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BIOLOGIA CELULAR 3º GRADO BIOLOGIA Raquel

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-Profesores: Alberto cuesta, Mª Engracia Abad. -6 Prácticas (en la última se hace el examen) -Trabajos por grupo (4-6 personas)  12 Noviembre -Examen: 30 preguntas tipo test (3 puntos) + 3 preguntas desarrollo (3 puntos). -Tutorías y seminarios  15% (0,25 asistencia). No entran los seminarios en el examen. Presentación seminario 1,25. -Prácticas  25% (0,2 asistencia). Habrá dos controles que puntuarán 0,5 y 0,3. El examen de prácticas vale 1,5. -Libros: Biología celular y molecular. Conceptos y experimentos (G. Karp). Biología molecular de la célula (B. Alberts). Biología celular y molecular (H. Lodish y Otros). La célula (G.M. Cooper)

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TEMA 1: MÉTODOS DE ESTUDIO DE CÉLULAS Y TEJIDOS 1. HISTORIA DE LA BIOLOGIA CELULAR La biología celular se basa en el estudio de la célula eucariota. Su interés es muy relevante (estudio de células madre, cáncer, etc.) pero sin embargo, en sus comienzos no parecía tan importante pues no se disponían de técnicas e instrumentos necesarios para su estudio. Con el desarrollo del microscopio óptico se empiezan a estudiar células. En los primeros estudios (siglo XIII-XVI) apenas hay interés por el estudio de la biología celular, pues se están desarrollando los microscopios que permiten aumentar las cosas de tamaño sentando la base para crear buenos microscopios. Con estos primeros microscopios que presentan lentes rudimentarias no se permitía ver bien las cosas. Lo inventó Jansen (1590) o Galileo Galilei (1610). En 1665 Robert Hooke crea un microscopio con dos lentes suficientemente bueno para observar células. Robert Hooke vio mediante el microscopio compuesto en el corcho estructuras como de ‘’celdas’’ vacías a las que llamó células (aunque realmente veía paredes). En 1674, Leeuwenhoek es el que describe por primera vez células vivas, describiendo gran cantidad de bacterias, células libres, núcleos, etc. Llamándolos animáculos. Usaba un microscopio simple. Entre los siglos XVIII y XIX se mejoran las lentes y los microscopios. En 1934. Se crea el microscopio de contraste de fases por Zernike. En 1942 Max Knoll y Ernst Ruska inventan el MET. En 1957 Minsky inventa el microscopio de Barrido Confocal. En 1965 se inventa el MEB. En el siglo XIX en 1838-39, Schleiden y Schwann tras una serie de hallazgos en muchos organismos, llegaron a concluir que todos los organismos están compuestos por células y que esta era la mínima unidad funcional y estructural de los seres vivos. Posteriormente Virchov confirma que toda célula proviene de una célula anterior. Estos 3 enunciados conforman la teoría celular tal y como la conocemos. TEORIA CELULAR - Todos los organismos están compuestos de células. - La célula es la unidad funcional y estructural de los seres vivos. - Toda célula proviene de otra célula

Posteriormente a finales del XIX se dan también una serie de hechos fundamentales corroborando todo lo anterior ya que se observa la mitosis y se demuestra la fusión de gametos y la meiosis. 3

2. DIFERENCIAS ENTRE EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS Las procariotas son las bacterias y las eucariotas son las células que forman parte de Protistas, plantas y animales. Las principales diferencias son: 1) Las bacterias son unicelulares simples (aunque pueden vivir en colonias) y los eucariotas son unicelulares o pluricelulares. 2) Los procariotas suelen ser más pequeños que los eucariotas. 3) A nivel de membrana plasmática, los procariotas nunca presentan esteroles, en cambio los eucariotas sí. 4) Los procariotas no tienen proteínas del citoesqueleto, los eucariotas si. 5) Además, los eucariotas tienen pared celular. Los procariotas pueden no tenerla. 6) Otra diferencia es en la presencia de núcleo, que solo está en eucariotas. La presencia del material genético está en una sola molécula en procariotas, y en eucariotas aparece como una molécula lineal y en un número mayor de uno (cromosomas). 7) Otra diferencia es el sistema respiratorio, en procariotas está integrado en la membrana plasmática y en las mitocondrias en las eucariotas. 8) Otra diferencia es la propiedad de sedimentación del ribosoma, son de 70S en procariotas y 80S en eucariotas, excepto el de las mitocondrias que es de 70S. Estos datos confirman que las mitocondrias proceden de bacterias.

3. PROPIEDADES DE LAS CÉLULAS 1) Son muy pequeñas y no podemos verlas. MICROSCOPIOS 2) Son transparentes (ofrecen poco contraste a la luz). 3) Son complejas y organizadas. 4) Son capaces de obtener energía y utilizarla. 5) Poseen un programa genético. 6) Crecen y se reproducen pues obtienen energía. 7) Producen reacciones químicas pues tienen un metabolismo. 8) Producen y reaccionan a estímulos del exterior 9) Pueden moverse y cambiar de forma pues son plásticas. 10) En organismos multicelulares sobretodo se autorregulan. Las células están en un proceso de homeostasis (Se regeneran, unas mueren y otras nacen). 11) Las células evoluciona 4

4. MICROSCOPIA -TAMAÑOS RELATIVOS El desarrollo del estudio de la célula se da con el desarrollo de la microscopia. Nuestro ojo es capaz de ver hasta 0’1 o 0’2 mm y las células presentan un tamaño de 5-10 μ. De manera que en función de la disminución del tamaño de las formas celulares tendremos 2 tipos de microscopio que nos permite estudiar células y componentes celulares.

-CARACTERISTICAS DE LAS CELULAS Además de que las células son pequeñas, son transparentes, de manera que tienen poco contraste (pequeñas, acuosas y tienen átomos ligeros) y no se pueden observar fácilmente. Para poder ser estudiadas por un microscopio podemos modificar el contraste de la muestra (tinciones o podemos modificar la física del microscopio. En función de estos dos factores presentamos distintos tipos de microscopia.

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5. MICROSCOPIOS OPTICOS En estos usamos una fuente lumínica. Dentro de estos tenemos: 1) Microscopio óptico de campo claro Usa la luz como fuente de energía que se conduce hasta el ojo a través de unas lentes. El microscopio óptico (de campo claro) presenta dos lentes que nos permiten ver el objeto. En el de Leeuwenhoek (microscopio simple) es un microscopio con una lente que nos amplifica la muestra.

La luz que pasa por el microscopio viaja por un sistema de espejos para que confluya toda la luz en la muestra concentrándose sobre ella y en función del contraste, esa luz va a cambiar su dirección y vamos a tener después un sistema de lentes (el objetivo) que nos recogen toda o parte de esa luz que ha atravesado la muestra. Gracias a un sistema de espejos y lentes (el ocular) nos va a llegar hasta el ojo siendo capaces de visualizar de forma aumentada la muestra y su contenido. El microscopio de Hooke era compuesto (dos lentes):

El límite de resolución es muy importante para el microscopio. Cuanto mayor sea su límite más separadas se ven las estructuras. Cuanto mayor sea el límite de resolución mejor es el microscopio y se calcula por una fórmula:

(AN es apertura numérica) 6

LUZ BLANCA λ = 550nm AN= n · senα AN ACEITE= 1, 5 Cuanto mayor es la apertura numérica (AN) menor es el límite de resolución. Cuanto más cerca esté la muestra del objetivo menor será el límite de resolución. Con aceite de inmersión, el límite de resolución aumenta hasta 1000 veces con respecto al ojo humano. El microscopio de campo claro necesita aumentar el contraste de la muestra, para ello se tiñe la muestra de manera que para suministrar coloración se trabaja con material muerto, de manera que esta microscopía no permite material vivo salvo que tenga pigmentos naturales.

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Microscopio de campo oscuro El microscopio de campo oscuro presenta una ventaja y es que permite trabajar con material vivo, que no tiene por qué estar coloreado. Lo que se hace es variar la física de la luz de manera que nos ofrece en el material vivo unos contornos brillantes con un fondo oscuro, ya que entre el condensador y la fuente de luz se pone un cilindro que bloquea toda la parte central de la luz, solo llegando la parte periférica de la luz haciendo que toda la luz llegue inclinada hacia la muestra y toda aquella luz que no es dispersada por la muestra no la vemos y vemos la dispersada por ello vemos brillo sobre un campo oscuro. En este caso no se permite estudiar con mucho detalle, es decir, no tiene buen límite de resolución, pues su apertura numérica no pasa de 1.

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Microscopio de contraste de fase El microscopio de contraste de fase es muy usado, y nos permite estudiar material vivo debido a su física, ya que se introduce un condensador de anillo y un plato de fase en el microscopio. El condensador solo permite que pase un cilindro de luz hueco en el centro que luego hace que una vez que la luz llega sobre la muestra se produzca un pequeño desfase en la luz (de un cuarto) que llega a través de la célula produciendo una refracción muy pequeña, pero al colocar el plato de fase hace que la longitud de onda que va desfasada la vuelve a retrasar (otro cuarto) de manera que se retrasa la mitad la longitud de onda y esta mitad si se puede recoger y ver. Su poder de resolución es bajo pero nos permite distinguir el contorno celular, el núcleo, etc.

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4) Microscopio de Nomarski o contraste por interferencia diferencial

(DIC) En este caso podemos trabajar también sobre material vivo pero además podemos trabajar sobre material grueso incluso hasta con pequeños organismos completos. Este microscopio va a trabajar sobre las pequeñas variaciones del índice de refracción que existía entre los distintos componentes extracelulares amplificándolos, sacando así una buena imagen. Para ello utilizamos luz normal la cual pasaremos por polarizadores, incidiendo en la muestra luz polarizada monocromática, por lo que toda la luz presenta una misma longitud de onda. Todos los rayos de luz son paralelos y deben llegar al mismo tiempo y con la misma inclinación, pero no es del todo cierto, ya que se introduce un prisma, por lo que todas estas longitudes las separa en dos rayos paralelos con las mismas longitudes de onda. Estos dos rayos atraviesan los condensadores, muestras y llegan a otro prisma que los junta. Si los dos llegan al mismo tiempo al prisma se fusionan y llega una única longitud de onda. Si esos dos rayos atraviesan muestras con distinto índice de refracción sufren un retardo y al fusionarse no lo hacen en la misma fase, de manera que uno llegará antes que otro, por lo que la imagen nos llega una antes que otra, formando una imagen tridimensional, eliminándose los halos de microscopía de contraste de fases.

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5)

Microscopio de fluorescencia/epifluorescencia (MF) En epifluorescencia el haz de luz llega por arriba incide sobre la muestra y vuelve de nuevo hacia arriba. Estos microscopios se basan en la fluorescencia, que es la capacidad de ciertas moléculas de absorber luz de una determinada longitud de onda y emitir luz a mayor longitud de onda durante un periodo de tiempo. Esto produce la emisión de energía que provoca esta fluorescencia por acción de los fluorocromos. La parte del fluorocromo que produce esta fluorescencia es el fluoroforo. Cada fluorocromo tiene un espectro de excitación con un máximo y va a tener un espectro de emisión de mayor longitud de onda con un máximo también. Estos espectros pueden solaparse en parte y pueden darnos imágenes que no se adecuen a la realidad. En este tipo de microscopio se cambian las fuentes de iluminación puesto que tenemos una luz ultravioleta y se parte con una longitud de onda baja para emitir longitudes mayores y puedan ser visibles, por eso se usa la luz ultravioleta (340-500 nm). Estos microscopios presentan una serie de filtros que no deben porque estar en el microscopio sino que se añaden a un microscopio cualquiera al que se le añade la fuente de luz ultravioleta y quita la luz. Hay un filtro que será el de excitación al que le llegará una luz y se elige la longitud de onda que queremos que atraviese ese filtro y que excite al fluorocromo. Después tenemos los 10

filtros de barrera. Estos eliminan todos los fluorocromos que se puedan solapar y pueden ser de 3 tipos:  Filtro de paso de banda, que puede pasar un rango más o menos estrecho de longitudes de onda. Puede pasar la longitud de onda de una franja.  Filtro de paso corto, donde pasan todas las longitudes que sean menores de 600 nm por ejemplo, y las que no lo sean, no pasan.  Filtro de paso largo donde pasan todas las longitudes de onda que sean mayores a X (por ejemplo, 600nm), mientras que las menores no.

En esta microscopia se pueden estudiar tanto material vivo como material muerto. Se puede usar para determinar una muestra concreta, para la presencia de una enzima, de ADN, proteínas, etc. Además se pueden utilizar distintos fluorocromos en la misma muestra, generalmente se trabaja con equipos rutinarios con verde, rojo y azul. El problema es que las muestras que se colorean no se saben con exactitud donde se encuentran cada estructura, por lo que se deben comparar con otras imágenes de la misma muestra con distinto microscopio para ver de qué estructura se trata. A la hora de trabajar con microscopia de fluorescencia debemos saber que: - Se presenta una emisión a mayor longitud de onda. La excitación del fluorocromo dura muy poco por lo que la fluorescencia es muy rápida, por ello se necesita un capturador de imágenes, muy rápido y sensible. Además, los fluorocromos presentan el apagado o “quenching”, que quiere decir que existen sustancias que enmascaran el espectro de emisión del fluorocromo por lo tanto no se podrá ver. - Se presenta también el blanqueamiento o “photobleacing” que quiere decir que la exposición continuada del fluorocromo hace que este no sea capaz de excitarse. Podemos estudiar tanto el apagado como la reaparición.

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Práctica 1

6) Microscopio de barrido confocal (MBF) En este caso usamos un rayo láser en lugar de luz y lo que tenemos son detectores y fuentes que actúan haciendo pinhole. Estos hacen que el rayo laser no incida sobre toda la muestra al mismo tiempo, de manera que, variando la apertura y la distancia de los pinhole, hacemos que la luz incida sobre una determinada parte de la muestra dándonos imágenes muy nítidas, por eso se llama barrido confocal (se puede focalizar todo el sistema en un plano y se puede cambiar la altura de ese plano). Resolución de 0’1 μm. Hasta 15.000X.

Ventajas: La mejora óptica, que va asociado a software muy buen. Produce la digitalización de imágenes, elimina los inconvenientes de la microscopía de fluorescencia, además la iluminación es más débil y más rápida, por lo que hay un sistema de captura más sensible; se excita menos el fluorocromo gastándolo menos, asique se puede excitar periódicamente pudiendo hacer estudios cinéticos. Se mejora la resolución al enfocar un solo plano. La toma de muchos planos nos permite hacer imágenes tridimensionales. Preparación de muestras: Las muestras pueden estar tanto vivas como fijadas. Enteras o secciones gruesas. Modos de recoger las imágenes: Las imágenes se recogen por secciones individuales (sección óptica). Podemos obtener imágenes 3D moviendo en el eje Z la profundidad, y podemos obtener imágenes 4D. 12

6. MICROSCOPIOS ELECTRONICOS 1) Microscopio electrónico de transmisión (MET) Se utiliza para estudiar la ultraestructura. Tenemos un microscopio con alto poder de resolución (1 nm). Esta microscopía es similar al microscopio óptico, se trabaja a alto vacio. Esto hace que los electrones se aceleren a un ánodo perforado pasando los electrones por el vacio por lentes electromagnéticas hasta llegar a la muestra y a través de unas lentes llega a una cámara digital. Al chocar los electrones sobre la muestra, estos se dispersan en todas las direcciones. En esta microscopía se recogen los electrones que no se dispersan por lo que en la imagen se verá en tonos negros, blancos y grises. Se trata de muestras sin nada de agua, estabilizadas y que estén contrastadas, pues todos los componentes celulares tienen muy baja densidad y eso no ofrece resistencia a los electrones. Se usan técnicas de tinción que nos permitan identificar estructuras y que sean muy electrodensos, siendo capaces de ser reflejados los electrones viendo así estructuras que sin contrastar no veríamos. Se obtendría una imagen similar a las de campo claro pero sin color. Además, para favorecer la penetración y transmisión de estos electrones la muestra debe ser muy fina. Se aumenta la imagen 200.000 veces.

2) Microscopio electrónica de barrido En este caso no estudiamos los electrones transmitidos, sino los dispersados. Esta microscopía nos permite estudiar la superficie, y su resolución es menor a la anterior (10nm), trabajando a 10.000 o 20.000 aumentos. Una vez que los electrones inciden sobre la muestra se recogen los electrones dispersados. En este caso las muestras se metalizan (material electrondenso) para hacer que los electrones se dispersen, pudiendo estudiar la superficie.

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7. COMPARACION ENTRE MO Y MET

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TÉCNICAS APLICADAS A BIOLOGÍA CELULAR 8. TECNICAS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA Consisten en un conjunto de técnicas encaminadas a identificar, localizar y cuantificar una molécula o estructura en un tejido (histoquímica) o célula (citoquímica). Estas técnicas pueden ser generales o especiales. Las técnicas especiales puedes ser enzimohistoquímica (la presencia de una enzima), inmunocitoquímica (presencia de un antígeno) y lectinohistoquímica (presencia de un azúcar). Se necesita contrastar el material mediante colorante. En cuanto al procesado de las muestras se realiza en varias partes: 1) Toma de la muestra mediante las técnicas apropiadas. El tamaño debe ser inferior a 1cm3 y las muestras deben tomarse en frio para evitar procesos de degradación. 2) Fijación: Una vez que tenemos la muestra, para evitar la degradación y para mantener la muestra en su forma, fijamos la muestra manteniendo la estructura de nuestro material lo más parecido posible a como es en realidad. Podemos hacer la fijación de distinto modo, si lo que hay es un fragmento se hace un inmersión, en la que la muestra se sumerge en el liquido fijador o se le inyecta al animal o se hace una perfusión, sustituyendo la sangre por liquido fijador. Los fijadores deben actuar con rapidez evitando degeneración y autolisis, además deben tener un buen poder de penetración limitando el tamaño de la muestra (cuanto mayor poder mayor tamaño puede tener la muestra). Debemos tener en cuenta la velocidad de fijación, es decir, cuánto tarda en fijar la muestra. Estos fijadores deben conservar todos los detalles estructurales, deben permitir los procedimientos posteriores, deben impedir la desaparición de los elementos durante la fijación o después y no deben retraer excesivamente los tejidos ni volverlos quebradizos.

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Hay distintos tipos de fijadores: - Físicos:  Por calor: Muy malo para histología. En microbiología.  Por frio y congelación: en estos se sumerge el órgano en N2 líquido o CO2 líquido. Se fija instantáneamente y el órgano se endurece. Se usa mucho para el estudio de enzimas pues conserva la función de las enzimas y mantienen los epitopos. Químicos: Se trata de sustancias químicas que actúan formando una red entre proteínas y material celular de manera que no altera las propiedades de los componentes, o bien desnaturalizando los componentes. En función de su naturaleza tenemos:  Aldehídos: Son muy buenos fijadores para proteínas, forman redes y por tanto no desnaturalizan, por lo que se usan para detectar la presencia de un antígeno o enzimas en algunos casos, pero penetran muy lento, los más usados son la formalina y el glutaraldehido.  Alcoholes: Son fijadores muy rápidos pero no penetran bien y se usan para teñir células en suspensión o frotis o en cultivos celulares y su fijación es prácticamente inmediata, pero contraen mucho a las células. Desnaturalizan, endurecen, disuelven lípidos. Se usan el metanol y el etanol al 96%.  Ácidos: Son muy buenos pero desnaturalizan las proteínas, se usa el pícrico que fija el citoplasma, el acético que estabiliza y fija el material genético y el ósmico que fija los lípidos.  Sales: Como el dicromato, permanganato potásico. Estos fijan bien proteínas pero desnaturalizan. Lo que se usa más que fijadores simples son mezclas de fijadores, normalmente se utiliza: Bouin: Se trata de formaldehido-picrico-acético, que estabiliza material genético y gran variedad de proteínas. Carnoy: Es otro que se usa para material genético. Está constituido por etanol, cloroformo y acético en relación 60:30:10. - Zenker: Que está constituido por bicromato de potasio bicloruro de mercurio y acético. Los fijadores además de fijar, retraen en cierta medida el material y lo vuelven quebradizo por lo que no se puede extender durante mucho tiempo la fijación pues se 16

dificulta el procesado por lo que se elimina tras su acción y para ello lo sumergimos en etanol de 70. 3)

Inclusión: Una vez fijada se inicia la inclusión que sirve para hacer un bloque que permita hacer cortes de la muestra. Se utiliza para hacer el bloque materiales no hidrosolubles, como parafina o resinas, por lo que la muestra se queda sin agua. Primero se deshidrata con pasos progresivos de etanol al 70% (50-70-90-96-absoluto) 12h cada uno. Tras la eliminación del agua se hace el aclaramiento pues la sustancia para realizar el bloque no es miscible en la muestra, por lo que se usa Xilol que si lo es. Tras ello se hace la impregnación, se impregna todo con parafina liquida (60oC) y una vez que lo tenemos impregnado se incorpora en un molde, se le añade parafina y queda la muestra secuestrada en el molde, quedándonos un bloque de parafina. 4) Corte: Este corte puede hacerse de distinta forma, puede ser a mano alzada si se tiene una estructura ya endurecida como se hace en histología vegetal. En el caso de tejido con el que se usa microtomo, primero hacemos un devastado del bloque (se dibuja como un trapecio alrededor de la muestra que será lo que se corta) y mediante un microtomo de parafina cortaremos la muestra en tamaños de 3 a 10 μm y una vez que tenemos los cortes estos van saliendo en fila y se van colocando en un portaobjetos. Para ello nos ayudamos de poli-L-lisina o albumina. Se pueden hacer cortes individuales o bien seriadas (se usa mucho para localizar en la misma célula dos reacciones o dos componentes, etc.). También hay criomicrotomos que se usan para hacer cortes por congelación, se hacen cortes de 5 a 30 μm y funcionan los microtomos igual que los anteriores. 5) Tinción: Una vez que el colorante ha reaccionado con el material biológico, el resultado es que ese colorante quede fijado en el material biológico. Los colorantes son soluciones acuosas de modo que no se puede impregnar con el material hasta que no se produzca la desparafinacion, se hidrate la muestra y ya por último se realice la tinción. Tras esto se realiza el montaje mediante el uso de un material hidrosoluble como la glicerina pero es hidrosoluble por lo que no se conserva por mucho tiempo, también se puede mantener por material no hidrosoluble, como es el DPX que nos lo puede mantener por más tiempo, pero para este caso se debe deshidratar de nuevo. Este montaje se realiza para mantener la muestra (en el caso de DPX) y además como su índice de refracción es mayor que el del aire nos permite ver imágenes con mayor índice de refracción. - Tinción de rutina Tiñe todas las estructuras en función de las técnicas acido-base entre las estructuras y el colorante. Según la naturaleza del colorante puede ser: Acido: Tiñe estructuras con carga positiva o acidofilas (como citoplasma, citoesqueleto, etc.). Estos colorantes son las eosinas. 17

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Básicos: Tiñen estructuras con carga negativa o basofilas (como núcleo, matriz extracelular, nucleolo). Este tipo de colorante es la hematoxilina. La hematoxilina da un color violáceo-rosa intenso. Colorantes mixtos: Se trata de la mezcla de estos dos colorantes por ejemplo. Giemsa: Usada para muestra de sangre. Este tipo de tinción mezcla distintos colorantes y tiñe de manera igual que la hematoxilina-eosina.

Tinciones especiales Nos permiten identificar un grupo de componentes. Estas tinciones pueden ser: - Tinciones para el ADN: Como el reactivo de Feulgen, que se hace un tratamiento enzimático con HCl a 60o y lo que hace es que los grupos de las bases purinicas se transforman de grupos alcohol a aldehídos que reaccionan específicamente con el reactivo de Schiff, que se basa en la fucsina básica decolorada, dando un color purpura que está siempre en el núcleo, que es donde está el ADN. También hay tinción doble para distinguir el ADN del ARN con el verde metilo-pironina. El metilo tiñe de verde el ADN y la pironina el ARN de rojo. - Tinción para carbohidratos y mucopolisacáridos: Tenemos la reacción de PAS (acido peryodico de Schiff) que actúa sobre la gran cantidad de carbohidratos de las mucinas, donde hace que los OH sean transformados a aldehídos que reacciona con Schiff dando un color rojo intenso. El azul alcian tiñe los glucosaminoglucanos ácidos y en función de la acidez del medio, podemos ver mucinas con distinto grado de acidez. La tinción sale de color azul pálido. Con estas tinciones también se observan los núcleos mediante una tinción de contraste (hematoxilina o eosina, siempre y cuando no enmascare la tinción de PAS). Se usan sobre todo para tejidos mucosos. Para saber si una célula presenta mucinas neutras o acidas se hacen las dos tinciones para ver el resultado. - Tinciones para grasas: Debemos mantener para ello grasas en su lugar por lo que no se usan disolventes orgánicos como el alcohol. Para el estudio de grasas se utilizan cortes por congelación. El colorante se unirá a estructuras con la misma afinidad. Estas muestras se podrán lavar con agua. Se utilizan principalmente tinciones de Sudan que forman precipitados negros o rojos. También se usa tetraóxido de osmio que produce una coloración de los fosfolípidos de color negro y se usa para MET (microscopio electrónico de transmisión) principalmente ya que además de fijar contrasta. También se usa el rojo-o al aceite. - Tinción para fibras de tejido conjuntivo:  En fibras colágenos: Se usa el tricrómico de Von Gieson (color rojo) tricrómico de Gomori (color rojo) y el de Masson (color azul).  En fibras elásticas: Se usa método de Gomori (tiñen de color purpura oscuro), orceina (purpura) o Verhoeff (color negro).  En fibras reticulares: Se usa el método de Gomori para la impregnación argentica de la reticulina (color negro).

- Tinciones especificas Nos identifican de forma concreta una proteína, gen, etc. - Enzimohistoquímica: Nos pone de manifiesto una enzima. Para ello se mantiene la integridad, estructura y función de esta proteína por lo que se usara la congelación o fijación débil. A esta enzima se le pone un sustrato incoloro que nos forma un producto enzimático coloreado e insoluble (que precipite). También hay reacciones donde el producto sea fluorescente o electrondenso. Es fundamental mantener las condiciones óptimas de pH, temperatura, concentración, etc. Se usan controles negativos mediantes inhibidores específicos para asegurarnos de que hay una reacción específica. Las enzimas 18

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mas típicas que se ponen de manifiesto son esterasas, fosfatasas, peroxidasas y diaforasas. Nos debemos asegurar de que la reacción es específica. Se usara contraste de fondos para identificar el fondo de nuestra muestra. Muchas de las enzimas que identifica solo presentan una localización, por lo que no solo se usa para poner de manifiesto una enzima, sino que se utiliza para localizar una estructura como son los lisosomas porque la mayoría de las enzimas estudiadas con esta técnica están allí. Hay otras enzimas que están solo en el Golgi, otras en el RE, etc. Lectinohistoquímica: Se basa en el uso de lectinas para el marcaje de una estructura. La lectina son glicoproteínas que se unen de forma específica a determinados enlaces de azucares de manera que nos permite estudiar la presencia de glicoproteínas y se puede así estudiar la presencia de determinados residuos sacarinicos de las proteínas. En algunas casos hay proteínas que solo tienen un tipo de residuo de manera que de forma indirecta nos permite identificar proteínas o grupo de proteínas. En función del carbohidrato que reconozca se dividen en 5 grupos. Lo que se hace es que al tener una sección histológica se desaparafina, se hidrata e incubamos la preparación con la lectina que va marcada con distintos tipos de marcaje. Una vez que se incuba se retira la muestra y se sigue el procesado histológico (se hace un contraste, se deshidrata, se monta y se observa al microscopio). Para el revelado se usa peroxidasa, de manera que se pone la lectina con peroxidasa unida y se pone un sustrato de la peroxidasa (diaminobencidina) que al entrar en contacto con la peroxidasa forma un precipitado de color marrón oscuro insoluble que se visualiza por microscopia. Existen lectinas que son especificas y otras que no. Al estudiar las glucoproteínas se usan distintos tipos de lectinas para determinar cuáles son los enlaces y así podemos localizar en que célula esta cada una de estas uniones o dentro de la misma célula. Esta técnica se puede conjugar con otras técnicas para ampliar la información que se obtiene del estudio. Inmunocitoquímica: Se basa en la reacción inmunológica de los anticuerpos que reconocen de forma específica a un antígeno. Se puede utilizar esta técnica para microscopia óptica, de fluorescencia, confocal, o MET. Se debe tener una consideración y es que a la hora de tratar el material se debe conservar la antigenicidad (que el epitopo sea reconocible por el anticuerpo) por lo que se prefiere técnicas de congelación, la fijación es débil, cada anticuerpo tiene preferencia por un tipo de fijación. Los anticuerpos pueden ser o monos o policlonales. Los monoclonales son anticuerpos idénticos porque son producidos por un solo tipo de célula del sistema inmune., en cambio los policlonales son una mezcla de inmunoglobulina, secretados en contra de un antígeno especifico, cada uno reconociendo diferentes epitopos. Además se deben hacer controles de especificidad, para que un epitopo se reconozca por un determinado anticuerpo y no por otro, por ello se usan distintos controles, como el bloqueo, que antes del uso del anticuerpo se pone una fuente alta de proteínas, de manera que tenemos una proteína que dificulta el acceso del anticuerpo al antígeno, seleccionando los anticuerpos que se unen muy bien al epitopo. También se puede hacer mediante el uso de un suero que sea de la misma especie de donde se obtiene el anticuerpo, o el uso de leche en polvo que también tiene gran cantidad de proteínas como el suero. También se puede hacer una preabsorcion que para ello se debe tener el antígeno purificado, para ello preincubamos el anticuerpo con el antígeno, de manera que esta mezcla se pone sobre el tejido, y como el anticuerpo esta unido al antígeno no se une a la muestra por lo que no se detecta nada. Una vez hechos los controles presentando gran cantidad de controles negativos, comprobando que funciona bien. Los anticuerpos se pueden marcar para poder visualizarlos, para ello se usan enzimas, fluorocromo, biotina, oro coloidal, bolas magnéticas, etc. unidas 19

al anticuerpo. La inmunocitoquímica puede ser directa cuando se une el anticuerpo con el marcador o bien indirecta cuando se usa primero un anticuerpo frente al antígeno y después un anticuerpo secundario frente al anticuerpo primario y este secundario es el que va marcado, amplificando así la señal. Como marcador se suele usar:  Una enzima, para MO, como puede ser:  Peroxidasa: La peroxidasa usa un sustrato que produce un precipitado de color marrón oscuro pero el problema que presenta es que no se sabe si la reacción es debida a la que va unida al anticuerpo o bien a la peroxidasa de dentro de la célula. La peroxidasa tiene un punto débil y es que se inhibe de forma irreversible por el sustrato, por lo que si la peroxidasa, una vez que se desparafina y se hidrata, se somete a alta concentración de peróxido de hidrogeno se inhibe, para así eliminar el exceso de peroxidasa quedando solo el que está unida al sustrato. Además hay que tener en cuenta que existe otro inhibidor de la peroxidasa que es la azida sódica.  Fosfatasa alcalina: No se inhibe por sustrato, pero se hace una inhibición de la fosfatasa endógena. Se puede añadir sustrato de forma continuada con la fosfatasa alcalina no como en la peroxidasa. La señal se puede amplificar con métodos como:  PAP: Donde tenemos un anticuerpo primario que reconoce al anticuerpo secundario, y después esta la estructura PAP que presenta un anticuerpo terciario que presenta peroxidasa, revelándose al igual que antes.  ABC: En este caso el anticuerpo secundario va marcado con biotina, después se pone avidina en el sistema ABC, uniéndose proteínas de forma específica a biotina que lleva unida peroxidasa. Se pueden utilizar bien con peroxidasas o bien con fluorocromos, de manera que se puede visualizar mediante microscopia de fluorescencia o de barrido o citometría de flujo. Si se quiere usar MET lo que se usara para marcar al anticuerpo partículas de oro coloidal. También se puede realizar una inmunocitoquímica simple o bien múltiple (detectar varios antígenos al mismo tiempo). Para ello debemos tener una precaución, se deben tener anticuerpos generados en especies distintas para que no haya reacción cruzada. Para identificar varios antígenos de una misma especie usando diferentes sistemas de revelado, pero el antígeno debe expresarse en amplia cantidad. - Hibridación in situ: Se utiliza para detectar ADN o ARN específicos. Se hacen sondas mediante PCR de ADN o ARN que presentan bases marcadas con biotina o digoxigenina, de manera que se pone a incubar a unas condiciones adecuadas la sonda y la muestra y las regiones complementarias se unirán con la sonda. Después se quita el exceso de sonda y se revela la presencia de la sonda marcada. Para ello se usan anticuerpos y se localiza el ADN o expresión de ARN. Además se puede hacer una técnica que es la PCR in situ. Lo que se hace es añadir a ese tejido una mezcla que lleve los nucleótidos, algunos marcados y se añade retrotranscriptasa inversa y se añaden cebadores, de manera que se hace una reacción de retrotranscripcion del ARNm con unos primers específicos así se pasa el ARNm a cDNA, de manera que solo el gen que se estudia se transcribe generando este cDNA. Además hay ADN polimerasa, por lo que se somete a PCR y se amplifica, amplificando la expresión de un ARNm de forma específica. Una vez terminada la PCR se somete al revelado del marcador con las técnicas que se precise, se hace un contraste y así localizamos las células que se están expresando. 20

- Autoradiografía Se basa en el uso de elementos marcados radiactivamente. Estas técnicas se han ido dejando de usar. En este caso al animal o célula se expone a un isotopo radiactivo y se estudia al cabo de un tiempo la muestra y se realiza un procesado para MO o MET y se observa usando un film fotográfico con emulsión de plata y se observa la presencia de depósitos de plata.

9. TECNICAS PARA MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA O DE BARRIDO CONFOCAL Estas técnicas se han desarrollado mucho pues han aparecido muchos fluorocromos tanto naturales como artificiales y son muy específicos. Estos fluorocromos pueden unirse de forma específica a proteínas, otros a ARN, a ADN, orgánulos celulares, ácidos nucleicos, etc. Hay otros que se usan como trazadores iónicos. Sus aplicaciones más importantes son: - Photobleaching donde tenemos: - Técnicas FRAP: Donde se elimina la fluorescencia de un punto y se estudia cómo va apareciendo la fluorescencia, de manera que se puede estudiar la movilidad de proteínas o lípidos en una zona. - Técnicas FLIP: Donde se utiliza para estudiar el caso contrario. - Técnica TRET: De manera que lo que hay es una proteína con dos dominios que interactúa, cada dominio esta unido a una proteína fluorescente. Se excita un solo fluorocromo que produce una excitación mayor y hace que se excite la otra proteína del otro dominio, haciendo que los fluorocromos se acerquen, pudiendo estudiar interacción entre proteínas distintas o entre dominios de la misma proteína. Estas técnicas se utilizan para estudios de viabilidad, ya que existen colorantes vitales que permiten generar fluorescencia en células vivas, mientras que otros solo actúan en células muertas y se van a unir al ADN pudiendo distinguir entre células vivas o muertas. También se puede estudiar proliferación, viabilidad, muerte celular, etc. También técnicas Inmunofluorescencia, actividades enzimáticas, movilización de sustancias, se pueden estudiar sondas fotoactivadas, que presentan grupos nitrofenilo que bloquean la fluorescencia y se activan por radiación ultravioleta, viendo la movilización de calcio, IP3, cGMP, etc. Las ventajas del uso de esta microscopia es la obtención de imágenes de secciones virtuales y al incidir poco tiempo en la muestra, puede obtener imágenes con mayor sensibilidad mucho más rápido. También se pueden obtener imágenes en 2D, 3D e incluso en 4D. Además se pueden realizar secciones longitudinales y se reconstruye las imágenes pudiendo estudiar formas que no se puede ver a microscopio

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TECNICAS PARA MET Para el MET es necesario aumentar el contraste de la muestra con materiales electronodensos. El procesado se debe realizar teniendo mucho cuidado porque se estudia la ultraestructura. Si se altera la muestra se puede llegar a conclusiones erróneas. Se toman muestras de tamaño muy pequeño y se debe trabajar siempre en frio. Al ser más pequeñas hace que los fijadores lleguen de forma mucho mas rápida. La fijación es mediante el uso de glutaraldehido del 2-4% que fija proteínas y queda un fijador que forma redes. Este fijador no va en agua sino que va a ir preparado en un tampón para que no haya diferencias en la presión osmótica. Tras la fijación se hace una post-fijación con OsO4 que lo que hace es fijar lípidos y además ofrece contraste por lo que se comienza a contrastar la muestra. Tras esto la muestra se deshidrata (alcohol de 50-70-80…) después hay un proceso de aclaramiento y posteriormente se forma la inclusión formando bloques de resinas epoxi. Una vez que se tiene el bloque se hacen secciones. Primero se hace un corte semifino, de 0’5 hasta 1 μm de grosor y se tiñe con azul de toluidina y se observa al microscopio óptico para acotar la zona que queremos observar al MET, por lo que después se realiza un corte ultrafino, de 25 a 100 nm mediante un ultramicrotomo con cuchillas de vidrio o diamante y se disponen las secciones sobre unas rejillas de niquel o cobre. Esta rejilla es el equivalente al portaobjetos, de manera que se realiza el proceso de tinción, para así aumentar el contraste, mediante citrato de plomo y acetato de uranilo, de manera que se disponen de forma específica sobre el material biológico.

Estas técnicas se usan para realizar reacciones de enzimohistoquímica (detectar enzimas), lectinohistoquímica (detectar azucares), inmunocitoquímica (detectar anticuerpos marcados con oro coloidal. Nos permite definir la localización exacta del antígeno. Se realiza antes una tinción inmune para poder observar estos anticuerpos, es decir, sería un tratamiento de pre-inclusión o bien post-inclusión en función del momento en que se realice. Se usa la proteína A-oro). También se pueden hacer técnicas autoradiograficas, hibridación in situ, etc. También se realizan tinciones negativas, para ello se pone la suspensión del material a estudiar sobre la que se dispone una gota de carbono y después se trata con acido fosfotúngstico que se une y da contraste a toda la muestra y es muy electronodensa. Una de las aplicaciones más importantes que se realiza es la técnica de criofractura para estudiar membrana. Cuando la muestra se congela y se somete a alto vacio se le hace incidir una cuchilla, que debido a la congelación y al vacio, el punto de ruptura es entre la bicapa lipídica. Una vez separada la membrana, las proteínas de membrana, especialmente las transmembrana nos quedaran o en una cara o en otra y lo que se hace, es que cada una de las partes, se metalizan a una cierta inclinación. De este modo se observara las proteínas transmembrana en forma de relieve.

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Otra forma de crear relieve para estudiar cualquier orgánulo consiste en el uso de un sombreado metálico, haciendo que la muestra tenga un aspecto tridimensional, pudiendo estudiar a MET esta estructura 3D.

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TECNICAS PARA MEB

La MEB (electrónico de barrido) tiene un procesado distinto, ya que se hace la fijación y la deshidratación igual pero como lo que se estudia la estructura tridimensional, no se realiza ningún corte, solo se metaliza con metales como oro o platino pudiendo estudiar toda la estructura celular, cavidades, etc.

 Citometría de flujo Esta tecnología se usa para medir células que están en suspensión. Se medirá tanto el tamaño, como la complejidad estructural y la fluorescencia (hay hasta 3 fluorescencias). Se hará de todas y cada una de las células. La ventaja que presenta es que tiene un alto valor estadístico, pues nos permite obtener información de todas las células a una velocidad de 5000 o 6000 células por segundo. El único problema que presenta es que no nos permite localizar en la célula donde está. El citómetro se compone de 3 partes: 1. Un sistema fluídico: Se trata de un sistema de fluidos que hace que la muestra pase a través de los conductos del sistema del citómetro. 2. Un sistema óptico: Sobre la muestra incide un rayo laser de 480 nm que bombardea y excita la muestra para excitar los fluorocromos, también tiene una serie de detectores para los distintos ángulos y longitud de onda y tiene unos fotomultiplicadores que hacen que esta señal eléctrica la amplifique o bien reducir en función de la señal que llega. 3. Un sistema eléctrico: Transforma las señales luminosas en digitales y se guarda en un ordenador. 23

En cuanto al funcionamiento tenemos las células en suspensión en un tubo y gracias a un sistema de presión, hace que ese medio se pase por un canal muy fino de manera que las células se alinean y pasan en fila india. En perpendicular a estas células incide el laser, que por cada célula que pase el laser se dispersa al chocar contra la célula. Todo el haz del laser que no choque contra la célula llega a un detector que nos da información sobre el tamaño de la célula. A este detector se le conoce como FSC. Los que inciden sobre la célula se dispersan en función de la densidad de las estructuras que haya dentro de la célula. El aparato tiene una serie de lentes que recogen aquellas ondas que salen a 90o, que son los que pasan a través de los filtros, que son cada uno de un color que determina la longitud de onda que capta. Lo primero que se recoge es la SSC que nos da información de la complejidad de la célula. Estas células se podrán clasificar mediante el uso de histogramas o bien de Dot-plot mediante la información obtenida por FSC y SSC que juntos nos permiten diferenciar los distintos tipos celulares en una población celular heterogénea.

Los factores fundamentales a tener en cuenta son:  Las células estén en suspensión, pues si no lo están no se puede trabajar con esta técnica.  Los valores son siempre relativos.  Establece el background o valores de fondo.  Se requiere de la calibración de fotodetectores y fotomultiplicadores para comparar las muestras entre experimentos.  Se requiere de una compensación de fluorescencia.  Este tipo de técnica no permite localizar una molécula en la célula.

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Aplicaciones de la citometría de flujo Son todas aquellas que presenten un fluorocromo:  Marcaje con anticuerpos (fenotipado): Se puede marcar con uno o varios anticuerpos. Es muy usado en diagnostico e investigación, por ejemplo para el cáncer. Podemos hacer una pequeña localización, es decir, localizando el antígeno o el fenómeno que queremos estudiar, pudiendo estar: o En la superficie externa de la célula: Si se trabaja con la célula viva y se pone el anticuerpo marcado que ira hacia el antígeno que está en la cara externa de la membrana. o Para proteínas intracelulares: Se debe fijar la célula permitiendo la entrada de los anticuerpos a la célula.  Estudio de permeabilidad de membrana: Usaremos colorantes vitales, que penetran en células vivas y metabolizan, quedando retenidos en la célula.  Estudio de necrosis (IP), apoptosis (se hace por FDA, que las negativas son las que tienen su membrana integra, por lo que están en apoptosis. También se puede estudiar por TÚNEL), proliferación del ciclo celular (CFSE-vivas, IP-muertas), etc.  Estudio del potencial del membrana, pH intracelular.  Cuantificación y movilización de iones, como calcio, magnesio, zinc, etc.  Actividades biológicas: Como reacciones enzimáticas, estudios de inmunológica, etc. Estudio de fagocitosis, citotoxicidad, producción de radicales libres, reacciones enzimáticas, etc.  Nos permite separar poblaciones celulares mediante el FACS (Flow Activated Cell Sorting): Al pasar células por este citómetro, si cumplen las condiciones que se ponen que se desea detectar, se detectan y en función de su carga se van a desviar y se recogen las distintas poblaciones de células que se originan.

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4. CULTIVOS CELULARES Son los cultivos de laboratorio in vitro de células o tejidos independientes. Es una alternativa al uso de animales de laboratorio y permite estudios de fenómenos in vivo.

 Tipos de cultivo: -

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Primarios: Se coge una célula, tejido u órgano de un animal y se pone en un cultivo y se mantiene in vitro. Estas células tienen una vida finita, por lo que al ponerlo in vitro llega un momento en el que mueren. Por lo que se está sacando continuamente células, tejidos u órganos de un animal. Secundarios: Donde a partir de subcultivos sucesivos de un cultivo primario y los cuales han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Estas células se están dividiendo de forma infinita (líneas celulares).

 Usos habituales -

Investigación: Para fisiología celular, toxicología, virología, desarrollo, cáncer, inmunología, células madre, etc. Ingeniería: Regeneración de tejidos, como hueso, cartílago, piel, etc. Industria: Producción de anticuerpos, hormonas, enzimas, vacunas virales, etc.

 Ventajas de su uso Estudio de células aisladas, purificadas, pudiendo saber su función concreta. Son fáciles de manipular y se puede controlar las condiciones del medio. Permite el estudio con líneas comerciales, pudiendo trabajar con el mismo material en todo el mundo si se desea. Se puede trabajar a pequeña escala (con microvolumenes)

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o a gran escala (Grandes volúmenes). Permite la posibilidad de mantenerlas indefinidamente congelada.

 Desventajas A veces su comportamiento no es extrapolable al tejido u órgano por tener distinto entorno, crecimiento, etc.

 Equipamiento laboratorio de cultivos Un laboratorio de cultivos debe tener: - Un equipamiento estéril: Cabinas de flujo laminar (habitáculos que mantiene todo el aire del interior estéril), autoclave, sistemas de filtración, etc. - Incubadoras: Controlan temperatura, humedad y CO2. - Centrifugas, frigoríficos, congeladores, etc. - Depósito de nitrógeno liquido para congelación. - Microscopio de contraste de fases invertido.

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 Soporte de cultivo Frascos, botellas, tubos, placas, bien sea de vidrio o de plástico, en función del cultivo. 

Medios de cultivo Es específico para cada tipo celular. Es un medio base que contiene hidratos de carbono, ácidos grasos esenciales y otros lípidos, es decir, contiene todo lo necesario pero además contiene aditivos como: - Suero fetal: Contiene factores de crecimiento, hormonas, proteínas transportadores, etc. - Antibióticos: Como la penicilina, estreptomicina que actúan inhibiendo el crecimiento de bacterias, y anfotericina para evitar el crecimiento de hongos y levaduras. - Reguladores de pH o indicadores de pH. - Aditivos adicionales como: Piruvato, glucosa, glutamina, etc. Hay también distintos tipos de medio, el definido, que no presenta suero o el indefinido que presenta suero.

 Condiciones fisico-quimicas del cultivo -

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Fase gaseosa: Debido al metabolismo celular se forma CO2 que es toxico para la célula, de modo que este CO2 al reaccionar con agua forma acido carbónico, estableciéndose un equilibrio acido-base carbonato-bicarbonato, de modo que este CO2 se inyecta para regular el pH del medio de cultivo. Existen diferencias entre lotes de suero: Muchas células por cambiar el lote de suero pueden no crecer. Se debe controlar la temperatura, trabajando a temperaturas distintas en función de la especie animal (37ºC mamíferos, 39ºC aves, 15-25ºC peces, 28ºC insectos). El pH se debe regular estando entre 7 y 7’7 manteniéndose por el CO2. Se debe mantener la osmolaridad del medio (entre 290 y 320 mOsm/kg).

 Tipos de crecimiento Existen 2 tipos de crecimiento. La célula puede crecer: - En suspensión. - Monocapa: Adheridas al sustrato. Cuando están creciendo, al tocarse una célula con otra se inhibe el crecimiento. - Una variante de esta es el crecimiento tridimensional: Se puede crear en un frasco una red natural o sintética formando una red tridimensional de células.

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Morfología celular Puede ser: - Fibroblástica: Son células adheridas al sustrato, son muy alargadas, suelen ser unipolares o multipolares y tienen inhibición por contacto. - Epiteliales: Crecen en monocapa, son poligonales y tienen prolongación finas y cortas y también tienen inhibición por contacto. - Linfoblásticas: Crecen en suspensión y son redondeadas.

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 Curva de crecimiento -

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Fase de latencia: Donde el cultivo no crece y en ella se produce la fijación al sustrato y el inicio del ciclo celular. Fase exponencial: Donde se duplica el número de células cada 24 horas (unas mas y otras menos Fase de confluencia: Todo el frasco está lleno de células o todos los nutrientes se está agotando y las células dejan de crecer. Si se mantiene el cultivo sin hacer nada se acaban los nutrientes y las células empiezan a morir. Fase de muerte: Solo se da si el cultivo es primario donde al cabo de un tiempo empieza a producirse la desaparición el cultivo.

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 Obtención de cultivo primario Se puede obtener a partir del órgano completo o fragmentado. Se fragmenta para que todas las células del extracto tengan una buena difusión de nutrientes. Estos trozos se pueden poner directamente en el cultivo, haciendo que las células salgan de los órganos adhiriéndose al sustrato del tubo de cultivo (explante). Pasado un tiempo se puede extraer el fragmento inicial o bien se puede obtener y purificar células asiladas (se usan órganos blandos), se realiza esta obtención mediante: - Procesos mecánicos: Mediante un tamizado o bien. - Procesos enzimáticos: Se administran proteasas que rompan la estructura del órgano, saliendo las células de forma directa o bien se realiza un tamiz, de manera que se consiguen celular para poder trabajar. El aislamiento de poblaciones celulares del órgano o tejido se puede producir teniendo en cuenta las características de la célula, como por: - La adherencia al sustrato o frasco de cultivo. - Por centrifugación isopicnica en gradiente continuo o discontinuo: Como el uso de técnicas con Percoll, Ficoll, etc. Se basa en la densidad de la célula o del medio de cultivo para separar las células. Las células en un medio de baja densidad, estas tienen alta densidad y bajan al fondo pero si se pone sobre una solución con distintas densidades o mayor de alguna de las poblaciones celulares, cuando las células lleguen a una capa con una densidad mayor se depositaran allí. El Percoll o Ficoll son los medios que se usan, para permitir el paso por densidad de algunas células. - Métodos inmunológicos: Como Panning, MACS, FACS. Siempre que se tiene un anticuerpo que reconozca de forma específica a un antígeno de una población celular se puede usar para aislar esa población. El 30

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panning usa un soporte plástico en la que se crea una fase solida donde se une un anticuerpo y se añade la suspensión celular, dejamos que la célula se una al anticuerpo, tras ello se retira el sobrenadante y se hacen varios lavados quedándonos con un grupo de células positivas y otras negativas. Microdisección de captura por laser: En este caso lo que se hace es aplicar a un corte en una región identificada mediante un laser se recorta esa zona y todo el material se recoge en un tubo. Si la sección es material vivo se estudia con barrido confocal.

 Subcultivo o pase Una vez que todo el sustrato está cubierto por la subcapa de células, antes de que llegue la senescencia se hace un pase o subcultivo. Para ello se cortan las células, se suspenden y se diluye en medio líquido. - Si las células crecen en monocapa, se debe separar para ello se realiza:  Un tratamiento mecánico.  Si está muy unido se usa un tratamiento enzimático: Como tripsina más un quemante de grasa como el EDTA. Una vez que tenemos las células se lavan, se limpian y se cuenta y se observa su viabilidad, para ello usamos una cámara de Neubauer. Además lo que se suele hacer es que al mismo tiempo que se cuentan se puede saber cuantas están vivas y cuantas muertas, para ello se marca con un colorante, que es azul tripano que nos señala las células vivas, viendo cuantas están vivas y cuantas muertas. Una de las cosas que se deben conocer es la curva de crecimiento (se debe saber cuánto tarda en crecer la muestra) pudiendo programar los experimentos. Para ello se pone varias diluciones de una suspensión celular, se ponen en cultivo y cada día se observa el número de células por conteo con el microscopio o bien usando contadores automáticos o se puede hacer un ensayo colorimétrico, de modo que marquen las células vivas. 31

 Aplicaciones Se usan para el estudio de: - Función celular: Muerte celular (Apoptosis vs. necrosis), curva de crecimiento, proliferación, parámetros celulares (enzimas, pH, potencial membrana), movilización de calcio, fagocitosis, producción de radicales libres, células madre, cáncer. - Toxicidad celular: Contaminantes en muestras de campo, cosmética, compuestos antitumorales y compuestos estrogénicos. - Estudio de cultivo y diagnostico viral: Cultivo de virus, recuento viral, diagnostico viral y producción de vacunas virales. - Anticuerpos monoclonales: Producción o identificación y purificación. - Transfección: Función y localización de proteínas o silenciamiento génico. - Terapia génica.

5. TRANSFECCION Es la producción de un gen (o varios genes) en una célula para que exprese una proteína. Este gen puede ir en un plásmido o en un virus (que no exprese una enfermedad).

 Tipos de transfección: Puede ser in vivo o in vitro (hacerlo en un cultivo in vitro o que se produzca en un animal esta transfección) y esta puede ser transitoria o permanente.

 Usos o aplicaciones -

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Expresión de proteínas para su purificación. Estudiar su efecto sobre el fenotipo celular. Estudio de promotores y elementos regulatorios. Estudio de procesamiento del ARN, postraduccionales, etc. Localización, distribución e interacción de proteínas. Terapia génica. Generación de vacunas, anticuerpos, etc.

Factores que afectan a la eficacia de transfección -

Tipo celular (líneas mejor que cultivos primarios, etc.). Estado del cultivo (fase exponencial al 60-70%). Medio de cultivos o aditivos: Algunos aditivos o medios pueden impedir la transfección. Tipo de plásmido o virus: En función de que sea permanente, que sea más grande, más pequeño, la cantidad, la calidad del plásmido, etc. Cantidad de ADN y transfectante. Calidad del ADN transfectante. Métodos de transfección.

 Métodos de transfección -

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Liposomas: Son de alta eficiencia y no es toxico. Fosfato de calcio: Es más simple y más económico pero peores. DEAE-dextrano: Igual que fosfato de calcio. Electroporacion: Se genera un pulso eléctrico que abre canales y entra el material genético, es alta su eficiencia pero tiene baja supervivencia por lo que no se usa mucho. Microinyeccion: Es muy laboriosa y muy cara pero muy efectiva. 32

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Biobalistica: Partículas de oro muy pequeñas que se recubren con el material genético y se disparan desde una pistola al organismo o célula penetrando en la célula pero sin romperla, también es muy caro pero presenta alta eficiencia. Uso de virus: Se usan virus atenuados pero sin embargo conseguir el virus recombinante y atenuado, pero como actúan infectando muy fácilmente la transfectancia es muy alta.

 Elementos de un plásmido Cuando se genera el plásmido presentara: - Elementos que permitan su replicación tanto en eucariotas como en procariotas. - Un promotor de eucariotas para que el gen se transcriba y el promotor puede ser constitutivo o inducible (por la inducción de la formación de algún compuesto, aumento de temperatura, etc.). - Señales de poliadenilacion. - Codones de inicio y stop. - Proteínas nativas o bien proteínas marcadas por un tag. - Marcadores de selección. Una vez que se está creando el plásmido, se puede introducir los tag tanto en el extremo carboxilo como el amino. Si se quiere estudiar la interacción entre 2 proteínas se puede transfectar con dos plásmidos distintos o bien con un plásmido que genere las dos proteínas. Se utilizaran genes chivatos que nos permiten evaluar la capacidad de transfixion o que nos permite visualizar la proteína recombinante. Estos genes chivatos son: - CAT: Nos permite clonar células que deriven todas de una positiva y por tanto sean todas positivas. - GAL: Se pone un sustrato que nos produce un producto que es un precipitado de color azul. - LUC: Usa la luciferina que emite fotones que se miden en un luminómetro. Esto se usa mucho pues nos permite obtener un dato estadístico directamente. - GFP: Que nos permite estudiar la célula in vivo y sin ninguna manipulación, por lo que mediante un microscopio de fluorescencia o barrido confocal o citometría seguir estas células. Detección de las proteínas expresadas. El tag lo bueno que tiene es que hay anticuerpos contra todos los tag, de modo que nos permite distinguir dentro de una célula que proteína es producida por la células de forma endógena o bien producida por le plásmido. Este tag se puede: - Poner en cualquier extremo. - Se puede quitar tras la purificación. - La detección necesita la muerte celular. GFP permite el seguimiento in vivo. - Pueden producir toxicidad celular. - Pueden alterar la función de la proteína recombinante. Permite favorecer la solubilidad de la proteína recombinante (para poder posteriormente purificarla) también se puede usar para silenciar genes.

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Silenciamiento o interferencia génica Introducción de ARN interferente solo o en plásmidos de modo que la transfección impide la traducción del mRNA a proteína, por lo que no se forma proteína y por tanto no hay función, por lo que esta transfección se puede usar como terapia génica. Se puede usar un virus atenuado o un plásmido que nos exprese un gen que contrarresta una deficiencia enzimática, hormona. Se puede hacer un silenciamiento para un gen relacionado con un tumor disminuyendo la producción del tumor, etc.

6. CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL Se obtiene un homogenado, se lisan las células en un tapón y se somete de forma secuencia a distintas velocidades y tiempos de centrifugación. Obteniendo en la primera centrifugación los núcleos y sobrenadante, que se vuelve a centrifugar y se obtiene mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas, después se vuelve a centrifugar el sobrenadante y se obtiene membrana plasmática, fracción microsomal, etc. Tras ello se vuelve a centrifugar el sobrenadante obteniéndose las subunidades ribosomales y pequeños poliribosomas y un sobrenadante que se vuelve a centrifugar y nos da la parte soluble del citoplasma. Para cada fracción se hace una reacción especifica de ese orgánulo de manera que sabemos así si la fracción es pura o no o cuando esta de contaminada con otras fracciones pues tenemos marcadores específicos de cada estructura.

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7. ELISA/EIA/RIA Nos permite la detección de un antígeno o anticuerpo en una muestra. Se puede tener en la fase solida, pegado al soporte o bien el anticuerpo o el antígeno. El revelado puede ser colorimétrico, luminimétrico, fluorimétrico o radiactivo (se llama RIA). Hay distintos tipos, el directo, el indirecto, sandwich o competitivo (se tiene en la fase solida el anticuerpo y se añade la muestra con el antígeno a determinar y una fracción conocida del mismo antígeno marcado, por lo que compiten por unirse al anticuerpo, una vez unido se lava y se mide para ver la cantidad de antígeno, si la muestra tiene poco antígeno, la muestra tiene mucho antígeno marcado, por lo que emite mucha señal. En este tipo de Elisa a mayor cantidad de antígeno mayor cantidad intensidad). No se puede localizar el antígeno

8. WESTERN BLOT Se hace una electroforesis de proteínas, se transfieren todas a una membrana de nitrocelulosa y se hace una inmunodetección en esa membrana. Nos permite ver una banda que es nuestra proteína de estudio, mediante un anticuerpo. Nos permite detectar la presencia de una proteína, en cierta medida si secretaba o no la proteína, determinar el tamaño pero no nos permite localizarla. También se puede modificar esta técnica para ver si nuestra proteína de estudio está libre o interactúa con otra proteína (se hace un gel nativo, de modo que si la proteína interactúa con otra proteína, al hacer electroforesis correrá menos, viendo que tiene un tamaño mayor, o que nos indica que interacciona con otra proteína.

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TEMA 2: LA SUPERFICIE CELULAR 1. LA MEMBRANA PLASMÁTICA  INTRODUCCION La membrana plasmática es la envoltura que limita los orgánulos y permite el contacto con el exterior. Fue observada por primera vez por por Robertson mediante MET. Se evidenció que todos los organismos tienen una membrana muy similar. Entre las principales funciones encontramos que se encarga de compartimentalizar la célula u órganos, y que es un lugar de reacciones.

 ESTRUCTURA Es una bicapa lipídica. Cuando se tiñe con tetraóxido de osmio (OsO4) aparecen dos capas electrodensas de 10nm. Está formada por proteínas.

 HISTORIA Overton, en la década de 1890, descubrió que los solutos que atraviesan la capa limitante tenían una solubilidad similar a la de los ác. Grasos. Grasos. Grendel y Gorter en 1925 vieron que los lípidos del eritrocito cubrían 1,8-2,2 la superficie del mismo. Bicapa lipídica con cabezas polares hacia afuera (exterior y citoplasma). Davson y Danielli, 1925-decada 1950. Bicapa lipídica recubierta por proteínas y con poros proteicos que explican el paso de sustancias. Singer y Nicolson, 1972. Modelo mosaico fluido. Los lípidos y proteínas se encuentran en un estado fluido que les permite el movimiento dentro de la membrana.

 COMPOSICION QUIMICA - Lípidos 1. Fosfolípidos  Fosfatidil-etanolamina/colina/serina/inositol/glicerol - Esfingolípidos  Esfingomielina  Glucolípidos (cerebrósidos y gangliósidos) - Esteroides. Colesterol - Proteínas 1. Periféricas 2. Integrales 3. Unidas a lípidos - Carbohidratos 1. Formando glucolípidos o glucoproteínas. Glucocálix

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 PROPIEDADES Integridad: Viabilidad. Colorantes vitales. Poros en la membrana. MO, MF, MBC, MET, MEB, citrometría de flujo. Asimetría: fosfolípidos que sufren movimientos de rotación, difusión lateral y flipflop. La fosfatidilserina se transloca a la cara externa durante la apostosis (anexina V). Los esfingolípidos se sintetizan en la membrana externa y mediante translocasas viajarán a la membrana interna. Los esfingolípidos solamente se encuentran en la hemimembrana plasmática. Balsas lipídicas, donde aparecen altos niveles de esfingolípidos La fluidez de la membrana aumenta con la temperatura (se licuan las grasas) y con la insaturación.

Distribución de proteínas (cara e o p): Digestión con detergentes para separar las proteínas transmembrana. Uso de proteasas (tripsina) las proteínas están parcialmente expuestas a la tripsina. Se fija la célula de manera que la tripsina puede entrar y degradar desde fuera y desde dentro. Se hace una electroforesis y aparecen 3 bandas, dos de las bandas corresponden a proteínas periféricas e internas, la otra proteína se ha acortado, lo q indica que tiene dominios expuestos tanto al exterior como al interior. Uso de anticuerpos. Ensayos de fusión celular y redistribución proteica

 METODOS DE ESTUDIO -

Centrifugación diferencial Determinación de la conductividad, potencial de membrana, etc. MET (Ultraestructura) Criofractura (Proteínas integrales, presencia de poros, etc.) Colorantes vitales. Permeabilidad y poros. FRAP/FLIP. Movimiento y regeneración de proteínas y lípidos. 37

 FUNCIONES - Transporte de moléculas de bajo peso molecular: Mediante transporte pasivo bien sea por difusión simple o facilitada y transporte activo, bien sea por acción de la bomba sodio-potasio o por otras bombas. - Transporte de moléculas de elevado peso molecular: Mediante endocitosis, como fagocitosis, pinocitosis o mediada por un receptor, o bien por exocitosis o transcitosis.

- Adhesión celular: Con células o matriz extracelular. - Comunicación celular: Neurotransmisores, hormonas o mediadores locales.

2. ADHESION CELULAR Las uniones celulas-celula o célula-matriz pueden ser estables o transitorias en función del tejido que presente. En tejidos extracelulares, las uniones son muy fuertes y estables. En células que se movilizan no son muy fuertes, son uniones transitorias. Hay moléculas de adhesión celular (CAM) o a la matriz (SAM). Según los criterios que se sigan se pueden clasificar de distinta forma a los distintos tipos de interacciones celulares.  En función de la distancia entre membranas: - Occludens o unión estrecha: Si esta unión es completa, es decir, no hay separación visible. Sin embargo, se ha visto que la separación es de unos 2nm. - Unión adherens o desmosoma: Se da cuando con técnicas convencionales podemos observar que estas membranas están separadas por unos 20-25 nm. - Uniones gap o hendidura o nexo: Se trata de una unión que es muy similar a la occludens, pero la membrana no está al lado de la otra sino que hay canales que atraviesan las 2 membranas.  En función de la superficie que ocupa esta unión tenemos: - Zónula: si rodea toda la célula. Se trata de una unión estrecha o desmosoma en banda. Se conoce como zonula adherens. - Macula: Si la unión es estrecha pero puntual. Se conoce como desmosoma puntual. - Fascia: Se trata de una macula que es irregular Todas estas suelen presentarse en unión entre células vecinas. En la zona basal de la célula tenemos hemidesmosomas (unión célula con la matriz). Tambien hay contacto focal que son similares a los hemidesmosomas pero son transitorios.

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La adhesión se lleva a cabo por moléculas de adhesión celular y se representa por 4 tipos de moléculas principalmente.  Cadherinas: Realizan uniones homogéneas, es decir, unión entre cadherinas. Existen más de 100 clasificadas en 6 subclases y su unión es calcio dependiente.  CAM con dominios inmunoglobulina (Ig): Uniones a otras proteínas con dominios de inmunoglobulina. Su unión no es calcio dependiente.  Integrinas: Presentan 18 unidades α y 8 β, y se pueden unir a células o matriz.  Selectinas: Se unen a azucares, es decir, son lectinas y son calcio dependientes. Estas moléculas son las responsables de las uniones estables o transitorias. Hay proteínas como las ocludinas o claudinas (uniones estrechas como zonula ocludens) o las proteínas JAM que son proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Las uniones GAP están mediadas por las conexinas. Los dominios citoplasmáticos unen proteína anclaje a las que se une el citoesqueleto.

 ZONULA OCCLUDENS/TIGHT JUNCTION/UNIÓN ESTRECHA Esta siempre en posición apical. Es un cinturón que rodea toda la célula y sella el epitelio. Es una unión covalente, por lo que es muy fuerte. Lo que hace es que el agua y todos los solutos del medio externo no penetren en los tejidos subyacentes. Las sustancias del exterior deben atravesar la célula para pasar a la zona basal. Si esta unión se rompe o desaparece, se infiltra agua y sales, aumentando la presión osmótica, se produce una dilatación, una respuesta inflamatoria o incluso la muerte. Las moléculas implicadas son ocludina, claudina y moléculas JAM. En todas las uniones hay un elemento extracelular (molécula en superficie que en dominios extracelulares se une a la molécula de superficie de la célula vecina), un complejo de proteínas de anclaje que se unen a los dominios citoplasmáticos que por el otro extremo se unen elementos del citoesqueleto. Las proteínas de anclaje de zonula occludens son ZO-1 o ZO-2 y son calcio dependientes. Una de las enfermedades que afecta a este tipo de uniones es la que produce la toxina del cólera.

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 ZONULA ADHERENS Y DESMOSOMAS Se sitúan bajo occludens. Dejan espacio entre las dos células y esta mediado por cadherinas. Se relaciona con filamentos de actina (en el caso de adherens) o queratina (en el caso de desmosoma). En función del tejido tenemos: - E-cadherinas: En tejidos epiteliales. - N-cadherinas: En el caso de si tejidos nerviosos, musculares cardiacos y del cristalino. - P-cadherinas: En el caso de epidermis, placenta y algunas embrionarias. - VE-cadherinas: En el caso de endotelios. En adherens se ve un espacio entre las células y en desmosoma es una zona electronodensa que se debe a una serie de proteínas, donde hay una placa de anclaje y filamentos muy gruesos. Las cadherinas pueden ser desmogleina, desmocolina, etc. Estos desmosomas los podemos ver mediante microscopia óptica, pero en el caso de hemidesmosoma, pues presentan una placa donde llegan muchos filamentos de queratina. Son calcio-dependientes.

 UNIONES GAP/UNIÓN DE HENDIDURA/NEXO Son muy abundantes sobretodo en tejidos no epiteliales (como en neuronas), ya que gracias a estos canales, el impulso electrónico se intercambia muy fácilmente. Si se observan estas uniones se puede confundir con una zonula adherens al ver con poca precisión, pero se puede diferenciar, ya que las gap son uniones mas basales. Las membranas están muy próximas y están atravesadas por un complejo proteico haciendo que no se vea espacio entre las dos membranas, de manera que la zona entre las dos membranas se ve electrondensa por esos poros, mientras que en zonula adherens se ve poco electronodensa. Lo que tenemos son una familia de proteínas que son las conexinas que se ensambla en un complejo proteico y se inserta en la membrana y lo mismo pasa con otro complejo de otra célula estableciéndose un canal entre dos células. Si inyectamos un material marcado en una célula se puede ver que en un tiempo aparece en la célula vecina determinando que pasan a través de estos poros. De este modo podemos determinar que todas las células de un tejido pueden actuar como 40

una única célula pero no todas las sustancias pueden pasar de una célula a la otra. Pueden pasar sustancias de hasta 2 kilodalton.

 UNIONES MEDIANTE INTEGRINAS EN TEJIDOS EPITELIALES Tenemos interacciones célula-matriz o sustrato, están en posición basal en los epitelios y son los hemidesmosomas. Están mediados por integrinas, que hay de varios tipos, unas que unen fibronectinas (mediante motivos RGD), otras que unen laminina y otras que unen colágeno. Los hemidesmosomas presentan uniones muy fuertes y estables pero que no solo ocurren en tejidos epiteliales sino que tambien ocurre en tejidos no epiteliales donde las integrinas actúan. Son calcio-dependientes.

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 UNIONES MEDIANTE INTEGRINAS EN TEJIDOS NO EPITELIALES En este caso se hablan de uniones focales, podosomas o uniones 3D. Si tenemos una célula en cultivo, la célula establece contacto con el sustrato, de modo que estos contactos se pueden hacer y deshacer de modo que la célula pueda moverse. Si se tiene un tejido real dentro de una matriz de colágeno, estas uniones no son solo superficiales sino que se dan por toda la célula (uniones 3D). Estas integrinas bien por alteraciones de los dominios que sean mediados por factores externos o internos, van a tener mayor o menor afinidad, haciendo que se una con mayor o menor afinidad, permitiendo que se hagan fuertes o se deshagan con facilidad las uniones. Están muy implicadas en células que están en quimiotaxis, en coagulación plaquetaria, remodelación ósea, desarrollo, etc. Tambien pueden interaccionar con CAMs celulares con dominios inmunoglobulina como por ejemplo tenemos las ICAM (presentes en leucocitos), VCAM (en endotelios), NCAM (en neuronas) o JAM (en uniones estrechas u occludens).

 UNIONES CÉLULA-CÉLULA MEDIANTE SELECTINAS Son lectinas que unen de forma calcio dependiente a carbohidratos de la superficie celular, hay distintos tipos de lectinas: - L-selectinas: En leucocitos. - P-selectinas: Presentes en plaquetas y endotelios activadas inmunológicamente. - E-selectinas: En endoteliales. Están relacionadas con la quimiotaxis. Hay una unión de selectinas entre leucocito y endotelio y una vez unida la selectina, se produce la interacción de otros receptores de superficie. La célula endotelial expresa una factor activador de plaquetas con su receptor que hace que la integrina presente en el leucocito y una proteína de superficie de tipo Ig interaccionen, de modo que la interacción de la integrina leucocitaria con la molécula de superficie de Ig del endotelio hace que se une y desaparezca las uniones fuertes entre las células endoteliales y pueda atravesar el endotelio.

 MÉTODOS DE ESTUDIO - MET o criofractura: Pues son proteínas transmembrana que se pueden estudiar muy bien con esta técnica. - Técnicas inmunocitoquimicas. - Cultivos celulares: Permiten ver como se hacen y deshacen estas uniones. Si se quiere estudiar uniones célula-sustrato se tiene una línea celular y un 42

soporte de plástico de vidrio a donde se unen distintas sustancias. Así se puede estudiar cómo se adhiere una célula y como varia con el tiempo variando las condiciones del medio, como quitando el calcio del medio para ver que no son calcio dependientes, o usar anticuerpos de bloqueo. Para células epiteliales se usa un pocillo en el que se pone medio de cultivo y se mete un inserto que se comunica por la parte basal con el medio de cultivo y tiene una membrana que permite el paso de nutrientes pero no de células y se añaden las células en medio de cultivo. Si todas las células están bien adheridas unas con otras, ambos medios de cultivo no se comunican, pero si se alteran las uniones si se puede producir el cambio de un medio y otro.

3. SEÑALIZACION CELULAR Respuesta frente a estímulos. Unión receptor-ligando. Moléculas de señalización: - Señalización sináptica. Neurotransmisores. - Hormonas (endocrinas). - Mediadores químicos locales (paracrinos y autocrinos): 1. Citoquinas (factores de crecimiento, interferones, quimioquinas, interleucinas….). 2. Eicosanoides. 3. Uniones gap. - Tipos de receptores: 1. Nucleares. Unen a hormonas esteroideas y tiroideas, vitamina D, retinoides, eicosanoides, NO, CO 2. Superficiales. Unen a neurotransmisores, hormonas proteicas y mayoría mediadores químicos. 2º mensajeros a. Asociados a canales b. Ligados a proteínas G. Adenilato ciclasa, fosfolipasa C, c. Ligados a enzimas catalíticos. Tirosin quinasa, guanilato ciclasa.

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TEMA 3: MATRIZ EXTRACELULAR EN TEJIDOS EPITELIALES Y NO EPITELIALES -

GENERALIDADES Es un conjunto de proteínas fibrosas que dan resistencia y están embebidas en una sustancia amorfa gelatinosa compuesta por polisacáridos que rodean a las células. En el caso de animales es la matriz extracelular y en el caso de plantas, hongos y algas se habla de pared vegetal. La matriz extracelular esta sintetizada por los fibroblastos casi exclusivamente. Estos fibroblastos van a ser los encargados de sintetizar la matriz. La COMPOSICIÓN es por un lado fibras colágenas y de elastina que dan elasticidad y resistencia elástica al tejido. Tendremos proteoglucanos que forman el gen amorfo que hay entre las fibras y sirve para anclar proteínas y nos va a ofrecer resistencia a al compactación debido a su naturaleza de gel, tendremos proteínas multiadhesivas (fibronectina y laminina) que unen estos componentes anteriores a la célula. Existe una continuidad entre el esqueleto externo e interno de la célula. Las FUNCIONES van a ser principalmente proporcionar soporte estructural y dar forma, elasticidad y resistencia. En función de los tipos y localización de la matriz tendremos: - Lámina basal: Capa delgada que se encuentra bajo todos los epitelios y que es el soporte para las células epiteliales. - Tejido conectivo: En función de la compactación de esta matriz extracelular de la composición y del número de células tendremos: - Tejido conectivo laxo: Los tejidos de mucosas formado por pocas fibras colágenas, pocos fibroblastos y que nos va a unir el epitelio con el muscular y por el circula gran cantidad de vasos sanguíneos, glándulas, etc. - Tejido conectivo compacto: La organización de las fibras y fibroblastos están muy compacto, forma el hueso, cartílago, tendones, estroma de la cornea. La matriz está implicada en muchos PROCESOS CELULARES como: - División celular: Las células que hay dentro de una matriz compacta si se quiere dividir debe desintegrarse parte de esta matriz. - Movilidad: Si una célula quiere atravesar un tejido conjuntivo compacto, si no elimina estas fibras no puede avanzar. - Diferenciación y desarrollo embrionario. - Adhesión celular: Si las células no tienen la matriz adecuada no pueden adherirse. - Filtro para el paso de macromoléculas: Para evitar el paso de parásitos o células que puedan afectar a un tejido.

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2. PROTEINAS DEL COLAGENO El colágeno es una glucoproteína que presenta alta resistencia a la tensión. Es una proteína muy importante y representa el 25% del total de la proteína del cuerpo humano. Se forma como cadenas α. Es una cadena de aminoácidos que presenta múltiples repeticiones de una secuencia, tiene repeticiones de 3 aminoácidos donde uno es glicina siempre mientras que los otros dos son hidroxiprolina o hidroxilisina y el otro prolina. Estas cadenas forman una triple helice que se enrolla y se une por las secuencias de glicina y aminoácidos hidroxilados. Estas fibrillas tienen de 10 a 300 nm de grosor y una vez que están formadas se autoensamblan interaccionando por las hidroxilisinas con otras fibrillas, formando una fibra de mayor grosor de hasta 3 micras y el ensamblado suele ser escalonado entre una fibrilla y otra permitiéndole que pueda resistir la tensión (puede estirarse y recogerse). Este escalonamiento hace que cuando se ve a MET no todas las zonas tienen el mismo numero de fibrillas de manera que nos aparecen bandeados indicándonos que existen zonas con mayor o menor número de cadenas. Existe un bandeado cada 65 nm, por lo que entre fibrilla y fibrilla hay 300 nm de longitud. Estas se pueden organizar las fibras de distinta forma, se puede alinear de forma paralela de forma más o menos compacta o bien formando redes.

Síntesis de colágeno Un vez que se detecta el péptido señal de la proteína de colágeno en el ribosoma es enviada al RER. Se sintetiza un péptido inmaduro o propéptido que tiene unas regiones que protegen los extremos de las cadenas α del colágeno y después se produce hidroxilaciones en la prolina y lisina. Estas hidroxilaciones se produce por enzimas que usan un cofactor que es la vitamina C (su falta produce escorbuto, por lo que no hidroxila las moléculas de colágeno, haciendo que estos enfermos tengan problemas de debilidad ósea y de cartílago entre otras alteraciones). Dentro del RER se producen las primeras glucosilaciones de las proteínas. Una vez que la proteína está formada, estas cadenas debido a los tripletes, entre los que esta glicina, interactúan con otras cadenas y forma la triple cadena a la que se une las chaperonas reconociendo la proteína viendo si está bien formada o no la proteína. Tras esto las moléculas pasan por el complejo de Golgi sufriendo los procesos de glucosilación y mediante vesículas de secreción se liberan al medio. Una vez en el medio actúan las peptidasas que eliminan los extremos impidiendo que una molécula interaccione con otra, y una vez activas comienzan a autoensamblarse de forma automática formándose las fibrillas y las fibras.

Tipos de colágeno Dependiendo de cuál sea la combinación de la cadena que se forma en la triple hélice tendremos distintos tipos de colágeno. 1. Colágenos fibrilares: Son aquellos que forman fibras. Dentro de estos tenemos:

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Colágeno fibrilar tipo 1: Está en piel, tendones y huesos. Colágeno fibrilar tipo 2: Presente en cartílago. Colágeno fibrilar tipo 3 y 5: Están menos representado.

Las fibras siempre tienen una longitud de unos 300 nm y estas fibras se disponen paralelas y más o menos compactas dependiendo del tejido.  Colágeno asociado a fibrillas: Hay dos tipos a. Colágeno tipo 6: Presente en tejidos intersticiales. b. Colágeno tipo 9: Presente en el cartílago.  Colágeno de anclaje: Este tipo de colágeno forma redes. a. Colágeno tipo 4: Esta en lámina basal. En el extremo tienen una cabeza globular que permite unirse a otras moléculas de colágeno y van 45

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fusionándose con los extremos formando redes más o menos simétricas permitiendo que el tejido se estire o encoja. b. Colágeno tipo 7: Bajo la lámina basal de la piel c. Colágeno tipo 15: Extendido, cerca de la lamina basal en el musculo. Colágeno transmembrana: Sirve tambien de anclaje. a. Colágeno tipo 13: Este forma hemidesmosoma en la piel, uniéndose las células epiteliales a la membrana basal. b. Colágeno tipo 17: Igual que el colágeno tipo 13. Colágenos implicados a la respuesta inmunitaria: a. Colectinas: Están presentes en la sangre. b. C1q: Es un componente implicado en el complemento de la sangre. Existe una familia de proteínas que desencadenan la ruta de este colágeno. Esta proteínas están formadas por 6 o 4 cadenas que tienen un dominio colágeno (un extremo con un dominio glicina, prolina y hidroxiprolina o bien hidroxilisina) y en el otro extremo un dominio de un ion a carbohidratos. Estas proteínas se ensamblan en tetrámeros o hexámeros unidos por la región de colágeno, dejando las cabezas de unión a azucares libres. c. Clase A scavenger receptor: Está presente en macrófagos.

En los tendones tenemos el colágeno fibrilar de tipo 1 y nos encontramos siempre asociados dos tipos de colágeno, uno fibrilar y otro no fibrilar (enlace fibras colágenas). El fibrilar es el 1 y el no fibrilar es el 6. En cartílago tenemos el fibrilar de tipo 2 y el colágeno no fibrilar de tipo 9.

3. ELASTINA Está presente en tejidos muy elásticos como piel, pulmones o vasos. Esta proteína a diferencia del colágeno no presenta hidroxilisina y no esta glicosilada pero tiene glicina y prolina y algo de hidroxiprolina. Sus rutas de síntesis no pasan por el Golgi ya que no se glicosila. Esta elastina se sintetiza como proelastina y una vez secretada se proteoliza la parte inactiva volviéndose activa. Una vez activa se une de forma covalente en el exterior por acción de las lisinas, por lo que ofrece resistencia elástica pues se puede plegar mucho y estirarse. Sus fibras se organizan en fibras elásticas que tiene una zona central con elastina y rodeado por una proteína conocida como fibrilina.

4. ACIDO HIALURONICO. PROTEOGLUCANOS Presentan una parte central proteica y cadenas laterales de glucosaminoglucanos (GAG) que confieren la función. Estos GAG son repeticiones de 2 carbohidratos, que el primero es glucurónico o galactosa y el segundo es N-acetil-glucosamina o N-acetil-galactosamina. Son muy aniónicos ya que tiene muchos residuos carboxilo o sulfato. Estos captan gran cantidades de cationes por lo que atraen y retienen agua por ello forman un gel hidratado y debido a ello permite que el tejido ofrezca resistencia a la compresión. Hay distintos tipos de GAG:  Acido hialurónico: Formado por acido glucurónico y N-acetil-glucosamina y no esta sulfatado. Tiene menor cantidad de cargas negativas. Está formado por 25.000 residuos.  Condroitin sulfato: Está formado por acido glucurónico, con menos de 250 repeticiones, y N-acetil-galactosamina.  Heparan sulfato: Está formado por glucurónico y N-acetil-glucosamina. Presenta casi las mismas repeticiones que el condroitin sulfato.  Queratan sulfato: Está formado por galactosa y N-acetil-glucosamina y es el mas pequeño, presentando entre unas 20 o 40 repeticiones.

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La síntesis proteica ocurre en el RER, donde se finaliza con una pequeña glicosilación sirviendo de anclaje en el Golgi para la unión de los GAG y modificaciones como la sulfatación. A diferencia de lo que ocurre con el ADN y proteínas, la secuencia está escrita en el genoma y los componentes solo tiene que leerlo pero sin embargo en glucosilaciones esta información no está escrita o no se sabe porque no se sabe que es lo que determina que la proteína se glicosile con un azúcar u otro, de un tamaño u otro, etc. Su función es que actúan proporcionando soporte mecánico, tambien pueden unir y modificar la vida media de los factores de crecimiento reteniéndolos cerca de la celula. Están implicados en la migración celular y en la creación de cavidades o cámaras durante la morfogénesis (en el desarrollo embrionario hay una gran síntesis de GAG que son excretados al exterior de la celula quedando inaccesibles para la celula y rodean estas zonas ricas en GAG degradando esta matriz que forman, generando una cámara. Así es como se forman las cavidades del corazón). Tambien es importante en el cierre de heridas y regeneración tisular.

Tipos de proteoglicanos Dependen del tipo de GAG que se tiene. De manera que tenemos:  Agrecano: Es el más grande y esta principalmente en cartílago, tenemos una proteína central a la que se le une queratan sulfato y condroitin sulfato. Está formado por unas 130 moléculas como esta que se unen a un eje y se unen a un GAG como es el acido hialurónico) observando una estructura como una escobilla.  Decorina.  Perlecan: Presente en membrana basal.  Sindecano: Captan y reclutan factores de crecimientos.

Fibronectina Es una glucoproteína que une tanto a matriz extracelular como células y es muy importante en la adhesión celular. Es un gen que codifica para distintas fibronectinas. Tiene varios dominios, dominios de unión a colágeno y a proteoglicanos de manera que interactúa uniendo todos los componentes de la matriz y si este dominio es RGD une a las integrinas celulares. Es muy importante para crear vías para la movilización celular y es fundamental para el desarrollo. Tambien participa en la coagulación sanguínea ya que aparte de unir por el dominio RGD y por integrinas en las plaquetas, une fibrina, colágeno, plaquetas y atrae células inmunes al lugar. Los fármacos que inhiben la formación de coágulos están basados en el bloqueo de la unión plaqueta fibrinógeno mediante los dominios RGD, que es el mecanismo que emplea el mecanismo de algunas serpientes, que presentan proteínas con dominios RGD compitiendo con las proteínas plaquetarias, impidiendo la formación de coágulos.

Laminina Es la principal proteína multiadhesiva en la lámina basal. Es un heterodimero formado por cadenas α, β y γ (gamma) y tiene forma de cruz. Tiene distintos dominios, unos de unión a GAG, a integrinas, a colágeno o nidogeno o entactina (Estos últimos son componentes en la matriz extracelular de la lamina basal). Tambien actúa con los GAG uniendo lípidos y esteroides, actuando modulando al a vida y concentración de esteroides como hormonas esteroideas. Su función va a ser la formación de redes e intervienen en procesos de morfogénesis, movilización y diferenciación celular.

Lamina basal Una de las matrices más estudiadas es la que forma parte de la lámina basal. La lámina basal es una red que sustenta a todos los tejidos epiteliales y además rodea a células 47

musculares y adiposas. Se trata de una capa muy delgada, de 50 a 200 nm, y visible a MO. La lamina basal separa muy bien el epitelio del tejido conjuntivo subyacente, ya que su función principal es separar tejidos. Además tambien sirve de barrera para el paso de macromoléculas y da polaridad a células epiteliales (las células epiteliales se unen a la lamina basal mediante integrinas formando hemidesmosomas. Este anclaje, como zonula occludens, dan polaridad a la celula estableciendo cuales son las partes apicales y las basales, influyendo en la distribución fisiológica de la celula). La composición de esta lámina basal es colágeno tipo IV, perlecano, usado como proteoglicano principal, laminina usada como proteína de unión a las integrinas y el nidogeno o entactina.

Degradación de la matriz extracelular La matriz extracelular presenta algunas funciones y una de ellas es que esta muy implicada en los procesos de movilización celular (paso de células). Unas de estas células que tienen una gran movilidad son los neutrófilos y los monocitos (o macrófagos), que deben atravesar la pared celular por lo que deben presentar algunos componentes que tengan la peculiaridad que pueden digerir la pared. La matriz por ello debe tener un equilibrio entre degradación y creación, de modo que al pasar estas células, la matriz debe cerrarse de nuevo, bien por acción de la celula que ha pasado que libera factores que la crean o bien por células de la propia matriz. Estas células implicadas en el cierre producen dos tipos de proteasas:  Metaloproteasas: Requieren de zinc o calcio para actuar. Entre ellas la más común es la colagenasa.  Serin-proteasas: Actúan sobre los residuos de serina.

Modo de acción de la degradación La degradación pueden ser que estas metaloproteasas se secretan de forma inactiva de manera que un vez que están en el lugar adecuado se activan por acción de otras proteínas. En el caso de neutrófilos o macrófagos que tienen cierta polaridad, se establece una parte anterior donde se expresan en la cara externa de la membrana receptores de la metaloproteasa, de modo que esta queda activa unida a los receptores celulares, haciendo que conforme se va destruyendo la matriz se va reconstruyendo. Aparte de la liberación y activación de estas proteasas se encuentra en equilibrio con la producción de inhibidores de dichas proteasas, teniendo:  Inhibidores de la metaloproteasas o TIMPs.  Serpinas que son inhibidores de serin-proteasas. La adecuada regulación entre síntesis, degradación y reparación de la matriz hace que se produzca un correcto funcionamiento o bien puede provocar enfermedades como artritis, defectos en coagulación, aterosclerosis, gingivitis, etc. Para poner de manifiesto estas metaloproteasas se debe saber que parte del tejido presentan actividad metaloproteasa para poder actuar. Se puede usar gelatina que degrada el colágeno, presentando unido una molécula que produce fluorescencia de modo que donde halla actividad hay metaloproteasa. Para hacer esta técnica debemos fijar la muestra por congelación y se hacen cortes por congelación con criomicrotomo. Otra forma de saber cuáles son las metaloproteasas implicadas y cuál es su actividad y tamaño se pueden usar geles (zimografia). Lo que se hace es una electroforesis de proteínas y cuando se hace el gel se añade una proteína que nos forma una red de manera que toda la superficie tiene una proteína que puede hacer un marcaje de proteínas de todo el gel. Una vez que se tiene el gel, se pone la muestra en las condiciones adecuadas para que la metaloproteasa actúe. Una vez que actúan se hace una tinción del gel, de manera que en las zonas donde están las metaloproteasas actuó el gel no hay marcaje y se verá blanco al revelar la muestra. De este modo se pueden 48

observar en que muestra hay mayor o menor cantidad de metaloproteasa y se puede ver el tamaño de la metaloproteasa.

Matriz extracelular. Estudio Diversas microscopias:  Óptica: a. Tricrómico de van Gieson, Masson, técnicas Gomori, orceina, etc. Para el estudio de fibras. b. Hematoxilina-eosina: Usada para el estudio de colágeno que se tiñe de rosa mientras que otras fibras tienen leve apetencia por la hematoxilina. c. Azul de toluidina: Para el estudio de GAGs se tiñen con azul de toluidina mediante metacromasia (se da cuando un colorante da una tinción que no se ve del mismo color, por ejemplo el azul de toluidina puede dar una tinción purpura en el colágeno). Los GAGs tambien se tiñen con azul alcian debido a los residuos ácidos. Tambien se caracterizan por ser PAS-.  MET con la que se puede estudiar la ultraestructura.  MEB viendo la estructura tridimensional.  Técnicas mediante anticuerpos. Cultivos celulares: Se pueden hacer estudios de adherencia, movilización, etc. Supresión génica. Haciendo transgénicos Knock-out o técnicas de silenciamiento

5. PARED VEGETAL Se trata de una matriz extracelular muy elaborada en vegetales que envuelve a la celula o protoplasto.

Funciones Confiere la forma a la célula, da soporte a la celula y toda la planta, protege a la celula de fenómenos osmóticos y patógenos, media la interacción célula-célula, regula el paso de sustancias, solo permitiendo el paso a proteínas menores de 20 kDa. Esto explica porque las hormonas vegetales son pequeñas e hidrosolubles.

Composición Es diferente a la de la matriz, pero todos los elementos cumplen la misma función.  Celulosa: Es el componente principal. Se trata de un polímero de glucosa, unido por enlaces β-1,4, y que presentan menos de 500 residuos. La unión de 40 a 60 polímeros de celulosa van a formar microfibrillas de hasta 10 nm de grosor que le proporciona resistencia a la celula a la tensión.  Hemicelulosa: Son cadenas de celulosa con ramificaciones, que presentan xilosa, y permiten la unión a las microfibrillas de celulosa (es el equivalente a colágenos no fibrilares).  Pectinas: Es un polisacárido rico en acido galacturonico por lo que tiene gran carga negativa atrayendo agua formando un gel hidratado entre los elementos fibrosos (es como los GAGs). La función principal de las pectinas es dotar a la celula de resistencia a la comprensión. Estas forman la laminilla media que une y da rigidez a las paredes de 2 células adyacentes. Junto con la hemicelulosa formara la pared primaria.  Lignina: Es un polímero de residuos fenólicos muy insolubles presente en la pared secundaria.

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 Proteínas y glicoproteínas: Como la extensina (que supone el 15% del peso de la pared). Estas proteínas suelen ser ricas en hidroxiprolina y están implicadas en síntesis y remodelación de la pared. Además tienen un papel importante en la unión y eliminación de patógenos.  Componentes específicos: Como ceras, suberina, cutina, etc.

Capas de la pared   

Lamina media: Esta formada por pectina y es la primera en sintetizarse y es la más externa de la celula. Pared primaria: Presenta fibras de celulosa laxa, hemicelulosa, pectinas y glicoproteínas. Esta pared es delgada y extensible y a MET se puede observar una estructura reticular de fibras de celulosa. Pared secundaria: Es la ultima capa que se sintetiza y es más gruesa y rígida. Está formada por celulosa muy compactada y le da gran rigidez y resistencia al tejido.

Formación de la pared La celulosa se forma en la cara externa de la membrana. La celulosa sintetasa forma un complejo de membrana por donde va tomando la glucosa citoplasmática y cuando llega al exterior se va uniendo y polimerizando, formando el polímero de celulosa que se va autoensamblando de forma automática formando las fibras. Estas fibras de celulosa se disponen paralelas y sobre un eje de microtúbulos citoplasmáticos. En la parte interna tendremos una red de microtúbulos y en la parte externa forma una red que dará lugar a la pared primaria. El resto de componentes, como hemicelulosa o pectinas se forma en el interior celular y se secreta ya formadas. Una vez fuera se ensamblan y se unen a la celulosa.

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Plasmodesmos La pared vegetal presenta estructuras que permiten la comunicación entre células. Una de las estructuras más comunes son los plasmodesmos que permiten una unión entre las dos células vecinas y un intercambio de citoplasma. Estas uniones se parecen a las uniones GAP pero en los plasmodesmos se forman unos poros que en su interior presentan túbulos del REL que unen el REL de una celula con la vecina. Estos plasmodesmos permiten el paso de sustancias de hasta 1 kDa. Esta permeabilidad es alterada por algunos virus como el del mosaico del tabaco que aumenta la permeabilidad facilitando su propia dispersión. Además se suelen disponer de forma agrupada formando los campos de poro, apareciendo zonas de la pared primaria deprimidas que presentan muchos poros.

Poros o punteaduras Los poros o punteaduras es otro tipo de comunicación, que se caracteriza porque además de pared primaria y lámina media, tambien tiene pared secundaria. Los poros son adelgazamientos donde desaparece la pared secundaria y permiten el intercambio de sustancias. La pared secundaria puede ser una zona donde desaparece y formar el poro con punteaduras simple o bien puede aparecer unas aureolas que van a facilitar o regular el intercambio de sustancias. En algunos casos la parte central del poro puede estar engrosada formando el toro, que lo que hace es permitir la regulación osmótica y puede moverse de un lado hacia a otro sellando el poro y evitando el paso de sustancias.

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Técnicas de tinción En el caso de vegetales se pueden hacer una detección de los distintos componentes con técnicas microscópicas, mediante el uso de tinciones especificas. Si queremos detectar celulosa se usa azul de toluidina, rojo Congo, etc. Para la lignina se usa safranina. Tambien se usa microscopia de contraste de fases para estudiar las hojas. Tambien técnicas inmunocitoquimicas, etc.

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TEMA 4. COMPONENTES Y FUNCIONES ESTRUCTURALES DEL CITOESQUELETO 1. INTRODUCCIÓN El citoesqueleto forma el esqueleto de la celula, pero no es un esqueleto estático, ya que está continuamente formándose y desapareciendo, es decir, sus componentes se van formando y desorganizando al mismo tiempo, por lo que son componentes muy dinámicos. Esta formación nueva y desaparición de la parte antigua permite a la otra función del citoesqueleto que es permitir la motilidad tanto de sus estructuras internas como el movimiento de la propia celula. Esto va a permitir que un orgánulo del complejo del Golgi u otra estructura pueda llegar hasta la membrana celular. Serán imprescindibles tanto en la estructura y soporte de la celula y en el transporte. El citoesqueleto está formado por tres tipos de estructuras, los microfilamentos (de 5 a 9 nm de grosor y está formado por actina), después tenemos microtúbulos que están formados por la tubulina (de 22 a 24 nm) y entre medio de estas tenemos los filamentos intermedios (de 8 a 12 nm) y presenta gran variedad de proteínas estructurales. En general podemos tener que los microfilamentos se localizan bajo la membrana celular, los microtúbulos desde el núcleo con prolongaciones a toda la celula y los filamentos intermedios tambien estarán formando parte de las uniones celula-celula o celula-matriz extracelular. Como estructura general de todos los filamentos están la proteína estructural que forma el filamento en sí, tendremos proteínas asociadas que se encargan de formar, degradar y regular a estos filamentos y otras proteínas que se encargan del movimiento de estos filamentos.

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2. MICROFILAMENTOS DE ACTINA La actina es la proteína celular más abundante, del 1 al 5% del peso seco de una celula y en células especializadas en la contracción representan hasta el 10%. Tambien se puede ver que en un hepatocito hay 2x104 receptores de insulina cuya función principal está relacionada con la insulina y de actina hay hasta 5x108. El gen que codifica esta proteína está muy conservado a lo largo de toda la filogenia, tenemos en organismos inferiores como bacterias o levaduras, hay uno o dos genes, en humanos hay 6 genes y en células vegetales hasta 60 genes y muchos de ellos son pseudogenes. En humanos hay 4 isoformas α que se expresan en células musculares y las β que forman las fibras de tensión o de estrés y las γ que forman parte del contorno celular. Estas últimas formas se dan en las células no musculares. Una vez expresadas la fibras se pueden organizar formando haces o bien formando redes. Dependiendo de su función se formaran redes o haces.

La actina puede aparecer en dos formas, o bien libre (actina G o globular) o formando parte de un filamento (actina F o fibrilar). La formación de los filamentos requiere la presencia de iones como magnesio, potasio o sodio. La actina según tenga unido ATP o ADP nos va a aparecer en 4 formas distintas, pudiendo tener:  Actina G-ADP: Es una forma libre que no se puede unir a fibras.  Actina G-ATP: Es la forma inactiva que se puede unir a fibras.  Actina F-ATP: Al unirse la Actina G-ATP este se hidroliza  Actina F-ADP. Una vez que se forma el filamento la actina adquiere actividad ATPasa y esta hidroliza el ATP que se libera del fosfato quedando como actina ADP. Cuando se va formando el microfilamento se establece un polo positivo y uno negativo, de manera que en el extremo positivo siempre hay actinas unidas a ATP mientras que en el negativo hay actinas unidas a ADP y este filamento está continuamente formándose y rompiéndose por lo que tiene un equilibrio dinámico y gran inestabilidad, de modo que permite el desplazamiento. A esta inestabilidad se le denomina rueda de molino. En el extremo positivo se van uniendo las actinas G con ATP que se hidroliza y forma ADP. La afinidad por la actina unidas a ATP es muy grande y la actividad ATP-asa es muy lenta de modo que se acumulan actinas con ATP sin que se digieran formando una cadena con bastantes ATP unido, esto facilita que las moléculas de actina con ATP se vayan uniendo de manera que crecen los filamentos por el extremo positivo ya que hay más unión de actinas con ATP. En el extremo negativo pasa lo contrario, ya que tienen menor actividad con actina ATP, por lo que la formación es muy lenta por este extremo. 54

La despolimerización o eliminación de moléculas de actina ocurre de forma inversa, en la zona positiva es muy lenta, ya que el equilibrio esta desplazado hacia la unión y en el negativo es muy rápida.

Formación de los filamentos de actina in vitro La formación de estos filamentos de actina in vitro se pueden observar. La formación del filamento tiene 3 etapas, empieza con una etapa de nucleacion que es muy lenta y en ella las moléculas de actina libres deben chocar unas con otras y esta interacción es arbitraria para conseguir unirse unas pocas moléculas. Una vez que se unen varias moléculas el establecimiento de los extremos positivo y negativo debido a la unión de ATP o ADP en sus extremos hace que el termodinámicamente el proceso se acelere hasta que se establece un equilibrio en el que la polimerización y la despolimerización están compensadas, de modo que se alcanza la concentración critica que corresponde con la mitad de la concentración de actina en forma soluble y la otra mitad en forma fibrilar. Esto se forma en el tubo de ensayo que forma filamentos pero no estructuras.

Proteínas implicadas en la formación y elongación de microfilamentos Hay proteínas y factores que regulan la síntesis, polimerización y despolimerización. Tenemos dos complejos proteicos como son:  Complejo organizador de microfilamentos: Está formado por las proteínas Arp2 y Arp3 que se unen al filamento por la parte negativa y añade actina G-ATP de manera que se une a un filamento ya existente y sirve de anclaje de nucleacion para otro filamento, de manera que el filamento existente y el nuevo quedan en una inclinación de 70o permitiendo la formación de redes. Este proceso está regulado por una familia de GTPasas de la familia Ras que activan este complejo y la formación de redes.  Complejo de formina: Si lo que se forma son fibras tenemos el complejo de forminas. El anillo de formina es complejo dimerico que se une al extremo positivo uniendo 2 moléculas de Actina G-ATP activadas.

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Estos dos complejos hacen que se forme o vaya creciendo el filamento. Hay otras proteínas que favorecen esta función como es la profilina que es una proteína de 15 KDa que pasa la actina G-ADP a Actina G-ATP que se une al extremo positivo. Tambien esta las faloidinas que se unen a filamentos e impiden la despolimerización pudiendo identificar los filamentos de actinas y favorece que el filamento vaya creciendo.

Proteínas que impiden la polimerización Hay tambien proteínas que impiden la polimerización, de modo que permitiendo la despolimerización acortando los microfilamentos. Tenemos la cofilina que tiene la función contraria a la profilina, es decir, se unen a la actina G-ADP e impiden que se fosforile. Hay otras como la latrunculina y la timusina β4 que tienen una acción similar a la cofilina.

Proteínas que favorecen la despolimerización Tambien hay proteínas que favorecen la despolimerización, como la cofilina, que se unen al extremo – y rompe el filamento de manera que lo acorta. Tambien hay citocalasina D, gelsolina o fragmina que se unen al extremo + y evita que siga creciendo por lo que el filamento se acorta.

Proteínas que estabilizan los filamentos Tambien hay otras proteínas que estabilizan los filamentos cuando el filamento esta ya formado. Estas son las proteínas de coronación (cap-Z) que se unen al extremo + protegiendo el crecimiento y la tropomodulina que se une al extremo – e impide la despolimerización.

Organización de microfilamentos. Formación de redes. En el caso de la formación de redes, estas están en la periferia celular, son las responsables de lamelipodios y pseudópodos es decir formaciones que permite que las células se desplacen lo que es muy importante en fibroblastos, neutrofilos y macrófagos. Las ramificaciones que forman estas redes están estabilizadas por la filamina que unen filamentos de actina y forman una red en tipo gel. Sin ella estas redes no serian capaces de formar un esqueleto suficientemente rígido. Si se elimina esta filamina las células adquieren una disposición globular con pequeñas vesículas que no permiten la formación de lamelipodios ni pseudópodos. La formación de redes esta inducida por factores de crecimiento, quimiotacticos, fagocitosis, etc. mediante Rac. Las redes se anclan a la membrana a través de zonas de anclaje o nucleacion mediada por receptores células, entre ellos integrinas.

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Organización de microfilamentos. Formación de haces no contráctiles En el caso de la formación de haces no contráctiles. Son fibras largas dispuestas de forma paralela que aparecen en microvellosidades, filopodios, conos axónicos, placas de adhesión. Estos haces tiene una tropomiosina que se une al filamento de actina sirviendo de coronación, es decir, lo protege. Estas fibras quedan unidas unas con otras mediante fimbrina quedando muy empaquetado o α-actinina quedando los filamentos más laxos. Existen otras proteínas que pueden formar o estabilizar estos haces como la espectrina en eritrocitos, fodrina en microvellosidades, fascina en erizo de mar, villina a bajas concentraciones de calcio, etc. En microvellosidades hay grandes filamentos de actinas estabilizados por fimbrina, villina y fodrina que une en las bases un filamento de una microvellosidad con el filamento de otra. FILAMENTOS DE ACTINA Y ΑACTININA

FILAMENTOS DE ACTINA CON FIMBRINA

Los filamentos de estos haces tienen moléculas accesorias que son las proteínas motoras. Los motores moleculares están formados por miosinas no convencionales en este caso denominadas miosina I o minimiosina que une el filamento de actina a la membrana plasmática facilitando el movimiento. Esta miosina I se encuentra en los lugares de prolongaciones largas y muy delgadas que son por las que se moviliza esta celula. Tambien hay miosina I, V, VII y XV que están implicadas en el desplazamiento de orgánulos a través de las fibras. La miosina V está implicada en el transporte de melanosomas a través de las células mediante un movimiento como si andase. Cada avance de esta vesícula hace que se desplace de 30 a 40 nm, mientras que en la miosina I solo es de 10 nm en el mejor de los casos. La unión de la miosina V y la vesícula no es directa, sino que es mediante unas proteínas de unión que une la vesícula a la miosina, que son proteínas Rab. Cuando esta proteína está alterada no se puede hacer este transporte de vesículas y produce albinismo. Tambien pueden ocurrir mutaciones en miosina VI y VIIa que produce sordera por mal tráfico vesicular y de impulsos eléctricos de los estereocilios. Estos movimientos se pueden estudiar in vitro mediante establecimiento de filamentos y para ello se usan bolas que asemejan a vesículas y que emiten fluorescencia de manera que podemos tener en un porta unida actina e incubar con proteínas motoras y vesículas sintéticas fluorescentes y se puede estudiar cómo se movilizan a través de las fibras.

Organización de microfilamentos. Formación de haces contráctiles La miosina convencional es la II que junto con los filamentos de actina forman haces contráctiles presentes en células musculares. Esta miosina tiene sus cabezas globulares que generan el golpe de fuerza para la contracción y una cola. Estas cadenas se alinean de forma antiparalela. Estas cadenas de miosina II se asocian entre 2 filamentos de actina unidos formando una estructura repetitiva que es el sarcómero. Esta contracción de la miosina con respecto a la actina hace que el musculo se contraiga o se estire. Existen otros haces contráctiles que tienen una función y organización diferente. En 57

células no musculares hay haces de actina unidos a miosina II que van a tener la función de contraerse. La función principal en la que están implicados es:  División celular: En ella se forma un anillo contráctil que separa las 2 células en el final de la mitosis, es decir, da lugar a la citocinesis. Si se inyecta en un célula sustancias que inhiben las sustancias de miosina II, las células cada vez que se divida, el proceso final de citocinesis no ocurre por lo que la celula divide el material genético formando una celula 4n y si se mantiene el bloqueo dará células 8n, etc., generando un celula multinucleada.

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Adhesiones focales: La miosina II permite que se contraiga la celula y se mueve.

Las proteínas Rho van a facilitar la interacción actina-miosina. Tambien intervienen proteínas Rab que mueven el equilibrio hacia la polimerizacion-despolimerizacion en función de su actividad y el complejo Arp2/Arp3 que está implicado en la nucleacion favoreciendo la formación de filamentos de actina

Funciones 

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Movimiento ameboide: Las células se desplazan generando prolongaciones citoplasmáticas. En el interior celular pueden estar organizados de distinta forma, pudiendo estar microfilamentos libres o haces o redes. En la zona interna del citoplasma tenemos muy poca cantidad de actina y hay principalmente filamentos cortos y libres y estas asociaciones de haces y redes están en la periferia celular. Estas organizaciones en haces o redes forman las estructuras de tipo gel que permiten el movimiento celular. El movimiento celular es el que ocurre en células fagocitarias. Formación de lamelipodios: Son prolongaciones gruesas y cortas que permiten a la celula desplazarse y están presentes en fibroblastos y queratinocitos. En este caso las fibras contráctiles de actina y miosina II se forman en un gel, en redes. Crecimiento de los filopodios: Son prolongaciones más finas y largas, en este caso los filopodios presentan miosina I. Estos filopodios tienen una red de actina en la periferia celular pero tiene solo un haz y no una red. En el caso de la formación de lamelipodios, la celula tiene un contacto con la superficie grande por lo que tenemos una distribución de actina por toda la celula pero sobre todo en la parte periférica formando una red y la miosina forma en la parte posterior un anillo contráctil que es el que impulsa el desplazamiento de esta red. Para detectar actina se suele usar paluidinas que van unidas a un fluorocromo.

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Forman parte de las microvellosidades intestinales: Los haces de actina están formados por filamentos paralelos de actina unidos de forma transversal con fimbrina y villina. Una vez que estos haces se introducen en el citoplasma celular quedan enlazados mediante fodrina y más abajo enlazan de forma perpendicular con los otros elementos del citoesqueleto que forman parte de las uniones celulacelula como los filamentos de actina de zonula occludens o adherens. En el caso de zonula occludens son solo de actina y en adherens tambien presentan miosina. Forman parte del anillo contráctil en la citocinesis animal. Intervienen en la localización de organelas: Se marca el citoesqueleto y mediante un anticuerpo específico se marcan los sacos del Golgi que tiene una distribución concreta y definida alrededor del núcleo, y si se trata la celula con un agente que despolimerice los filamentos de actina vemos que el Golgi se redistribuye por la celula. Transporte de vesículas y de ARNm: La miosina 5 puede unir un ARNm y lo dirige a una zona concreta para que se exprese. Usado por determinados patógenos: Para escapar de mecanismos de lisis celular. Hay bacterias que utilizan la polimerización de la actina para desplazarse por la celula y evitar ser capturada por un lisosoma, de manera que esta bacteria presentan el polo opuesto de la dirección del movimiento una proteína que recluta las proteínas del complejo Arp celular. Desplazamiento de receptores superficiales: Las proteínas de membrana pueden moverse por la membrana y están relacionados o ligados a filamentos de actina que van a permitir que este desplazamiento ocurra o no. La citocalasina D que despolimeriza los filamentos, las células dejan de activarse con el mitogeno ConA.

Tambien están implicados en las uniones celula-celula (en las zónulas adherens hay cadeninas que se unen a haces de actina por α-actinina y se unen a través de lignina y caderina). En el caso de las uniones células matriz tenemos contactos focales y hemidesmosomas. A estas estructuras de filamentos hay una regulación con complejos proteicos con GTPasas.

3. MICROTÚBULOS Tienen un tamaño de 22 a 24 nm de grosor. Están formados por un heterodimero con αtubulina y β-tubulina, cada subunidad de 55 KDa de peso. La α siempre tiene unido GTP y la β tiene unida GTP pero tiene actividad GTPasa, de manera que la α siempre tiene unido GTP y la β tiene unido GTP o GDP en función de si actúa o no la fosfatasa. Forman una estructura de manera que los heterodimeros forman una espiral. Cuando se corta de forma transversal vemos que se forman un anillo de 13 subunidades de tubulina. Si se hace el corte longitudinal se ve que en su interior hay varias líneas más electronodensas que son las fibras de tubulina. Estos están implicados en la motilidad celular, división y transporte. Los microtúbulos tienen la misma propiedad que los filamentos de actina, es decir, son muy dinámicos inestables, presentan un polo + y otro -. A partir de un heterodimero se unen mas heterodimeros y donde hay una unidad β con GTP y una α con GTP se produce la degradación del GTP de la β y queda siempre una α con GTP y la β con GDP. Esto determina la polaridad de manera que en el extremo – hay siempre una α-tubulina con GTP y en el extremo + siempre hay una β-tubulina con GTP o GDP en función si a hidrolizado o no. Estos filamentos vemos que si protegemos un microtúbulo inicial vemos que el extremo + crece más que el negativo. Este microtúbulo se forma en primer lugar un protofilamento, que es una única cadena de dímero, que se va fusionando 13 protofilamentos formando una hoja y luego esta hoja se cierra quedando los 13 protofilamentos unidos formando una estructura cilíndrica. 59

In vitro se observa una cinética de polimerizacion-despolimerizacion descompensada. Un microfilamento tarda mucho en crecer pero la despolimerización ocurre de forma muy rápida, además se puede ver que la polimerización es temperatura dependiente, por lo que si se baja la temperatura 4o se produce la despolimerización salvo si aumenta la temperatura. Para estudiar los microtúbulos se usan colchicina, colcemida, nocodazil y taxol, es decir compuestos naturales o sintéticos que favorecen la despolimerización.

Proteínas asociadas a los microtúbulos (MAP) En este caso están las proteínas MAP. Tenemos un grupo de proteínas estabilizadoras. Estas proteínas se asocian lateralmente al microtúbulo y tienen una estructura como de L dejando un brazo unido al microtúbulo y otro que sale perpendicular al otro microtúbulo. Además de estabilizar estos microtúbulos tambien impiden que los microtúbulos se unan unos a otros y se acerquen demasiados. Como el microtúbulo siempre tiene el mismo tipo de proteínas asociadas tienen una distribución muy simétrica. En función de la proteína asociada al microtúbulo depende del tamaño depende la cercanía o lejanía de los microtúbulos. Las MAP4 y CLIP170 están en todas las células mientras que MAP1, MAP2 y TAU están en neuronas y alguna se puede usar como marcadores de estructuras concretas. MAP2 se caracteriza porque se encuentra en dendritas. Tambien tenemos proteínas desestabilizadoras, como son las cataninas y estafmina, que están en casi todas las células.

Centros organizadores de microtúbulos (MTOC). Centrosoma Los microtúbulos tienen un centro organizador de microtúbulos o MTOC o centrosoma. Hay uno por celula y se localiza de forma perinuclear. Cuando la celula se va a dividir este centrosoma se divide para que uno se distribuya en cada celula. Existen células como células embrionarias o polarizadas y vegetales que tienen numerosos centrosomas. Estos centros organizan la motilidad y polaridad celular, ya que a partir de él irradian todos los microtúbulos de la celula, de manera que en esa zona encontramos el polo – y el polo +. Está formado por 2 centriolos perpendiculares formados por 9 tripletes de microtúbulos. Hay un triplete de microtúbulos que está completo y los otros 3 no están completos. Los centriolos se organizan 2 y se disponen de forma perpendicular y rodeándolos esta el material pericentriolar que es electronodenso y de composición amorfa y rico en γ-tubulina que es el complejo proteico que sirve de nucleacion y formación para los microtúbulos. Esta forma un anillo con 8 subunidades γ-tubulina y es el que se encarga de generar estos microtúbulos. Las células que carecen de centriolos aparece una zona de material amorfo y electronodenso a partir de la cual irradian y se generan los microtúbulos y es rica en γtubulina.

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Proteínas motoras de los microtúbulos Hay dos grupos de proteínas, las proteínas de la familia de las quinesinas que se desplazan siempre hacia el polo + teniendo movimiento anterogrado. Por otro lado tenemos las dineinas que se desplazan hacia el extremo – teniendo un movimiento retrogrado. En ambos casos el movimiento depende de ATP. Hay dineinas y quinesinas que se pueden clasificar en función de si están implicados en el desplazamiento citosolico, desplazamiento mitótico y del axonema. Estas proteínas tienen una estructura y funcionamiento similar al de miosina en ambos casos, de modo que tenemos un complejo proteico donde hay una zona globular que presenta actividad ATPasa y por la que se une al microtúbulo y por el otro extremo se une a lo que se vaya a transportar, de manera que las quinesinas unen distintas estructuras y las desplazan hacia el extremo + mientras que las dineinas dirigen esos orgánulos hacia el centro del centrosoma. Estos microtúbulos no llegan a la membrana citoplasmática y por tanto no pueden dirigir una vesícula desde el Golgi hasta la membrana donde se debe fusionar por lo que lo lleva a medio camino donde existe una serie de haces o redes de actina de manera que la quinesina desplaza la organela y se la pasa a una miosina que la dirige hasta la membrana.

Organización y función en neuronas Una función de los microtúbulos es la dirección y transporte axonal. En los axones los microtúbulos forman haces paralelos, mientras que en las dendritas estos microtúbulos forman haces agitados. Todas las vesículas de secreción viajan por los microtúbulos gracias a quinesinas hasta el extremo donde la red de actina los lleva hasta la membrana. Las vesículas que no se utilicen o se vayan a regenerar se van al soma a través de dineina.

Cilios y flagelos Los microtúbulos forman parte de cilios y flagelos. Los cilios suelen aparecer en agrupaciones de prolongaciones celulares cortas y delgadas. Su movimiento facilita el movimiento de los fluidos que están en el conducto o superficie donde se localizan. El movimiento es siempre perpendicular, por lo que solo se pueden mover hacia los lados. Los flagelos suelen ser largos y aparecen aislados y permiten el desplazamiento de la celula. Estos tienen un movimiento ondulatorio por lo que en función del sentido del giro que produce la celula se desplazara hacia delante o hacia atrás. La estructura que presenta es una prolongación citoplasmática que su interior está ocupado por microtúbulos. Estos microtúbulos tienen una estructura de 9+2 dobletes, formando el axonema. Los microtúbulos no aparecen aislados sino que aparecen mucha cantidad de material electronodenso entre los microtúbulos contiguos y centrales. Los microtúbulos periféricos están unidos a la pareja de microtúbulos adyacente mediante dos tipos de uniones, uno es mediante la proteína dineina y nexina que tambien une los centrales. La parte basal del cilio o flagelo presenta solo los 9 dobletes periféricos. La zona que se introduce de estos cilios y flagelos en la celula es el cuerpo basal y tambien presente 9 tripletes.

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El movimiento es gracias a la proteína motora dineina y este movimiento está regulado por el calcio y AMPc de manera que en un cilio o flagelo se desplaza curvándose de manera que en el lado por el que se curva, las dineinas atraen a los dobletes y en el lado que se estira las dineinas separan los dobletes, de manera que la unión desunión y la contracción de estas dineinas va a permitir que el cilio y flagelo se mueva.

División celular Tambien los microtúbulos influyen en la división celular pues forman el huso mitótico que dirige y facilita la separación de los cromosomas. Se puede realizar el estudio de esto mediante tinción con fluorocromo verde y tiñendo de azul el material genético, pudiendo ver que al principio de la mitosis se condensa el material genético y aparecen 2 centrosomas que forman el huso mitótico y se concentraran los cromosomas en el centro formando una placa ecuatorial que divide cada cromatida y van cada uno a cada celula. Los microtúbulos suelen aparecer organizados alrededor de un centrosoma que suele ser único en las células. Este centrosoma se divide para que cada celula reciba un centrosoma. Justo antes de empezar la síntesis del material genético empieza el proceso de modo que los centriolos se alejan, cada uno llevándose parte del material amorfo pericentriolar formado por γ tubulina originando la síntesis de microtúbulos. A partir de cada centriolo se forma de forma perpendicular otro centriolo de modo que hay 2 parejas de centriolos comenzando la reorganización de los microtúbulos celulares y comienza la nueva síntesis de microtúbulos alrededor de estos centros. En un estadio inicial tenemos 2 centrosomas, y los microtúbulos se alinean alrededor de cada uno de ellos y comienza la polimerización de estos, de manera que los microtúbulos que crecen la extremo + se alinean y quedan unidos por proteínas del tipo quinesina. Las quinesinas uniendo distintos microtúbulos, cada una se va a desplazar hacia el extremo + de manera que los microtúbulos se van separando y se va polimerizando mas en el extremo + haciendo que las quinesinas se vayan moviendo de modo que los centrosomas se van separando. De forma contraria en los otros microtúbulos que están unidos a la actina periférica están las dineinas que se desplazan hacia el polo – arrastrando hacia si al centrosoma de manera que de esta forma coordinada se separan los 2 centrosomas. Una vez que se forma el huso mitótico y los cromosomas forman la placa ecuatorial, dispondremos de microtúbulos astrales que van hacia el exterior y otros microtúbulos que son los polares que están implicados en la unión al microtúbulo polar del otro centrosoma y favoreciendo la separación de centrosomas, y microtúbulos de cinetocoro que unen a los cromosomas de manera que un cromosoma con sus dos copias va a quedar unido por un lado a un centrosoma y por el otro extremo al otro centrosoma. En el cinetocoro hay un complejo multiproteico que enlaza la cromatida al microtúbulo. La formación de la placa ecuatorial se forma gracias a la quinesina. El microtúbulo crece hacia el extremo + moviendo el cromosoma hacia el centro y la quinesina va desplazando al cromosoma hacia el centro tambien de modo que todas las cromatidas dispersas se disponen en el centro. Una vez que están los cromosomas en el centro alineados se separan las cromatidas y cada cromatida viaja a un extremo para permitir la separación del material genético. El acercamiento hacia el centrosoma ocurre por dos procesos, uno la implicación de la dineina que se desplaza al extremo – arrastrando al cromosoma y tambien puede ser que se produzca una despolimerización de los microtúbulos en el extremo +. Las proteínas protegen el extremo – de la formación y destrucción y el extremo + solo sufre procesos de despolimerización. La despolimerización como el cromosoma esta unido mediante proteínas del cinetocoro como las dineinas se van a desplazar hacia el extremo -.Cuando se acorta la longitud del microtúbulo y se desplaza hacia el extremo -, el cromosoma no se desplazara en la dirección incorrecta. Esto se descubrió gracias a la microscopia confocal tiñendo los microtúbulos de verde y el material genético de azul.

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4. FILAMENTOS INTERMEDIOS Son filamentos de 8 a 12 nm. Están implicados en funciones estructurales y no en la motilidad. Existen unos 6 o 7 tipos de filamentos intermedios pero básicamente tenemos las laminas formadas por 3 proteínas que le dan consistencia y estructura al núcleo, queratinas, neurofilamentos, gliofilamentos, desmina y vimentina. Todos tienen la misma estructura formando tetrámeros con una zona lineal que permite la interacción entre los distintos monómeros y las cabezas globulares en los extremos. Los tetrámeros forman protofilamentos y filamentos intermedios. Suelen aparecer en células animales solamente y presenta un tipo de filamento intermedio o varios y algunas células pueden expresar en un momento un tipo de filamento y en otro momento otro tipo de filamento. Son estructurales que suelen interaccionar con filamentos de actina y microtúbulos mediante uniones débiles o por plectina. La polimerización y despolimerización de estos se conoce muy poco. Este proceso de formación no requiere de energía y no hay ningún centro organizador que forme estos filamentos. Los tetrámeros se van incorporando en la zona central, creciendo del centro a los extremos y su polimerización y despolimerización está regulada por fosforilacion y desfosforilacion, de modo que la fosforilacion induce la desagregación y la desfosforilacion induce la agregación.

Queratinas Están en la mayoría de epitelios sobre todo los que estén queratinizados. Hay más de 20 proteínas de queratina codificadas por unos 38 genes aunque cada celula presenta una sola queratina. En la piel, las células de cada estrato presentan una queratina distinta. Se suelen ubicar alrededor del núcleo unidas por desmosomas y hemidesmosomas. La plectina hace de puente entre las proteínas de adhesión y filamentos en hemidesmosomas.

Neurofilamentos Están formados por 3 proteínas distintas NF-L, NF-M y NF-H. Los filamentos forman haces bastante laxos unidos por la proteína plectina. En algunas enfermedades está asociada su acumulación con el desarrollo esta enfermedad.

Gliofilamentos Son similares a neurofilamentos pero más delgados y presentes en astrocitos y células de Schwann. Están formados por la proteína acida fibrilar glial.

Desmina Es una proteína que forma parte de los filamentos intermedios. Esta proteína está presente en células musculares. Forma una red que une los haces contráctiles de actina y miosina mediante la línea Z. Son muy similares a los gliofilamentos.

Vimentina Presenta una proteína similar a los gliofilamentos y está en células gliales, células de Schwann, endoteliales, melanocitos, fibroblastos, condrocitos, osteocitos y musculares. Suelen coexistir con la desmina y en las células suele aparecer alrededor del núcleo, asociados a la línea Z o unida a cromosomas durante la mitosis. No se han detectado alteraciones genéticas.

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TEMA 5. COMPARTIMENTOS RELACIONADOS CON LA CONVERSION ENERGETICA -

MITOCONDRIAS Y CLOROPLASTOS. Son los principales orgánulos celulares para obtener energía. Se cree que se introdujeron en una célula eucariota por endosimbiosis y esta teoría fue descrita por Lynn Margullis. Se cree que a partir de un organismo primitivo sin pared (archaea) se introdujeron en la celula organismos y estuvieron viviendo por simbiosis formando cloroplastos (cianobacteria) o mitocondrias (bacteria purpura no sulfurosa). En la evolución se dio primero la unión bacteria purpura con la archaea formando mitocondria y después la simbiosis cianobacteria con archaea. Las pruebas que apoyan esta hipótesis son que ambas organelas presentan un tamaño similar al de bacterias, además tienen membrana doble y su membrana externa es muy similar a la de las células eucarióticas apoyando la hipótesis de que hubo una incorporación por endocitosis del microorganismo. Por otro lado, la membrana interna no se parece en nada a cualquier otra membrana de la celula eucariótica pero si a la membrana de bacterias, por ejemplo en cuanto al ratio de proteínas y lípidos. Además en esta membrana se presentan ATPasas. Además tienen ADN bicatenario cerrado al igual que bacterias. El mecanismo de división es por fisión al igual que bacterias y aun quedan organismos que siguen realizando esta endosimbiosis pero de forma muy puntual. Hay teorías que van en contra de esta teoría, por ejemplo que el ADN bicatenario presenta nitrógeno presente solo en eucariotas.

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MITOCONDRIA. Tienen forma de bastón, teniendo un tamaño de hasta 1μm de anchura por 7μm de longitud. Son visibles en algunos tipos de microscopia. Existe hasta 1000 mitocondrias en hepatocitos por célula y su distribución depende del tipo celular y de la función que realice. En cuanto a su estructura se caracteriza por la presencia de repliegues en la membrana interna formando las crestas mitocondriales. Estas crestas pueden presentar distinta estructura y en su interior hay un material poco electronodenso que es la matriz mitocondrial donde hay enzimas, lípidos, etc.

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Estructura La membrana externa es similar al retículo presentando un 60% de proteínas y 40% de lípidos. Tiene distintas proteínas transportadoras de electrones como Cit b5, reductasa de b5-NADH. Tambien presenta proteínas que intervienen en la degradación oxidativa de lípidos, monoaminooxidasa, nucleosido difosfatasa quinasa, proteínas de apoptosis (Bcl- 2) y presenta poros y canales. Presenta la proteína porina que forman poros que permite el paso libre de moléculas de más de 10 KDa. La membrana interna es similar a la de bacterias, presentando un 80% proteínas y un 20% lípidos. Presenta un alto contenido de cardiolipina teniendo impermeabilidad a iones. Presenta un complejo de incorporación de proteínas, enzimas de oxidación de ácidos grasos, transferasas, cadena de transporte de electrones y ATP sintetasa. Ambas membranas tienen un espacio membranoso de 8 nm de grosor, tiene poco contenido en cuanto a proteínas (presenta adenilato ciclasa) y presenta proteínas similares a la actina que forma la estructura reticular de la mitocondria y permite el cambio de forma y volumen, pero no se ha demostrado. En cuanto a la matriz presenta distintas enzimas implicadas en la oxidación de ácidos grasos, piruvato, ciclo de Krebs. Presenta el ADN bicatenario con intrones y codifica algunas proteínas de la membrana. Para traducir el ADN necesita ribosomas que son similares a los bacterianos, siendo de 35S y 25S y su actividad se inhibe por cloranfenicol y se inicia la traducción de las proteínas en la N-formilmetionina, al igual que en bacterias. Además presenta inclusiones lipídicas debido a síntesis de hormonas esteroideas. Su mayor función está relacionada con el metabolismo energético. Lo que hacen es completar la oxidación de compuestos energéticos para obtener energía, de modo que en condiciones normales en una celula sin mitocondrias o en situaciones donde las mitocondrias no funcionan se produce la glucolisis anaerobia, es decir, en el citosol se oxida la glucosa obteniendo dos moléculas de ATP. Sin embargo si el intermediario de la glucolisis, que es el piruvato, viaja a la mitocondria y se realiza una glucolisis aeróbica, este piruvato se oxida totalmente y forma mayor cantidad de energía de manera que se obtiene a partir de una glucosa hasta 38 moléculas de ATP. El piruvato entra en la celula, entrando en la mitocondria por transportadores y en la matriz es transformado en acetil-CoA que es oxidado hasta formar CO2. Esta oxidación sigue el ciclo de Krebs descrito en 1930 y que es un ciclo fundamental en el metabolismo mitocondrial y oxidación de compuestos energéticos. El ciclo produce coenzimas reducidos a partir del piruvato, en una primera fase primero se produce el acetil-CoA formando NADH y este acetil formara 3 moléculas de NADH y otra de FADH. Los ácidos grasos se enlazan con la acetil-CoA formando acil-CoA que ingresan en la mitocondria donde pasan a acetil-CoA entrando de nuevo en el ciclo de Krebs obteniendo coenzimas reducidos y GTP. Esta es la primera fase de la oxidación. En el segundo paso que es la cadena de transporte, toda la energía acumulada en las coenzimas reducidas formadas en el ciclo o en el citosol van acumulando electrones que van a reducir al oxigeno que es muy oxidante, por lo que tiene mucha afinidad por los electrones. El oxigeno capta los electrones del NADH que es una molécula muy reductora de manera que el oxigeno se reduce formando agua y las coenzimas reducidas se oxidan y entran de nuevo en el ciclo siendo oxidantes. Estos electrones van a viajar por una cadena de proteínas donde ocurren reacciones de oxidacion-reduccion de manera que los electrones van a ser captados desde el 65

NADH por el complejo NADH-CoQ reductasa (Complejo I) y lo que ocurre mientras se pierde electrones se pierden tambien protones pasando de la matriz al espacio intermembranoso de manera que se vuelve a tener NAD oxidado y s acumulan protones en el espacio intermembranoso. La coenzima Q le cede los electrones al complejo III (Citocromo C reductasa) y existe un nuevo bombeo de protones al espacio intermembranoso. Estos electrones son captados por el citocromo C que los pasa al último complejo, el IV (Citocromo C oxidasa) que usa la energía y los electrones para reducir al oxigeno y formar agua. En todo este ciclo se produce una caída de energía que se usa por los canales de protones para translocar los protones desde la matriz hasta el espacio intermembranoso. El FADH2 utiliza el complejo II(succinato-CoQ reductasa) provocando la translocacion de menos protones que son usados para la obtención de ATP, de manera que este intercambio de protones hace que la matriz que tiene un pH de 8 aproximadamente hace que el espacio intermembranoso tenga más protones generando un pH mas acido, siendo de unos 7. Existen distintos inhibidores de cada uno de los complejos de manera que el complejo I esta inhibido por la rotenona, el III por la antimicina A y el IV por cianuro y azida sódica. En función de que pasa inhibamos se pueden obtener mayor o menor cantidad de energía.

La acumulación de protones en el espacio genera un gradiente de protones y un proceso de quimiosmosis de manera que los protones son usados por un complejo multiproteico que es la ATPasa que está en la membrana mitocondrial interna y en las crestas y se puede dividir en 2 partículas, una insertada en la membrana que es la F0 y permite el paso de protones y una cabeza globular dispuesta hacia la matriz que es la partícula F1 que es donde está la actividad ATPasa de manera que cada vez que pasan 3 protones por la partícula F0 se libera la suficiente energía como para genera un ATP. Además se demostró la función de cada parte con una técnica, que al romper las mitocondrias se obtenían fracciones de mitocondrias, se vio que las esferas completas tenían actividad ATPasa pero al tratar con algún detergente suave o tratamientos mecánicos había algo en la molécula que hacía que estas esferas perdieran alguna de las actividades, de manera que si precipitaban los microsomas 66

había cadena de transporte pero no actividad ATPasa mientras que en la fracción soluble no había transporte pero si actividad ATPasa y cuando las fracciones se fusionaban se unión las dos funciones por lo que se comprobó que había una parte del complejo que permitía el paso de electrones y otra parte que tenia actividad ATPasa. Todas estas moléculas deben entrar o salir a la mitocondria y lo hacen por transportadores de modo que el ADP y fosfato lo hacen por transportadores del citosol. Los OH- y ATP salen al espacio intermembranoso. El OH- gasta parte de los protones para formar agua y otra parte formara ATP. El ATP formado a través de la ATPasa sale al citosol. Además la fosforilacion esta acoplada a la cadena de transporte de electrones. Los dos procesos deben estar muy coordinados. Se usan sustancias como oligomicina que permeabilizan la membrana interna favoreciendo que los protones al mismo tiempo que son bombeados vuelvan a entrar rompiendo el gradiente e impidiendo la formación de ATP. La cardiolipina le confiere a la membrana interna permeabilidad a los iones por lo que gracias a ella se produce el gradiente de protones. La termogenina es una proteína mitocondrial en tejido graso pardo que permite que el gradiente de protones se rompa sin obtener ATP pero si se obtiene calor, de manera que oxidamos los carbohidratos pero no se obtiene energía, que es lo que ocurre en animales que hibernan. En lo humanos tambien hay termogenina al nacer pero se va perdiendo con el tiempo por lo que dificulta que obtengamos calor de forma natural.

Incorporación de proteínas La incorporación se produce en la síntesis de proteínas de ribosomas libres que se forman precursores con secuencia señal en el extremo amino que las dirigen hacia la mitocondria. Cuando la proteína se sintetiza en los ribosomas se une a factores estimuladores de mitocondrias o al HSP70 que unen en un proceso ADP dependiente a las proteínas y mantiene su configuración, la proteína es reconocida por receptores que forman un canal de transporte en la membrana externa mitocondrial que es el TOM y tenemos distintas proteínas como TOM70 y 37 que transfiere y se van agregando formando complejos multiprotéicos llegando al final donde está la TOM40 que forma el poro físico por donde la proteína se introduce de manera que esa proteína que está atravesando la membrana externa tiene que tener continuidad con la membrana interna. En la membrana interna existen otros complejos proteicos como son TIM que los alineamientos entre TOM 40 y TIM 44 forman complejos que permite el paso de la proteína. Conforme la proteína entra, el péptido es reconocido y se le une chaperonas que estabilizan a dicha proteína. La proteína entra y se libera de la chaperona y permite que la estructura lineal que tenia para poder atravesar el complejo TOM y TIM se pierde y adquiere su conformación típica. El péptido señal será eliminada de manera que se tiene la proteína internalizada en la matriz. Tenemos tambien la situación en la que la proteína tenga de destino el espacio intermembranoso, tendremos la secuencia que la dirige a la matriz y una secuencia interna que la direcciona al espacio intermembranoso de manera que se produce el acoplamiento, por lo que tiene la proteína HSP70 unida y el alineamiento de TOM y TIM hace que la proteína entre en la matriz. Cuando la señal de reconocimiento atraviesa TIM44 en lugar de seguir entrando se transloca hacia la membrana quedando unida a ella, de manera que queda unida a la membrana interna pero en el espacio intermembranoso y después actúa una proteasa que rompe y libera la proteína activa dentro del espacio. Hay otras proteínas que al atravesar TOM40 quedan en el espacio intermembranoso porque no aparece TIM44. Si lo que queremos es tener proteínas de membrana, una opción es que una vez que la proteína ha entrado en el espacio intermembranoso es reconocido por distintas 67

chaperonas y por la presencia de secuencias internas de transmembrana es reconocida por el complejo SAM presente en la membrana externa y la incorpora a la membrana externa quedando como proteína de membrana.

Para el caso de la membrana interna tenemos distintas opciones, la anteriormente vista, pero no actúa la proteasas por lo que la proteína queda anclada a la membrana. Si la proteína tiene varias secuencias de direccionamiento puede ser que la proteína entre completamente en la matriz pero una vez dentro las secuencias hace que se anclaje a un complejo que es Oxa quedando anclada con sus dominios transmembrana en la membrana interna. Hay otro caso que es cuando la proteína pasa al espacio intermembranoso, el canal queda bloqueado y debido a la presencia de otros complejos proteicos y que la proteína presenta numerosas secuencias transmembrana directamente se anclan desde el espacio a la membrana interna. Hay secuencias señal en cada proteína que indica a donde va cada proteína, quedando en la matriz, membrana interna, externa o espacio.

Incorporación de lípidos Los lípidos se incorporan mediante la lanzadera de carnitina. Y en la oxidación del ciclo de Krebs. Casi todos los lípidos de la membrana son importados desde el citosol. La fosfatidilcolina y la fosfatidilserina son sintetizados en el REL e intercambiados con la membrana mitocondrial (MAM, mitochondria-associated RE membrane). La fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol y cardiolipina se transforman a partir de ellos. Estos se intercambian a la membrana interna por puntos de contacto entre ambas. 

Metabolismo de esteroides Citocromo P450 o CYP11A. Formación pregenenoloma. 11 β-hidroxilasa y aldosteronsintetasa. Forman cortisol, corticosterona y aldosterona.

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Apoptosis El Citocromo C se encuentra localizado en la membrana externa. Es liberado en apoptosis al citoplasma en la ruta intrínseca. Bcl-2 bloquea, y Bax induce su liberación.

Reproducción mitocondrial En 1963 se demuestra la división de las mitocondrias mediante radioactividad. Se produce por un mecanismo similar al bacteriano: bipartición, estrangulación o gemación. Las mismas proteínas se encuentran en algunos protozoarios. En animales superiores está mediado por dinamina. En humanos todas las mitocondrias proceden de la madre. La replicación del DNA mitocondrial es independiente del nuclear.

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CLOROPLASTO. Los primeros organismos eran heterótrofos, compuestos de carbono, complejos y realizaban la fermentación, y posteriormente la respiración aeróbica mitocondrial. Uso de CO2, autótrofos. La energía proviene de: -Compuestos inorgánicos (NH3, H2S): Quimioautótrofos. -Luz. Fotoautótrofos. Plantas, algas, algunas bacterias. Organismos fotosintéticos.

Tipos de plastos o plastidios (todos igual genoma y doble membrana) -Proplastos: indiferenciados. Pueden dar lugar a cualquier tipo -Etioplastos: proplastos que se diferencian en oscuridad, tienen estructuras tubulares y precursores de clorofila (protoclorofila) -Cloroplastos: tienen pigmentos (clorofila) y realizan la fotosíntesis -Cromoplastos: tienen pigmentos, no realizan la fotosíntesis -Leucoplastos: incoloros, almacenan sustancias: ·Amiloplastos  Almidón. ·Oleoplastos (elaioplastos)  Aceites. ·Proteinoplastos  Proteínas. 69

OLEOPLASTOS

AMILOPLASTOS

Características y estructura Los cloroplastos tienen hasta 10µm de longitud. Se dividen como las mitocondrias por fisión. Están formados por una membrana externa con porinas para el paso de moléculas hasta 10kDa. Hay un espacio intermembranoso. La membrana interna es impermeable a iones. La membrana tilacoidal es la encargada de la fotosíntesis. Está formada por los tilacoides de los grana, los tilacoides del estroma y lumen o espacio tilacoidal. En el estroma se encuentran enzimas, DNA y ribosomas.

Fotosíntesis: cesión de electrones de baja energía del agua y conversión en alta energía por acción de la luz, se forman NADPH y ATP para la síntesis de compuestos orgánicos. -Fotosíntesis anoxigénica: CO2+ H2S → (CH2O) + H2O + 2 S -Fotosíntesis oxigénica (cianobacterias): CO2+ H2O → (CH2O) + O2. Hace 2700 millones de años. La fotosíntesis es un proceso que necesita energía: la luz. Los cloroplastos oxidan el agua para dar oxígeno. Es inverso a la mitocondria. En 1930 Van Niel propuso la fórmula general: CO2+ H2A → (CH2O) + H2O + 2 A. Posteriormente se comprobó que el O2 provenía del agua. La fotosíntesis tiene dos fases: -La fase dependiente de luz en la que la energía lumínica se usa para formar ATP y NADPH. -Independiente de luz en la que se sintetizan azúcares a partir de CO2.

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Las hojas verdes contienen clorofila, el pigmento fotosintético. La clorofila tiene un anillo de porfirina con Mg2+, el cual capta la luz azul. También tiene una cola de fitol que le sirve de anclaje a la membrana tilacoidal. Hay distinto tipos de clorofila: - Clorofila a: En organismos fotosintéticos. En sulfobacterias no. - Clorofila b: En plantas y algas verdes. - Clorofila c: En algas marrones, diatomeas y algunos protozoarios. - Bacterioclorofila: En bacterias verdes y púrpuras. Los carotenos son pigmentos accesorios que recogen el exceso de electrones y energía protegiendo las hojas del daño oxidante. La luz excita los electrones de la clorofila aislada y la vuelta al estado basal emite fluorescencia. Esto no ocurre con tilacoides o cloroplastos completos.

Unidades fotosintéticas o fotosistemas: - Complejo antena: Complejo de proteínas, clorofila y carotenoides. La clorofila capta la luz (fotones) y transfieren la energía, pero no e-, al centro de reacción mediante transferencia de energía por resonancia. Los carotenoides protegen a las clorofilas de la oxidación. - Centro de reacción: Pareja especial de clorofilas que recibe gran cantidad de energía y emiten un e- de alta energía (queda con carga positiva) a una molécula aceptora y recupera un e- de baja energía (del agua). 71

Fotofosforilación: - Flujo de electrones en Z descrito por Hill y Bendall - La energía se transfiere en 2 etapas. P680 y P700 - Gradiente de protones usado para generar ATP

Fotofosforilación no cíclica - Citocromo b6-f es parecido al de las mitocondrias. Sirve como bomba de protones. - Es inhibida por algunos insecticidas.  Derivados de urea y triazinas bloquean las pastoquinonas.  Diquat y Paraquat (gramaxone) inhiben la ferredoxina-NADP reductasa.

Fotofosforilación cíclica - No forma NADPH. - Los e- pasan del FSI al complejo citocromo b6-f que bombea protones. - Mayor obtención de ATP.

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Fijación de CO2 - Ciclo de Calvin. 6 CO2 + 18 ATP + 12 NADPH. Requiere mucha energía. - Se le llama fase oscura por no necesitar luz. - Fases:  Fijación de carbono. Rubisco. Enzima más abundante de la Tierra. Condensa un CO2 con la ribulosa-1,5-difosfato (RuBP) para generar 2 moléculas de 3-fosfoglicerato (PGA) (plantas C3).  Reducción del PGA mediante el NAPH y formación de gliceraldehído 3-fosfato (sale al citosol para forma sacarosa o se guarda como almidón en cloroplasto).  Regeneración de RuBP. Necesita ATP.

Fotorrespiración La Rubisco no solo se encarga de la fijación de CO2 sino que puede usar otro sustrato como es el O2. En el caso de que use O2, transforma la RuBP en fosfoglicolato y este en glicolato, de modo que en el cloroplasto el glicolato no sigue una vía normal sino que para ser transformado tiene que translocarse al peroxisoma donde formara glioxilato, que viaja a la mitocondria formando glicinas que formaran CO2 liberando amonio formando serina que sigue el camino opuesto llegando al peroxisoma donde se modifica formando glicerato que se transloca al cloroplasto que forma fosfoglicerato. La Rubisco genera fosfoglicerato si une CO2 y si une O2 tambien lo forma pero tambien sigue la ruta del glioxilato, desprendiéndose CO2 en el balance completo de esta reacción. La afinidad de la Rubisco por un sustrato u otro depende de los niveles internos de CO2 y de O2, de manera que si hay exceso de iluminación se producen muchas moléculas energéticas acelerándose el ciclo de Calvin que fija CO2, por lo que descenso la concentración de CO2 aumentando por tanto la de O2, activándose la enzima Rubisco que fija mayor cantidad de O2. En este caso se consume energía y se produce por tanto una pérdida de energía, pero se consigue generar CO2. Además tambien se utiliza como protección de la celula, de modo que si la celula está muy activa se está formando en el interior celular mas oxigeno y se elimina por esta vía.

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Plantas C4 Hay plantas que se han especializado en la forma que realiza esta fotorrespiración, que es lo que ocurre en plantas C4. En estas plantas lo que ocurre es que tienen concentraciones de CO2 muy bajas por lo que los estomas están cerrados para evitar la pérdida de agua, evitando la entrada y salida de gases por lo que la cantidad de O2 aumenta. En este caso el CO2 es controlado en las células del mesófilo que hay justo el epitelio, es fijado y transformado en acido málico que viaja a través de poros celulares a las células de la vaina y libera CO2 el cual se incorpora en el ciclo de Calvin formando pirúvico que va a las células mesófilo formando el fosfoenolpiruvato. Estas plantas fijan todo en forma de un compuesto orgánico que se libera en la celula adyacente, por lo que en la celula de la vaina aumenta la concentración de CO2.

Plantas MAC (metabolismo acido de las crasuláceas) Las plantas MAC lo que hacen es lo mismo que en C4 pero no lo realizan en dos células diferentes sino en una misma celula. Lo que hacen es diferenciar una fase liberadora de CO2 y otra de O2. Durante la noche, cuando la temperatura es más baja se abren los estomas y se realiza el intercambio. El CO2 es fijado durante la noche formando el málico. Cuando los estomas se cierran por el día se libera el CO2 que es fijado en el ciclo de Calvin.

Incorporación de proteínas Las proteínas de los cloroplastos al igual que en la mitocondria, estas se sintetizan en ribosomas libres y tienen que ser incorporadas a su destino dentro del cloroplasto. Las proteínas que van a la membrana interna externa o matriz siguen un proceso similar al mitocondria. Es un proceso de baja energía donde se le une a la proteína una chaperona que es reconocida por un complejo proteico que la transloca al interior del cloroplasto. Hay un complejo proteico que forma un canal y se conoce como TOC, que se abre y justo debajo hay otro canal que es TIC, por lo que si queremos que la proteína pase al interior debe haber un alineamiento entre TOC y TIC pero si no se quiere que se introduzca, el alineamiento no se produce, por lo que la proteína queda en el espacio intermembranoso quedando la proteína en la membrana interna o en la externa. En esta incorporación se puede requerir de ATP o GTP. A diferencia de mitocondria, hay un compartimento membranoso adicional donde hay una serie de proteínas. Cuando la proteína llega a la matriz por una secuencia señal que hay en el extremo carboxilo, cuando se escinde, hay una secuencia externa de marcaje que hace que esa proteína vaya al tilacoide, de manera que la proteína va a formar parte de la membrana tilacoidal o del lumen. La proteína si forma parte del lumen va a tener un complejo proteico que le permite translocarse por la existencia de un poro. De modo que hay dos rutas, una que implica a una familia de proteínas conocidas como SEC en un proceso que depende de ATP y otras proteínas siguen otro translocador denominado TAT que su energía es generada por un gradiente de protones. En el caso de la proteína de membrana, esta se incorpora a la misma membrana por dos mecanismos, bien sea por inserción espontanea (por la existencia de dominios hidrofobicos que le permite incorporarse a la membrana, sin requerir energía) o bien un proceso dependiente de energía que será mediado por una receptor de membrana que va a reconocer a una proteína que se le una a esta proteína inserta en la membrana (sistema SRP, que es similar al sistema que hay en el RER).

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Metabolismo lipídico Los cloroplastos están implicados en el metabolismo lipídico, al igual que en mitocondrias. Los fosfolípidos de la membrana externa e interna son intercambiados por translocasas desde el REL y en el cloroplasto se sintetizan casi todos los ácidos grasos de la celula, por lo que son importantes en el metabolismo de ácidos grasos de modo que hay una serie de reacciones de síntesis a partir del piruvato formando acetil-CoA y van a ir ciclándose aumentando el número de carbonos y formando ácidos grasos. Estos ácidos grasos salen del cloroplasto y van a formar los distintos fosfolípidos gracias a las enzimas sintetizadoras de fosfolípidos presentes en la membrana externa de RE. El acido graso libre se forma en el cloroplasto y los fosfolípidos se sintetizan en el REL. -

PEROXISOMA Son orgánulos membranosos de 0’2 hasta 1μ de diámetro, y suelen ser esféricos. Pueden presentar un contenido muy electronodenso o poco electronodenso con cristales de distinto tamaño en su interior. Son similares a los lisosomas pero su síntesis es muy distinta ya que los lisosomas se forman siguiendo la ruta del RER, complejo de Golgi y formación de lisosomas y todas sus proteínas provienen de ribosomas libres. Los fosfolípidos del REL mediante translocasas forman los fosfolípidos de la membrana. Están implicados en el metabolismo oxidativo y se conocen así porque su primera actividad era la síntesis y degradación de peróxido. Están tanto en células animales como vegetales y su origen es compartido con mitocondrias y cloroplastos en cierta medida, ya que existen crecimiento y división por fisión, pero algunas se forman como vesículas del RE y por incorporación de proteínas van creciendo y se dividen formando más peroxisomas Están implicados en múltiples funciones como la oxidación de ácidos grasos de cadena larga pero en estas etapas no se forma energía, por ejemplo si son ácidos grasos de 22 carbonos no pueden ser oxidados por las mitocondrias directamente de modo que estos ingresan en el peroxisoma y por una serie de reacciones se van retirando carbonos hasta generar moléculas mas pequeñas, que si que pueden viajar hasta la mitocondria y ser oxidadas por estas. Tambien son importantes en la síntesis hepática de colesterol y ácidos grasos. Tambien están implicados en el metabolismo de compuestos nitrogenados, de modo que a partir de compuestos nitrogenados como en la oxidación de aminoácidos se van degradando los aminoácidos de forma que no sean tóxicos y se va formando peróxido de hidrogeno que será eliminado por acción de la catalasa. Tambien se eliminan algunos compuestos tóxicos que van a ser oxidados dentro del peroxisoma permitiendo que sean o no solubles o bien que pueda sacarse o recuperarse parte de ellos. También están implicados en la síntesis de plasmalogenos (fosfolípidos que tienen un acido graso unido al glicerol y sin importantes en vainas de mielina).

Peroxisomas y glioxisomas vegetales Los peroxisomas vegetales aparecen generalmente asociados a mitocondrias y cloroplastos ya que intervienen en el metabolismo de la fijación de CO2 implicándose en la fotorrespiración. Tambien aparecen unos peroxisomas especiales conocidos como glioxisomas que abundan en semillas y lo que usan es la glucosa que se genera a partir de ácidos grasos por rutas de glioxilacion, es decir, utilizan los productos de la degradación de ácidos grasos para obtener energía rápidamente.

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Incorporación de proteínas Las proteínas de peroxisomas se incorporan de forma similar a mitocondrias y cloroplastos, es decir, son sintetizadas por ribosomas libres y se interiorizan por poros y canales. La mayoría de proteínas tienen un extremo carboxilo con una secuencia serinalisina- leucina. En este caso hay una familia de proteínas conocidas como peroxi-peroxinas. Hay un receptor de peroxina que reconoce la secuencia señal que es reconocida por una peroxina de la membrana que interacciona con un complejo de peroxina que se abre y forma un poro por donde entra la proteína. Esto es lo que pasa con la catalasa, que es reconocida por un receptor y va al peroxisoma.

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TEMA 6. EL NUCLEO CELULAR 1. INTRODUCCION El núcleo es el orgánulo más grande y fue el primero en observarse por primera vez con microscopia óptica, en 1700 por Leeuwenhoek estudiando eritrocitos de salmón. Suele existir un núcleo por celula pero hay células que tienen varios como los osteoclastos o músculos esqueléticos, etc. Se vio que el volumen del núcleo y de la celula guardaba una relación muy estrecha, y en cada celula, este volumen independientemente del estado de la celula solía estar aumentado. Se puede calcular el volumen celular que depende del volumen celular y del núcleo. Si el volumen del núcleo aumentaba por duplicación del ADN y el de la celula no lo hace siempre se producía una división. El volumen del núcleo aumenta en función de la cantidad de ADN, numero de cromosomas, duplicaciones del material genético, si este material esta mas o menos condensado etc. Su forma varia con la celula pudiendo ser esférico, alargado, cubico, etc. y su posición varía en función de la función y forma de la celula, pudiendo aparecer en el centro, en la base, en la parte apical, etc. Es la principal o la primera evidencia que pudo separar las células eucarióticas y procariotas y permite que el material genético esté compartimentalizado y permite una zonalizacion y regulación de la expresión génica. En cuanto a la estructura, el núcleo está rodeado por una envoltura nuclear formado por una doble membrana que continúa con el RE pudiendo tener ribosomas en su cara externa y forma parte del sistema de endomembranas ya que hay una continuidad entre envoltura y retículo. Hay nucleolo que son estructuras amorfas electronodensas donde ocurre la síntesis de ARN ribosomal y ensamblaje de proteínas. Tambien está la cromatina que es el ADN asociado a nucleoproteínas, que en interfase se diferenciaran dos tipos de cromatina, la heterocromatina que son masas densas generalmente periféricas y la eucromatina que son finas fibrillas dispersas. Tambien está el nucleoplasma que es la fase acuosa que contiene todos estos componentes y sales, enzimas, factores, etc.

2. ENVOLTURA NUCLEAR Es una doble membrana en forma de cisterna que separa el núcleo del citoplasma, hay una envoltura externa y otra interna. Se formo a partir de una vesícula del RE que engloba al material genético. Tenemos una membrana externa que tiene, al igual que el RER, ribosomas adosados a una membrana que presenta un espacio de 25 a 40 nm y la membrana interna tiene unida una serie de proteínas que son las láminas donde tenemos la lamina A, B1 B2 y C que son filamentos intermedios. Estas láminas forman una red. Estas láminas no interaccionan directamente con la envoltura interna sino que lo hacen por una serie de proteínas como LAN, LBR, MAN1, emerina, otefina, nesprina, etc. Son una serie de proteínas que unen la red con la envoltura interna de la membrana y van a unir el material genético (cromatina), es decir, se va a formar una red que va a unir todas las estructuras.

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Funciones La lámina nuclear se está formando y destruyendo continuamente, permitiendo regular el tamaño del núcleo (si la red está más laxa o sus laminas estén más próximas o lejanas permiten que la red sea moldeable, por lo que el núcleo puede aumentar o disminuir de tamaño). Sirven para anclar la cromatina a la envoltura. Además cuando se produce la muerte celular por apoptosis, estas láminas son degradadas por las caspasas. Tambien están implicadas en la división celular, de manera que en células en interfase aparecen las láminas y todo el material genético disperso en el núcleo. En una celula que se está dividiendo vemos que no aparecen las láminas. En profase las láminas son fosforiladas y quedan toda la envoltura nuclear desorganizada y el material genético que se va condensando y la fosforilacion se produce por el factor activador de mitosis, las laminas una vez desorganizadas forman dímeros y tetrámeros de lamina A y C y fragmentos de lamina B que constituyen la primera fase de nucleacion. En telofase son desfosforiladas las laminas y empiezan a organizarse fragmentos de laminas A y C y fragmentos de lamina B junto con fragmentos dispersos por el citoplasma de la envoltura nuclear empezando a rodear los cromosomas y se fusionan englobándolos.

Poros nucleares o complejo del poro Existen una serie de complejos proteicos que forman un poro que permite la entrada y salida de material al núcleo, de manera que va a ser fundamental en la comunicación núcleo-citoplasma. Hay entre 3000-4000 poros por celula pero su número va a depender de la actividad transcripcional. Estos poros tienen un diámetro de unos 120 nm, es decir, 30 veces más grande que un ribosoma, pero presenta solo un poro funcional de unos 9 nm de diámetro, el resto es el complejo proteico. Los poros tienen múltiples proteínas, se organizando formando un octamero y tenemos una serie de proteínas que se unen a la membrana nuclear donde hay una proteína de anclaje que se integra en el espacio entre las 2 membranas, una proteína columnar y una radial unida a esta columnar. Además tenemos distintos tipos de proteínas en la membrana interna como en la externa. Existen además otras proteínas que forman un anillo interno y otro externo. En las proteínas del anillo interno y externo cuelgan unas proteínas filamentosas hacia el interior y exterior. Las que van al interior forman gracias a la unión de nucleoporinas forman una especie de bolsa de manera que la apertura e interacción de la molécula al interactuar con las proteínas radiales y las filamentosas de una cara y de otra van a permitir que la molécula se transporte correctamente. A la hora de visualizar estos poros se usa ME mediante diversas técnicas como:

- MET:

- Criofractura (se permite separar las 2 membranas del núcleo y se usa sombreado metálico):

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- Tinciones negativas (pudiendo observar los octameros):

- ME de barrido:

Los poros son fundamentales para el transporte de partículas que será un transporte bidireccional permitiendo la entrada de proteínas principalmente, como proteínas nucleares, factores de crecimiento, hormonas, etc. Y permite la salida de ARNm, ARNr y las subunidades ribosomales. Este transporte va a ser pasivo o activo. - Pasivo: Permite el paso de proteínas de hasta 50 KDa, de manera que dependiendo del tamaño el paso por el poro va a ser más o menos rápido, una molécula pequeña pasa rápidamente y una grande llegara a tardar hasta 30 minutos. - Activo: Mediado por receptores y se consume energía. Las proteínas entran y salen al núcleo porque parte de su secuencia presenta una secuencia señal que la direcciona, las que entran presentan una secuencia de entrada (Pro-pro-lys-lys-lys-arg-lys-val) y otra de salida (Leu-ala-ley-lys-leu-ala-gly-leu-aspleu). Esta señal se ha visto que se localiza en el núcleo pero si se delecciona el extremo carboxilo esta proteína esta en el citoplasma y si se delecciona el amino esta señal permanece en el núcleo por lo que se ve que la secuencia de la proteína esta en el extremo carboxilo. La proteína presenta componentes en el citoplasma necesarios para el transporte.

Poros nucleares. Transporte proteínas Estos componentes o receptores pueden ser de dos tipos, las importinas y las exportinas. Además, las fibrillas en jaula, son ricas en fenilalanina y glicina y gracias a estos dominios interaccionan con los receptores. Es necesaria una GTPasa que se va a unir al complejo proteína-receptor, de manera que siempre hay un gradiente de estas proteínas GTPasa en forma GTP o GDP y de las proteínas accesorias que intercambia el GTP por GDP. RAN-GDP y la proteína activadora estará siempre en una concentración mucho mayor en el citoplasma, mientras que Ran-GTP y la proteína GEF estará en el núcleo. Para transportar una proteína se une el receptor con la proteína atravesando el poro con la proteína Ran-GDP, antes de atravesar el poro, el GDP es hidrolizado y cambiado por GTP de manera que si no hay intercambio, la proteína no termina de atravesar el poro, por lo que se libera el receptor de la proteína al unirse el GTP a la proteína. Para la importación ocurre lo mismo pero al revés.

Poros nucleares. Factores de transcripción Tambien ocurre con los factores nucleares como por ejemplo ocurre con la translocacion del factor NF-AT que es el factor de linfocitos T activados que al activarse los linfocitos, hay un factor citosolico fosforilado es desfoforilado y unido a la calcineurina y al desfosforilarse se separa y hace que la proteína se pueda translocar pudiendo ser importada al núcleo, de manera que una vez en el núcleo se 79

une al ADN e induce la transcripción. Cuando la celula deja de ser activada, este factor nuclear se vuelve a fosforilar por lo que la región de importación queda inactiva y la proteína calcineurina se desprende quedando libre el dominio con una región NF que es una señal de importación, pudiendo ser importada la proteína.

Poros nucleares. Hormonas esteroideas Las hormonas esteroideas pueden encontrarse libres o bien unidas a una proteína de unión. Si están libres pueden atravesar libremente la membrana o gracias a un translocador. Una vez la hormona en el citoplasma, en el caso de glucocorticoides, el receptor esta en el citosol que va a unir a la hormona y se activa. Estos receptores se encuentran acomplejados con proteínas de choque térmico y se mantienen en el citoplasma, de manera que una vez que se une la hormona, sufre el receptor un cambio conformacional haciendo que no interaccione con las proteínas de choque térmico, que al separarse, una de las zonas que está unida a HSP90 queda libre y una de estas regiones presenta un región de importación. El resto de hormonas pueden atravesar mediante los poros o por la membrana libremente y llegar al núcleo. En el núcleo hay un receptor de esta hormona de manera que una vez dentro reconocen al receptor y se activan desempeñando su función, por lo que solo en los glucocorticoides existe un complejo hormona receptor.

Poros nucleares. Salida de ARN En cuanto a la salida de ARN, se tienen distintos tipos. - ARN transferente y el interferente (mini ARN): Utilizan un mecanismo de salida igual al de proteínas, con exportinas y Ran-GTP. - ARNm: Tiene un mecanismo para salir independiente de exportina de manera que simplemente sale por la interacción de un complejo proteico que se une con el ARNm y unas proteínas puente que interaccionan con las proteínas fibrilares y conducen la exportación del ARNm sin necesidad de energía. - ARNr: Se procesa y se le une todas las proteínas ribosomales formándose las subunidades 40S y 60S en el núcleo y estos complejos son los que salen fuera. En este caso tambien se usa importación con gasto de energía y es fundamental la unión de la proteína al complejo CRN1

3. CROMATINA Y CROMOSOMAS El material genético no está aislado sino que está formado por ADN en forma lineal. Esta estabilizado por una serie de proteínas estabilizadoras que están implicadas en el empaquetamiento del ADN y que son las histonas. El ADN se puede teñir con distintos tipos de colorantes como básicos ya que es una estructura acida, o con tinción Feulgen, verde metilo o ioduro propidio, etc. El ADN está asociado con distintas proteínas como son las histonas donde hay 4, la H2A, H2b, H3 y H4 que están muy conservadas a lo largo de la filogenia y se unen formando una unidad estructural junto a la ADN que son los nucleosomas. Los nucleosomas es la unidad mínima a la que se asocia el ADN y las proteínas. Hay otras histonas como son la H1 que forma parte de la cromatina pero esta histona esta menos conservada que la anterior y no forma parte del nucleosoma pero es necesaria para el ensamblaje. Estas histonas son proteínas muy básicas y se sintetizan en la fase S o de síntesis de ADN. En algunas células estas histonas son sustituidas por unas proteínas que cumplen la misma función y son las protominas. Además existen otras proteínas que son casi todas ellas acidas y son sintetizadas durante toda la vida celular. Estas proteínas son las nucleoplasmina que se une a H2A y H2B, las proteínas N1 que se unen a H3 y H4, el antígeno nuclear de proliferación, implicado en reparación y replicación de 80

ADN, la ADN sintetasa y la histona acetilasa, entre otras. Estas proteínas están implicadas tambien en el empaquetamiento de la cromatina.

Eucromatina/Heterocromatina Originariamente era para distinguir el bandeado de cromosomas metafásicos. Microscopía electrónica transmisión: - Eucromatina es la cromatina laxa, generalmente central. Constituye las fibras de DNA activas (10 y 30 nm). 10% del DNA - Heterocromatina forma masas densas y generalmente periférica. Inactiva  Facultativa. A veces se expresa y otras se condensa. Según el tipo celular  Constitutiva. Nunca se expresa - Clasificación según el número de repeticiones  DNA secuencia únicas. 70%, transcrito a RNAm (es eucromatina en células que lo expresan y heterocromatina en las que no)  DNA moderadamente repetitivo. 20%, corresponden con secuencias de genes en tándem como las histonas, RNAr, RNAt, etc. Forman eucromatina o heterocromatina facultativa  DNA altamente repetitivo (satélite). 10%. Forma heterocromatina constitutiva:  DNA satélite: Hasta 100 pb repetidas 1 millón veces. En los centrómeros  DNA minisatélite: 15 pb repetidas hasta 1000 veces  DNA microsatélite: 2-5 pb repetidas hasta 100 veces

Cromatina interfásica - Nucleosoma. Octámero de histonas que interacciona mediante Lys y Arg (Aa positivos) con el DNA. 1 ¾ de vuelta (140 pb) y 60 pb internucleosómicas. - Fibra 10 nm, cromatina en estado funcional de replicación o transcripción. - Fibra 30 nm. Se forma espiral de 6 octámeros gracias a fosforilación de H1 e interacción de H4 internucleosómicas.

Cromatina metafásica. Cromosomas - La fibra de 30 nm se pliega formando dominios de bucles, espirales y el cromosoma. - Condensinas son importantes en este plegamiento. - Eliminadas las histonas queda un armazón proteico en cada cromátida que se une por el centrómero formado por proteínas de alta mobilidad (HMG).

Regulación del empaquetamiento Modificaciones de las histonas nucleosomales afecta a la estructura, replicación y transcripción (epigenética). - Acetilación. Evita interacción con el DNA, protege acción Dnasas y favorece la expresión génica - Fosforilación. Evitan la interacción con el DNA - Metilación. Induce desacetilación e inhibe la expresión - Ubiquitinación. Degradación de las histonas y liberación del DNA 81

Regiones del cromosoma metafásico - Cromómeros: Zonas de la cromátida con mayor condensación del DNA, generan un bandeado al teñirlos con Giemsa - Centrómero. Constricción primaria vista la microscopio óptico, contiene heterocromatina constitutiva con histonas desacetiladas y metiladas (no expresión). Se le asocia un complejo multiproteico denominado cinetocoro por el que se unen los microtúbulos - Organizador nucleolar. Constricción secundaria, no visible al MO, consta de fibrillas - poco densas con empaquetamiento diferente al resto del cromosoma. En interfase dará lugar a la formación del nucléolo - Telómeros. Extremo del cromosoma, permite la correcta replicación de TODO el DNA y el espacio físico para que se una la DNA polimerasa y replique en dirección 5’-3’. Consta se secuencias repetitivas cortas que sirven de anclaje a los RNA cebadores, se replica gracias a la telomerasa (actividad RNA polimerasa) que evita el acortamiento del tamaño de los cromosomas en las divisiones. Presenta actividad en células madre y no en las que presentan vida limitada y no se dividen.

4. EL NUCLEOLO Lugar de transcripción y procesamiento de RNAr y ensamblaje de ribosomas Su tamaño y número depende de la actividad y necesidad de ribosomas.

Tinción: - Principalmente acidófilo por tener RNA y proteínas ácidas, pero a veces las proteínas básicas las enmascaran y aparecen eosinófilas. - Se tiñen con pironina y no con verde de metilo ni tinción de Feulgen.

Estructura - Centro fibrilar (FC). Estructura globular muy poco densa, número depende necesidad de ribosomas, formado por fibrillas de 7-9 nm, contiene DNA y RNA. Forma el centro organizador nucleolar aunque a veces no aparece. - Componente fibrilar denso (DFC). Fibrillas de ribonucleoproteínas de 8-10 nm. - Componente granular (G). Acumulaciones ribonucleoproteínas de 25 nm. El 80% del RNA celular es de tipo ribosómico. Complejo organizador nucleolar (centro fibrilar). - Un gen multicopia (hasta 800 copias) en tándem que forma fibras con zonas mudas (sin transcripción) y zonas con transcripción. Forma de “árbol de navidad”. - Cada copia se transcribe simultáneamente hasta por 100 RNA polimerasa. - Se origina un pre-RNAr mediante RNA polimerasa I. Se le unen ribonucleoproteínas conforme se sintetizan. 45S en aves y mamíferos, 40S en anfibios, 34S en Drosophila. RNAr 5S. Origen extranucleolar, transcrito por RNA polimerasa III.

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Procesamiento de pre-RNAr 45S Excisión y formación de RNAr 5’8S, 18S y 28S. Inhibido por actinomicina D, bromuro de etidio, tiocetamida, toyocamicina. Proceso mediado por RNPsno (1 RNAsno y unas 8 ribonucleoproteínas) - Implicadas más de 300 ribonucleoproteínas. - Unos 200 RNAsno. Pequeños RNA (10-20 nt), muchos vienen de intrones del RNAm. Se unen al RNAr y dirigen a las enzimas modificadoras. Funciones: - Excisión de pre-RNA. Implicación de U3, U8 y U22 RNPsno - Dirigir las metilaciones (C/D box snoRNA) y formación de deoxiuridina (H/ACA box snoRNA).

Ensamblado de subunidades ribosomales - Entrada de proteínas ribosomales desde el citosol. - Unión a los RNAr para formar las subunidades. - Subunidad 60S. RNAr 5S, 5’8S y 28S y 50 proteínas. - Subunidad 40S. RNAr 18S y 33 proteínas. - Salida de subunidades por complejo de poros y ensamblado en el citosol.

Ciclo del nucléolo - En interfase suelen crecer e incluso fusionarse los muy próximos. - Desorganización. Profase. Disminuye tamaño, se vuelve irregular y aparecen pequeños fragmentos entre los cromosomas. - Transporte. Metafase y anafase. Totalmente fragmentado entre los cromosomas. - Reorganización. Telofase. Fusión de pequeños fragmentos y aparición de pequeñas regiones fibrilares (cuerpos prenucleares) los cuales se van fusionando y organizando para dar los nucléolos.

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TEMA 7. SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS El sistema de endomembranas son los compartimentos intracelulares relacionados con las vías biosinteticas, secretorias y endociticas. Se trata de un sistema cerrado delimitado por membranas encargado de la síntesis (de lípidos y proteínas), procesado, distribución y transporte de macromoléculas o materiales ingresados. Este sistema está formado por: 1- Retículo endoplasmatico. 2- Complejo de Golgi. 3- Lisosomas/vesículas. 4- Endosomas. Se trata de compartimentos dinámicos con un flujo coordinado continuo. Cada parte está conectada entre sí por vesículas de transporte que se desplazan por el citoesqueleto. Al llegar a su destino, las vesículas fusionan sus membranas con el compartimento receptor. Estas vesículas llevan un marcador que son unas GTPasas RAB que determinan la zona a la que tienen que ir cada vesícula. Las proteínas SNAIL son las que determinan la fusión de la vesícula y la membrana receptora. Las vesículas que salen del RE son vesículas cubiertas y se conocen como vesículas de transición que se fusionan a nivel de la cara CIS del Golgi, constituyendo la red CIS del Golgi. Después de la cisterna CIS están las mediales y después la cisterna trans a donde llegan las sustancias ya empaquetadas y bien formadas que se añaden a una vesícula saliendo fuera. Las envueltas proteicas de las vesículas son la envuelta de clatrina o las moléculas COP, que determinan el destino de los materiales.

Flujo de vesículas Todas aquellas vesículas que salen del RE que van al Golgi van recubiertas y protegidas por las proteínas COP2. El material que sale en vesículas desde la cara trans del Golgi va recubierto por la cubierta de clatrina. El COP1 se encarga del trafico retrogrado, es decir, dentro del sistema de endomembranas, no todo el sistema lleva una misma dirección, sino que dentro del mismo sistema hay un reciclado de componentes de membrana.

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1. TRANSPORTE SELECTIVO A LOS LISOSOMAS En los lisosomas convergen muchas diferentes rutas del tráfico intracelular. Según la procedencia del material tenemos: - Si procede del Complejo de Golgi participa los endosomas - Si procede de digestión intracelular podemos tener:  Heterofagia: Si se digiere material incorporado por proceso de endocitosis. La heterofagia participa en la defensa, procesamiento de hormonas o reabsorción. En este proceso participaran los fagosomas (heterofagosomas), vesículas de pinocitosis y endosomas.  Autofagia: Se produce la eliminación de partes obsoletas de la propia celula (para renovación o protección), y participa en la regulación de la secreción. En este proceso participan los autofagosomas, lisosomas y los endosomas. El resultado será la formación de un cuerpo residual de un diámetro de unos 3 μm y la formación de gránulos de lipofucsina (en el envejecimiento celular).

Marcaje de las enzimas lisosomales En el RER se produce la síntesis del precursor de la hidrolasa lisosómica, que se trata de una proteína glucosilada. Este marcaje se realizara en el compartimento cis del Golgi. Se va a producir la transferencia de una N-acetil glucosamina fosforilada de un donador azúcar nucleótido a residuos de manosa de un N-oligosacarido. El marcador en esta reacción es la manosa-6-fosfato. En el proceso intervienen la N-acetil-glucosamina fosfotransferasa, la Nacetilglucosamina P-P-U (es el portador) que adiciona fosfatos a una manosa y fosfoglucosidasa que libera la NacGlc.

2. BIOGÉNESIS DE LISOSOMAS Las hidrolasas ácidas, que deben ir a los lisosomas, van marcadas según el lugar donde vayan. En este caso el marcador es la manosa-6-fosfato. Una vez que se ha producido el marcaje con la manosa, en la membrana del Golgi se encuentra el receptor específico para esa parte de la manosa marcada. Una vez que se produce la unión lisosoma receptor se desencadena el sistema de reconocimiento de esa porción de la membrana, de forma que para poder segregar esta porción se realiza por la cubierta proteica de clatrina alrededor de esa zona. Posteriormente se produce el estrangulamiento (fusión y fisión de membrana) y tras ello se desprende de la cubierta de clatrina y llevada sobre los rieles del citoesqueleto se dirige al compartimento endosomal para producir la separación del receptor del ligando (enzima lisosomal) de manera que precisamente en este receptáculo (endosomas) y debido al pH bajo pero intermedio que poseen el compartimento de los endosomas temprano (pH de 3’4) es donde se produce la disociación de endosoma. Produciéndose la via retrograda al Golgi. Cuando se produce la envoltura de la vesícula en el PGN (receptor), para que se puedan formar las envueltas proteicas alrededor de las vesículas de transporte hace falta una proteína adaptadora y un transformador energético. En el caso de la cubierta de clatrina en PGN, la proteína adaptadora es la proteína GGA que es un polímero con varios dominios que por un lado se unen a las unidades de clatrina y por otro se unen al receptor de membrana y por otro lado se unen a esa proteína moléculas de ARF1-

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GTP, que cede la energía para que se pueda producir el complejo. En el caso de la formación de cubierta clatrina el que actúa como molécula de energía es el ARF1.

Estructura de la cubierta de clatrina La vesícula de clatrina presenta varias subunidades proteicas que son los trisqueliones que presentan 3 cadenas ligeras y 3 pesadas que tienen una disposición espacial formando una especie de gancho que se dirige hacia abajo. 36 de estas unidades se unen de esta manera, de manera que siempre hay 2 brazos de los trisqueliones que coinciden con dos brazos del vecino. Esto forma una estructura que es la envoltura que presenta 6 hexágonos y 12 pentágonos.

Ensamblaje de los trisqueliones de clatrina El ensamblaje de los trisqueliones a la clatrina se produce por la acción de proteínas accesorias. Para que se pueda producir el ensamblaje se requieren de las proteínas adaptadoras. El extremo de cada cadena pesada forma un gancho que sobresale hacia la superficie de la membrana, donde se une con una proteína adaptadora. Los adaptadores son complejos formados por 4 subunidades. Estos adaptadores se van a unir con diversas proteínas accesorias. Se va a producir una invaginación de la membrana y se va a producir la actuación de la dinamina. La dinamina está en forma de monómeros en el citosol y polimeriza organizándose en forma de helice, por lo que se coloca alrededor de la base del cuello de la vesícula 86

polimerizando y formando un anillo helicoidal que cada vez cierra más de manera que provoca que las membranas queden contiguas y en una distancia menor de 1 nm, la bicapa lipídica se fusiona. Esto se sabe porque se ha usado un homologo que no hidroliza ATP, de manera que este homologo se va polimerizando pudiendo verse en el microscopio como una vesícula que no consigue la fusión formando un anillo alrededor. Una vez que se ha separada la vesícula se produce el desensamblado y para ello se requiere de una auxilina y de una chaperona (HSC70) que por la hidrolisis del ATP desensambla este sistema.

Fosfoinositoles: marcadores de membrana Todas estas funciones celulares que están ubicadas en membrana requieren de marcajes para determinar la ubicación y el destino. Los fosfolípidos de membrana pueden actuar como marcador y estos son los fosfoinositoles (PIP). El fosfatidilinositol (PI) puede sufrir ciclos rápidos de fosforilacion estando en posición 3 4 y 5, constituyéndose marcadores que pueden ser reconocidos por estructuras proteicas con dominios específicos para estos. De esta manera se generan los fosfoinositoles. Estos PIP en función de la posición donde se una el grupo fosfato van a variar. Los dominios de membrana que forman vesículas de transporte o son membranas dianas tenemos: - Membrana plasmática: Tenemos PI (4,5) P2 y produce endocitosis y hay clatrina, AP2 y dinamina. - TGN, gránulos de secreción y vesículas sinápticas: Tenemos PI (4) P. - Endosomas temprano: PI (3) P. - Endosomas tardíos: PI (3,5) P2. Una vez separada la vesícula del TGN esta se va a dirigir al compartimento endosomal. Para ello, para que la vesícula pueda interaccionar con la membrana del compartimento diana (endosomas temprano), necesitamos primero el reconocimiento y fijación. Para que se de este reconocimiento, tanto en membrana de vesícula y membrana diana, se requieren de unas proteínas integrales de membrana que son las proteínas adaptadoras. Estas proteínas son las pequeñas proteínas GTP-Rab y además se requieren de factores de anclaje que junto con las proteínas Rab reconocen la vesícula en la superficie de la membrana diana. Para que se produzca el acoplamiento de la vesícula con la membrana se requiere de unas proteínas que son complementarias entre sí de manera que una familia de esta familia está en la membrana de la vesícula y otra familia está en la membrana diana, estas son las llamadas proteínas SNARE. El SNARE que hay en la vesícula de transporte es el V-SNARE y el que está en la proteína diana es la T-SNARE. Estas son proteínas complementarias que hacen una interacción específica. Una vez producida la interacción, los SNARE se une estableciéndose de forma helicoidal aproximando la vesícula a la membrana del compartimento diana. Una vez producido esto se produce la fusión de membranas y para ello se necesita un factor el NSF que proporciona la energía y un vez fusionada las membranas se vierte el contenido de la vesícula en el compartimento diana.

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Para que se produzca la fusión se debe disociar el acoplamiento SNARE para lo que se usa proteínas accesorias como el complejo NSF con ATP. El compartimento donde se ha vertido todo es el compartimento endosomal.

3. ENDOSOMAS Los endosomas son estructuras de forma curiosidad, con un cuerpo con forma esférica que tiene en la superficie extensiones tubulares de unos 60 nm de diámetro y hacia su interior forman evaginaciones formando vesículas intraluminares que tienen un tamaño de unos 50 u 80 nm. Las membranas contienen muchas de las proteínas y lípidos que se usan como marcadores de dominios de transporte presentando los fosfoinositoles, proteínas RAB, bombas de protones, de manera que dentro de este sistema endosomal tenemos: - Endosomas tempranos: Son más periféricos, su pH es de 6’2, son donde se forman las invaginaciones para formar los cuerpos multivesiculares y es donde se produce la clasificación. - Endosomas de reciclaje: Estos se forman como consecuencia de la fusión de los túbulos de los endosomas tempranos que finalmente se segregan y se fusionan y se reúnen posteriormente para formar los endosomas. Estos tienen un pH de 6’2. - Endosomas tardíos: Son más centrales en el citosol y más próximos al núcleo. Su interior es mucho mas acido, presentando un pH de 5. El compartimento endosomal está relacionado con el tránsito de todas las moléculas en el sistema de endomembranas (endocitosis o autofagia). Se produce por tanto la clasificación del material que entra por endocitosis, se produce la disociación de complejos receptor-ligando dirigiéndose las moléculas al TGN del Golgi por transporte retrogrado, enviando material a la membrana por reciclaje o enviando material a los lisosomas por degradación. Los sistemas endosomales participan activamente en la señalización celular. Los compartimentos membranosos que forman todo este sistema se pudieron observar mediante el marcaje de enzimas usando compuestos que se sabe que atraviesan de forma específica algún compartimento usando las técnicas histoquímicas. Para ello se usa la peroxidasa que permite caracterizar el compartimento de endosomas tempranos. Tambien se puede hacer el marcaje de una forma parecida usando el marcaje en técnicas histoquímicas usando lectinas que reconocen glicoproteínas en la superficie de la vesícula pudiendo observar los cuerpos multivesiculares. Para ver como recorre el receptor de la manosa 6 fosfato todo su recorrido desde la salida del TGN del Golgi hasta el endosoma se usaron tambien marcaje. La composición membranosa de los endosomas es una estructura altamente dinámica de modo que lo que es la membrana de endosomas se pueden marcar dominios que son lipoproteicos de manera que en esos dominios tenemos proteínas marcadoras, proteínas RAB y junto con esto una gran diversidad y complejidad bioquímica. Los endosomas tempranos son el primero compartimento en recibir el material transportado. Estos presenta un pH de 6’3 a 6’8 y producen la disociación ligandoreceptor. Los ligandos son solubles y se van acumulando en las vesículas. Estos endosomas tienen una elevada tendencia a realizar fusión homotipica con sus iguales. En la superficie endosomal, los componentes diferenciadores Rab aparecen y desaparecen dinámicamente formando subdominios que constituyen las unidades funcionales del sistema endosomal y responsables del transporte preciso y controlado.

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Dinámica Las partículas/moléculas/receptores transportados en vesículas llegan al endosoma temprano en un proceso regulado por la GTPasa Rab5. El destino posterior de esta serán los lisosomas, el TGN o la membrana plasmática. Durante la clasificación se produce una remodelación de la membrana ya que se va a producir la formación de túbulos (material para reciclar), formación de los endosomas de reciclaje y biogénesis de los endosomas tardíos por la via de la formación de los cuerpos multivesiculares (por vesículas intraluminales) para el material a degradar. Además se va a producir la liberación de Rab5 y la unión de Rab11 y Rab7 respectivamente. Tambien se van a producir cambios en el pH, siendo en endosomas tempranos un pH de 6’3, en los cuerpos multivesiculares de 5’5 y en los túbulos de 6’7.

4. DIGESTIÓN INTRACELULAR Desde la superficie celular y a través de procesos de endocitosis se introduce materiales en el interior de las moléculas con un objetivo muy variado. En este proceso se incorporan nutrientes pero además se sabe que dentro de la interiorización interviene tambien en fenómenos de defensa, procesamiento de hormonas o reabsorción. Todo esto entra dentro de la heterofagia. Cuando se produce la interiorización por via de endocitosis se producen dos tipos de entidades intracitoplasmaticas, por un lado los fagosomas y por otro las vesículas de endocitosis.

5. VÍAS ENDOCITICAS Esto se observa en células animales, ya que en vegetales su pared no permite este tipo de comunicaciones. Las vías endociticas se observaron mediante el uso de microscopios y una serie de técnicas que se usan marcadores fluorescente o se ponen en sistemas de cultivos estudiando la sensibilidad a las drogas y la dependencia de este transporte a quinasas. La endocitosis tiene lugar en la superficie celular y en ella está implicada la membrana y el citoesqueleto Tiene lugar distintos procesos por la via endocitica como: o Interiorización de la membrana: La entrada de porciones de la membrana le sirve a la celula para el mantenimiento de la homeostasis de la membrana. o Captura del medio extracelular: De forma básica se obtienen nutrientes. o Regulación de procesos iniciados en la superficie celular: Es el proceso de señalización celular, de manera que por la via endocitica, algunas de las señales que llegan a la superficie celular y que contacta y reacciona con sus receptores específicos son incorporados en el interior celular para que continúe su acción. o Las características físicas y químicas de la molécula de carga son las que determina el tipo de vesícula endocitica (tamaño, forma y propiedades química). Los factores que se necesitan para que se produzca la endocitosis son la modificación estructura en la membrana. Además la dinámica de membrana basada en las balsas lipídicas (rafts) y tambien los diferentes tipos de endocitosis puede ser dependiente o independiente de una cubierta proteica. Por último en estos factores tambien hay que tener en cuenta el mecanismo de escisión (se tiene en cuenta que intervenga o no la dinamina). El mecanismo que tiene lugar en esta via se produce por la captura de fluidos, macromoléculas, partículas u otras células del medio extracelular mediante la formación de una vesícula de endocitosis. 89

A la hora de clasificar las vías de endocitosis podemos usar la clasificación clásica, es decir se clasifica en función de la entrada de grandes partículas o de pequeñas partículas. En función de esto tenemos: - Fagocitosis: Es la ingestión de partículas grandes, de tamaño superior a 500 nm. Las células que hacen esta factura son los fagocitos (macrófagos, monocitos, neutrofilos, osteoclastos, etc.). El proceso de la fagocitosis es un proceso regulado de manera que estas partículas deben ser reconocidas a través de ligandos que tienen en la superficie que son reconocidos por receptores activados presentes en la membrana plasmática. Para que se produzca la fagocitosis, los receptores modifican la superficie de la célula generando pseudópodos que rodea a la partícula y se produce en función de la presencia de actina. - Pinocitosis: Es la entrada de fluidos y macromoléculas de bajo peso molecular. En este caso la superficie se modifica de forma diferente, la celula forma repliegues que va capturando grandes cantidades de fluido extracelular o a través de pequeñas vesículas que son de pequeño tamaño y contorno uniforme y se produce pro invaginación de la membrana. Este proceso lo realizan todos los tipos celulares haciéndolo algunos de ellos con mayor intensidad. La via endocitica se clasifica en dos: - Macroescala: o Fagocitosis: Consiste en la ingesta de grandes partículas reconocidas por receptores y modifica la superficie celular. o Macropinocitosis: Se produce interiorización masiva de membrana capturando gran parte del medio extracelular. En ambos casos la superficie celular necesita un aporte extra de membrana. - Microescala: o Endocitosis mediada por clatrina. o Sistema de caveolas. o Compartimento endosomal enriquecido desencadenado por proteínas que se unen a los glucofosfatidilinositol. o Vías dependientes de Arf6.

Dinámica de la endocitosis Para comprenderla es necesario saber que en esos puntos de la superficie celular, en la membrana plasmática, la presencia o no de determinados componentes son los que determina que se pueda producir las invaginaciones de la membrana ya que en esas zonas están las proteínas que lo permiten, por lo que es interesante conocer la topologia de la membrana. Las vías de endocitosis son lugares de la membrana caracterizados por los dominios Raft (balsas lipídicas). Estas balsas contienen glicoesfingolipidos unidos a colesterol formando una estructura muy compacta de manera que estos glicoesfingolipidos se encuentran solo en la hemimembrana externa. Los fosfolípidos que forman parte de las balsas contienen las cadenas de ácidos grasos largas y muy saturadas lo que hace que en comparación con el resto de la membrana hace que estas zonas sean muy estables, que además por ser ricas en colesterol, determinando que la membrana deje de tener fluidez convirtiéndose en una zona estable con todo lo que hay en ella fijado a la membrana. Además en estas zonas raft se caracteriza por atraer y permitir que se incorporen proteínas específicas de manera que en las rafts hay proteínas relacionadas con las vías de endocitosis, por lo que en rafts se instalan proteínas que atraen a la cara exoplasmatica son mayoritariamente con anclajes con GIP. 90

Las proteínas unidas a la cara citoplasmática se unen a grupos miristico y palmítico (como son las flotilinas y caveolinas). Tambien otras proteínas se unen por acilacion (como la Src-tirosina quinasa). Además algunas de estas proteínas que caracterizan a estas vías de entrada se unen muy intensamente con el colesterol como las caveolinas (esta unión forma una especie de horquilla), otras se unen a los fosfolípidos como las anexinas. Dentro de las balsas siempre hay proteínas G quinasas. Estas proteínas G son especificas de cada tipo de via de endocitosis. Lo que caracteriza a una balsa lipídica es que es un compartimento de membrana que está destinado a que en el sucedan la mayoría de las más importantes acciones de las células eucarióticas y lo hace a través del cambio de composición proteica, de manera que el tipo de unión que se pueden dar en las rafts es una interacción proteina-lipido o lipido-lipido, a diferencia de la interacción que ocurre en el resto de la bicapa que es proteina-proteina.

Fagocitosis (inmunidad innata y adquirida) Para estudiar la fagocitosis ligado a la inmunidad innata y adquirida se puede hacer del siguiente modo. En la inmunidad adquirida la APC reconoce antígenos por sus anticuerpos, y en su membrana plasmática se colocan los receptores FC de modo que el reconocimiento del microorganismo se hace por receptores activados y se produce de tipo de cremallera, es decir, toda la superficie del microorganismo va a ser reconocido por los receptores. En este tipo de fagocitosis intervienen las proteínas G como es la Src tirosina quinasa. El complejo formado por la Arp2, 3 y N-WASP son los que desencadenan el cambio del citoesqueleto pues polimerizan actina formando microfilamentos de actina y hace que los que existen se ramifican ya que el citoesqueleto a través de la polimerización mueve la membrana plasmática para que rodee a la partícula suponiendo un gasto de membrana plasmática para que la celula no modifique ni su forma ni su función necesita aporte de membrana y para ello se incorpora membrana procedente del interior del citoplasma y se hace por la utilización de la ARF1 o AP1. Esto hace que gran parte del área de membrana sea desplazado hasta que se termine de cerrar produciéndose la incorporación. Hay otra via dentro de la inmunidad adquirida como es que será mediada la endocitosis por el factor Cr3b del complemento que presenta receptores C3R siendo la unión una unión focal de la partícula opsonizada. La proteína G que interviene es la PAK1. La proteína G que hace que se puedan polimerizar los microfilamentos son efectores de proteínas Rho (Rho GTP-asas). FALTA UNA PARTE

6. AUTOFAGIA Es la eliminación, por parte de la celula, de sus propios componentes. El proceso de la autofagia tiene distintas vertientes, por un lado es un aparato que permite renovar la celula y nos sirve para protegernos por la formación de proteínas mutadas por ejemplo que pueden ocasionar enfermedades. Los componentes morfológicos que intervienen en la autofagia son los autofagosomas, el lisosoma y el endosoma. La autofagia tiene mucha importancia para la supervivencia celular, sobre todo en los tejidos cuyas células han alcanzado el máximo crecimiento celular y que estas no se dividen. Es tambien importante durante las enfermedades, ya que la autofagia muestra a las células los componentes antigénicos para que pueda reconocer la celula lo que es propio de lo que no es propio. Tambien la autofagia es una buena colaboradora del cuerpo en la defensa contra los tumores, ya que las proteínas que estimulan la 91

autofagia tienen la propiedad de inhibir los canceres. En relación con las enfermedades neurodegenerativas, se produce por fallos en los degradados de proteínas, por lo que la autofagia se encarga de eliminar los agregados de proteínas que provocan estas enfermedades. En el envejecimiento tambien participan ya que las células envejecidas acumulan proteínas, orgánulos dañados, etc. Y la autofagia lo que hace es eliminar este material sobrante. Las situaciones que generan esta autofagia se puede dar por el desarrollo (cuando se produce el desarrollo embrionario se generan muchos tipos celulares con muchos componentes que actúan en solo un momento concreto por lo que se elimina y se ponen otros), tambien en los periodos de ausencia de nutrientes, o en situaciones como cuando se da un estrés en el retículo endoplasmatico, ya que se forman muchas proteínas que no se excretan por lo que se deben retirar ese exceso de proteínas. Con infecciones microbianas, estrés metabólico, o enfermedades por acumulación de proteínas. Los requerimientos de la autofagia requieren de una regulación precisa y fina del proceso y se hace en base a la expresión de unos genes, los genes relacionados con la autofagia que sintetiza unas proteínas, la Atg.

Tipos de autofagia El proceso de autofagia se encarga de la degradación de proteínas y orgánulos celulares deteriorados o productos elaborados en exceso. El destino de este material son los lisosomas pero la forma de llegar a este puede ser de dos maneras: - Macroautofagia: El material va englobado en grandes vesículas de doble membrana, pudiendo capturarse de forma no selectiva. - Microautofagia: De forma selectiva Hay distintos tipos de macroautofagia en función del material que se ha captado. Otra modalidad de incorporar el material al lisosoma por la invaginación de la propia superficie del lisosoma formando vesículas que incorpora de forma directa el material, pudiendo incorporar proteínas de forma específica o bien incorporar proteínas a granel. Este tipo de autofagia es la microautofagia. El tercer tipo de autofagia es la autofagia mediada por chaperonas (CMA) que se trata de la retirada selectiva de proteínas, que deben ser reconocidas por chaperonas. Las chaperonas que funcionan en esta autofagia es la HSC70. Es un proceso mucho más controlado y selectivo. Los tres tipos de autofagia se pueden dar en un mismo tipo celular, de modo que estos tres tipos solo se diferencian en el modo en el que el material es reconocido para realizar su descarga en los lisosomas para ser degradado.

Macroautofagia La macroautofagia ocurre en todas la células de forma constitutiva, es decir, no requiere señal. El material que queda capturado su destino es dirigirse al lisosoma para degradarlo y los componentes que se obtienen del lisosoma, salen de la superficie del lisosoma por transportadores para que la celula vuelva a utilizarlo. La macroautofagia necesita para que se pueda producir de una serie de factores que a la misma vez actúan como marcadores. En principio se necesitan: - Proteínas: Pertenecen al sistema de proteínas asociadas a autofagia (Atg9) y una proteína de membrana vacuolar (VMP1). - Complejo PI3 quinasa: Necesario para que produzca PI (3) P que se requiere para que se forme la macroautofagia. 92

- Serina-treonina quinasa ATP1: Tambien llamada ULK1 y 2. Es un complejo proteico. - Proteínas asociadas a la autofagia: En conjunto la asociación de estas forman el complejo Atg16L. El material con toda esta maquinaria se recoge en grandes vesículas de doble membrana que son los autofagosomas que tienen un diámetro de hasta 700 nm. Estas vesículas se fusionan con el endosoma tardío para degradarse.

Biogénesis de los autofagosomas La biogénesis tiene 5 etapas. Va a comenzar con la inducción. Esta etapa supone la formación inicial de una bicapa lipídica. El aporte de membrana hasta este momento no tiene proteínas, solo es una bicapa lipídica. En esta inducción a la bicapa se la conoce como membrana de aislamiento que formara el fagoforo por que la membrana actúa como centro de nucleacion de material membranoso. Aun se desconoce el origen de la membrana.

Para la formación y ensamblaje de la membrana que forma el fagoforo actúan factores como el complejo ULK1/2 que se une a la membrana de aislamiento y es necesario porque debe funcionar para que la PI3 quinasa forme y una el PI (3) P a la membrana para el reclutamiento de las proteínas Atg9 y VMP1 que son transmembrana. Todo esto es necesario para que pueda crecer el aporte de membrana para formar el autofagosoma.

El complejo Atg12, 5 y 16L es el que provoca que se unan mas trozos de membrana y provocando la curvatura de la vesícula al mismo tiempo que engloba material del citosol que queda en su interior. Por último se produce el cierre hasta que entran en contacto la membrana produciéndose la fusión y cierre, quedando formado el autofagosoma con una doble membrana que se fusiona con los endosomas y lisosomas formando un autofagolisosoma degradando el material del interior.

Ultraestructura de la macroautofagia Los orgánulos se rodean de una doble membrana formando el fagoforo que se cierra y forma el autofagosoma que se fusiona con lisosomas primarios generando un autofagolisosoma degradando el material y produciendo la salida de los materiales generados al citosol y cuando el contenido el hidrolasas acidas de autofagolisosomas 93

no dé para seguir degradando mas material se constituyen los cuerpos residuales. La mayoría de cuerpos contienen material lipídico que no puede ser degradado generando cuerpos residuales como gránulos de lipofucsina por ejemplo.

Microautofagia Consiste en la captura y degradación de porciones de citoplasma, incluido proteínas solubles del citosol. Lo que hace es formar vesículas invaginadas en la membrana del lisosoma o del endosoma tardío de forma semejante a la formación de los cuerpos multivesiculares. La captura puede ser de forma selectiva por ayuda de chaperonas citosolicas que reconocen en las proteínas secuencias señal específica. Esta microautofagia está muy bien caracterizada en levaduras ya que en mamíferos se desconoce.

Autofagia mediada por chaperonas En este caso es un mecanismo realiza la captura del citosol de proteínas de forma selectiva con ayuda de las chaperonas. La forma de reconocer las proteínas, que deben ser reconocidas para la autofagia, deben presentar un péptido señal. Aproximadamente el 30% de las proteínas solubles del citosol llevan esta péptido señal, como enzimas glucoliticas, factores de transcripción y sus inhibidores y proteínas unidas al calcio. El mecanismo mediante el cual se realiza este tipo de autofagia es primero el reconocimiento de la chaperona por el péptido señal. Este péptido señal es un pentapeptido con lys-phe-glu-arg-gln conocido como KFERQ, que es reconocido por la chaperona HSC70 que va unido a cochaperonas formando un complejo que se unen al péptido por la secuencia de la proteína. Tras ello se une a la superficie del lisosoma, al unirse a una proteína LAMP (LAMP 2A), que se polimeriza formando un complejo de translocacion. El complejo de translocacion para que se mantenga estable queda estabilizado por otra chaperona, la HSP90 que es intralisosomal. Una vez formando el complejo de translocacion se produce el despliegue de la proteína para que pase a través del complejo LAMP. La HSP70, que está dentro del lisosoma, se asegura de que pase correctamente la proteína al interior del lisosoma, y una vez dentro se produce la desagregación del complejo de translocacion, consumiendo ATP y lo realiza la HSC70. En la membrana de los lisosomas hay un dominio lipídico RAFT donde van los monómeros de la proteína que produce la interiorización de la proteína (HSC70) degradada donde son separados de la membrana por la catepsina A para ser degradados.

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Microautofagia por los endosomas tardíos Dentro del compartimiento endosomal se hace un proceso similar a autofagia y se produce en la biogénesis de los cuerpos multivesiculares, pudiendo verse que se produce una incorporación de proteínas solubles en las vesículas de los endosomas tardíos. El sistema de microautofagia de los endosomas tardíos comprende la maquinaria molecular que es común a la via endocitica y autofagia, por lo que es un proceso mediado por chaperonas debido a la acción de la HSC70 y a la acción del complejo ESCRT del I al III que es necesario para la formación de la vesícula donde se incorpora la proteína. A estas conclusiones se llega por una serie de experimentos. Primero se vio si se producían distintos tipos de autofagia en lisosomas y endosomas tardíos, para ello marcaron proteínas con isotopos radioactivos siguiendo como se transportan. Inhibieron la proteólisis en ambos orgánulos. Se observa que los lisosomas en células que no tenia inhibida la via de la autofagia mediada por chaperonas, se producía proteólisis elevada y además, cuando se hace el estudio sobre la población de lisosomas por separado se comportaba como las células que tenían inhibida la captura mediada por chaperonas. En los lisosomas la captura se hace a través de microautofagia mediada por chaperonas y en el endosoma tardío hay tambien mucha captura y proteólisis. Se vio que en los endosomas tardíos hay degradación cuando la proteína esta ya dentro del orgánulo. Se bloqueo la macroautofagia mediante el bloqueo de sus proteínas relacionadas viendo que en las células no se formaban las dobles membranas que caracterizan a los fagosomas, viéndose que no afectaba a la habilidad del endosoma tardío para interiorizar y degradar proteínas marcadas en los MVBs, por lo que se determino que se producía por microautofagia. La entrada de proteínas al endosoma tardío se desconocía si era dependiente de la proteína LAMP por lo que para ver como ocurría se inhibía su acción y se vio que se reducía el cuerpo multivesicular, disminuyendo la degradación de proteínas en los lisosomas y no afecta a los tardíos. En cuanto a la incorporación de las proteínas en el cuerpo multivesicular, se vio que al eliminar la VPS4-ATPasa se impide que se pueda disociar el complejo ESCRT por lo que no se secretan pequeñas vesículas, por lo que afecta a la proteólisis de proteínas, no afectando a lisosomas pero si afecta al cuerpo multivesicular que descendió su cantidad por celula. En cuanto a la demostración de la presencia de HSC70 en endosomas tardíos se utilizaron dos tipos de proteínas, las proteínas que tuvieran la péptida señal y las que no lo tuvieran. Se usaron como proteínas que si tenían el péptido, la GAPGH, que se comprobó que a nivel de membrana con técnicas inmunocitoquimicas con oro se comprobó que estaba la proteína en el interior de cuerpos vesiculares, realizándose un estudio de tomografía. Con esto se vio que para que la proteína pueda entrar a través de la membrana con esta señal requiere de la chaperona. Para comprobar con exactitud se incubo las células con el anti-HSC70 quedando bloqueada la chaperona, de modo que se inhibió la eficiencia de la translocacion y degradación de proteínas con la señal en el endosoma tardío. Lo que ocurre es que se puede producir una incorporación de proteínas que tienen el péptido señal con el uso de chaperonas o sin la necesidad de que la proteína sea reconducida por la chaperona. Debido a que no existe la LAMP debe existir algún 95

translocon para introducir la proteína, por lo que para determinar la existencia se usa la proteína DHFR que es una proteína que cuando se une el sistema dentro de los endosomas, la proteína contiene el péptido señal y se estabiliza su estructura para que la chaperona la pueda desplegar y se usa el MTX. Cuando se mide la incorporación de la proteína, cuando no lleva MTX pasaba a través del complejo de la LAMP pero cuando se usa el MTX no se puede introducir en el lisosoma. Pero cuando se hizo el experimento con endosomas se vio que puede entrar con MTX y sin MTX ya que en endosomas tardíos las proteínas entran sin la presencia de LAMP.

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TEMA 8. CICLO CELULAR Las células pueden tener distintos destinos como: - Proliferación: Las células entran en proceso de proliferación, es decir, producción de células nuevas por división. Es un proceso que es mayoritario cuando se produce el desarrollo embrionario, pero tambien cuando el individuo ya está formado, para que las células se puedan reponer debido a perdidas por lesiones por ejemplo. - Crecimiento: Otra de las actividades vitales de la celula es el crecimiento, que puede producirse cuando viene de haberse realizado una duplicación del contenido para dividirse para que así las células que generen tengan el contenido adecuado. Las células presentan coordinados dos sistemas en la división, debe coordinar la síntesis de materiales e inhibir los procesos de degradación. - Diferenciación: provocando el aumento de complejidad y diversidad de la celula, haciendo la celula una especialización de su función en el tejido. Cuando se especializa la proliferación de la celula disminuye. Otra actividad es el envejecimiento. - Envejecimiento: Con el paso del tiempo se van acumulando materiales y alteraciones de material genético de la celula provocando su muerte programada (apoptosis) que es la última actividad de la celula.

1. PROLIFERACIÓN Es la multiplicación celular por división de células preexistentes para producir una población celular. Es necesaria para la reproducción y desarrollo del organismo, así como remplazar las células perdidas por envejecimiento, mal funcionamiento o celular. La proliferación ocurre mediante un conjunto de procesos temporalmente ordenados (ciclo celular). La celula antes de dividirse debe retirar todos sus orgánulos y macromoléculas. Dentro de este fenómeno de duplicar los orgánulos y material se produce la copia de toda la información genética para repartirlo (replicación), después se produce una separación y distribución del material de forma cuantitativa y cualitativamente de forma correcta (división celular). Para que todo esto funcione bien hace falta una regulación. El proceso por el cual las células duplican su contenido se conoce como biogénesis, por el que se divide por mitosis. Ambos procesos deben regularse y coordinarse.

2. CICLO CELULAR El ciclo celular presenta dos periodos - Interfase: Periodo más largo del ciclo celular, de hasta el 95% y dinámico. En este periodo se duplica el ADN de forma exacta por replicación y se incrementa la masa celular por crecimiento. Esto está dividido en tres fases, la G1 que es la de crecimiento, la S y la G2. o Fase G1: Se produce el crecimiento, duplicación del tamaño, orgánulos, enzimas, etc. o Fase S: Se produce la duplicación del ADN y proteínas asociadas, formándose nuevos nucleosomas o Fase G2: Se produce el crecimiento y los cromosomas son sometidos a condensación. Se produce además la formación del huso. - Fase de división: Consta de la fase M que es la fase de división y que se produce por mitosis en células somáticas y por meiosis en gametos. Se produce primero la división nuclear que es la cariocinesis y después del citoplasma. 97

Control del ciclo celular El ciclo es una sucesión de eventos temporalmente ordenada. Una fase no comienza hasta que no se ha verificado que la fase anterior ha terminado satisfactoriamente. El ciclo se debe asegurar que los cromosomas no estén incompletos o dañados para que no sean replicados y transmitidos a las células hijas. Tambien se debe asegurar de que el genoma se replica una vez por ciclo celular y que las condiciones ambientales extracelulares e intracelular sean adecuadas. Todos estos procesos han de ser verificados y definen los puntos de control. Los puntos de control están regulados y están regulados por genes: - Regulación positiva: Son los protocongoenes que codifican proteínas como las quinasas y ciclinas dependiente. Estos van a facilitar el ciclo celular. - Regulación negativa: Son genes supresores tumorales. Estos hacen que si se detecta un problema en algunas de las verificaciones hacen que no se produzca la progresión del ciclo. Si no se superan los puntos de control la celula entra en stand-by que es la senescencia o directamente muere (apoptosis).

Puntos de control En cuanto a los puntos de control basándonos en las premisas anteriores, la celula a lo largo del ciclo, en distintos momentos se pregunta así misma. En interfase comprueba si hace suficiente factores de crecimiento en el medio, que a nivel tanto intracelular como extracelular si hay suficientes nutrientes y si el tamaño de la celula es adecuado así como si el material genético ha sido dañado de alguna manera. Si detecta alguna de estas cosas se para, de manera que tenemos el primer punto de control que es el punto G1/S (no se debe replicar un ADN dañado). El siguiente punto de control está en la fase S donde la celula comprueba que el ADN dañado no sea replicado para ello antes debe repararlo. Otro punto de control se da cuando estamos en la fase G2/M que la celula sigue viendo si el tamaño celular es el adecuado, si existe aun daño en el ADN y si la replicación del ADN no se ha completado. Por último está el punto de control M, que en este caso, la celula se asegura si la mitosis o meiosis se ha producido de forma correcta, es decir, si se forma bien el huso mitótico, si los cromosomas se unen de forma correcta o si la alineación es incorrecta.

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Regulación del ciclo celular La regulación de los puntos de control del ciclo están realizadas por diversas proteínas que actúan como interruptores bioquímicos para encender o apagar el ciclo. La célula para su funcionamiento reacciona frente a señales. Estas señales pueden ser estimuladoras o inhibidoras y dependen de la expresión de genes que actúen sobre factores de transcripción. 1. Estimuladoras: Si son estimuladores las moléculas van hasta el receptor de membrana pasando a la célula produciendo la activación de factores de transcripción haciendo que aumente la acción del ciclo celular. 2. Inhibidoras: En el caso de los factores inhibidores ocurre el proceso inverso, generan proteínas que bloquean el ciclo celular.

Las señales tambien pueden ser externas o internas. 1. Señales externas: Suelen ser factores de crecimiento, nutrientes o las condiciones ambientales. 2. Señales internas: Se produce por la acción de proteínas quinasas que son activadas cíclicamente en momentos del ciclo celular. El aumento de actividad quinasa era dependiente de ciclinas (durante la interfase desciende la cantidad de ciclina y conforme avanza la interfase aumenta la cantidad de ciclinas produciendo el aumento de proteínas quinasas).

Señales intracelulares El complejo quinasa-ciclina (Cdk) está formado por dos subunidades, la que presenta actividad quinasa que consolida proteínas diana y por otro lado la subunidad reguladora que es la ciclina. Estos complejos para poder funcionar lo hacen en base a que la quinasa este fosforilada. Para que se pueda unir la quinasa y ciclina se debe producir fosforilacion en el tirosina 161, que es activadora, o en la posición de tirosina 15, es inactivadora. Para regular la concentración de los complejos, se produce por degradación por proteólisis controlada uniendo la ciclina a ubiquitina degradándose por proteosomas. Otro tipo de control se hace por regulación transcripcional inhibiendo o activando las ciclinas. El complejo quinasa/ciclina por la regulación transcripcional se forman las ciclinas y las quinasas dando el complejo, a donde se puede unir una molécula activadora o inhibidora produciendo su actividad. La regulación de este complejo en el ciclo celular se produce del siguiente modo: 1. Para entrar en la fase S: El complejo ciclina/quinasa es necesario para entrar en la fase S. Las ciclinas G1 son las que actúan junto con las Cdk 4 o Cdk 6. Su actuación depende de condiciones ambientales, es decir, que haya suficiente factores de crecimiento. Este complejo actúa sobre la proteína Rb produciéndose la expresión de genes que permiten la entrada en la fase S. 99

2. Para la replicación del ADN: En este caso la ciclina E aparece combinada con la Cdk 2 y es imprescindible para el inicio de replicación de ADN. Además actúan las ciclinas A con la Cdk 2, que permite la duplicación del ADN ya que facilita la fosforilacion de la ciclina quinasa. 3. Para entrar en mitosis: En esta parte interviene la ciclina B junto con las Cdk 1. A este complejo se le denomina factor promotor de mitosis. Controla el paso de G2 a M.

3. FASE G1 La fase G1 está controlada por aquellos factores ambientales, como los de crecimiento, que controla la progresión del ciclo. Los factores de crecimiento desencadenan la activación del factor de transcripción E2F que activan la síntesis de ciclinas de las fases G1/S y S. El factor de crecimiento está bloqueado por la proteína Rb (procede de un gen supresor de tumores que si se encuentra mutado su inactivación conduce al desarrollo de tumores). Cuando el factor esta unido a la proteína no actúa, pero al fosforilar las quinasas se libera el factor que se traduce a ARNm y sintetiza las enzimas y proteínas necesarias para la fase S. Es un sistema que se retroalimenta. Las condiciones que impiden que el ciclo se produzca son mediante las condiciones ambientales adversas.

4. REGULACIÓN NEGATIVA DEL CICLO: GENES SUPRESORES Si en el núcleo aparece una alteración del ADN los genes supresores inducen la síntesis de proteínas que impiden que el ciclo progrese o altera la supervivencia de la celula. Los genes codifican proteínas que previenen mutaciones de genes reguladores de ciclo, que inactivan las quinasas por fosforilacion en el punto de inactivación. A través de la síntesis de proteínas inhibidoras como las CKI tambien actúan, por acción del Rb por el p53 y por las proteínas proapoptoticas (favorecen la muerte celular programada). 100

La pérdida de la actividad de los genes supresores para hacer la síntesis de todas estas proteínas supone una mutación tan grave que desencadena una neoplasia. Las proteínas inhibidoras que se unen a los complejos ciclinas quinasas. Hay de dos familias, las Cip/kip y las lnk4. Cada una de estas familias presenta un complejo ciclina quinasa y afecta a una fase del ciclo celular.

5. GEN RB: CROMOSOMA 13 HUMANO El gen Rb esta en el cromosoma 13 humano y codifica una fosfoproteína (la proteína Rb) que inactiva al factor de transcripción E2F. Si se fosforila esta Rb se libera E2f. La Cdk4, 6/clnD es la que fosforila Rb. La proteína Rb unida al factor de transcripción reprime la actuación para la traducción a ARNm y la aparición de proteínas imprescindibles para la replicación. Cuando la ciclina D es unida a quinasa 4, la proteína queda libre, actuando el E2F como factor de transcripción formando toda la proteína necesaria para la transcripción. Los inhibidores inhiben la fosforilacion, por lo que se inactiva el complejo ciclina quinasa por lo que el ciclo celular no progresa y se detiene en el punto G1 reprimiéndose la transcripción de genes.

6. PUNTOS DE CONTROL La celula se debe asegurar de que su genoma será transmitido a sus hijas de forma correcta. Si la celula no es capaz de superar los puntos de control puede provocar la senescencia o la apoptosis. Una de las decisiones drásticas que el sistema de control puede adoptar es que la celula se retire completamente del ciclo y se interrumpa la división celular indefinidamente. A esta decisión es lo que se conoce como senescencia.

Senescencia celular La senescencia celular es un programa que la celula activa en respuesta a diferentes situaciones de estrés, y cuyo objetivo es prevenir la proliferación celular, deteniendo el ciclo celular en la fase G1, ingresando indefinidamente en G0. En G0, el sistema de control del ciclo se encuentra en gran medida desmantelado, por desaparición de muchas Cdk y ciclinas. Hay distintos tipos de senescencia: - Senescencia replicativa: Por la erosión de los telomeros. - Senescencia por ambiente desfavorable. - Senescencia por daños en la cromatina. - Senescencia inducida por oncogenes. - Senescencia prematura inducida: Que puede ser: o Por estrés oxidativo o Por radiaciones. En general las señales desencadenantes de la senescencia es el acortamiento de telomeros, daños en al cromatina, estrés oxidativo, expresión de oncoproteinas activadas, falta de nutrientes o factores de crecimiento o bien por contactos celulares inapropiados.

Senescencia replicativa Es un fenómeno que se da en las células en el momento que alcanzan el límite Hayflick y dejan de dividirse. Tras unas 50-60 duplicaciones poblacionales las células dejan de dividirse pero no mueren. Estas células permanecen vivas metabólicamente alteradas y su ciclo celular se interrumpe de forma indefinida quedando detenido en la fase G0/G1 debido al acortamiento de los telomeros. Las células no responden a estímulos proliferativos y las células no se receptivas a estimulas apoptoticos. 101

Los telomeros son áreas especializadas que previenen la degradación del cromosoma. El ADN de los telomeros no se transcribe y contiene secuencias TTAGGG repetidas en tándem 100-1500 copias (3-15 kb). Hacen un bucle, formando una estructura circular y está asociado a varias proteínas (casquete) que protegen los extremos. Durante la replicación, en ADN lineal, desde el punto de origen de transcripción se realiza la transcripción de una cadena de forma correcta y el otro de forma inversa mediante el uso de fragmentos de Okazaki. Cuando se termina la copia, la cadena copiada va a perder un fragmento de su cadena, que si se repite en sucesivas divisiones, las células hijas van a presentar un ADN más corto cada vez, haciendo que cuando llegue a un tamaño predeterminado la celula lo percibe como un daño en la estructura del ADN provocando la lisis. Se conocen tipos celulares que son inmortales como las células germinales, las células stem cells y las tumorales. Todas expresan telomerasa, que es un transcriptasa inversa que usando un molde de ARN es capaz de crear e insertar fragmentos telomericos. Las células somáticas NO expresan telomerasa. Su potencial de proliferación va a estar relacionada con el número de veces que se han dividido. Eventualmente, el acortamiento de los cromosomas, en las sucesivas divisiones conlleva la senescencia celular, cesando las divisiones celulares al detener el ciclo celular en G0/G1. Las células tumorales sobre expresan telomerasa. Estas células poseen telomeros cortos y estables que las hacen inmortales pudiendo replicarse indefinidamente. Los telomeros son el factor limitante que determina la duración de la vida.

P53: Cromosoma 17 humano El p53 se expresa en el cromosoma 17 humano. Este codifica la p53 que es un factor de transcripción actuando sobre ADN dañado. En las células sanas los niveles de p53 están en proporción muy baja. El que haya una alta concentración induce a genes que detienen el ciclo celular o bien produce la muerte celular (apoptosis). El p53 es precioso a la hora de valorar el daño que existe en el material genético. Este es capaz de discernir entre daños leves que sean reparables (por acción del gen Mdm2 que forma la proteína Mdm2 que elimina el p53 mediante la ubiquitina. El p53, si la situación no se revierte, se debe fosforilar de manera que regula la síntesis de p21 provocando la detención del ciclo celular en G1. Si el daño es grande y no es reparable, se produce apoptosis para que el organismo no pierda el control del ciclo. La retirada de esta celula/material genético se produce por inhibición de Bcl-2 o por estimulación de Bax. En el caso de que el daño sea grave y no reparable la celula no puede responder ante esto por lo que se produce neoplasia. Las mutaciones del gen que codifica p53 conllevan la pérdida de su función, no se produce la paralización del ciclo G1 aunque el ADN haya sido dañado y no hay eliminación de la celula del tejido por muerte celular. La herencia del ADN dañado causa inestabilidad en el genoma contribuyendo en el desarrollo de cáncer en humanos.

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Sistema de control del ADN dañado Hay distintas situaciones que alteran el ADN, como la radiación ionizante/ ultravioleta. Existen complejos que activan una cadena de transmisión de proteínas quinasas que por acción de la quinasa 2 fosforila el p53 para retenerlo dentro del núcleo. Cuando se detecta el error en el ADN se bloquea la liberación de p53 ya que si no actúa como factor de transcripción produciendo dos tipos de transcripción: Una que actúa inhibiendo a Cdk, que inhibe la Cdk-ciclina no pudiendo fosforilar a Rb que detiene el ciclo celular. Por otro lado se produce la inhibición de Bcl 2 por lo que no se puede inhibir la apoptosis produciéndose. La P53 e INK4 son dos vías que integran la señal de estrés y la procesan mediante el modo lineal (P53-P21-Rb) o a modo paralelo (P16-Rb) que ambos convergen.

Senescencia celular y cáncer La senescencia se postula como un mecanismo supresor del cáncer, pero es un factor contribuyente al envejecimiento de los organismos por pérdida del potencial regenerativo, y por tanto, de la funcionalidad de los tejidos. Ante un estimulo neoplasico las células pueden entrar en un proceso de envejecimiento o apoptosis para evitar esta neoplasia.

Fenotipo de las células senescentes. Biomarcadores Las células senescentes: - Son visibles y metabólicamente activas. - Son más grandes y más granuladas y vacuoladas, con núcleo más heterocromatinico por tanto silencia la trascripción de genes promotores del crecimiento. - Estas células muestran un acortamiento gradual de los telomeros. - Se produce un incremento de la actividad β-galactosidasa a pH 6 debido a que en las células senescentes se produce un aumento del contenido lisosomal. - Se produce un aumento del nivel de proteínas marcadoras de la senescencia (ATM/ATP). - Las células tienen la incapacidad para proliferar en respuesta a estímulos mitogenicos quedando detenidas irreversiblemente en la fase G0/G1. - Estas células son resistentes a estímulos que inducen la muerte celular por apoptosis. - Estas células muestran cambios en el perfil de expresión génica y en el procesado de proteínas (disminución de proteínas del choque térmico, aumento de osteonectina, fibronectina, etc.). - Disminuye la capacidad defensiva intracelular. - Presencia de mutaciones en el ADN mitocondrial. 103

Las células senescentes son buenas ciudadanas pero malas vecinas en los tejidos. Las teorías evolucionistas del envejecimiento proponen la existencia de un antagonismo pleiotropico. Esto dice que la senescencia pudo haber sido seleccionada para proteger al organismo contra la neoplasia en etapas tempranas de la vida, antes y durante la etapa reproductiva. Sin embargo, la acumulación de células senescentes que tiene un fenotipo disfuncional y enrarecen el micro-ambiente circundante, no solo hace que la integridad y función del tejido en el que se encuentran decaiga, sino que fomentan una desregulación metabólica en las células vecinas que las lleva a incrementar las posibilidades de iniciar un proceso neoplasico.

7. APOPTOSIS Existe un control en la proliferación celular a lo largo de la vida. De manera que a partir de una sola celula, el ovocito fertilizado, todos los humanos llegamos a desarrollar 1014 células de 200 tipos diferenciados, para organizar tejidos y estos a su vez órganos. En el embrión, el complejo proceso de desarrollo implica proliferación, diferenciación celular, morfogénesis y muerte celular. Las células puede morir por sucesos traumáticos impredecibles, pero la mayoría de las muertes son consecuencia de una proceso fisiológico normal ordenado denominado muerte celular programada o apoptosis. Las anomalías de la muerte celular está asociado con patologías como cáncer, patologías autoinmunes, trastornos neurodegenerativos. La importancia de los mecanismos que regulan la muerte celular debe estar combinada con la capacidad de las células madre de proliferar y diferenciarse para remplazar tejidos dañados. En cada segundo unas 100.000 células son producidas por mitosis y otras tantas retiradas por apoptosis. Por tanto esta apoptosis es un proceso fisiológico de muerte para: 1. Mantenimiento de los tejidos adultos: Aquellos tejidos que están sometidos a intensa renovación (células sanguíneas) para equilibrar su continua producción 2. En el desarrollo embrionario eliminado células innecesarias: Hay tejidos larvales durante la metamorfosis que tras terminar por apoptosis se eliminan las células innecesarias. Tambien el desarrollo del sistema nervioso de mamíferos, ya que se elimina el 50% de las neuronas formadas en exceso en el desarrollo, solo sobreviven las que establecen conexiones correctas. Además tambien se eliminan de nuestro sistema inmune los linfocitos T para evitar que respondan contra nuestras propias proteínas. 3. Mecanismo de defensa: Las células dañadas y potencialmente peligrosas son eliminadas para la supervivencia del organismo como células infectadas por virus (evitando que se generen nuevos virus y se extiendan) y para lesiones en el ADN (se eliminan las células portadoras de mutaciones potencialmente dañinas, sobre todo las que son cancerosas). La apoptosis se define como un “suicidio celular inducido” establecido por Kerr, Wyllie & Curie. La apoptosis afecta a células aisladas y además en este proceso las células sufren cambios observables. Se produce: 1) Disminución de tamaño. 2) Condensación de cromatina. 3) Fragmentación del ADN cromosómico: Mediante exonucleasas separando paquetes de nucleosomas. 4) Se produce ruptura de la lámina nuclear: Se rompe por proteasas de modo que la lámina nuclear queda desensamblada. 104

5) Fragmentación del núcleo: Se separan fragmentos. 6) Colapso del citoesqueleto: La celula pierde la forma y adhesión con células vecinas. 7) Fragmentación de la celula Al final se generan cuerpos apoptoticos que es material nuclear y citoplasmático rodeado de membrana. El resto de orgánulos celulares quedan intactos. Además se produce cambios en la composición del fosfolípidos de la membrana que induce a la fagocitosis de las células o fragmentos apoptoticos. Se trata por tanto de un proceso rápido y limpio, sin liberación al exterior de material celular.

Fases de la apoptosis 1. Inducción: Se deben expresar genes para que se sintetizan enzimas que provoquen la ruptura de elementos de citoesqueleto de la lámina y del material genético 2. Ejecución: Se produce la pérdida de uniones celulares, reducción del tamaño, condensación de la cromatina y fragmentación de cromatina 3. Degradación: Rotura nuclear en fragmentos rodeados de porciones del citoplasma y envueltos por membrana y formación de los cuerpos apoptoticos 4. Fagocitosis: De los cuerpos apoptoticos por fagocitosis adyacentes. Se degradan en los lisosomas Las células que están en apoptosis se pueden distinguir por microscopia óptica con el uso de H-E, la cromatina se ve condensada, el citoplasma es eosinofilo y se observa el núcleo fragmentado (cariorrexis). Además se produce la fragmentación celular. A MET se observa la celula redondeada con superficie celular irregular, masas de cromatina hipercondensadas en la periferia y el citoplasma es granular y vesicular. Las mitocondrias están integras y las membranas células intactas, comienza un proceso, tras la partición del material genético, de segmentación alrededor de las porciones de núcleo formando los cuerpos apoptoticos.

Regulación de la apoptosis La apoptosis es un proceso regulado por: 1) Señales inductoras: Son señales de muerte a. Extracelulares (proteínas mensajeras): La apoptosis se desencadena como respuesta a un estimulo del entorno. Puede ser TNF (factor de necrosis tumoral). Es producido por las células T del sistema inmunitario en respuesta a factores adversos. b. Intracelulares (genéticos). Es un estrés provocado por daño en el genoma irreparable (a través de radiaciones), presencia de calcio, etc. Los efectores son las proteínas de la familia Bcl2, que las hay activadores (proapoptoticas) e inhibidoras (antiapoptoticas). En ambos casos la respuesta esta mediada por una cascada de transducción de señales desde la superficie celular hasta el núcleo.

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2) Señales efectoras: Son enzimas, como las caspasas que son proteasas que producen una cadena de proteólisis sintetizándose en forma de procaspasas y por escisión proteolítica se forman las caspasas. Además actúan endonucleasas.

Genes reguladores Codifican elementos para controlar el proceso. - FIA (factor indiciador de la apoptosis): Es el activador de las caspasas. - Familia de proteínas IAP: Inhiben la actividad de las caspasas o las unen ubiquitina para su degradación en el proteosoma - Apaf-1: Es el factor activador de las proteasas apoptoticas. Forma un complejo multiproteico que se encarga de activar las caspasas - Citocromo C: Presente en el espacio intermembranoso de la mitocondria. Activa conjuntamente con Apaf-1 a las caspasas - Smac/Diablo: Es el segundo activador de las caspasas y sale de mitocondrias con el citocromo C. Inhibe a las IAP. - Familias de las proteínas Bcl-2: Estos pueden ser: o Proapoptoticos: Son las proteínas Bax y Bak que se dirigen desde el citosol a la mitocondria y se caracterizan por permeabilizar la membrana mitocondrial externa formando poros con proteínas Bid, Bad, Puma y Noxa, inactivando a los antiapoptoticos y activando a Bax y Bak o Antiapoptoticos: Impiden la apertura de los canales formados por Bax y Bak por lo que bloquean la liberación de citocromo c mitocondrial. Estos secuestran proteínas vitales Presentan en común el dominio BH3 por donde contactan.

Genes efectores Codifican proteínas que desarrollan el proceso. Los efectores son las caspasas que son protesasas que hidrolizan a sus proteínas sustrato en residuos de acido aspartico. Hay dos tipos de caspasas, las iniciadoras (caspasa 8 9 y 10) y las efectoras (caspasas 3,6 y 7). Su función es la inactivar la quinasa de adhesión focal y separa la celula de las vecinas. Además activa la endonucleasa responsable de la rotura del ADN. Además rompe las láminas nucleares, produciendo la fragmentación del núcleo, rompe tambien las proteínas del citoesqueleto produciendo la desorganización, deformación de la membrana y fragmentación de la celula. Su modo de acción es primero su síntesis como precursores inactivos, después se activan por excision proteolítica catalizada por otras caspasas formando una estructura de heterodimeros formando por 4 subunidades, dos subunidades pequeñas y dos grandes en el centro. Cuando se activa las caspasas provocan una cadena de proteólisis de caspasas efectoras y una vez producido el fenómeno se produce la muerte celular y se fagocita la celula.

Via extrinseca En esta via el factor tumoral (TNF) es un ligando de tipo FAS. La celula apoptotica en la superficie de la membrana tiene su receptor de muerte FAS. El FAS tiene dominios intracitoplasmaticos que son dominios de muerte que se unen a unas proteínas adapatoras, las FADD, que se une a la caspasa 8 de forma inactiva, produciéndose la excision de la caspasa 8 formando el heterodimero formando la caspasa 8 activada. Esta caspasa actúa sobre la caspasa 3 produciendo la excision de molécula formando caspasa 3 ejecutora, actuando sobre sus elementos.

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Via intrínseca Al ser un daño interno se activa el Bax o Bak generando un poro en la mitocondria, saliendo el citocromo C. En el citoplasma hay Apaf-1, que junto con la caspasa 9 y Bax o Bak forma el apostosoma que es el complejo de iniciación que actúa sobre la caspasa 3 activándola para producir los distintos fenómenos de apoptosis. Además a través de la síntesis de proteína puma inhibe la BCL2 o BCX (que inhiben la formación del canal de la mitocondria), por lo que Bax forma el canal, haciendo que se libere citocromo y se produzca apoptosis. Tambien se forma Smac/diablo que hacen que IAP se inhiba. Ambas vías pueden aparecer ligadas, ya que la caspasa 8 puede inactivar el Bid que hace que el Bax actúe de modo que se libera el citocromo C que forma el apoptosoma y activa la caspasa 3.

Apoptosis y mitocondria En la membrana mitocondrial externa se produce la formación del canal de proteína Bax por donde sale el citocromo C al espacio intermembranoso. Además actúan segundos activadores de caspasas, como FIA y Smac/diablo por inhibición de las IAPs. La permeabilidad de la membrana se incrementa con el calcio liberado desde el RE.

Fagocitosis de las células apoptoticas y cuerpos apoptoticos Las células fagocitarias son los macrófagos. Estos macrófagos reconocen las células apoptoticas basándose en el reconocimiento de una señal como es la fosfatidilserina que cambia su posición desde la cara citosolica a la superficie externa de la membrana plasmática. Se produce la fagocitosis, digestión y reciclado de materiales.

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