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LICENCIATURA EN:

MEDICO CIRUJANO

MANUAL DE PRACTICAS DE Biologia Celular y Molecular QBP. Martín Zavala Núñez

MATERIA:

Biologia Celular y Molecular

1

ÍNDICE

Introducción

3

Programa de la asignatura de Biología Celular

4

Lineamientos en el Laboratorio

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Formato de cada práctica

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PRÁCTICAS 1. Diferenciación celular

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2. Conteo celular de glóbulos blancos

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3. Propiedades de la membrana

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4. Fenómeno de transporte en las membranas

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5. Diferenciación mitocondrial y citoplasmática

33

6. Actividad enzimática de los peroxisomas

36

7. Mitosis en células vegetales

42

8. Cariotipos en raíces de haba

47

Bibliografía

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INTRODUCCION Las guías consignadas en este manual procuran conducir al estudiante de primer año universitario de medicina, en el fascinante mundo de la experimentación biológica. Como es apenas lógico, el trabajo de experimentación supone una actitud protagónica y constructiva por parte del alumno; bajo la orientación del profesor. Consiguiendo así, la confirmación de algunos fenómenos expuestos en las clases teóricas, además de la familiarización del estudiante con el trabajo de laboratorio. En tal sentido, al inicio de cada práctica el profesor ofrece una breve introducción sobre los fundamentos básicos y metodología de la práctica. El objetivo fundamental del manual de prácticas es presentar a los estudiantes una serie de experiencias prácticas diseñadas para que no sólo sigan instrucciones, sino para que aprendan a pensar y a llegar a conclusiones lógicas cuando se analizan problemas relacionados con el área de la Biología Celular y Molecular. La Biología Celular y Molecular en la actualidad ha tenido un avance muy notable, ya que se ha dado la aplicación de nuevos métodos para el análisis de la célula en todos sus niveles. Para tener un mayor conocimiento acerca de la organización molecular de la célula es necesario que sea a partir del estudio de las diferentes moléculas que la conforman. Esto nos permite enfocar cada uno de los fenómenos celulares que se llevan a cabo en aquella. El manual consta de ocho prácticas, las cuales constituyen material suficiente para el desarrollo de la asignatura de Biología Celular y Molecular. Las prácticas están diseñadas para dos horas de laboratorio, de tal manera que haya tiempo suficiente para discusión y explicaciones preliminares sobre el trabajo experimental.

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PROGRAMA DE LA ASIGNATURA La materia de BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR, pretende establecer métodos de estudio aplicables de la estructura y función de las células animal y vegetal, así como su composición y estructura describiendo sus relaciones con las células vecinas y con la matriz que las rodea. OBJETIVO GENERAL DE LA MATERIA: Conocer los avances realizados en el estudio de la estructura y fisiología celular. Explicar la naturaleza fluida de las membranas biológicas y relacionar con los componentes lipídicos y proteicos, señalar la fluidez de las membranas y sus funciones dinámicas, los diferentes componentes del citoesqueleto, relacionarlos con sus funciones celulares y su intervención en la modulación de los procesos extracelulares. Describir la importancia de la comunicación intra e intercelular para el mantenimiento de la vida celular. Referir la ultraestructura de mitocondrias y cloroplastos, y relacionarla con los procesos transductores de energía.

UNIDAD I. PRINCIPALES BIOMOLECULAS DE LA MATERIA VIVA I.1 Carbohidratos. Generalidades, clasificación e importancia. I.1.1 Glucoproteínas y glucolípidos. I.2 Lípidos. I.2.1 Generalidades, clasificación e importancia. I.2.2 Propiedades químicas. I.3 Aminoácidos y proteínas. I.3.1 Aminoácidos como unidades fundamentales de las proteínas. I.3.2 Generalidades sobre proteínas. I.3.3 Organización y estructura de las proteínas. I.3.4 Clasificación de proteínas y su importancia. I.4 Ácidos nucleicos. I.4.1 Generalidades de los ácidos nucleicos como unidades de la herencia. I.4.2 Composición química de los ácidos nucleicos (nucleósidos y nucleótidos). I.4.2 Estructura y función del ADN. Estructura, tipos y función del ARN.

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UNIDAD II. INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA CÉLULA II.1 Niveles de organización de la materia viva. II.1.1 Átomo, molécula, coacervado, célula, tejidos, órganos, aparatos, sistemas e individuos. II.2 Origen de la vida y evolución celular. II.2.1 Evolución química y síntesis prebiológica de compuestos orgánicos; surgimiento de las moléculas orgánicas; síntesis abiótica. II.2.2 Teoría de Oparin-Haldane; experimentos de Miller y Urey. II.2.3 Origen y evolución del metabolismo. II.2.4 Origen de los procariontes y eucariontes. II.2.5 Evolución prebiológica como antecedente del surgimiento de las primeras células. II.2.6 Hipótesis más fundamentada del origen de los eucariontes (simbiótica). II.2.7 Origen del núcleo y del retículo endoplásmico. II.3 Antecedentes y generalidades sobre el estudio de la célula. II.3.1 Teoría celular. II.3.2 Datos históricos sobre las aportaciones y avances tecnológicos que permitieron profundizar en el estudio de la célula. II.3.3 Postulados de la teoría celular y el impacto en su momento histórico. II.3.4 Unidad y diversidad celular; los tres dominios (Archea, Eubacteria y Eucaria). II.3.5 Unidad y diversidad celular; los tres dominios (Archea, Eubacteria y Eucaria). II.3.6 Clasificación de R. Whittaker. II.4 Métodos para el estudio de la célula. II.4.1 Microscopía: fundamentos; microscopio fotónico, de campo claro, contraste de fases, electrónico, de transmisión y de barrido. II.4.2 Análisis de fracciones celulares: centrifugación diferencial, cromatografía, electroforesis y espectroscopía. II.4.3. Métodos histológicos: fijación, inclusión, corte, tinción (colorantes, composición, especificidad y clasificación). II.5 Organización y estructura general de la célula. II.5.1 Procariontes: estructura y organización genómica; importancia y diversidad.

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II.5.2 Eucariontes: estructura (panorama general de los distintos organelos que componen a la célula); importancia y diversidad.

UNIDAD III. ESTRUCTURAS DE SOSTÉN Y DE RECONOCIMIENTO III.1 Pared celular. Estructura, función e importancia en procariontes (Gram positivas, Gram negativas y de Archea) y de eucariontes (hongos, algas y vegetales). III .1.1 Estructura y función del glicocálix. III.2 Matriz extracelular. Composición química y funciones; diversidad estructural. III.3 Membrana celular de procariontes y eucariontes: composición química y función. III.3.1 Modelo del mosaico fluido, proteínas membranales integrales y periféricas. III.4 Mecanismos de transporte. III .4.1 Transporte pasivo: ósmosis y difusión; transporte activo; transporte masivo. III.4.1 Endocitosis: fagocitosis y pinocitosis; endocitosis constitutiva y mediada por receptores. Exocitosis.

UNIDAD IV. CITOESQUELETO Y MOVIMIENTO IV.1 Componentes del citoesqueleto. IV.1.1 Estructura, función e importancia de microtúbulos, microfilamentos, filamentos intermedios y microtrabéculas. IV.1.2 Relevancia e Importancia del citoesqueleto en las funciones celulares. IV.2 Centríolo, cuerpo basal y huso acromático. IV.3 Asociaciones especializadas del citoesqueleto y de la matriz. IV.4 Movilidad celular: estructura de cilios y flagelos en eubacterias, eucaria y archeobacterias.

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UNIDAD V. SISTEMAS MEMBRANOSOS V.1 Retículo endoplásmico. V.1.1 Estructura, función e importancia. V.1.2 Retículo endoplásmico rugoso: síntesis de proteínas lisosomales y de secreción (hipótesis del péptido señal). V.1.3 Retículo endoplásmico liso: estructura y función; síntesis de lípidos y detoxificación celular. V.2 Aparato de Golgi. V.2.1 Estructura y función; modificaciones postraduccionales (glicosilaciones y sulfataciones). V.2.3 Transporte: tráfico y empacamiento de productos de secreción; procesos secretores; renovación membranal. V.3 Lisosomas. Lisosoma primario, secundario y cuerpos residuales; mecanismos de digestión, defensa y autodigestión controlada. V.4 Microcuerpos. Peroxisomas y glioxisomas. Estructura y procesos oxidativos en los que intervienen.

UNIDAD

VI.

ESTRUCTURAS

INVOLUCRADAS

EN

LA

TRANSFORMACIÓN DE ENERGÍA VI.1 Mitocondria. VI.1.1 Ultraestructura: permeabilidad de la membrana, componentes de la membrana interna, espacio intermembranal y matriz. VI.1.2 Función e importancia en el envejecimiento celular.

UNIDAD VII. NÚCLEO Y REPRODUCCIÓN CELULAR VII.1 Núcleo. VII.1.1 Envoltura nuclear; estructura y función. VII.1.2 Complejo de poro y su regulación en el transporte de materiales. VII.1.3 Cromatina y estructura cromosómica. VII.1.4 Nucleosoma.

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VII.1.5 Matriz nuclear; nucleoplasma, participación en la organización y transcripción del ADN. VII.2 Nucleolo. VII.2.1 Estructura y composición (región granular, región fibrilar y ADN asociado). VII.2.2 Componentes ribonucleoproteicos. VII.3 Ciclo celular. VII.3.1 Fases del ciclo celular, duración del mismo en células eucariontes. VII.3.2 Interfase (fase G0, G1, S, G2) eventos fisiológicos. División celular: mitosis, meiosis, citocinesis. VII.4 Control del ciclo celular. VII.5 Apoptosis (muerte celular programada). VII.5.1 Vías que conducen a la muerte celular.

UNIDAD VIII. COMUNICACIÓN CELULAR VIII.1 Características de los sistemas de señales celulares. VIII.2 Traducción de señales en el interior de la célula. VIII.2.1 Señal directa. VIII.2.2 Transformación de la señal. VIII.2.3 Amplificación de la señal. VIII.2.4 Distribución de la señal. VIII.2.5 Moduladores de la señal. VIII.3 Adhesión intracelular. VIII.3.1 Uniones estrechas. VIII.3.2 Uniones de anclaje: mediadas por caderina y por integrinas. VIII.3.3 Uniones GAP y plasmodesmos.

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LINEAMIENTOS EN EL LABORATORIO Se recomienda que se lea cada práctica antes de presentarse a la sesión de laboratorio, ya que este curso está dirigido hacia la aplicación de técnicas de estudio de la Biología Celular. Para lo cual se pide el diseño y control sobre los experimentos que se estén realizando. El alumno deberá observar buena conducta dentro del laboratorio y cumplir con los Lineamientos que marca el Reglamento interno de los Laboratorios: 1. El uso de la bata en el laboratorio es obligatorio, NO permitiendo el acceso al mismo a ningún alumno si no se trae en ese momento. 2. El alumno deberá tener limpio su lugar de trabajo, por tal motivo deberá depositar la basura en los cestos y no en el suelo y no se permite la ingesta de bebidas ni alimentos dentro del laboratorio. 3. Al término de la práctica todo el material de cristalería utilizado debe estar perfectamente bien lavado y sus mesas de trabajo limpias. 4. Trabaje en orden, evitando distraer a sus compañeros cuando estén realizando sus experimentos. El alumno desordenado será suspendido de la sesión en curso. 5. Está prohibido el uso de celulares dentro del laboratorio como medio de comunicación. Solo podrán ser utilizados para la toma de fotografías de las preparaciones cuando así lo requieran, para una mayor calidad en el reporte.

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FORMATO DE CADA PRÁCTICA Cada práctica consta de las siguientes secciones: 1. Título 2. Objetivo 3. Introducción 4. Material 5. Procedimiento 6. Cuestionario 7. Informe Para el desarrollo de la práctica, primero se establecen los objetivos; posteriormente en la introducción se discuten los principios teóricos que se aplican, las técnicas de laboratorio requeridas y un ejemplo de cálculos si fuese necesario. El procedimiento experimental incluye el material y reactivos necesarios, los avisos de seguridad pertinentes y las formas apropiadas de disponer de los desperdicios y reactivos sobrantes. El cuestionario contiene preguntas y problemas sobre el experimento y se tendrán que contestar antes con un prelaboratorio (prueba que el estudiante se preparó para la práctica), durante (comprobación experimental) y después de la práctica (informe). En el informe se anotaran las observaciones, datos y resultados. Asimismo se analizaran los resultados. Siendo el informe final de la práctica el documento en el que se basará la evaluación de la misma.

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PRÁCTICA No. 1 “CELULAS ANIMALES Y VEGETALES” OBJETIVO Establecer que de acuerdo con el nivel de organización, existen dos tipos de células: procariotas y eucariotas. INTRODUCCIÓN Según lo expresado por Curtis y Sue (2000) y Starr y Taggart (2004), las células animales y vegetales presentan algunas diferencias y similitudes, entre las diferencias se destaca, en la célula vegetal además de la membrana celular, presenta pared celular compuesta de celulosa y otros polisacáridos, la presencia de plástidos en la célula vegetal, constituye una de las grandes diferencias con respecto a la célula animal, las vacuolas grandes en células vegetales(ocupa gran parte de la célula) y vacuolas pequeñas o ausentes en células animales es otra diferencia importante en los dos grupos. Las similitudes se tienen la presencia de ribosomas, mitocondrias, núcleo, nucléolo, complejos de Golgi. Para González y Spinel (2004), según la complejidad de la ultraestructura celular los organismos se dividen en procariontes y eucariontes. Los primeros o prenucleares, se caracterizan por carecer de organelos con unidad de membrana tales como núcleo, mitocondrias, cloroplastos, aparato de Golgi etc. como lo son las bacterias. En el grupo de los eucariontes están los hongos, las algas, los protozoarios y demás organismos superiores vegetales y animales. La principal restricción al tamaño de la célula es la que impone la relación entre el volumen y la superficie, esto es, en células grandes, la relación superficie /volumen es menor que en células pequeñas, lo que significa que las células grandes disponen de una superficie de intercambio con el medio ambiente proporcionalmente menor. Una segunda limitación al tamaño de una célula eucariótica parece estar relacionada con la capacidad del núcleo –centro de control de la célula-para suministrar suficientes copias de moléculas con la

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información necesaria para regular los procesos que ocurren en una célula grande, metabólicamente activa (Curtis y Sue, 2000).

MATERIAL Microscopio

Azul de metileno

Portaobjetos

Rojo Sudan III

Cubreobjetos

Colorante Wright

Mechero de alcohol

Frasco lavador

Lanceta estéril

Alcohol absoluto

Cubeta de tinción

Eosina

Cuchillas de afeitar nuevas

Hematoxilina

Cajas de Petri (pequeñas)

Lugol

Palillos de dientes

Cebolla

Papa

Tradescantia (siempre viva)

Tomate

Tocino graso

Sangre humana

Agua de charca y algas

PROCEDIMIENTO Primera actividad: Observación de células vegetales 1. Células de cebolla (Allium sp): Tome con cuidado varias hojas de cebolla y, retire la delgada capa (epidermis) que está adherida a ellas. Deposítelas en una placa portaobjetos, evitando que se enrollen y agregue una gota de azul de metileno u otro colorante que se le indique. Finalmente coloque el cubreobjetos y realice las observaciones y esquemas en diferentes aumentos. 2. Células de tradescantia: Se procede de la misma forma que la cebolla, pero sin agregar ningún colorante a la muestra. Realice las observaciones y esquemas en diferentes aumentos. 3. Células de papa (Solanum tuberosum): Realice varios cortes (finos) de escasos micrómetros con la ayuda de cuchillas de afeitar nuevas, parte de esos cortes deposítelos en una caja Petri con agua y agrégueles azul de metileno u otro colorante que se indique, el resto agrégueles directamente

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el colorante lugol. Realice las observaciones y esquemas en diferentes aumentos. 4. Células de tomate (Lycopersicum esculentum): Retire un trozo pequeño de pulpa de tomate con la ayuda de un bisturí o cuchilla de afeitar, deposítelo en el portaobjeto y cúbralo con el cubreobjetos. Haga las observaciones y esquemas en diferentes aumentos. Segunda actividad: Observación de células animales 5. Células de epitelio bucal: Con la ayuda de un palillo de dientes, realice un frotis de la cavidad interna de la mejilla, deposite el raspado sobre la lámina portaobjetos y haga un extendido sobre la misma. Adicione una gota de azul de metileno y coloque la laminilla cubreobjetos. Anote las observaciones y dibuje los esquemas en diferentes aumentos. Finalizada la observación deposite las placas en el recipiente de riesgo biológico (guardián) que hay en el laboratorio. 6. Células de tejido graso: Tome una cuchilla de afeitar o bisturí, y haga un raspado sobre el tejido graso, deposítelo en el portaobjeto y agréguele rojo sudan III. Anote las observaciones y dibuje los esquemas en diferentes aumentos. 7. Células sanguíneas: Para esta actividad es necesario un donante. Se procede de la siguiente manera: desinfecta con alcohol y algodón el área (punción en dedo, o vena del brazo), sin pasar dos veces por el mismo sitio (para evitar infecciones). Obtenida la muestra de sangre, deposite una gota sobre una placa portaobjetos y con la ayuda de otra placa, realice un extendido de la misma, adiciónele el colorante wrigth, procurando distribuir el mismo en toda la placa. Luego, pase el portaobjeto por el mechero, haciendo varias pasadas sobre la flama (evitar quemar las células). Realice las observaciones y esquemas de la muestra, donde se observarán predominantemente glóbulos rojos.

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Observación de algas 8. Recoja agua de charcas, rió o de florero en un recipiente limpio con varios días de antelación. En el laboratorio, tome una pequeña gota del agua con la ayuda de un gotero, deposítela en una lámina portaobjetos y colóquele el cubreobjetos. 9. Inicie la observación en el objetivo de 4x, y luego con los otros aumentos. Para la identificación de géneros solicite las claves y láminas utilizadas para tal fin. Realice las figuras y anotaciones necesarias de cada género encontrado. En todos los casos recuerde seguir las normas generales de laboratorio, utilizando guantes de látex en todo el transcurso de la práctica. Para la identificación de los diferentes géneros de algas y protozoos se cuenta con manuales, claves, laminas. Solicite ayuda a los encargados de dirigir la práctica.

CUESTIONARIO 1. Al Identificar las diferentes partes de las células animales y vegetales observadas, notamos algunas diferencias. Explique 2. En qué etapa de formación del eritrocito desaparece el núcleo del mismo 3. Mencione la hormona encargada de la producción de glóbulos rojos en la sangre y el lugar donde se produce. 4. Escriba al menos una función de cada uno de los componentes celulares de la sangre. 5. ¿Qué función desempeñan los plástidos en los vegetales? ¿Qué tipo de plástidos se conocen? ¿Es posible identificar plástidos en células animales? Explique. 6. Se sabe que las grasas o triglicéridos son las sustancias más abundantes en la naturaleza. ¿En qué órganos de las plantas y animales las podemos encontrar? ¿Qué papel desempeñan y en qué proporción están en nuestro organismo?

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PRÁCTICA No. 2 “CONTEO CELULAR DE GLÓBULOS BLANCOS” OBJETIVO Conocer y practicar el uso correcto de una cámara de Neubauer, para poder ejercitar

los cálculos necesarios para estimar el número celular de una

suspensión celular,

realizar y aplicar la metodología para un recuento de

Leucocitos por milímetro cúbico de sangre e interpretar el resultado INTRODUCCIÓN En Biología Celular es común el encontrarse con la necesidad de conocer el número de células que presentes en un volumen dado; por ejemplo, cuando se realizan cultivos celulares se precisa saber cuántas células se encuentran en un momento x (t1) con respecto al número de células que inicialmente se sembraron (t0). O bien, para saber cuántos espermatozoides hay en los eyaculados de diferentes pacientes. En tales casos se requiere de un instrumento que permita contar directamente, o bien, calcular la concentración celular en un medio. Para resolver el problema de conteo celular, se ha optado, en algunos casos, por calibrar sistemas espectrofotométricos, cuyo fundamento se finca en las propiedades de absorción de la luz por parte de las células; sin embargo, tales sistemas son poco exactos y los resultados que se obtienen son difíciles de repetir. Una alternativa a este problema es el contar directamente el número de células presentes en un volumen conocido; esto puede ser un trabajo agobiante si consideramos, por ejemplo, a las células procariontes, las cuales miden generalmente menos de 10 micras (>1X10-6 metros o 1X10-3 milímetros o bien 0.010 y por lo tanto se pueden encontrar muchísimas en un volumen muy pequeño. No obstante, se cuenta con la cámara de Neubauer, la cual es un instrumento muy útil que permite contar células de distinto tamaño. La cámara de Neubauer tiene la apariencia de un portaobjetos grueso, que en una cara tiene una placa muy delgada de metal, la cual se encuentra grabada con un par de cuadriculas muy finas y de medidas definidas. La cámara de Neubauer cuenta

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también con un par de muescas que permiten colocar la muestra a analizar en dos compartimientos. Por último, la cámara de Neubauer se complementa con un cubreobjetos cuyo grosor es mayor, también, que el de los cubreobjetos convencionales. Ver la siguiente figura:

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Entonces, la altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos se encuentra definida, así como el área de la cuadricula en el portaobjetos; por lo tanto, es posible calcular el volumen contenido en cada compartimiento de la cámara de Neubauer. De esta manera, es posible conocer el volumen de muestra celular que se coloca en la cámara, ahora solo resta conocer el número de células presentes en ese volumen. Para el conteo de leucocitos, se usan métodos sistemáticos que son más rápidos y precisos, y los métodos manuales. Todo método manual de recuento celular incluye 3 fases:  Dilución de la sangre  Muestreo de la sangre diluida en un volumen  Recuento de células en ese volumen Para el recuento de leucos se cuentan los 4 cuadrados de las esquinas, que corresponden a los campos 1, 3,7 y 9. Para su dilución, se hace lo mismo que para los hematíes pero empleando la pipeta de blancos, de modo que la solución que obtenemos es de 1/20. Se utiliza como diluyente el líquido de Turk. El líquido de Turk es hipotónico de modo que se destruyen los hematíes y así no entorpecen en el recuento. El líquido de Turk consta de ácido acético glaciar 2ml, violeta de genciana disolución de 1% 1ml y agua destilada en cantidad suficiente para 1000ml. Deberá filtrarse a menudo para evitar levaduras y hongos.

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En un principio es un poco difícil distinguir los leucocitos de los restos de membranas de los hematíes hemolizados. Se debe tener en cuenta que los leucocitos son más refringentes (más brillantes) al moverlo con el microscopio que los restos de hematíes. Se debe observar la presencia de la membrana citoplasmática y de la membrana nuclear (a veces más) como líneas finas y brillantes. Esto se observa fácilmente moviendo el microscopio hacia delante y hacia atrás. MATERIAL Pipeta de Thoma para glóbulos blancos

Boquilla blanca

Tubo de goma

Tubos de ensayo con anticoagulante

Papel parafilm

Cámara de Neubauer

Cubrehematímetro

Microscopio

Gasas

Alcohol al 70%

Sangre venosa

Líquido de Turk

PROCEDIMIENTO 1. Una vez seleccionada, se desinfecta la zona con alcohol al 70%, y se practica punción venosa. La sangre es recogida en un tubo lila con EDTA 2. Colocar el tubo de plástico y la boquilla para aspirar en la pipeta 3. Llenar la pipeta de glóbulos blancos con sangre hasta la marca 0.5 para realizar una dilución de 1/20. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. Si la sangre se pasa de la marca, se puede absorber con gasa el excedente 4. Introducir la pipeta en el tubo o frasquito que contiene el diluyente (liquido de Turk) y absorber hasta la marca 11, no deben quedar burbujas. 5. Se tapan ambos extremos de la pipeta con papel parafilm y se coloca en un rotador automático o se hace rotar manualmente de 2-3 minutos 6. Montar la laminilla de vidrio en la cámara para recuento. Debe estar limpia y seca.

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7. Destapar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequeña cerca de un extremo de la cámara para que por capilaridad se llene exactamente. 8. Dejar 3 minutos que los leucocitos se sedimenten 9. Colocar en la platina del microscopio y enfocar la cuadricula a 10x. y contar en los 4 cuadrados angulares. 10. En el recuento se incluyen las células que cubren o tocan por dentro o por fuera las líneas limitantes superior e izquierda en el cuadro pequeño de recuento y no se consideran los que estén en los límites inferior y derecho. 11. Los recuentos de leucocitos, al igual que los eritrocitos, se expresan como concentraciones, que en este caso serían número de células por unidad de volumen de sangre, que es 1mm3 Después de contar los glóbulos blancos de los 4 cuadrados angulares, se suman el total de ellos y con dicha cantidad de hace el siguiente cálculo: N° de leucocitos x mm3 = altura x dilución x área N° de leucocitos x mm3 = 1/10 x 1/20 x 4 = 1/10 000 N° de leucocitos x mm3 = 4/200 = 1/50 N° de leucocitos x mm3 = N° de leucocitos contados x 50

CUESTIONARIO 1. Esquematiza las partes que conforman a la cámara de Neubauer 2. ¿Bajo qué condiciones se puede utilizar dicha cámara? 3. ¿Qué utilidad biológica tiene? 4. Representa la distribución celular observada por la cámara

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PRÁCTICA No. 3 “PROPIEDADES DE LAS MEMBRANAS” OBJETIVO Comprobar algunas propiedades de las membranas biológicas como lo es la permeabilidad selectiva, el efecto que pueden tener algunos agentes químicos sobre las mismas y conozca la importancia del entorno para mantener su integridad. INTRODUCCIÓN La vida como la conocemos hoy no existiría si no existieran las membranas. Estas estructuras definen el límite entre lo que se considera una célula y su entorno. En el caso de las células eucariotas, las membranas también definen las organelas internas. Las membranas tienen una función más compleja que ser simples barreras delimitantes, son estructuras activas donde ocurren procesos metabólicos como transporte de moléculas, transducción de señales, respiración celular y generación de potenciales eléctricos entre otros. Es por esto que las membranas están constituidas no solo de lípidos sino también de proteínas y carbohidratos. La proporción de cada una de estas macromoléculas dependerá de la función de cada membrana en particular, la cual a su vez depende de la célula a la cual pertenece. Por ejemplo, la membrana plasmática de un hepatocito de ratón está constituida proporcionalmente de 45% de proteínas, 27 % de Fosfolípidos, 25 % de colesterol y 3% de otras macromoléculas. La estructura de las membranas biológicas aceptada hoy en día es aquella descrita en el modelo del mosaico fluido. En este modelo se establece que los Fosfolípidos forman una bicapa en la cual las regiones no polares de cada capa se encuentran hacia adentro de la misma y las regiones polares de cada capa se encuentran hacia afuera, en interacción con el medio acuoso. Las proteínas se encuentran embebidas en este “mar” de Fosfolípidos con interacciones generalmente de tipo no covalente.

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Las membranas son impermeables a la mayoría de los solutos polares y permeables a los solutos no polares. En general, a mayor número de grupos polares (-OH, -O, -NH2) en una molécula polar, menor será su permeabilidad a través de una membrana. Por lo tanto, para el intercambio de la mayoría de los solutos polares existen mecanismos controlados que pueden implicar inversión de energía. Otro factor que afecta la permeabilidad de una molécula es su tamaño o peso molecular. A mayor peso, la molécula es menos permeable. Los eritrocitos son células sanguíneas cuya función principal es transportar oxígeno a los tejidos. Esta función es llevada a cabo por la hemoglobina, una proteína que contiene grupos heme, responsable del color rojo que presentan los eritrocitos. Durante el proceso de maduración de estas células, la hemoglobina producida se disuelve en el citoplasma y alcanza concentraciones muy altas (cerca del 34% del peso del eritrocito); las organelas intracelulares como núcleo, retículo endoplásmico y mitocondria se pierden. Los eritrocitos son entonces vestigios de células, destinadas a sobrevivir, en el caso de los bovinos, por unos 120 días. De esta forma, midiendo los tiempos de hemólisis, se puede comparar la permeabilidad de una serie de moléculas orgánicas. A su vez, la presencia de hemólisis al añadir diferentes agentes químicos permitirá evidenciar cómo la interacción de los mismos con la membrana puede tener efectos irreversibles en su estructura. MATERIAL Cloruro de sodio 0.9%: Pesar 0.9 gramos de cloruro de sodio y llevar a 100 ml con agua destilada. Solución saturada de jabón Cloroformo Etanol Solución de eritrocitos lavados, no usar eritrocitos de oveja Pipeta de 10 ml y pipeta Pasteur

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PROCEDIMIENTO Precaución: el día de hoy usted trabajará con muestras biológicas. Una regla de oro preventiva es trabajar cualquier muestra biológica como potencialmente infecciosa. El uso de guantes es recomendado. Si ocurre algún derrame, avise inmediatamente al instructor más cercano. Lavado de eritrocitos: Material Tubos de ensaye de 75 X 12 mm Muestra de sangre Solución salina fisiológica Técnica Centrifugar la muestra para separar el suero o plasma de los glóbulos rojos. Pasar el suero o plasma a otro tubo limpio rotulado. Con una pipeta Pasteur, colocar 0.2 - 0.5ml de glóbulos rojos en cada tubo. Completar con solución salina hasta 1cm del borde. Centrifugar durante 1-2minutos para sedimentar las células. Extraer la solución salina. Agitar el tubo para resuspender los glóbulos rojos. Esta secuencia constituye el primer lavado. Repetir los pasos 3-6 por lo menos dos veces. En el ultimo lavado, la solución salina debe ser clara, sin signos de hemolisis. Nota: Para que se pueda observar el fenómeno a estudiar es necesario no mezclar eritrocitos de distinto origen en un mismo tubo Actividad uno 1. A 10 ml de cloruro de sodio al 0.9% colocados en cada uno de 4 tubos de ensayo, añada 2 gotas de eritrocitos lavados. 2. Conserve uno de los tubos como control y a los otros 3 añádales respectivamente, 2 gotas de una solución saturada de jabón, cloroformo (agente irritante, manipular con cuidado) y alcohol etílico. 3. Agite repetidamente y deje la solución en reposo durante 15 minutos.

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4. Observe los tubos y compárelos con el control Actividad dos MATERIAL Pipeta de 5ml con pipeta Pasteur Soluciones 0.3M de: urea, tiourea, glicerol, glucosa y sacarosa Solución de eritrocitos lavados con cloruro de sodio al 0.9% Cloruro de sodio 0.9%: Pesar 0.9 gramos de cloruro de sodio y llevar a 100 ml con agua destilada. Cronómetro PROCEDIMIENTO 1. Coloque 2 ml de la solución 0.3 M a probar (urea, glucosa, etc) en un tubo de

ensayo

rotulado y adicione

una

gota

de

sangre

mezclando

inmediatamente. 2. Mida el tiempo de hemólisis. El tubo control del experimento de hemólisis causada por agentes químicos es utilizado como control de no hemólisis. 3. Repita el procedimiento una vez más para corroborar el tiempo de hemólisis

CUESTIONARIO 1. Elabore un cuadro con los resultados obtenidos de tiempo de hemólisis versus sustancia utilizada, ordenados de mayor tiempo de hemólisis a menor tiempo de hemólisis 2. Tomando en cuenta los resultados del cuadro elaborado y la estructura molecular de las sustancias utilizadas, explique si los datos obtenidos concuerdan o no con lo esperado teóricamente.

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Puede utilizar los siguientes datos como referencia: Cuadro 1. Permeabilidad relativa de algunas sustancias, según el diámetro de la molécula. Diámetro

Permeabilida

(nm)

d relativa

Agua

0.300

1

Urea

0.360

6X104

Ión cloruro hidratado

0.386

1X10-8

Ión potasio hidratado

0.396

6X10-11

Sodio

0.512

2X10-11

Glicerol

0.620

6X10-4

Glucosa

0.860

9X10-6

Sustancia

3. Describa el efecto en los eritrocitos con cada una de las soluciones saturadas usadas. 4. Investigue con base en qué mecanismo cada una de las soluciones saturadas de jabón, cloroformo y alcohol etílico causan lisis de los eritrocitos. Hemólisis producida por efecto de la permeabilidad

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PRÁCTICA No. 4 “FENÓMENOS DE TRANSPORTE EN LAS MEMBRANAS” OBJETIVO Estudiar

algunos factores que afectan el funcionamiento de las membranas

celulares. INTRODUCCIÓN Las membranas celulares son barreras selectivas que separan las células y forman compartimientos intracelulares. Entre sus funciones están: La membrana celular está formada por una capa doble de Fosfolípidos, proteínas y carbohidratos. Cada Fosfolípido está compuesto por glicerol, ácidos grasos y fosfato, que en conjunto crean una barrera hidrofóbica entre los compartimientos acuosos de la célula. Las proteínas permiten el paso de moléculas hidrofílicas a través de la membrana, determinan las funciones específicas de ésta e incluyen bombas, canales, receptores, moléculas de adhesión, transductores de energía y enzimas. Las proteínas periféricas están asociadas con las superficies, mientras que las integrales están incrustadas en la membrana y pueden atravesar completamente la capa doble. La función de los carbohidratos adheridos a las proteínas (glicoproteínas) o a los Fosfolípidos (glicolípidos) es la de adhesión y comunicación intercelular. El colesterol, que es un esteroide (lípido), determina la fluidez de la membrana. Para que la célula funcione eficientemente, debe mantenerse en la misma un ambiente estable conocido como homeostasis. Para mantener este equilibrio existen mecanismos para el transporte selectivo de materiales hacia el interior o exterior de la célula. Las membranas de la célula son selectivamente permeables, permitiendo el paso de algunas sustancias o partículas (moléculas, átomos, o iones), e impidiendo el paso de otras. Esta selectividad se debe a la capa doble de Fosfolipidos de la membrana. La manera en que las moléculas pasan por la membrana depende en parte de la polaridad de las mismas. Las moléculas hidrofóbicas, o no polares, pasan con relativa libertad a través de la capa de

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lípidos, mientras que moléculas hidrofílicas, o polares, incluyendo el agua, y las moléculas de mayor tamaño, pasan a través de canales formados por proteínas transportadoras. La regulación del transporte de las moléculas, o la dirección en que se mueven depende de su gradiente de concentración (diferencia en concentración entre dos lugares). TRANSPORTE CELULAR: DIFUSIÓN Y OSMOSIS Para que la célula funcione eficientemente, debe mantenerse en la misma un ambiente estable conocido como homeostasis. Para mantener este equilibrio existen mecanismos para el transporte selectivo de materiales hacia el interior o exterior de la célula. Las membranas de la célula son selectivamente permeables, permitiendo el paso de algunas sustancias o partículas (moléculas, átomos, o iones), e impidiendo el paso de otras. Esta selectividad se debe a la capa doble de Fosfolípidos de la membrana. La manera en que las moléculas pasan por la membrana depende en parte de la polaridad de las mismas. Las moléculas hidrofóbicas, o no polares, pasan con relativa libertad a través de la capa de lípidos, mientras que moléculas hidrofílicas, o polares, incluyendo el agua, y las moléculas de mayor tamaño, pasan a través de canales formados por proteínas transportadoras. La regulación del transporte de las moléculas, o la dirección en que se mueven depende de su gradiente de concentración (diferencia en concentración entre dos lugares). Las moléculas se mueven constantemente debido a su energía cinética y se esparcen uniformemente en el espacio disponible. Este movimiento, llamado movimiento browniano, es la fuerza motriz de la difusión. Difusión, se define como el movimiento natural de las partículas de un área de mayor concentración a un área de menor concentración hasta alcanzar un equilibrio dinámico, en el cual el movimiento neto de partículas es cero. La difusión no requiere gasto de energía por parte de la célula y por lo tanto es un movimiento pasivo. Cuando la célula transporta sustancias en contra de un gradiente de concentración (de un área de menor concentración a un área de mayor concentración) se requiere energía (ATP) y sucede movimiento activo.

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El componente principal de la célula es el agua, que actúa como solvente (el agente que disuelve) de solutos orgánicos e inorgánicos. El movimiento de agua a través de una membrana selectivamente permeable se llama osmosis (difusión de agua) y sucede siempre del área de mayor concentración de agua (con menor concentración de soluto) al área de menor concentración de agua (con mayor concentración de soluto). El agua se moverá entonces, a favor de un gradiente de concentración hacia el área de mayor concentración de soluto (donde hay una menor concentración de moléculas de agua libres). Cuando la célula contiene una concentración de solutos mayor que su ambiente externo, se dice que la célula está en una solución hipotónica, y como consecuencia, el agua entra a la célula causando que se expanda. Si la concentración de solutos es mayor fuera de la célula, se dice que la célula está en una solución hipertónica; la célula pierde agua y se encoge. Si las concentraciones de soluto son iguales en ambos lados de la membrana, se dice que la célula está en una solución isotónica, donde el movimiento neto es cero. Las células animales funcionan óptimamente en ambientes isotónicos. En las células vegetales, sin embargo, cuando la vacuola se llena de agua, ésta ejerce presión contra la pared celular hasta llegar a un punto donde se impida que entre más agua (presión de turgencia) y la célula se encuentra túrgida (firme), lo cual es el estado ideal de estas células. Por otra parte, si la célula vegetal pierde agua, la célula sufre plasmólisis al separarse la membrana celular de la pared celular, lo cual suele ser letal para la célula. MATERIAL Agua destilada

Gradilla

Baño de agua a 70°C

Vasos de precipitado de 250 ml

Baño de agua a 37°C

Betabel

Hielo

6-Tubos de ensayo

Nevera

Vaso con hielo

Navaja

Pinzas para tubo de ensayo

Plato para calentar u hornilla

Aguja de disección

Pipetas de 5 ml

Termómetro

Regla

Marcador de cera

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PROCEDIMIENTO A. Efecto de la temperatura En este ejercicio se usará la planta de remolacha (Beta vulgaris), cuyas células almacenan en la vacuola central el pigmento violeta betacianina. 1. Corte seis pedazos de remolacha (15 mm de largo) con un sacabocado y colóquelos en tubos de ensayo rotulados del 1 al 6. 2. Añade 5 ml de agua al tubo 6 y colóquelo en el congelador por 30 min. 3. Añade 5 ml de agua al tubo 5 y colóquelo en el baño de hielo por 30 min. 4. Añade 5 ml de agua al tubo 1 y colóquelo en un baño de agua caliente a 70° C durante 1 min. Después de 20 min, remueva el pedazo de remolacha del tubo. 5. Deje que la temperatura del baño baje a 55 °C y haga lo mismo con el tubo 2. 6. Repita el procedimiento de arriba con el tubo 3 a 37 °C y con el tubo 4 a 20 °C. 7. Compare la intensidad de color de las soluciones en los tubos. 8. Coloque los resultados (intensidad de color vs. temperatura) en la Tabla 7.1. Tabla 7.1 Efecto de temperatura Tubo Temperatura

Intensidad de color (1 = menos intenso; 6 = más intenso)

1

70 °C

2

55 °C

3

37 °C

4

20 °C

5

En baño de hielo

6

En congelador

B. Efecto de solventes En este ejercicio se observará cómo algunos solventes actúan sobre las membranas. El instructor preparará este experimento.

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MATERIAL Soluciones de acetona y metanol 2 a 4 huevos de gallina 10 ml de aceite Gradilla para tubos de ensayo Un betabel MÉTODO 1. Rotule seis tubos de ensayo de 1 al 6. 2. Añada 5 ml de las siguientes soluciones a los tubos de ensayo: Tubo 1: metanol 1 % Tubo 2: metanol 25 % Tubo 3: metanol 50 % Tubo 4: acetona 1 % Tubo 5: acetona 25 % Tubo 6: acetona 50 % 3. Corte seis pedazos de remolacha de 15 mm y colóquelos en los tubos de ensayo. 4. Luego de 30 min, remueva la remolacha y observe la intensidad de color para cada solución. 5. ¿Qué tubo mostró la mayor intensidad de color? 6. Rotule seis tubos adicionales y añada lo siguiente a cada uno: Tubo A: 1 ml de agua + 1 ml de acetona Tubo B: 1 ml de agua + 1 ml de metanol Tubo C: 1 ml de aceite + 1 ml de acetona Tubo D: 1 ml de aceite + 1 ml de metanol Tubo E: Un poco de clara de huevo + 1 ml de metanol Tubo F: Un poco de clara de huevo + 1 ml de acetona CUESTIONARIO 1. ¿Qué tubo mostró más intensidad de color? 2. ¿Qué indica la intensidad del color? 3. ¿Cómo afectan las temperaturas altas a las membranas celulares?

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4. ¿Qué le pasa a las células en temperaturas bajas? 5. ¿En qué tubos se observaron reacciones? 6. Basado en lo que se observó en los tubos de ensayos (refiriéndose a los tubos 1 - 6 y A - F), ¿cómo afecta la acetona a la membrana? 7. ¿Cómo afecta el metanol a la membrana? 8. ¿Qué indican los resultados sobre los componentes de la membrana? C. Difusión de moléculas en agua En este ejercicio, se estudiará el movimiento browniano de las moléculas y el efecto de la temperatura sobre dicho movimiento. MATERIAL Dos vasos de precipitado de 200 ml Agua fría Agua a temperatura ambiente Colorante vegetal PROCEDIMIENTO 1. Añade agua a temperatura ambiente a un vaso y al otro vaso añada agua fría. 2. Deje los vasos reposar por 10-15 min para que no haya movimiento del agua. 3. Añada cuidadosamente una gota de colorante a cada envase y observe la dispersión de la gota. 4. ¿Afectó la temperatura la difusión del tinte? Explica tu observación. D. Difusión a través de una membrana selectivamente permeable (diálisis) En este ejercicio se usará una membrana de diálisis que posee poros de un tamaño determinado y que actúa como una membrana selectivamente permeable. MATERIAL Un vaso de precipitado de 500 ml Una bolsa de diálisis y cordón o bandas de goma Rejilla y tubos de ensayo pequeños Baño de maría y matraz pequeño con agua

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Pinzas de tubo de ensayo Reactivo de Benedict Solución de yodo Cilindro graduado Solución de glucosa 30 % y solución de almidón 1 %. Se usarán aproximadamente 25 ml de cada una por mesa (150 ml de cada solución por laboratorio). PROCEDIMIENTO 1. Corte la bolsa de diálisis a 25 cm de largo y póngala en agua por unos minutos para abrirla. 2. Añada a la bolsa aproximadamente la mitad de la solución de glucosa y la mitad de la solución de almidón. 3. Cierre la bolsa con un cordón o con una banda de goma, de forma que luego pueda abrirla 4. Mezcle la solución dentro de la bolsa y enjuague con agua la superficie externa de la bolsa; anote el color inicial de la solución dentro de la bolsa. 5. Añada varias gotas de la solución de yodo a un vaso (beaker) con 300 ml de agua hasta obtener un color dorado. 6. Coloque la bolsa de diálisis dentro del agua por 30 min

Saque la bolsa del agua y colóquela en un vaso (beaker) vacío. Anote el color de la solución dentro de la bolsa y compárela con la solución en el primer vaso. 8. Realice la prueba de Benedict para las dos soluciones contenidas en las bolsas. 9. ¿Cuáles son los resultados de este experimento para las pruebas de yodo y de Benedict?

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D. Osmosis en células animales y vegetales En los siguientes ejercicios se observará qué ocurre al poner células animales y vegetales en soluciones con concentraciones diferentes de solutos. MATERIAL Botellas con soluciones de sacarosa

Elodea fresca

(0.1, 0.3 y 0.6 M)

Gradilla

Botella con sangre

Tubos de ensaye de 13 X 100

Goteros

Agujas de disección

Portaobjetos

Microscopio compuesto

Cubreobjetos

Lápiz de cera

Papel toalla

Papel para lente

PROCEDIMIENTO 1. Rotule tres tubos de ensayo: 0.1, 0.3 y 0.6 M. 2. Añada soluciones de sacarosa de diferentes osmolaridades Tubo 1: 3 ml de solución de sacarosa 0.1 M Tubo 2: 3 ml de solución de sacarosa 0.3 M Tubo 3: 3 ml de solución de sacarosa 0.6 M 3. Añada 3 ml de sangre a cada tubo, y observe la apariencia de la mezcla. 4. Rotule y prepare cuatro laminillas: Laminilla 1: Gota de sangre, coloque el cubreobjetos y observe los eritrocitos bajo el microscopio. Laminilla 2: Gota de la mezcla del tubo 1 (0.1 M), coloque el cubreobjetos, observe bajo el microscopio y compare con laminilla 1. Laminilla 3: Gota de la mezcla del tubo 2 (0.3 M), coloque el cubreobjetos, observe bajo el microscopio y compare con laminilla 1. Laminilla 4: Gota de la mezcla del tubo 3 (0.6 M), coloque el cubreobjetos, observe bajo el microscopio y compare con laminilla 1. 5. ¿Qué le pasó a las células al entrar en contacto con cada una de las soluciones? ¿Por qué? 6. ¿Cuáles de las soluciones usadas fueron hipotónicas, hipertónicas e isotónicas para los eritrocitos?

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7. ¿En qué solución sucedió hemólisis de los eritrocitos y por qué 8. ¿Por qué ocurrió la crenación? 9. ¿Qué indican los resultados acerca de la concentración de solutos en el plasma sanguíneo? D. 2. Células vegetales PROCEDIMIENTO 1. Rotule y prepare cuatro laminillas según se indica a continuación. Coloque un cubreobjetos y observe con el microscopio: Laminilla 1: Hoja de Elodea con una gota de agua de estanque. Laminilla 2: Gota de la solución de sacarosa 0.1 M y una hoja de Elodea Laminilla 3: Gota de la solución de sacarosa 0.3 M y una hoja de Elodea Laminilla 4: Gota de la solución de sacarosa 0.6 M, una hoja de Elodea 2. ¿Qué le pasó a las células al entrar en contacto con cada una de las soluciones? 3. ¿Cuáles de las soluciones fueron hipotónicas, hipertónicas e isotónicas con respecto a la célula? 4. ¿Por qué ocurrió plasmólisis en una de las soluciones? 5. ¿Cuál es la diferencia entre plasmólisis y crenación? 6. ¿Por qué no ocurre lisis (rompimiento de la célula) en la célula vegetal? 7. ¿En qué tipo de solución ocurrió turgencia?

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PRÁCTICA No. 5 “CLOROPLASTOS Y MITOCONDRIAS” OBJETIVO Identificar los cloroplastos y las mitocondrias en células vegetales. INTRODUCCIÓN Los cloroplastos se caracterizan por la presencia de pigmentos, como la clorofila y los carotenoides. Por medio del proceso de la fotosíntesis produce oxígeno y la mayor parte de la energía química que es utilizada para los organismos vivientes. Los cloroplastos se localizan principalmente en las hojas de las plantas superiores y en las algas. Estos organelos capturan la energía de la luz y la transforman en ATP y diversos alimentos. La forma de los cloroplastos varía, puede ser esférica, ovoide, discoidea, de clava o vesiculosa. Estos organelos se encuentran dentro del citoplasma, específicamente agrupados cerca del núcleo. Las mitocondrias son organelos granulares o filamentosos que se encuentran en el citoplasma de las células. Aproximadamente el 90% de la energía de la célula se mantiene gracias a las reacciones químicas que ocurren en las mitocondrias. Por ello se les llama: La central de energía de la célula. Una mitocondria está rodeada por dos membranas, la exterior es lisa y encierra al organelo y la interior se dobla en una serie de pliegues o dobleces. Estos pliegues llamados crestas mitocondriales son más abundantes en las células con actividad metabólica intensa y aquí es donde ocurren la mayor parte de las actividades respiratorias de la célula.

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MATERIAL Microscopio óptico

Sol. Glucosa o dextrosa al 5%

Bisturí

Sol. De Janus Green 0.001%

Portaobjetos

Elodea

Cubreobjetos

Apio

Toallas de papel

Planta de musgo o lama

Papel filtro

Gotero

PROCEDIMIENTO 1. En un tallo de apio, corte una tira delgada de 1 cm de longitud, conteniendo dos venas del tallo de apio. 2. Coloque sobre un portaobjetos con la superficie hacia arriba y agrega solución de glucosa al 5 %. 3. Utilice una navaja de bisturí corta paralelamente entre las venas. De esta manera obtén un corte paralelo a las venas lo más delgado posible. 4. Cubre con un cubreobjetos eliminando el exceso de líquido con una toalla de papel. Observa al microscopio utilizando un objetivo de 40X. 5. Quite la preparación del microscopio. Coloca un trozo de papel absorbente en la orilla del cubreobjetos de tal manera que se absorba la solución que contiene su preparación; en el extremo opuesto coloca unas gotas de Jannus Green al 0.001 % introduciéndose este colorante a la preparación por debajo del cubreobjetos. 6. Elimine el exceso de líquido con un trozo de papel absorbente. 7. Observe la preparación al microscopio utilizando el objetivo de 40X, y con la ayuda de tu profesor observa con el objetivo de 100X. (las mitocondrias se tiñen de color azul, perdiendo el color minutos después por la acción de la hidrogenasa). 8. Corte dos hojas de Elodea, toma las hojas en tus manos por algunos minutos (para que tome una temperatura cercana a la del cuerpo). 9. Coloque las hojas en el centro del portaobjetos una por el haz y otra por el envés y añade una gota de agua.

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10. Cubre con un cubreobjetos y elimina el exceso de líquido con papel absorbente. Observa al microscopio con el objetivo de 40X. 11. Observe como se mueven los cloroplastos en el citoplasma girando alrededor del núcleo celular. Dibuja lo observado.

CUESTIONARIO. 1. ¿Qué son las mitocondrias y qué función realizan? 2. ¿En qué parte de la célula se localiza a las mitocondrias? 3. ¿Cómo se llama el pigmento verde que contienen los cloroplastos? 4. ¿Qué son los plástidos y cómo se clasifican? 5. ¿Cuál es la función de los cloroplastos? 6. ¿Por qué razón a los vegetales verdes se les da el nombre de productores o seres autótrofos?. 7. Escribe el nombre de las estructuras internas del cloroplasto.

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PRÁCTICA No. 6 “ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LOS PEROXISOMAS” OBJETIVO Demostrar in vitro la actividad enzimática de los Peroxisomas en diferentes células. INTRODUCCIÓN Los peroxisomas se denominan así porque generalmente contienen una o más enzimas que utilizan oxígeno molecular para eliminar átomos de hidrógeno a partir de substratos orgánicos específicos a través de una reacción oxidativa que produce peróxido de hidrógeno. El peroxisoma es una organela celular que consta de una membrana, constituida por una doble capa lipídica que contiene diversas proteínas. En su interior se halla una matriz peroxisomal, que contiene proteínas de función enzimática. Los peroxisomas se halla en todos los tejidos, pero predomina en el hígado, en el riñón y en el cerebro durante el período de formación de la mielina. Los peroxisomas tienen múltiples funciones. Destacan las relacionadas con el metabolismo lipídico. Entre ellas se hallan las reacciones de degradación, como la β- oxidación de los ácidos grasos de cadena muy larga (AGCML: de más de 22 átomos de carbono) y del ácido

fitánico y

también

reacciones

de

formación

de

plasmalógenos (lípidos complejos localizados en la mielina), colesterol y ácidos biliares. La β-oxidación peroxisomal de los AGCML acorta la longitud de su cadena para que puedan seguir degradándose en el interior de la mitocondria.

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MATERIAL 12 tubos de ensayo

Hígado de pollo

1 gradilla

Corazón de pollo

1 estuche de disección

Riñón de pollo

2 cajas de Petri

Rama de apio

5 vasos precipitados de 100ml

Papa

1 pipeta de 10 ml

HCl

1 Mechero

Alcohol

1 Mortero con pistilo

Hidróxido de sodio Peróxido de hidrógeno

PROCEDIMIENTO 1. Corte 6 cubos de aproximadamente 1 cm3 de apio, colócalo en hielo. 2. Corte 6 cubos de aproximadamente 1 cm3 de papa, colócalo en hielo. 3. Corte 6 cubos de aproximadamente 1 cm3 de carne (hígado, riñón y corazón), colócalo en hielo. 4. Enumere los tubos del 1 al 6 y adiciona 2 ml de peróxido de hidrógeno (PRECAUCIÓN) A cada tubo adiciona el tejido tal como se anota en la tabla 5. En cada uno de los tubos se debe determinar la presencia o ausencia de 02, inmediatamente después de adicionar el tejido tapa el tubo con el dedo pulgar y coloca en la boca del mismo tubo, un palillo en punto de ignición (no acerques los tubos a tu cara o a la de tus compañeros) 6. Repite los pasos 4 a 6 para los otros tejidos.

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TUBO

Papa

1

Machacado

2

Cocido

3

Con HCl

4

Con Etanol

5

Con NaOH

6

Sin ninguna alteración

TUBO

Apio

1

Machacado

2

Cocido

3

Con HCl

4

Con Etanol

5

Con NaOH

6

Sin ninguna alteración

TUBO

Hígado

1

Machacado

2

Cocido

3

Con HCl

4

Con Etanol

5

Con NaOH

6

Sin ninguna alteración

AL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)

AL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)

AL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)

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TUBO

Corazón

1

Machacado

2

Cocido

3

Con HCl

4

Con Etanol

5

Con NaOH

6

Sin ninguna alteración

TUBO

Riñón

1

Machacado

2

Cocido

3

Con HCl

4

Con Etanol

5

Con NaOH

6

Sin ninguna alteración

AL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)

AL MOMENTO DE AGREGAR (H2O2)

CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es la estructura y función de los peroxisomas? 2. ¿Qué es la enzima y como se relaciona con las peroxisomas? 3. ¿Cuál es la función de los glioxisomas en la germinación de las semillas de aceite de ricino? 4. ¿Cuál son los efectos del etanol y ácido clorhídrico sobre las enzimas? 5. Al cocinar los alimentos demasiado ¿ Cómo influye en la actividad de las enzimas? en lista las enzimas presentes en el peroxisoma 6. Anota las enzimas características de los glioxisomas, que no están presentes en los peroxisomas?

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PRÁCTICA No. 7 “MITOSIS EN CÉLULAS VEGETALES” OBJETIVO Observar células eucariotas de vegetales y animales e identificará la organización de genoma en interfase y mitosis. INTRODUCCIÓN El estudio de los cromosomas de células eucariotas con el microscopio óptico se hace preferencialmente en metafase, cuando estos tienen la morfología y estructura definida. La observación de la estructura del genoma en interfase, está fuera de la resolución del microscopio óptico, sin embargo, en algunas células es posible observar el cromosoma X heterocromatizado que se identifica como un corpúsculo, el cuerpo de Barr o cromatina sexual. La mitosis es el proceso celular por el cual las células somáticas se dividen para originar nuevas células hijas, son las encargadas de provocar el crecimiento y desarrollo de un organismo, esto es, las células aumentan en número por división, como resultado de la mitosis. Los núcleos resultantes mantienen el mismo número e identidad de los cromosomas de la célula de la cual derivan. La mitosis es un proceso bajo control genético, el cual ha sido dividido en cuatro fases: PROFASE, METAFASE, ANAFASE y TELOFASE. Teniendo cada una de estas sus etapas intermedias correspondiente. Además de la etapa terminal de la división celular llamada CITOCINESIS Este proceso celular ocurre en todas las regiones meristemáticas o puntos de crecimiento de una planta

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MATERIAL 2 Portaobjetos

Raices primarias de Allium cepa (cebolla)

2 cubreobjetos 1 Vidrios de reloj 1 Estuche de disección

Células de epitelio bucal Barniz de uña transparente

1 Lámpara de alcohol

HCl 1 N

1 Microscopio

Ac. Acético 45%

1 pinzas

Orceina acética

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PROCEDIMIENTO Preparación de los meristemos 1. Cortar de 1-2 cm la parte terminal de las raíces y colocar en vidrio de reloj con orceina acética. Cuidar que los meristemos queden perfectamente cubiertos con el colorante. 2. Calentar a la llama de la lámpara de alcohol, retirar al desprenderse vapores, enfriar y volver a calentar suavemente por 2-3 veces, cuide que la temperatura no ponga en ebullición el colorante, ya que esto daña los meristemos. 3. Enfríe y transfiera cada una de las raíces a un portaobjeto, corte 2 mm después del ápice, añada una gota de orceína y coloque encima el porta, presione con la punta de un lápiz la zona donde se encuentra el meristemo y mediante golpes con la goma del lápiz, dispérselo en monocapa, quite el exceso de colorante. 4. Observe al microscopio a 40X.

Método para la cromatina sexual-cuerpo de Barr 1. En porta objetos perfectamente lavados y desengrasados (alcohol etílicoácido acético 45%, 3:1), coloque una muestra de epitelio bucal (enjuague varias veces la boca), tomando por raspado suave con un abatelenguas, haga frotis de hombre, etiquételos. 2. Hidrolice con HCl 1N por 30-60 segundos y absorba el ácido acético por goteo, cubra con un portaobjetos y selle con barniz. Observa al microscopio a 100X

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Informe Meristemos Descripción

Cromatina Sexual Descripción

CUESTIONARIO 1. ¿Qué es el cariotipo? Explique cómo haría usted uno. 2. ¿Qué

aplicación

daría

usted

a

la

observación

de

las

células

meristemáticas? 3. ¿Qué diferencia hay entre la mitosis de células animales y vegetales? 4. Investiga cómo Barr y Bertram (1949), encontraron cromatina sexual. 5. Investiga

que

dice

la

hipótesis

de

Mary

Lyon,

respecto

a

la

heterocromatización del cromosoma X 6. De acuerdo a la hipótesis de Lyon explica por qué en hombres con una formula cromosómica 46XY, no se observa la cromatina sexual o cuerpo de Barr.

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Práctica No.8 “CARIOTIPOS EN RAÍCES DE HABA” Objetivo Realizar un cariotipo en una célula eucariota de un vegetal. Introducción En 1931, Levintsky llamó cariotipo al complemento cromosómico particular de un individuo ò grupo afín de individuos. Las características del cariotipo son constantes para las especies y pueden utilizarse, al igual que la morfología externa, para su clasificación taxonómica. Su análisis comparativo nos permite inferir relaciones filogenéticas entre los diferentes taxa. Definido tanto por el número como la forma de los cromosomas, es posible mediante el análisis de estas características detectar la diversidad de mecanismos citológicos surgidos en el curso de la evolución de los seres vivos. Con base en el cariotipo es posible observar si existen números anormales de cromosomas e identificar el sexo de los organismos. Los cariotipos se definen con respecto a las siguientes características: 1. Número de cromosomas 2. Tamaño absoluto y relativo de cada cromosoma 3. Relación de brazos cromosómicos 4. Posición centromérica 5. Constricciones secundarias

Material y reactivos Microscopio compuesto

HCL 1N

Portaobjetos

Alcohol al 70%

Cubreobjetos

Ácido acético al 45%

Aguja de disección (recta)

Solución de acetocarmin

Navajas de afeitar o bisturí

Aceite de inmersión

Colorante Feulgen

Ortho-Para diclorobenceno

Farmer (alcohol etílico absoluto: ácido acético glacial proporción 3:1)

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Material biológico: Semillas de haba germinadas de 10 días de edad o raíces

recién cortadas de plantas jóvenes. (Material preparado por el alumno). Procedimiento: 1. Se deben seleccionar los ápices radicales de las habas que presenten mejores condiciones, es decir que no tengan lesiones o manchas cafés. 2. Se ponen a pretratar en 8 Hidroxiquinoleina u Ortho-Para dicloro benceno durante 2 a 3 horas a 4 °C. 3. Se colocan en fijador Farmer (Alcohol etílico absoluto: ácido acético glacial en proporción 3:1) durante 24 horas y se cambian a Alcohol 70% hasta su utilización. 4. Después de la fijación de las raíces se lleva a cabo una hidrólisis colocando las mismas en HCl 1N durante 16 min a 60°C. 5. Inmediatamente se pasan al colorante Feulgen pera la tinción de los cromosomas por lo menos una hora. 6. Se realizan cortes muy finos del ápice y se colocan estos cortes en un portaobjetos limpio y seco con gotas de Acetocarmín o acetorceina, las suficientes para cubrir totalmente los tejidos. Se calientan brevemente en la lámpara de alcohol evitando que llegue a ebullición. 7. Posteriormente se coloca el cubreobjetos y se presiona con la goma de un lápiz cuidando de no romper el cubreobjetos, se puede presionar con el pulgar poniendo encima papel filtro o toalla sanita para quitar exceso de colorante. Nota: Tenga cuidado de no dejar deshidratar los tejidos, esto es, deberá de agregar un reactivo enseguida del otro, teniendo un breve espacio para secarlo. 8. Después se pueden adicionar gotas de ácido acético al 45 %, colocando

el cubreobjetos y observando al microscopio.

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Informe

Deberá ubicar distintos campos celulares, teniendo especial atención en aquellas células que presenten los cromosomas bien separados. Cuestionario

1. ¿Por qué cree usted que se observan mejor los cromosomas en metafase 2. Mitótica y no en otra fase celular? 3. ¿Podría trabajar con semillas sin germinar para poder observar los cromosomas? 4. Explique por qué los cromosomas se pueden teñir con acetorceìna. 5. Describa al menos 4 cariotipos en plantas, colocando en una tabla

comparativa el número de cromosomas, tamaño, forma y posición del centrómero.

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BIBLIOGRAFIA 1. Lehninger Albert. Bioquímica (Las bases moleculares de la estructura y función celular). Ediciones Omega. 1990. 2. Laguna

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1999. 3. Caracterización de biomoléculas. Mauricio D. Carbajal Tinoco. Premios Nóbel en Ciencias 2002: Química 4. Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K.Roberts y J.D. Watson “Biología Molecular de la Célula (1996) 3ª. Edición (traducido de la 3ª. edición inglesa, 1994). Ediciones Omega S.A., Barcelona. 5. Alberts, B., D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K.Roberts Y Peter Walter (1998) “Essential Cell Biology”, Garland Publishing, Inc. New York & London. 6. TERRÉS Speziale Arturo M; Clínica y Laboratorio: Ciencia y Tecnología; 2ª ed; ed. Graphimedic S.A. de C.V; México 2002. 7. PRESIDENCIA DE LA REPÚBLICA; CGEA, Guía técnica para la elaboración de manuales de procedimientos; Colección guías técnicas, serie organización y métodos núm. 9. 8. ANDERSON, Shauna C, Susan Cockayne; Química Clínica; 1ª ed; trad. Ma. Teresa Aguilar; ed. Interamericana-McGraw-Hill; México, 1995. 9. KAPLAN, A. Lawrence, Amadeo J. Pesce; Química Clínica Teoría, análisis y correlación; 3ª ed; trad. Tania Carreón Valencia; ed. Javier Ortega Ceseña; México 1996

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