondiente a la energía reflejada a la longitud de onda correspondiente (Figura 2).

Figura 2. Representación gráfica de la relación entre reflectancia (ρ) y color. Además, con cálculos, se pueden obtener las medidas de coordenadas de color y valores triestímulo que son magnitudes derivadas de la reflectancia difusa (Shah y Gandhi, 1990). Otro ejemplo de instrumentos ópticos para análisis son los refractómetros. Estos instrumentos tienen la capacidad de medir dos mensurandos equivalentes que son el índice de refracción (η) y el porcentaje de sacarosa/sal (sólidos disueltos) conocido también como % Brix o º Brix, ambas fundamentadas en el cambio del ángulo de un haz de luz, a una longitud de onda dada, al pasar de un medio. El índice de refracción de las sustancias es una propiedad intensiva de las mismas y por lo mismo no importará la cantidad de elemento o compuesto, éste siempre tendrá el mismo índice de refracción, siendo la temperatura la principal causante (y mayor fuente de incertidumbre) de que esta magnitud varíe. Por otro lado, también se sabe que el índice de refracción es directamente proporcional (a temperatura constante) a la densidad de la solución, lo que ayuda a medir el %Brix o porcentaje de sacarosa disuelto en la misma. Se usa comúnmente el término de

13

sacarosa o azúcar disuelto pero aplica también para sales, proteínas, ácidos, etcétera, presentes en la solución. Los refractómetros son ampliamente utilizados en la industria de alimentos y existen tanto analógicos como digitales, además hay dos sistemas para medir el índice de refracción los cuáles son: el sistema transparente y el sistema de reflexión (Figura 3).

Figura 3. Sistema transparente (arriba) y de reflexión (abajo) para medición de índice de refracción. Estos instrumentos, como todos, trabajan con un error y una incertidumbre propios los cuáles deben ser determinados mediante una calibración, la cual les otorgará trazabilidad al CENAM o a algún otro INM. El CENAM mantiene los patrones nacionales para estas magnitudes y que, a pesar de no ser constantes físicas, son instrumentos (o soluciones) con incertidumbre muy baja y con trazabilidad a patrones internacionales. Por ejemplo, en refractometría con sistema transparente de medición el patrón nacional es un

14

refractómetro tipo ABBE marca Bausch & Lomb modelo 33.46.10 certificado y trazable al Sistema de Referencia de Refractometría y su incertidumbre es de ±0.00031 unidades en índice de refracción. Para refractómetros con sistema de reflexión se utilizan soluciones certificadas elaboradas por laboratorios calibrados por el NIST (National Institute of Standars and Technology), Instituto Nacional de Metrología de Estados Unidos. Por otro lado, el patrón nacional de reflectancia es el Sistema Nacional de Espectrofotometría y que consta de un espectrofotómetro de alta exactitud, estabilidad y reproducibilidad y un juego de materiales de referencia certificados, ambos son calibrados periódicamente por el NIST. Si bien, los espectrocolorímetros y los refractómetros son instrumentos ópticos de gran importancia en análisis cualitativos, existen unos que tienen mayores propiedades y usos en varios sectores, desde industria hasta investigación, éstos son los espectrofotómetros UV-Visible y que son el motivo de éstas memorias de trabajo.

2.2 Espectrofotometría UV-Visible. Se sabe que el espectro electromagnético está constituido por una amplia gama de ondas de distinta energía que es dependiente de la longitud de onda (λ) y/o de la frecuencia (ν) de la misma (Figura 4). Éstas ondas, emitidas por distintas fuentes, pueden ser tan pequeñas (del orden de 10 -12 metros) como los rayos gamma o tan grandes (del orden de 104 metros) como son las radiofrecuencias.

Figura 4. Espectro electromagnético en longitud de onda en metros (escala superior) y en frecuencia en Hz (escala inferior) 15

La espectrofotometría UV-Visible es una técnica del área óptica que utiliza radiación electromagnética en los intervalos ultravioleta (de 200 nm a 400 nm aproximadamente) y visible (de 400 nm a 750 nm aproximadamente) para realizar análisis cualitativos y cuantitativos de muestras transparentes. Se fundamenta en que, toda sustancia transparente en la que incida un haz de luz a cierta longitud de onda absorberá una cantidad de esa energía proporcional a la composición, y particularmente a la concentración, de la sustancia y transmitirá la energía restante. En química es una técnica de absorción molecular debido a que moléculas orgánicas e inorgánicas absorban en mayor o menor cantidad a diferentes longitudes de onda dependiendo del tipo de enlaces que posean (sistemas conjugados) y a las transiciones electrónicas más probables (McMurry, 2012) o de si poseen grupos cromóforos y cromógenos y al encontrarse disueltas producen soluciones coloridas (Vincent-Vela y col., 2006). El primer espectrofotómetro funcional fue inventado en la década de 1920 por Arthur Hardy y utilizaba fotoceldas de cesio para detectar el espectro. Previo a esta invención se utilizaban espectrógrafos, inventados por Walter Noel Hartley en 1877, los cuales contribuyeron (junto con los espectrómetros de masas) en el descubrimiento de nuevos elementos (Tilstone y col., 2006). Desde entonces han ido evolucionando y en la actualidad podemos encontrar espectrofotómetros analógicos y digitales, de haz simple y doble haz, de barrido automático o manual, y sus combinaciones. Pero a pesar de esto, es importante recalcar que todos ellos funcionan bajo el mismo fundamento científico. Todo espectrofotómetro UV-Visible o Visible consta de ciertas partes elementales para funcionar, éstas son: fuente de radiación, sistema monocromador, compartimiento de muestras, detector y una serie de espejos colimadores y rendijas de entrada y salida cuya función es la de afinar los haces de luz y mejorar la medición. Las fuentes de radiación en estas técnicas son lámparas de distintos tipos, la luz Ultravioleta es producida en la mayoría de los casos por una lámpara de Deuterio que emite radiación de 190 nm a 360 nm de longitud de onda, mientras que la luz visible la genera una lámpara de tungsteno-halógeno y va de 320 nm a 2500 nm 16

(IR-cercano), en ambas su funcionalidad es dependiente de la temperatura de la lámpara y es por esto que previo a usar el instrumento es necesario dar un periodo de estabilización (aproximadamente 30 minutos). También existe la lámpara de Xenón que emite radiación en las dos regiones y que, al contrario de las anteriores, no requiere estabilizarse ya que solo enciende cuando analiza y en forma de pulsos frecuentes. Posterior a la generación de la radiación, ésta pasa al selector de longitud de onda que en la mayoría de los casos es un monocromador que consta de un slit (rendija) de entrada, un espejo colimador, que homogeneiza la trayectoria de la luz y logra que toda ella incida uniformemente sobre el siguiente componente, un prisma o una red de reflexión los cuáles dispersarán la luz blanca o ultravioleta en todas sus longitudes de onda, otro espejo cóncavo que dirigirá la luz hacia una superficie en donde se encuentra el slit de salida. El elemento dispersor (prisma o red) es el que posee movimiento en el instrumento y que generará los cambios controlados de longitud de onda. El slit de salida es un elemento importante a tomar en cuenta, ya que éste determinará la resolución de las bandas de absorción de un barrido, es decir, controlará lo que se conoce como Ancho de Banda Espectral (ABE) y que se define como la separación de los parámetros del monocromador necesaria para mover la imagen de la rendija de entrada enfrente de la rendija de salida, entre menor sea el ABE mayor será la resolución de las bandas, lo que causará mayor ruido. Cada espectrofotómetro tiene una ancho de banda espectral distinto y en los más actuales se puede controlar. Al haber seleccionado la longitud de onda, esta radiación casi monocromática pasa al compartimiento de muestras que usualmente contiene la celda con la sustancia a analizar. Finalmente, la luz transmitida es dirigida al sistema transductor o detector del instrumento, este es, en la mayoría de los casos un fototubo que consta de un cátodo muy sensible a la radiación, al incidir en él la radiación proveniente de la muestra, electrones del cátodo se dirigen al ánodo colocado frente al él, generando una diferencia de potencial que es proporcional a la cantidad de radiación que transmitida. Un detector con un fundamento similar es el tubo fotomultiplicador, el cual también tiene un cátodo sensible solo que está vez tiene en frente un dínodo, los dínodos son dispositivos con la capacidad de fotomultiplicar los electrones que chocan con 17

él y dirigirlos al siguiente dínodo, frente al último dínodo se encuentra el ánodo que medirá la diferencia de potencial y generará una respuesta proporcional a los fotones transmitidos. La desventaja de estos detectores es que son lentos, sin embargo el tubo fotomultiplicador es más sensible. En cuanto a rapidez, existe un detector ideal que son los fotodiodos de silicio, sin embargo, a pesar de procesar la señal rápidamente su sensibilidad está muy por debajo de los fototubos y de los tubos fotomulplicadores. Hay muchos otros detectores en espectrometría pero son utilizados para otras zonas del espectro electromagnético como el infrarrojo (Skoog y col., 2008).

Figura 5. Esquema de los componentes de un espectrofotómetro UV-Visible de haz simple. El detector generará una señal de salida que el usuario podrá leer en unidades de transmitancia (τ) o absorbancia (α). Ambas son magnitudes adimensionales que indican la potencia radiante transmitida o absorbida por la muestra, sin embargo a partir de la que es medida por el instrumento y mediante cálculos, se puede obtener la otra de acuerdo a la siguiente ecuación:

𝛼 = −log 𝜏 Esta escala, llamada escala fotométrica, es la que variará con respecto a la escala de longitud de onda (λ) de acuerdo a las propiedades de la muestra (absortividad) que se analice en el espectrofotómetro UV-Visible, así como de la concentración de la misma y al tamaño de la celda que la contenga. De esta manera establecemos que existen dos escalas de medida en el instrumento y que pueden ser calibradas con materiales de referencia trazables a un patrón nacional (Figura 6).

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Figura 6. Instrumento patrón del Sistema Nacional de Espectrofotometría. Las fuentes de incertidumbre tomadas en cuenta para la calibración de espectrofotómetros UV-Visible son las siguientes: - Incertidumbre por repetibilidad (uA). - Incertidumbre del material de referencia (uB). - Incertidumbre por la resolución del instrumento (uResolución). La incertidumbre por repetibilidad se calcula de acuerdo a la siguiente ecuación:

𝑢𝐴 =

𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑀á𝑥𝑖𝑚𝑜 −𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑀í𝑛𝑖𝑚𝑜 2√3

La incertidumbre del material de referencia se obtiene del certificado de calibración del mismo, sin embargo, este parámetro ha sido obtenido con cierto nivel de confianza, por lo que es el producto de la incertidumbre combinada por un factor de cobertura (k). Para incluirla en el cálculo de incertidumbre de la calibración debemos anular este producto y trabajar solo con la incertidumbre combinada del material:

𝑢𝐵 =

𝐼𝑛𝑐𝑒𝑟𝑡𝑖𝑑𝑢𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑒𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜 𝑘

Y finalmente, la incertidumbre por la resolución del instrumento se calcula con la fórmula:

𝑢𝑅𝑒𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 =

𝑅𝑒𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝐼𝑛𝑠𝑡𝑟𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 2√3

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Teniendo estos datos se obtiene la incertidumbre combinada mediante la Ley de Propagación de la Incertidumbre y se le aplica un factor de cobertura de 2 (Intervalo de confianza de ≈95.5%). Si

bien,

existen

otras

fuentes

de

incertidumbre

en

la

medición

con

espectrofotómetros UV-Visible: - Incertidumbre del ruido fotométrico. - Incertidumbre por estabilidad del instrumento. - Incertidumbre por luz extraviada. Algunos instrumentos realizan una validación de estos parámetros antes de cualquier análisis y es posible incluirlos en el cálculo de incertidumbre instrumental si se registran los resultados. Para los que no cuentan con esta característica, existen filtros especiales para evaluar dichas fuentes de incertidumbre, sin embargo hay espectrofotómetros que por su capacidad y diseño no alcanzan a detectarlos, en cuyo caso se considerarán parte del error del instrumento.

2.3 Calibración de la escala fotométrica. La escala fotométrica, como hemos visto, está en unidades de transmitancia o de absorbancia. Para su calibración, usualmente se emplean vidrios o películas conocidos como Filtros de Densidad Neutra (FDN). Estos filtros tienen un valor nominal aproximado en todo el intervalo UV-Visible, sin embargo, para utilizarse como materiales de referencia, deben poseer valores certificados a longitudes de onda establecidas por el CENAM y otros INM’s. Para realizar la calibración de la escala fotométrica se debe ajustar el espectrofotómetro a la primer longitud de onda a la que se certificaron los filtros, y medir el blanco (que tanto en esta escala como en la de longitud de onda será el aire), después se mide el primer filtro y se registra el valor nominal de transmitancia, se retira el primer filtro, se coloca el segundo y se realiza la medición, y se repite hasta el cuarto filtro, posteriormente se vuelve a medir el blanco y se inician nuevamente las mediciones, esto es por triplicado. En seguida, se ajusta el instrumento a la siguiente longitud de onda del certificado para comenzar con un nuevo triplicado. Todo esto con cada longitud de onda. Se 20

mencionó que a lo largo del tiempo han ido desarrollándose diversos modelos de espectrofotómetros, muchos de ellos tienen la capacidad de medir a múltiples longitudes de onda o de realizar barridos automáticos y después obtener los datos gráficamente o en tabulación. Esto facilita ampliamente el trabajo de la calibración, pero éste sería el procedimiento general. Obteniendo los datos, se calculan los errores de ajuste y las incertidumbres expandidas para cada longitud de onda y se reportan en el certificado generado, además se muestran los datos en % de transmitancia y en absorbancia, aunque la toma de datos solo se haya realizado en una de esas magnitudes, la otra se obtiene matemáticamente. Los espectros de los

Transmitancia (%)

filtros de densidad neutra (FDN) certificados se muestran en la Figura 7.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

FDN 3% FDN 30% FDN 50% FDN 90%

300

400

500

600

700

800

900

Longitud de onda (nm)

Figura 7. Espectro de los FDN en el intervalo visible. 2.4 Calibración de la escala de longitud de onda. Esta calibración consiste en localizar las bandas de absorción certificadas de dos compuestos cuyas propiedades le otorgan estabilidad y homogeneidad y por lo mismo pueden ser utilizados como materiales de referencia. Estos compuestos son el óxido de didimio y el óxido de holmio, este último se encuentra en presentaciones de vidrio y en solución de ácido perclórico dentro de una celda de cuarzo sellada para evitar su contacto con el medio (Figura 8). Cada uno de ellos

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nos sirven para la calibración de la escala de longitud de onda pero uno es para el intervalo ultravioleta (óxido de holmio) y el otro para el visible (óxido de didimio).

Figura 8. Filtros óxido de didimio (derecha) y óxido de holmio en solución (izquierda). Para la toma de datos se debe tener en cuenta varios puntos, el primero de ellos es el tipo de espectrofotómetro a calibrar, si es un instrumento que únicamente trabaja en el intervalo visible se buscarán las bandas del didimio y solo aquellas bandas del holmio que estén dentro del rango del espectro, sin embargo, si alcanza también el intervalo ultravioleta, se localizarán las bandas del holmio y las restantes del didimio. Además de esto, se debe saber si puede realizar un barrido automático o si debe hacerse de manera manual. De ser automático deben cuidarse la manera en que se capturan los datos ya que en muchas ocasiones, al procesar los datos, el software muestra algo que no va de acuerdo a la resolución del instrumento, u omite bandas por no poseer la altura de rechazo adecuados. Pero de ser manual lo que debe cuidarse es la resolución. Los certificados de estos materiales muestran las longitudes de onda a las cuáles el patrón nacional encontró los mínimos de transmitancia o los máximos de absorbancia con una resolución de 0.01 nm, lamentablemente, la mayoría de los instrumentos tienen una resolución de 1 nm en longitud de onda. Cuando esto ocurre, el valor certificado debe redondearse a la

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resolución del espectrofotómetro y realizar barridos para cada banda certificada tomando el valor certificado como punto medio y tomar cinco unidades inferiores y superiores a este. Se buscan los mínimos de transmitancia y se registra la longitud de onda en la cual se encontraron. Se realiza también por triplicado para ser considerado el mejor valor del mensurando y tener datos para la medición de la incertidumbre. Los espectros de estos materiales son muy característicos (Figura 10) y ambos forman parte de las tierras raras. El holmio

es un lantánido

descubierto en Estocolmo con número atómico 67, a finales del siglo XIX durante la época en que la espectrometría de masas ayudó a identificar y aislar gran cantidad de nuevos elementos, aunque no solo ayudó a identificar los nuevos, también gracias a ella se eliminaron elementos que finalmente eran mezclas, por ejemplo el didimio, el cual se encontraba en las primeras tablas periódicas de los elementos pero en 1885 se descubre que era una combinación de neodimio y praseodimio (ambos lantánidos). Sin embargo, desde esa época se dan cuenta que tienen bandas espectroscópicas muy particulares y por lo mismo actualmente se utilizan para la calibración de la escala de longitud de onda (Emsley, 2011). La solución de óxido de holmio que se utiliza como material de referencia es a una concentración de 40 g/L en ácido perclórico al 10%. El NIST, cuando aún era la Oficina Nacional de Normas (NBS por sus siglas en inglés), emitió una publicación especial en donde evaluaba la influencia de la temperatura, la pureza, la concentración y el ancho de banda espectral en la medición del espectro del holmio. La localización de las bandas principales no variaba más de 0.02 nm en tres

concentraciones

distintas,

aunque

no

indicaba

los

valores

de

transmitancia/absorbancia encontrados (Weidner y col., 1986). Más tarde, Travis y colaboradores re-diseñan el experimento y el análisis de datos, y encuentran que al normalizar los resultados en función de la solución al 4% la variación entre las bandas iba de 0.03 a 0.05 nm (dependiendo de la banda) contrario a lo publicado en 1986. Este estudio corrobora que la concentración adecuada de óxido de holmio para uso como material de referencia es la de 40 g/L (Travis y col., 2005).

23

Dentro de las especificaciones de todos los instrumentos se encuentra un dato muy importante para la calibración de la escala de longitud de onda que corresponde al ancho de banda espectral y que tiene un efecto directo con la resolución de las señales. Por lo mismo, cuando se certifican las bandas de los filtros de óxido de holmio se especifica el ABE y se pueden calibrar a distintos anchos de banda, para con esto abarcar una mayor campo de trabajo ya que puede haber equipos con ABE desde 1 nm hasta 20 nm. Para el óxido de didimio no es necesario calibrarlo a distintos anchos de banda ya que como podemos observar en la figura 9, sus bandas características son muy anchas inclusive a un ABE de 1 nm (ASTM, 2013).

Figura 9. Espectros del óxido de holmio (arriba) y del óxido de didimio (abajo) a un ABE = 1 nm 2.5 Espectroscopía infrarroja. La región del espectro electromagnético correspondiente a la radiación infrarroja comienza a los 0.7 μm y termina a los 1000 μm aproximadamente en longitud de onda (Figura 10) y está dividida en tres regiones conocidas como NIR (Infrarrojo cercano), MIR (Infrarrojo medio) y FIR (Infrarrojo lejano). Cada región tiene diferentes aplicaciones debido a su interacción con la materia. El NIR viene a ser una extensión de la técnica de espectrofotometría UV-Visible y, si bien no se le usa

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para la identificación y caracterización de compuestos, se utiliza para análisis cuantitativos. Pero la región del IR con mayor utilidad es el MIR debido a que la información que se puede obtener de un espectro en este intervalo es de gran ayuda puesto que en él aparecen bandas características de los distintos tipos de enlaces que posee una molécula orgánica lo que sirve (parcialmente) para la identificación de nuevos compuestos.

Figura 10. Distribución de la radiación IR en el espectro electromagnético. Fundamentalmente, un espectrómetro infrarrojo cuenta con un principio físico similar al de los espectrofotómetros UV-Visible, ya que cuenta con una fuente emisora de radiación la cual incide en una muestra que absorberá parte de esta energía y transmitirá la restante, que será detectada por un transductor de señal reportando ya sea medidas de transmitancia y/o absorbancia o un espectro. Sin embargo, a nivel molecular difiere bastante, puesto que no implica transiciones electrónicas (radiación ultravioleta) o absorción de radiación visible debida a la coloración. Los compuestos orgánicos presentan en su estructura enlaces (simples, dobles o triples) tipo covalente entre átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, entre otros, la absorción de radiación infrarroja por estas moléculas ocasiona cambios vibracionales en sus enlaces (Figura 11) y que dependen de la longitud de onda de dicha radiación. Además, esta absorción molecular implica que habrá una diferencia entre la intensidad radiante emitida por la fuente y la intensidad radiante que llega al detector, y por esto, cuanto mayor sea la energía requerida para hacer vibrar un enlace a cierta longitud de onda mayor será la absorción y menor la transmisión generando, gráficamente, máximos de absorbancia y mínimos de transmitancia, es decir, un espectro IR del compuesto. 25

Figura 11. Vibraciones moleculares ocasionadas por radiación IR. A pesar de que el arreglo óptico de los instrumentos infrarrojos es bastante similar al de los UV-visible, sus componentes difieren bastante uno de otro. Sin embargo, es necesario indicar que actualmente existen, de manera general, dos tipos de espectrómetros IR: los sistemas dispersivos y los espectrómetros por transformada de Fourier (FT-IR). Los sistemas dispersivos tienen prácticamente el mismo diseño de un espectrofotómetro UV-visible de doble haz, con ellos es necesario indicar el número de onda que quiere ser analizada y nos dará un dato en absorbancia en transmitancia, debido a que, como se observa en la Figura 12, cuenta con una red de difracción que permite seleccionar la longitud de onda. Aunque se distingue de los espectrofotómetros en que el sistema monocromador está después del compartimiento de muestras/referencia. Debido a este sistema en el cuál únicamente se pueden ir recopilando resultado por números de onda individuales, el análisis es considerablemente lento suponiendo que se quieran localizar todas o algunas bandas de absorción/transmisión de una sustancia. Los espectrómetros FT-IR no tienen el monocromador pero poseen un componente adicional que le da rapidez, precisión y exactitud al análisis, un interferómetro de Michelson (Figura 13).

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Figura 12. Diseño óptico de un espectrómetro infrarrojo dispersivo. El interferómetro de Michelson está constituido por un láser, un divisor de haz y dos espejos, uno de ellos móvil y el otro fijo. La radiación incide en el divisor de haz que la separará, cierta cantidad pasará al espejo fijo y la restante al móvil, ambas volverán al divisor que unirá ambos haces que formarán una radiación combinada, sin embargo, parte de esa radiación habrá recorrido una distancia diferente y proporcional a la velocidad del espejo móvil (que es constante). Esta diferencia en distancias genera interferencias, destructivas y constructivas, en la longitud de onda de la radiación resultante. El láser (hélio-neón) de alta precisión del interferómetro emite radiación a una longitud de onda única y estable (632.8 nm) pero recorre el mismo camino que el haz de la fuente infrarroja. Éste láser sirve como base para la escala de longitud de onda y controla, además, la velocidad del espejo móvil del interferómetro. La radiación con interferencias incide en la muestra y posteriormente en el detector. Las ondas en la región infrarroja son considerablemente más amplias que las del visible o las del ultravioleta, recordemos que la energía de una onda es inversamente proporcional a su longitud de onda, por lo mismo, la radiación IR no genera la energía suficiente para desprender electrones de una superficie, por esto no se pueden usar fototubos o fotomultiplicadores como detector, pero si generan energía para provocar un cambio de temperatura, por esta razón los transductores de la señal en espectrómetros FT-IR miden conductividad térmica. 27

Figura 13. Diseño óptico de un espectrómetro FT-IR. Las fuentes de radiación infrarroja están constituidas por materiales que encandecen a temperaturas bajas (aproximadamente 1500 ºC), comparadas con las fuentes de UV-visible (aproximadamente 3000 ºC), las más comunes son pequeñas barras de carburo de silicio, conocida generalmente como Globar, y el emisor de Nernst, que es una varilla compuesta de óxidos de zirconio, itrio y torio. Ambas tienen un alcance similar, sin embargo, los componentes del emisor de Nernst irradian mayor energía en el intervalo debajo de los 2000 cm -1, por encima de este número de onda, se obtendrán mayores energías usando Globar como fuente de radiación. Existen otros emisores como el arco de mercurio o incluso filamento de wolframio (fuente de radiación visible) puede funcionar. Se usan detectores de conductividad térmica, debido a la baja energía que poseen las ondas de la región infrarroja, de alta sensibilidad a los cambios de temperatura Entre los más utilizados se encuentran el detector DLaTGS (sulfato de triglicina deuterado dopado de L-alanina) y el detector MCT (telururo de mercurio-cadmio). El DLaTGS es el detector estándar de los FT-IR y provee excelente respuesta en todo el intervalo (12500 cm-1 a 350 cm-1). El MCT es un detector más especializado y que es más rápido y sensible que el DLaTGS, además elimina el ruido térmico puesto que trabaja a la temperatura del nitrógeno líquido, lo cual representa una ventaja y desventaja a la vez frente al DLaTGS que opera a temperatura ambiente. Otra desventaja del MCT es que el intervalo de mayor eficacia es menor al otro

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detector ya que va de 11700 cm-1 a 800 cm-1. Bolómetros y termopares también son utilizados como detectores de infrarrojo pero para la región del FIR y con menores niveles de sensibilidad. Finalmente, en cuanto a instrumentación, se ha implementado una técnica altamente efectiva en la medición usando FT-IR. Esta técnica permite analizar muestras en cualquier fase con mayor facilidad y se conoce como Reflectancia Atenuada Total (ATR por sus siglas en inglés). Consiste básicamente en colocar la muestra por analizar en un cristal con un elevado índice de refracción (el ATR), en uno de sus extremos incide el rayo de radiación infrarroja el cuál se dirige a la superficie donde se encuentra la muestra que absorbe la energía propia de su composición, la radiación restante se refracta hacia la otra superficie debido a su alto índice de refracción, esta zona funciona a manera de espejo y refleja el haz nuevamente a la superficie donde está la muestra, repitiéndose de 5 a 10 veces dependiendo del tamaño del ATR. En cada ocasión en que la radiación incide en la muestra, la señal se atenúa y mejora la calidad del haz resultante (Figura 14).

Figura 14. Representación gráfica del funcionamiento del ATR. El uso de esta técnica elimina la necesidad de celdas especiales para muestras líquidas o de una composición particular para sólidos. La única condición es que la muestra ocupe totalmente la ventana del ATR para evitar la interferencia del medio (Smith y Thompson, 1979; Walton y Reyes, 1983; Olsen, 1990; Griffiths y de Hasset, 2007; Skoog y col., 2008).

29

2.6 Calibración de escala de número de onda. La incorporación del láser He-Ne en los espectrómetros infrarrojos es el principal avance instrumental en este campo. Este láser es la base de la medición en la escala de número de onda y por tanto es susceptible a calibración. Durante años, se han investigado gran cantidad de compuestos que pudieran ser candidatos a materiales de referencia para calibración de la escala de número de onda. Se probó con compuestos en estado gaseoso durante muchos años y se encontró que, a pesar de que muchos de ellos presentaban señales en la región infrarroja (incluso en la ultravioleta y visible), sus bandas eran demasiado anchas como para considerarse materiales de referencia ya que la incertidumbre de las mismas sería increíblemente elevada. Otras de estas especies tenían bandas con una resolución muy buena pero eran insuficientes para cubrir todo el rango. Sin embargo, estos estudios facilitaron la creación de una base de datos conocida como HITRAN (highresolution transmission molecular absorption database) que cuenta con los espectros infrarrojos de alta resolución de al menos 37 especies, los cuales se utilizan más como modelos que para calibración, ya que algunos de estos compuestos manejan un alto grado de peligrosidad o requieren resoluciones muy específicas que no todos los instrumentos poseen. En cuanto a materiales sólidos y líquidos se estudiaron metanol, 1,2,4-triclorobenceno, metilciclohexano, tolueno y el poliestireno en presentación de lámina de 25 μm de espesor. Muchos años se compitió entre el poliestireno y el indeno (líquido) ya que encontraban cada vez más bandas de absorción purificando o mezclando al indeno o cambiando el espesor del poliestireno. Finalmente el NIST y el NPL proponen al poliestireno sobre el indeno como material de referencia en la calibración de escala de número de onda, la IUPAC y la Sociedad Americana de Pruebas y Materiales (ASTM) aceptan dicha propuesta y actualmente se comercializa dicho material con su correspondiente certificado de calibración, con al menos 16 bandas certificadas (Hanssen y Zhu, 2002). En México, el Departamento de Materiales de Referencia del CENAM se encarga de la calibración y la emisión de certificados del patrón de número de onda del IR medio correspondiente a la película de poliestireno.

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3. OBJETIVOS. 3.1 Objetivo General. Adquirir los conocimientos, aptitudes, documentos y materiales necesarios para el manejo y la calibración de espectrómetros FT-IR medio y, con ello, incrementar el alcance acreditado en el área óptica del laboratorio de calibración.

3.2 Objetivos Específicos. - Obtener el espectro infrarrojo del material de referencia certificado y localizar sus bandas características. - Redactar un procedimiento de calibración de espectrómetros FT-IR. - Calibrar un espectrómetro FT-IR. - Calibrar un espectrofotómetro UV-Visible.

4. METODOLOGÍA. 4.1 Material de referencia certificado. - Adquirir una película de poliestireno junto con su certificado emitido por el Centro Nacional de Metrología. - Reportar el espectro infrarrojo, las bandas certificadas (con sus respectivas vibraciones moleculares) y las incertidumbres expandidas del material de referencia.

4.2 Procedimiento de calibración. -

Elaborar

un

procedimiento

técnico

específico

para

la

calibración

de

espectrómetros FT-IR conforme a lo establecido por el Sistema de Gestión de Calidad del laboratorio.

4.3 Calibración de espectrómetros de Infrarrojo medio. - Calibrar un espectrómetro FT-IR de acuerdo al procedimiento de calibración antes redactado. - Emitir su certificado de calibración.

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4.4 Calibración de espectrofotómetros UV-Visible. - Calibrar un espectrofotómetro UV-Visible conforme al procedimiento técnico específico del laboratorio de calibración: 

Calibración de escala de longitud de onda.



Calibración de escala de absorbancia/transmitancia.



Cálculo de incertidumbre.

- Reportar resultados de la calibración.

5. RESULTADOS. 5.1 Película de poliestireno. Se adquirió el material de referencia certificado a través del Departamento de Materiales de Referencia del CENAM, dicho material (Figura 15) consiste en una película de poliestireno de 32 µm de espesor, biaxialmente orientado y montado en una tarjeta rectangular de 11 cm por 5 cm con una ventana circular de 1.9 cm de diámetro aproximadamente.

Figura 15. Material de referencia certificado por el CENAM. El propósito de este material certificado es para calibración de la escala de número de onda de espectrómetros FT-IR en la región del espectro que va de 540 cm -1 a 3124 cm-1 (infrarrojo medio). Los valores certificados de las 16 señales seleccionadas (Figura 16) fueron obtenidos por el método del centro de gravedad y

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se encuentran reportadas en el Cuadro 3 junto con sus incertidumbres con un factor de cobertura igual a 2. Cuadro 3. Valores certificados de número de onda (σ) e incertidumbres con k = 2 de la película de poliestireno. Banda

σ (cm-1)

U (cm-1)

1

540.4*

±5.1

2

699.9

±1.0

3

842.1

±1.0

4

906.7

±0.6

5

1028.5

±0.6

6

1069.5

±1.0

7

1155.4*

±1.7

8

1583.2

±0.5

9

1601.3

±0.5

10

1943.2*

±1.5

11

2850.1

±0.5

12

2922.8*

±1.5

13

3001.3

±0.5

14

3026.2

±0.7

15

3060.0

±0.5

16

3082.2

±0.5

Para la medición de estas bandas, el CENAM utilizó un espectrómetro infrarrojo con transformada de Fourier con detector de sulfato de triglicina deuterado (DTGS) a una temperatura ambiente entre 20 °C y 23 °C y humedad relativa entre 15% y 70%, el intervalo de datos fue de 0.5 cm-1 y de 4 cm-1. Aunque aún no se considera como Sistema Nacional de Espectrometría IR, este instrumento es el patrón nacional en esta área.

33

Figura 16. Espectro infrarrojo del material de referencia certificado.

5.2 Procedimiento de calibración de espectrómetros FT-IR y parámetros espectrales. Se calibró el espectrómetro FT-IR del Laboratorio de Instrumentación Analítica, ubicado en el Centro de Estudios Ambientales sobre Contaminación Ambiental (CEACA) de la Facultad de Química de la Universidad Autónoma de Querétaro (campus C. U.), marca Perkin Elmer, modelo Spectrum 100, N° de serie: 50177 y con identificación particular: FTIR-PE. La calibración se realizó siguiendo el siguiente procedimiento: - El espectrómetro FT-IR a calibrar debe contar con el compartimiento de muestras estándar para celdas, en caso de tener una interfaz para ATR, reflectancia difusa u otro, cambiar por el antes mencionado. - Encender el instrumento de medición junto con el ordenador que tiene instalado el software de manejo. - Establecer los parámetros espectrales de la medición: intervalo, resolución, escala espectral (transmitancia/absorbancia), número de escaneos, número de mediciones (6).* - Especificar que se medirá un Background (blanco, línea base, etcétera). - Verificar que el compartimiento de muestras se encuentre vacío y limpio. - Medir Background. 34

- Especificar que se medirán las muestras. - Colocar el material de referencia en el compartimiento de muestras. La película de poliestireno debe encontrarse libre de polvo y en buenas condiciones. Puede soplarse con aire en dirección diagonal a las caras de la película, nunca perpendicularmente a ellas. - Realizar mediciones. - Identificar las bandas certificadas de absorción/transmisión en cada medición y registrarlas. - Apagar el espectrómetro y el ordenador. - Realizar el cálculo de errores sistemáticos e incertidumbres. - Emitir certificado de calibración. * Los parámetros utilizados en la calibración se presentan en el Cuadro 4 indicados como “Día 2”. Con la finalidad de realizar un análisis de repetibilidad y reproducibilidad (r&R) se hicieron mediciones en el mismo instrumento y siguiendo el mismo procedimiento pero cambiando dos parámetros espectrales los cuáles se muestran en el Cuadro 4.

Cuadro 4. Parámetros espectrales usados en la calibración del FTIR-PE. Parámetro

Día 1

Día 2

Día 3

500 cm-1 – 3200 cm-1

500 cm-1 – 3200 cm-1

500 cm-1 – 3200 cm-1

6

6

6

% Transmitancia

% Transmitancia

% Transmitancia

# de escaneos

10

64

64

Resolución

1 cm-1

0.5 cm-1

4 cm-1

Intervalo de medición # de mediciones Escala espectral

35

Error

-0.35

-0.69

-0.44

0.30

-0.12

-0.34

-0.68

0.05

0.18

-0.07

-0.21

1.19

0.18

0.27

0.39

0.53

Valor

540.05

699.21

841.66

907.00

1028.38

1069.16

1154.72

1583.25

1601.48

1943.13

2849.89

2923.99

3001.48

3026.47

3060.39

3082.73

Día 1

36

±0.51

±0.61

±0.82

±0.53

±1.82

±0.57

±1.51

±0.52

±0.51

±1.72

±1.01

±0.64

±1.03

±1.06

±3.20

±5.22

Incertidumbre

3082.68

3060.39

3026.37

3001.54

2923.96

2849.95

1942.88

1601.44

1583.28

1154.64

1069.40

1028.36

906.74

842.07

698.03

539.85

Valor

0.48

0.38

0.17

0.24

1.15

-0.15

-0.32

0.14

0.08

-0.76

-0.10

-0.14

0.04

-0.04

-1.88

-0.55

Error

±0.50

±0.51

±0.72

±0.50

±1.74

±0.52

±1.51

±0.51

±0.50

±1.70

±1.05

±0.61

±0.61

±1.01

±4.08

±5.14

Incertidumbre

Día 2

3082.12

3060.04

3025.98

3001.48

2923.74

2849.77

1942.74

1601.37

1583.16

1154.67

1069.30

1028.54

906.62

841.90

700.61

539.65

Valor

-0.08

0.04

-0.22

0.18

0.94

-0.33

-0.46

0.06

-0.04

-0.73

-0.20

0.04

-0.08

-0.20

0.71

-0.75

Error

±0.50

±0.50

±0.70

±0.50

±1.50

±0.50

±1.50

±0.50

±0.50

±1.70

±1.00

±0.60

±0.60

±1.00

±1.20

±5.10

Incertidumbre

Día 3

Cuadro 5. Resultados de la calibración del FTIR-PE (valores en cm-1).

5.3 Resultados de la calibración de un espectrómetro FT-IR.

37

Figura 17. Espectro infrarrojo de la película de poliestireno obtenido en el FTIR-PE.

Para tener un criterio de aceptación de los errores sistemáticos con respecto al valor de referencia se realizó una prueba de error normalizado para los resultados obtenidos en ambos días (Cuadro 6).

Cuadro 6. Error normalizado en la medición del material de referencia. Banda

Error Normalizado Día 1

Día 2

Día 3

1

0.05

0.08

0.10

2

0.21

0.45

0.46

3

0.30

0.02

0.14

4

0.25

0.04

0.09

5

0.14

0.17

0.05

6

0.24

0.07

0.14

7

0.28

0.32

0.30

8

0.07

0.11

0.06

9

0.25

0.19

0.09

10

0.03

0.15

0.22

11

0.28

0.22

0.47

12

0.51

0.50

0.44

13

0.25

0.33

0.25

14

0.25

0.17

0.22

15

0.50

0.54

0.06

16

0.75

0.68

0.11

Para corroborar que las medias entre los errores de las tres mediciones para cada banda no sean significativamente distintas, se evaluaron mediante un ANOVA de un factor, el Cuadro 7 muestra los valores del estadístico F de dicho análisis. La distribución de estos errores se grafica en la Figura 18, se omite la incertidumbre expandida.

38

Cuadro 7. Resultados de ANOVA para los errores sistemáticos. Valor crítico de F0.05,2,5 = 3.682 Banda

Fcalculada

Banda

Fcalculada

1

1.166

9

5.221

2

3.171

10

19.118

3

12.892

11

3.268

4

2.417

12

0.462

5

7.840

13

1.481

6

5.027

14

15.194

7

1.102

15

14.841

8

21.355

16

600.005

2.00 Medición 1 Medición 2 Medición 3

Error Sistemático (cm-1)

1.00

0.00

-1.00

-2.00 500

1000

1500 2000 Número de onda (cm-1)

2500

Figura 18. Distribución de los errores sistemáticos.

39

3000

Finalmente, se elaboraron diagramas de caja y bigotes (boxplot) para observar la dispersión de los datos en la medición de cada banda certificada para cada procedimiento (Figuras 19 y 20).

Banda 1

Banda 2

541.00

705.00

540.00

700.00

539.00 695.00

538.00 537.00

690.00 1

2

3

1

Banda 3

2

3

Banda 4

842.50

909.00

842.00

908.00

841.50

907.00

841.00

906.00

840.50

905.00 1

2

3

1

Banda 5

2

3

Banda 6

1028.80

1070.00

1028.60

1069.50

1028.40 1069.00

1028.20 1028.00

1068.50 1

2

3

1

Banda 7

2

3

Banda 8

1155.00 1154.80

1583.30

1154.60

1583.20

1154.40

1583.10

1154.20

1583.00 1

2

3

1

2

3

Figura 19. Diagramas de caja y bigotes de las mediciones en el FTIR-PE.

40

Banda 9

Banda 10 1943.50

1601.50 1601.40 1601.30 1601.20 1601.10

1943.00 1942.50 1942.00 1

2

3

1

Banda 11

2

3

Banda 12

2850.50

2926.00 2925.00

2850.00

2924.00 2849.50

2923.00

2849.00

2922.00 1

2

3

1

Banda 13

2

3

Banda 14

3001.60

3027.00

3001.40

3026.50

3001.20

3026.00

3001.00

3025.50 1

2

3

1

Banda 15

2

3

Banda 16

3061.00

3083.00

3060.50

3082.50

3060.00

3082.00

3059.50

3081.50

1

2

3

1

2

3

Figura 20. Diagramas de caja y bigotes de las mediciones en el FTIR-PE (cont.) 5.4 Resultados de la calibración de un espectrofotómetro UV-Visible. Se calibró el espectrofotómetro UV-Visible del Laboratorio de Instrumentación Analítica, ubicado en el Centro de Estudios Ambientales sobre Contaminación 41

Ambiental (CEACA) de la Facultad de Química de la Universidad Autónoma de Querétaro (campus C. U.), marca Hewlett Packard, modelo 8453 con número de serie DE91602430 e identificación interna UV/VIS-HP. La escala de longitud de onda se calibró con dos filtros, para la región ultravioleta y parte de la visible se utilizó el filtro de óxido de holmio en cristal y para la región visible un filtro de didimio. Se obtuvieron los espectros (Figura 21) y se registraron las bandas certificadas de transmisión de los materiales, esto se realizó por triplicado, en el Cuadro 8 se muestran los resultados obtenidos de la calibración de dicha escala.

Cuadro 8. Resultados de la calibración de la escala de longitud de onda del UV/VIS-HP (valores en nm). Filtro de óxido de holmio Valor Obtenido

Error (nm)

(nm)

Filtro de didimio

Incertidumbre (nm)

Valor Obtenido

Error (nm)

(nm)

Incertidumbre (nm)

280

0.68

±0.58

432

0.95

±0.58

288

0.38

±0.58

441

0.93

±0.59

334

0.07

±0.58

463

0.51

±0.83

345

0.47

±0.60

473

-0.08

±0.59

348

0.14

±0.58

480

1.02

±0.60

361

0.17

±0.58

514

0.42

±0.59

382

0.32

±0.58

529

0.03

±0.58

386

0.17

±0.58

586

0.54

±0.83

391

0.28

±0.59

624

0.28

±0.62

419

0.41

±0.59

629

-0.18

±0.62

425

0.20

±0.58

685

0.50

±0.59

537

0.65

±0.59

741

0.01

±0.83

546

0.04

±0.59

-

-

-

638

0.38

±0.59

-

-

-

42

43

Figura 21. Espectro visible del filtro de didimio (arriba) y ultravioleta visible del óxido de holmio obtenidos en el UV/VIS-HP.

En las figuras 22 y 23 se observa la distribución del error en la escala de longitud de onda junto con la incertidumbre expandida (Figura 22) y una curva simulada que modela el comportamiento de dicha distribución (Figura 23).

1.80

0.60 0.00

-0.60 -1.20 -1.80 250

305

360

415

470

525

580

635

690

745

Longitud de onda (nm)

Figura 22. Distribución del error y la incertidumbre expandida. 1.20 1.00

Error Sistemático (nm)

Error sistemático (nm)

1.20

0.80 0.60 0.40

0.20 0.00 250

350

450

550

650

750

-0.20 -0.40

Longitud de onda (nm)

Figura 23. Curva simulada del error sistemático del instrumento. 44

800

También se calibró la escala fotométrica utilizando 4 filtros de densidad neutra, únicamente para la región visible del espectro (400 nm a 900 nm), dichos filtros tienen valores certificados, tanto de absorbancia como de transmitancia, por el CENAM a distintas longitudes de onda, siendo el filtro 1 el más oscuro, y por tanto el que tiene menor transmitancia, y el filtro 4 el más claro. Los Cuadros 9 y 10 muestran los resultados (valores, errores sistemáticos e incertidumbres expandidas) de la calibración de la escala fotométrica, únicamente se muestran valores de porciento de transmitancia.

Cuadro 9. Resultados de la calibración de la escala fotométrica. Longitud de onda (nm)

Filtro de densidad neutra 1 Valor obtenido (%)

Error

Incertidumbre

(%)

(%)

Filtro de densidad neutra 2 Valor obtenido (%)

Error

Incertidumbre

(%)

(%)

400

1.700

-0.051

±0.022

27.275

0.079

±0.109

440

2.578

0.023

±0.028

27.983

0.151

±0.122

450

2.810

-0.028

±0.038

29.474

0.138

±0.108

465

3.171

-0.030

±0.024

31.238

0.210

±0.110

500

3.033

0.160

±0.077

29.130

0.247

±0.116

546.1

2.970

-0.008

±0.070

30.041

0.218

±0.119

590

2.828

0.044

±0.019

27.617

0.201

±0.100

600

2.879

0.004

±0.022

27.655

0.174

±0.101

635

3.349

-0.023

±0.056

28.564

0.173

±0.143

650

3.509

-0.081

±0.039

28.416

0.114

±0.186

700

6.117

-0.040

±0.082

34.923

0.071

±0.139

750

7.654

-0.089

±0.058

35.572

0.216

±0.137

800

7.889

0.076

±0.035

31.791

0.098

±0.167

850

7.100

-0.017

±0.140

27.870

0.169

±0.220

900

5.987

-0.220

±0.212

23.939

-0.460

±0.776

45

Cuadro 10. Resultados de la calibración de la escala fotométrica (cont.) Longitud de onda (nm)

Filtro de densidad neutra 3 Valor obtenido (%)

Error

Incertidumbre

(%)

(%)

Filtro de densidad neutra 4 Valor obtenido (%)

Error

Incertidumbre

(%)

(%)

400

48.685

0.321

±0.187

91.786

0.390

±0.348

440

47.632

0.391

±0.161

91.771

0.305

±0.341

450

49.607

0.275

±0.187

91.802

0.305

±0.359

465

52.154

0.384

±0.174

91.773

0.252

±0.359

500

50.308

0.341

±0.185

91.931

0.332

±0.340

546.1

51.459

0.398

±0.174

91.728

0.079

±0.339

590

48.921

0.409

±0.179

92.392

0.653

±0.361

600

48.824

0.322

±0.185

91.554

-0.236

±0.375

635

48.609

0.247

±0.196

91.899

0.109

±0.354

650

48.314

0.345

±0.210

92.229

0.423

±0.347

700

52.271

0.278

±0.203

91.884

0.008

±0.358

750

49.632

0.199

±0.182

92.233

0.361

±0.360

800

44.856

0.306

±0.180

92.131

0.192

±0.367

850

39.944

0.099

±0.223

91.954

0.062

±0.446

900

36.057

0.011

±1.078

92.181

-0.541

±1.785

Los valores certificados, y las incertidumbres asociadas a estos valores, de cada uno de los filtros, tanto de óxido de holmio y didimio, como los de densidad neutra, se muestran en los Anexos A, B y C. Las gráficas de la Figura 24 presentan la distribución de los errores y las respectivas incertidumbres expandidas de cada uno de los 4 filtros, en ellos se omiten los resultados obtenidos a una longitud de onda de 900 nm debido a que, como podemos ver en los Cuadros 9 y 10, las incertidumbres en este punto son considerablemente más grandes con respecto a las otras incertidumbres del mismo filtro y esto no permite observar claramente la distribución en los demás puntos.

46

0.300 0.100 -0.100 -0.300 350

450

550 650 Longitud de onda (nm)

750

850

750

850

750

850

750

850

Error sistemático (%)

Filtro de densidad neutra 2 0.400 0.200 0.000 -0.200 350

450

550 650 Longitud de onda (nm)

Error sistemático (%)

Filtro de densidad neutra 3 0.500 0.300 0.100 -0.100 350

450

550 650 Longitud de onda (nm)

Filtro de densidad neutra 4 Error sistemático (%)

Figura 24. Distribución del error sistemático en escala fotométrica.

Error sistemático (%)

Filtro de densidad neutra 1

1.050 0.700 0.350 0.000 -0.350 -0.700 350

450

550 650 Longitud de onda (nm)

47

6. DISCUSIÓN. El poliestireno (Figura 25) es un polímero formado por n unidades de metilenos unidos a anillos aromáticos.

Figura 25. Unidad fundamental del poliestireno. La película de poliestireno adquirida y utilizada como material de referencia tiene la característica de estar biaxialmente orientada. Puede que esto no represente mayor significado que el de ser la responsable de la transparencia de la película. Sin embargo, también nos indica la tacticidad del polímero con el que trabajamos. Siendo biaxialmente orientado, implica que realizando dos cortes axiales la orientación de sus moléculas será exactamente la misma en ambas partes. Un polímero atáctico (Figura 26 izquierda) tiene un arreglo molecular aleatorio y no correspondería con la definición mencionada, por otro lado, un polímero isotáctico (Figura 26 derecha) posee un arreglo en cual sus sustituyentes principales se encuentran orientados hacia un lado de la molécula, esto significa que al hacer un corte axial de manera vertical las partes resultantes serían similares, pero al hacerlo horizontalmente serían completamente distintas y esto tampoco encaja en la característica de la película. Finalmente los polímeros sindiotácticos (Figura 26 central) están arreglados de tal manera que el sustituyente principal se alterna a un lado y otro de la molécula, esto significa que al realizar los cortes moleculares obtendríamos partes idénticas. La importancia de la tacticidad es que, a pesar de ser la misma molécula, en el momento de obtener el espectro infrarrojo, algunas bandas pueden desaparecer, aparecer, desplazarse, atenuarse o acentuarse dependiendo de su arreglo espacial.

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Figura 26. Tacticidad del poliestireno. Cuando un anillo aromático es el principal o único sustituyente de una cadena de metilenos, su espectro infrarrojo presenta bandas características de dichas cadenas y de anillos aromáticos monosustituidos como es el caso del poliestireno (Figura 25). El espectro de esta macromolécula tiene bandas dominantes a 2926 cm-1 y 2851 cm-1 por la tensión entre los metilenos. Las bandas de los enlaces C-H fuera del plano de los anillos aromáticos son intensas a 698 cm -1 y 756 cm-1 y las tensiones de dichos enlaces se caracterizan por absorber a 3082 cm -1, 3061 cm-1 y 3027 cm-1. También se hacen presentes las bandas características de la “respiración” del anillo aromático a 1601 cm-1, 1493 cm-1 y 1452 cm-1. En total, suman 16 señales características del poliestireno (Cuadro 3 y Figura 16), estas bandas se obtuvieron a través de un algoritmo conocido como Método del centro de gravedad y que es el mismo cálculo que la mayoría de los espectrómetros infrarrojos con transformada de Fourier utilizan para calcular los mínimos de transmitancia en sus mediciones. Las bandas marcadas con un asterisco (*) son valores sensibles a la resolución del instrumento y al algoritmo

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utilizado, es decir que si se miden estas señales en un FT-IR que no use el método del centro de gravedad para el cálculo de los mínimos de transmitancia es probable que se obtengan resultados muy distintos a los certificados, por lo mismo son aquellas cuyas incertidumbres son las más altas. El método del centro de gravedad requiere de la búsqueda del intervalo en número de onda en donde se encuentre el “pico” y dependerá en gran parte de la simetría del mismo. Los límites de este intervalo se establecen como se indica en la Figura 27.

Figura 27. Método del Centro de gravedad para determinar posición de picos. La trazabilidad de este material de referencia viene desde niveles superiores al Centro Nacional de Metrología, su instrumento de medición fue calibrado, verificado e inspeccionado con estándares y procedimientos del Instituto Nacional de Física y del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NPL y NIST respectivamente, por sus siglas en inglés). La incertidumbre de estos laboratorios se transfiere a al espectrómetro FT-IR del CENAM quien calibra la película de poliestireno y con ello le asigna una incertidumbre asociada a dicho material, el cual podrá utilizarse ahora 50

para calibrar otros instrumentos, para determinar el error y la incertidumbre de los mismos. La Figura 28 muestra gráficamente esta cadena ininterrumpida de mediciones desde los INM’s internacionales hasta los usuarios finales.

Figura 28. Carta de trazabilidad de la película de poliestireno. En el cálculo de incertidumbre para la calibración del FT-IR se tomaron en cuenta las siguientes fuentes: -

Incertidumbre por repetibilidad (uA).

-

Incertidumbre del patrón (uB).

-

Incertidumbre por resolución.

Usando la ley de propagación de incertidumbres obtuvimos la incertidumbre combinada.

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La incertidumbre expandida, a un nivel de confianza del 95% aproximadamente, se calculó multiplicando la incertidumbre combinada por un factor de cobertura (k) igual a dos. Para validar un método analítico es necesario evaluar la repetibilidad y la reproduciblidad mediante herramientas estadísticas que nos permitirán conocer la exactitud, precisión y robustez del mismo. En este caso, se realizó la medición de las bandas de transmisión cambiando parámetros del certificado de calibración que entrega el CENAM donde indica que la resolución debe ser de 4 cm -1 o menor y que el número de barridos debe ser mayor a 64. En distintos días se midió cambiando los parámetros espectrales indicados en el Cuadro 4 y se obtuvieron una serie de datos que se sometieron a pruebas estadísticas para encontrar el mejor procedimiento de calibración. Los resultados en el Cuadro 5 son el promedio de las mediciones, el error sistemático con respecto al valor de referencia y la incertidumbre expandida para cada banda de transmisión. En el podemos observar que las bandas 1, 7, 10 y 12 son las que mayor incertidumbre presentan pero se debe, en gran parte, a la incertidumbre asociada al material de referencia. De la misma manera, para las señales 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 13, 14, 15 y 16, la fuente de incertidumbre que más peso tiene en la incertidumbre expandida es la que proviene de la película de poliestireno, y esto es el comportamiento ideal en una calibración. Sin embargo, se observa que hay una banda cuyos errores e incertidumbres en los tres procedimientos fueron bastante más elevados que en las otras señales, la banda número 2 (699.9 cm-1 ± 1.0 cm-1) parece tener incluso mayor sensibilidad a la resolución del instrumento. Observemos que cuando se ajustó el FT-IR a 0,5 cm-1 de resolución, el error sistemático fue de -1.88 cm-1 y una incertidumbre expandida igual a ± 4.08 cm -1 (nótese que la incertidumbre asociada a dicha banda es de ± 1.0 cm -1), mientras que al hacer la medición a resoluciones más altas (1 cm -1 y 4 cm-1) se obtuvieron errores e incertidumbres de -0.69 cm-1 ± 3.20 cm-1 y 0.71 cm-1 ± 1.20 cm-1 respectivamente. En el espectro IR obtenido (Figura 17) podemos ver que esta

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banda, correspondiente a las vibraciones fuera del plano de los enlaces C-H del anillo aromático, es la señal más intensa de todo el intervalo. La prueba de error normalizado sirve para corroborar que los resultados obtenidos correspondan y estén relacionados directamente con los valores del material de referencia al compararlos entre sí, no solo los valores nominales sino también sus incertidumbres expandidas. La Figura 28 muestra gráficamente la prueba del error normalizado, donde podemos ver que una medición pasa siempre y cuando dicho parámetro sea menor a uno. Por el contrario, si el error normalizado es igual o mayor a uno, se puede sospechar que no se está midiendo la misma muestra, que se alteraron los resultados y que simplemente es un valor aberrante.

EN ≥ 1

EN < 1 Valor de Referencia ± Incertidumbre Valor Medido 1 ± Incertidumbre Valor Medido 2 ± Incertidumbre

Figura 29. Descripción gráfica de la prueba de error normalizado. En el Cuadro 6 se encuentran los resultados de dicha prueba, en donde podemos ver que los errores normalizados de todas las bandas medidas con los distintos métodos son menores a uno y por tanto podemos afirmar que, a pesar de sus errores e incertidumbres, éstas pertenecen a mediciones de la misma película de poliestireno. Sabiendo esto, y usando las seis mediciones de cada banda para cada método, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) para evaluar la reproducibilidad.

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La finalidad de esta prueba es demostrar que no existe diferencia significativa entre las medias/varianzas de las mediciones realizadas con distintos métodos. Se realizó con un alfa igual a 0.05 (95% de nivel de confianza) y es en el Cuadro 7 donde se encuentran los valores de F de ANOVA. En la parte superior de la tabla se reporta el valor crítico de F para los grados de libertad y nivel de confianza establecidos y, recordando un poco, se establece que al obtener un valor calculado de F en la prueba mayor al valor crítico se rechazará la hipótesis nula, siendo esta que las medias/varianzas son estadísticamente idénticas. En caso contrario (Fcalculada