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MANUAL DE LABORATORIO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE ENFERMERÍA

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

MANUAL DE PRÁCTICAS

2012

Elaborado por Blg. Fabrissio Bravo Cubas Colaborador Blg. Katherine Verástegui A.

–

SESIONES DE PRÁCTICAS

Sesión 01

: Introducción. Formación de grupos. Bioseguridad y manejo de residuos intrahospitalarios

Sesión 02

: Determinación de acidez y alcalinidad

Sesión 03

: Niveles de organización de la materia viva

Sesión 04

: Microscopia. Uso y manejo del microscopio

Sesión 05

: Célula Procariótica y Célula Eucariótica

Sesión 06

: Permeabilidad celular

Sesión 07

: Ciclo Celular: Mitosis

Sesión 08

: Video Taller: Reproducción Humana.

Sesión 09

: Reconocimiento de grupos sanguíneos

Sesión 10

: Primer Examen de Laboratorio

Sesión 11

: Semana de Evaluación Parcial

Sesión 12

: Extracción del ADN

Sesión 13

: Video Taller: El Fantasma en sus genes

Sesión 14

: Código genético y Herencia: Leyes de Mendel

Sesión 15

: Segundo Examen de Laboratorio

Sesión 16

: Semana de Evaluación Final.

Sesión 17

: Semana de Evaluación Sustitutoria.

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NORMAS PARA LAS SESIONES DE PRÁCTICAS

1. El ingreso al Laboratorio tiene como tolerancia 10 minutos, luego del cual ya no se permitirá el ingreso. 2. El Ingreso al Laboratorio se debe hacer con la chaqueta o mandilón perfectamente colocado. 3. De acuerdo a las mínimas Normas de Bioseguridad, se evitará la ingesta de cualquier tipo de alimento, durante la permanencia en el Laboratorio. 4. De acuerdo a los requerimientos de las prácticas a realizar, el grupo que no presente las muestras requeridas para el desarrollo de las mismas, no podrá participar de ellas. 5. Una vez finalizada la sesión se debe dejar todo el material y/o equipo empleado, en las mismas condiciones en las que fue recibido y cualquier desecho debe ser eliminado en el lugar correspondiente. Nadie puede abandonar el Laboratorio sin hacerlo.

SISTEMA DE EVALUACIÓN

1. Al inicio de cada sesión de laboratorio se evaluará en forma escrita u oral, lo relacionado tanto a la sesión a realizar como a la realizada en la sesión anterior. 2. Los informes de prácticas se presentarán al inicio de la sesión posterior de acuerdo a lo planteado en el presente Manual de Prácticas (cuestionarios, esquemas o cualquier otro tipo de actividad). En este informe sólo deberán figurar a los alumnos del grupo, que hayan participado de la sesión. 3. Se evaluará parcialmente con dos Exámenes de Laboratorio, según calendarización, los mismos que tienen carácter cancelatorio. 4. Las notas parciales correspondientes a las sesiones de Laboratorio constan de: Promedio de Informes Promedio de Evaluaciones Escritas Nota Actitudinal Examen de Laboratorio Notas que serán promediadas con las respectivas de Teoría, tal como está indicado en el Sílabo. 5. La asistencia a las sesiones de prácticas es Obligatoria. Alumno que no asista y no presente la justificación respectiva (por salud o trabajo), se le asignará como nota: cero (00) en el Informe de la fecha, en la evaluación escrita correspondiente y en consecuencia afectará su nota actitudinal. 6. Por ningún motivo se recibirán informes fuera del momento señalado. 7. No se podrá intercambiar de grupos asignados ni de los horarios correspondientes.

BIOSEGURIDAD Y MANEJO DE RESIDUOS INTRAHOSPITALARIOS

OBJETIVOS: Familiarizarse con las Normas de Bioseguridad. Conocer los Niveles y Señales de Bioseguridad empleadas en áreas de Salud. Manejar los residuos sólidos según las Normas de Bioseguridad

MATERIALES: Papelógrafos y/o cartulinas Hojas bond Plumones gruesos para papel Tijeras Cinta maskintape Lápiz, colores, regla y borrador.

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INTRODUCCIÓN:

En el campo de la salud existen diversos lugares en donde el profesional respectivo se desempeña, como los hospitales, clínicas, postas, centros asistenciales, etc. Sin embargo el laboratorio también constituye un lugar de trabajo, tanto en el campo clínico, educativo, de investigación e incluso de enseñanza, siendo por ello necesario que se conozcan las pautas mínimas necesarias para el normal desempeño dentro de, el.

Se define como bioseguridad al conjunto de combinaciones específicas (normas) de trabajo, equipo de seguridad y facilidades diseñadas para minimizar la exposición de los trabajadores y el ambiente a los agentes infecciosos; es así que las normas de bioseguridad están destinadas a reducir el riesgo de transmisión de microorganismos de fuentes reconocidas o no reconocidas de infección en Servicios de Salud vinculadas a accidentes por exposición a sangre y fluidos corporales, así como también agentes físicos y químicos.

Los objetivos de estas normas son establecer: 1. Las normas para proteger la salud del personal de salud que pueda estar expuesto a riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos, químicos y físicos. 2. La conducta a seguir frente a un accidente con exposición a dichos elementos.

Sólo si las personas que trabajan en las diversas áreas de salud conocen las normas de bioseguridad y las aplican, pueden determinar su propia seguridad, la de sus compañeros y de la colectividad.

El personal de salud debe cumplir con las normas de bioseguridad y los directivos de la institución deben cumplir con brindar las facilidades para que estas normas sean aplicadas.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD (GRUPOS DE AGENTES DE RIESGO)

TIPOS DE ÁREAS DE TRABAJO: Área contaminada.- Área donde se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo: Laboratorios donde se manipulan virus, producción de antígenos etc. Área de tránsito limitado.- Área donde el tránsito está permitido sólo a personas previamente autorizadas, debido a la presencia de agentes que corresponden a los grupos I (Es poco probable que cause una enfermedad en el hombre. Es decir, los que no producen enfermedad en el ser humano sano y de susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Ejemplo: E. coli K12, Saccharomyces cerevisiae, microorganismos que se utilizan en la industria de la alimentación para la elaboración de quesos, embutidos, entre otros) y II (Puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Como algunos que, perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de originar patología infecciosa humana de gravedad moderada o limitada. Ejemplo: Staphylococcus epidermidis, Salmonella sp, entre otros), y/o al uso de sustancias químicas de bajo riesgo). El acceso del personal administrativo está terminantemente prohibido. Área de tránsito restringido.- Área en las que el tránsito está permitido sólo al personal adecuadamente protegido y autorizado, debido a la presencia de agentes de los grupos III (Puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a él generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Implican patología grave, de difícil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas y ocasionalmente producir la muerte. El mayor y más frecuente peligro que entrañan éstos es la infección adquirida a través de aerosoles y por fluidos biológicos. Ejemplo: M. tuberculosis, Brucella

sp,

Coxiella burneti, entre otros. El laboratorio debe tener características de diseño e ingeniería especiales. Sin embargo, se reconoce que algunas instalaciones existentes pueden no presentar todas las características recomendadas para el nivel de bioseguridad 3 (por Ejemplo, zona de acceso con doble puerta y penetraciones selladas). En esta circunstancia, se puede lograr un nivel de seguridad

aceptable para la práctica de

procedimientos de rutina. La decisión de implementar esta modificación a las recomendaciones del nivel IV (Aquel que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a él profilaxis

o

tratamiento

eficaz.

Normalmente

son

microorganismos de dosis infectiva baja y alta

contagiosidad. Ejemplo: Arenavirus. También incluye los laboratorios de producción de biológicos y control de calidad de alimentos, medicamentos y afines. El acceso del personal administrativo está terminantemente prohibido.

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 

Colores de los Pictogramas      

SEÑALES DE SEGURIDAD

A. De Prohibición: Redondas, con pictograma de color negro sobre fondo blanco, con bordes y banda transversal de izquierda a derecha. B. Contra Incendios: Rectangulares o cuadrangulares, con pictograma blanco sobre fondo rojo. C. De Advertencia: Triangulares, con pictogramas de color negro y fondo amarillo o naranja. D. De Seguridad: Rectangulares o cuadrangulares, con pictogramas de color blanco y fondo verde. E. De Obligación: Circulares y con pictogramas de color blanco con fondo azul.

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SEÑALES DE SEGURIDAD

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Investigar los pictogramas correspondientes a los siguientes reactivos

Reactivo

Lugol

Cristal Violeta

Azul de Metileno

Fenol

Safranina

Pictograma

Interpretación

GESTIÓN EN MANEJO DE RESIDUOS EN SALUD

1. Generalidades: La gestión de residuos debe ser considerada como una parte importante de la seguridad en los laboratorios. Los desechos que se generan pueden estar contaminados por microorganismos o contener sustancias químicas tóxicas y peligrosas. En menor medida, el personal del laboratorio puede estar expuesto a los efectos de las radiaciones ionizantes. Los casos de infecciones o intoxicaciones en el laboratorio son conocidos lo que obliga a la adopción de medidas de protección para el personal que trabaja en este ámbito. La visión que se pretende dar está

sobre todo encaminada a la protección del personal de los laboratorios, no olvidar que las actividades que en ellos se realizan pueden afectar a la salud comunitaria. La mejor manera de racionalizar los residuos es mediante una gestión integrada cuyos pilares básicos son la minimización, segregación y eliminación.

2. Clasificación de los Residuos según su Peligrosidad: Clase A: Residuos Biocontaminados (Peligrosos)  Tipo A 1: Atención al paciente. Instrumentos y materiales utilizados en la toma de muestra de sangre, tejidos y otros.  Tipo A 2: Material biológico.  Tipo A 3: Sangre humana y productos derivados.  Tipo A 4: Quirúrgicos y anatomopatológicos.  Tipo A 5: Animales contaminados. Clase B: Residuos Especiales  Tipo B 1: Químicos peligrosos.  Tipo B 2: Farmacéuticos.  Tipo B 3: Radioactivos. Clase C: Residuos Comunes: Similares a los domésticos. Incluye a los generados en administración como: cartón, papel, material de oficina, basura orgánica, etc.

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3. Manejo de Residuos Sólidos:

Las bolsas de recolección de residuos sólidos se deben de diferenciar por colores: Residuos Biocontaminados: Color roja. Residuos Especiales: Color amarilla. Residuos comunes: Color negra. Si los residuos son punzantes o cortantes debe utilizarse recipientes rígidos resistentes a la perforación cuyo volumen no supere los 2 L y que contengan desinfectante (hipoclorito de sódio al 10%), el cual debe ocupar los 2/3 del volumen del recipiente.

ACTIVIDADES A DESARROLLAR

1. Mencione 5 tipos de residuos biocontaminados, 5 especiales y 5 comunes, que pueda encontrar en un Nosocomio o Centro asistencial. 2. Mencione 5 Normas de Bioseguridad que usted estime conveniente debe de tener un laboratorio de prácticas.

3. Señale que institución norma la Bioseguridad en las áreas de salud de nuestro país. 4. Reconozca según las definiciones determinadas, 3 señales de Prohibición, 3 de Seguridad, 3 de Advertencia, 3 obligatorias y 3 Contra incendios y esquematícelas según lo establecido.

5. Identifique las probables fuentes de que generen residuos sólidos en la UCV y diseñe un sistema de gestión de dichos residuos.

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DETERMINACIÓN DE ACIDEZ Y ALCALINIDAD OBJETIVOS: Comprender la importancia del pH en el ser humano. Conocer los medios que permiten determinar el pH de una solución

MATERIALES: - Papel de tornasol azul - Papel de tornasol rojo - Cinta Universal - Pinzas - Muestras diversas: (Agua de mar, bebida oscura, lejía, detergente, cerveza, zumo de limón, leche materna, orina, sudor, semen, secreción vaginal, saliva, etc.)

INTRODUCCIÓN: La medición de la acidez o basicidad de una sustancia es definida como el pH, término que significa potencial de hidrógeno y se define como el logaritmo negativo de la concentración de los iones hidrógeno presentes en ella. Esto es:

pH = - log [H+] La determinación de la acidez o basicidad, es uno de los procedimientos analíticos más importantes y más usados en ciencias tales como química, bioquímica y la química de suelos. El pH determina muchas características notables de la estructura y actividad de las biomacromoléculas y, por lo tanto, del comportamiento de células y organismos.

El valor del pH se puede medir de forma precisa mediante un potenciómetro, un instrumento que mide la diferencia de potencial entre dos electrodos. También se puede medir de forma aproximada el pH de una disolución empleando indicadores, ácidos o bases débiles que presentan diferente color según el pH, como la fenolftaleína. Generalmente se emplea papel indicador, que se trata de papel impregnado de una mezcla de indicadores. Algunos compuestos orgánicos que cambian de color en dependencia del grado de acidez del medio en que se encuentren, son usados como indicadores cualitativos para la determinación del pH. El papel de Litmus o papel tornasol es el indicador mejor conocido, el cual está impregnado de una solución que cambia o vira de color al estar en presencia de una sustancia ácida o alcalina. Así tenemos el papel tornasol Azul el cual vira a rojo en presencia de sustancias ácidas y el Papel Tornasol Rojo el cual vira a azul en presencia de sustancias alcalinas o básicas. Otros indicadores usuales son la fenolftaleína y anaranjado de metilo.

MUESTRA ANALIZADA

PAPEL DE TORNASOL CINTA UNIVERSAL

ROJO

AZUL

ACTIVIDADES A DESARROLLAR

1. Introducir a cada muestra a analizar una tira de papel tornasol rojo y otra de papel tornasol azul empleando para ello la pinza (limpia y seca). 2. Introduzca ahora a las mismas muestras una tira de Cinta Universal. 3. Registre e interprete los resultados obtenidos para cada muestra en la siguiente tabla y determine la naturaleza de cada muestra analizada. 4. Indique 4 métodos que se emplean para determinar el pH de una muestra. 5. Por qué es importante determinar la acidez o basicidad de una sustancia?

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NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LA MATERIA VIVA

OBJETIVOS: Identificar las unidades monoméricas de la materia viva Identificar las macromoléculas que constituyen al organismo viviente

MATERIALES: Solución de albúmina de huevo al 1% Aceite vegetal Glucosa al 1% Almidón al 1% Reactivo de Benedict Reactivo de Biuret Sudam III Lugol Agua destilada Tubos de ensayo Pipetas de 1 ml, 2 ml Goteros Mecheros a gas Trípode Malla Beacker de 500 ml

INTRODUCCIÓN:

Los seres vivos u organismos son necesariamente complejos. Su complejidad afecta, entre otros aspectos, a las moléculas que los componen y a cómo se organizan éstas en asociaciones macromoleculares para formar las diferentes estructuras de los seres vivos. Al observar la materia viva se pueden distinguir varios

grados de complejidad estructural, que son los

denominados niveles de organización. Cada uno de ellos proporciona unas propiedades a la materia viva que no se encuentran en los niveles inferiores.

Tal es así que tanto un organismo procariótico como la bacteria o un mamífero o una planta, están formados por cuatro átomos principales: el carbono (C), el hidrógeno (H), el oxígeno (O) y el nitrógeno (N), (Nivel atómico), los cuales se organizan para formar moléculas como el agua, anhídrido carbónico, carbonato de calcio, nitrógeno molecular, etc. (Nivel molecular). Dichas moléculas darán lugar a unidades monoméricas conocidas como aminoácidos, azúcares simples, triglicéridos y nucleótidos, denominadas también por estar formando a los seres vivos como biomoléculas las cuales a su vez conformarán proteínas, polisacáridos,

lípidos y ácidos nucleicos respectivamente,

denominados como macromoléculas.(Nivel macromolecular). Los complejos supramoleculares: están formados por varias moléculas. Por ejemplo, la unión de glúcidos y proteínas para dar glucoproteínas, o también podemos mencionar a los ribosomas, formados por ácido ribonucleico más proteínas. Los orgánulos celulares: están formados por varios complejos supramoleculares y, aunque tienen cierta entidad propia, no se pueden considerar como seres vivos, ya que no cumplen sus características de nutrición, relación y reproducción. Dentro de la célula se encuentran varios orgánulos celulares como las mitocondrias, los peroxisomas, el retículo endoplasmático, etcétera. Por último existe el Nivel celular, siendo éste el último nivel de organización de la materia viva.

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Fundamento teórico:

I.- Identificación de Unidades Monoméricas: a) Monosacáridos: Una manera de reconocer azúcares simples es mediante el empleo del reactivo de Benedict, en los cuales los grupos aldehídicos (-CHO) o cetónicos (-CO-) contenidos en los

++

+

glúcidos son capaces de reducir el Cu a Cu en medio alcalino y en presencia de calor,

originando un precipitado de Cu2O de color rojo ladrillo. El mecanismo de esta reacción implica fenómenos de enolización por acción de los grupos OH- y de la temperatura.

b) Ácidos grasos: Los ácidos grasos resultan del alargamiento de la molécula de ácido acético por adición sucesiva de grupos –CH2, los cuales le confieren características hidrofóbicas. Mediante la reacción del Sudam III se puede observar la afinidad de este compuesto por tale moléculas. El Sudam III, forma una suspensión heterogénea en agua o soluciones alcohólicas, Sin embargo, este compuesto es muy soluble en aceite, separando por tanto de la solución alcohólica si se añade un ácido graso como el ácido oleico. La densidad del aceite es menor que la del alcohol diluido y por ello en la fase superior de una mezcla alcohol-aceite, aparecerá un color rojo cereza.

II.- Identificación de Macromoléculas:

a) Polisacáridos: El almidón, la celulosa y el glucógeno al ser enfrentados con el lugol reaccionan de una manera peculiar que se debe a que la solución yodo-yodurada (lugol) puede formar compuestos de absorción con los enlaces glucosídicos 1,4 presentes en los polisacáridos. La coloración obtenida depende de la estructura macromolecular del polisacárido y del enlace glucosídico formado, siendo para el caso del almidón de color azul violáceo.

b) Proteínas: La reacción de Biuret usada para sus identificación se basa en que las uniones +

peptídicas CO-NH establecidas entre los aminoácidos de las proteínas, pueden formar con el Cu un complejo Biuret cuprosídico en medio alcalino. De este modo se puede diferenciar un aminoácido de un polipéptido. Esta reacción ocurre con los otros grupos como CH 2, NH2 y CSNH2.

ACTIVIDADES A DESARROLLAR

Identificación de Unidades Monoméricas:

1. Reconocimiento de azúcares simples:  Procedimiento: Preparar 2 tubos. En el tubo 1 coloque 2 ml de Agua destilada En el tubo 2 coloque 2 ml de glucosa al 1% Adicione a cada tubo 1 ml del Reactivo de Benedict Someter ambos tubos a 100 C x 5 minutos Observe y anote sus resultados 2. Reconocimiento de ácidos grasos:  Procedimiento: Preparar 2 tubos. En el tubo 3 coloque 1 ml de aceite En el tubo 4 coloque 1 ml de agua destilada Adicione a cada tubo 1 ml de solución alcohólica de Sudam III y agite. Observe y anote sus resultados.

Identificación de Macromoléculas:

1. Reconocimiento de Proteínas:  Procedimiento: Preparar 2 tubos. En el tubo 1 coloque 2 ml de solución de albúmina de huevo al 1% En el tubo 2 coloque 2 ml de agua destilada Adicione a cada tubo 2 ml del Reactivo de Biuret y agite. Observe y anote los resultados obtenidos a los 10 y 30 minutos

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2. Reconocimiento de Polisacáridos:  Procedimiento: Preparar 2 tubos. En el tubo 3 coloque 2 ml de solución de almidón al 1 % En el tubo 4 coloque 2 ml de agua destilada Adicione a cada tubo 5 gotas de Lugol Observe y anote los resultados obtenidos

CUESTIONARIO

1. Por qué el reactivo de Biuret sólo reacciona con las proteínas? 2. Por qué la sacarosa daría la reacción positiva de Benedict? 3. Determine cuáles son las unidades monoméricas de los Carbohidratos, Ácidos nucleicos y Proteínas e indique los enlaces que se establecen entre estas unidades.

4. Por qué se emplean tubos blanco o control en la realización de un experimento?

MICROSCOPIA: USO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO OBJETIVOS: Identificar las partes del microscopio compuesto Aprender a manejar el microscopio

MATERIALES: Microscopio Papel lente Láminas portaobjetos Láminas cubreobjetos Lámina con tinción Gram Láminas con frotis Sanguíneo Aceite de cedro o de inmersión

DEFINICION: El desarrollo y perfeccionamiento del microscopio en los últimos años, ha permitido ampliar el campo de las investigaciones biológicas y se ha convertido en uno de los instrumentos básicos para abrir fronteras en la Biología. El microscopio es un instrumento que permite observar una imagen amplificada de un objeto pequeño. La imagen puede ser observada directamente, fotografiada o proyectada, dependiendo de la naturaleza y del uso que haya de hacerse de esta imagen.

RESOLUCIÓN DE UN MICROSCOPIO: Se denomina así a la capacidad del microscopio de distinguir dos puntos vecinos individualmente. Dos puntos luminosos pueden formar imágenes separadas siempre que exista entre ellos una distancia minima llamada “limite de resolucion”(r), si la distancia que separa dos puntos es menor que r, formarán una sola imagen, es decir se confunden.

TIPOS DE MICROSCOPIO:  Microscopio simple (lupa)  Microscopio compuesto (óptico, estereoscópico, de contraste de fases, de luz polarizada, de luz ultravioleta, de fluorescencia, el microscopio electrónico de transmisión, microscopio electrónico de barrido, etc.).

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PARTES DEL MICROSCOPIO: El microscopio consta de la parte mecánica y de la parte óptica.

A. Parte Mecánica:

1. Base, pie o estativo: Sirve como base del microscopio y tiene un peso suficiente para dar estabilidad al aparato. En los microscopios antiguos tenía forma de herradura o de trípode pero en la actualidad suele ser una plataforma rectangular. En él se integra la fuente luminosa. 2. Brazo: Es una columna perpendicular al pie, al cual se une. Puede ser arqueado o vertical y en su parte superior se une con el tubo ocular. 3. Tubo ocular: Es una cámara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Tiene el revólver con los lentes objetivos en su parte inferior y los lentes oculares en el extremo superior. 4. Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes

de la fuente de

iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa.

5. Revólver: Es un dispositivo metálico que está unido a la parte inferior del tubo óptico y posee 4 roscas en donde se atornillan los lentes objetivos, que al girar se ubican en posición de observación.

6. Tornillos macro y micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El tornillo macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.

B. Parte Óptica:

1. Fuente Luminosa: Se trata de una lámpara halógena de intensidad graduable. Está situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y en su superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar filtros que facilitan la visualización. Condensador: El condensador es un sistema de lentes situadas bajo la platina su función es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminación hacia la preparación. 3. Diafragma: Ubicado en el interior del condensador, cuya función es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la cantidad de luz).

4. Lentes oculares: Están colocados en la parte superior del tubo. Se denominan así, porque están muy cercanos al ojo. Su función es la de captar y ampliar la imagen real e invertida formada en los lentes objetivos. En los modernos microscopios hay dos oculares (microscopios binoculares) que están unidos mediante un mecanismo que permite ajustar la distancia interpupilar. En general los más utilizados son los de 10x (producen un aumento de 10 veces). 5. Lentes objetivos: Están atornillados en el revólver, que permite cambiarlos fácilmente. Generan una imagen real, invertida y aumentada. Los más frecuentes son los de 4x, 10x, 40x, y 100x. Este último se llama de inmersión ya que para su utilización se necesita utilizar aceite de cedro sobre la preparación. En la superficie de cada objetivo se indican sus características principales, aumento, apertura numérica, y llevan dibujado un anillo coloreado que indica el número de aumentos (rojo 4x, amarillo 10x, azul 40x y blanco 100x). Forman imágenes reales del objeto.

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MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO: 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición). 4. Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

6. Empleo del objetivo de inmersión: a. Bajar totalmente la platina. b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40. d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

AUMENTO DE LA OBSERVACIÓN Pare determinar el aumento al cual se está observando una muestra en particular, se debe multiplicar el valor del lente ocular por el valor del lente objetivo.

Así por ejemplo:

Lente ocular empleado = 10x, Lente objetivo utilizado = 4x Aumento = (10x) (4x) = 40x; es decir, 40 veces de su imagen real.

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MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES:

1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. 5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción. 6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador). 7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol. 9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

FACTORES QUE DAÑAN AL MICROSCOPIO: 1. Lavar las lentes con alcohol. 2. Mojar los objetivos con xilol o alcohol, o bien con alguna otra sustancia. 3. Usar papel ordinario para limpiar las lentes. 4. Poner los dedos sobre las lentes. 5. Limpiar el soporte o la platina con xilol. 6. Limpiar el interior de las lentes con tela o papel, en caso de que sea completamente necesario, utiliza un pincel de cerdas muy pequeñas y/o utiliza papel seda. 7. Dejar el microscopio sin oculares. 8. Guardar el microscopio con aceite de inmersión en el objetivo. 9. Transportar el microscopio con una sola mano.

CUESTIONARIO

1. Qué tipo de imagen produce un microscopio compuesto? 2. Cómo son los movimientos en relación a las muestras observadas? 3. Cuál es la diferencia entre un microscopio simple y uno compuesto? 4. Indique 2 diferencias muy importantes entre el microscopio compuesto y el microscopio electrónico. 5. Por qué es necesario utilizar aceite de cedro o de inmersión cuando usamos el lente objetivo de inmersión (100X)? 6. Señale las partes del microscopio compuesto en el siguiente esquema:

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CELULA PROCARIÓTICA Y CELULA EUCARIÓTICA

OBJETIVOS: Identificar células procariotas y eucariotas Diferenciar la célula animal de la célula vegetal Identificar las diversas estructuras celulares

MATERIALES: Microscopios Láminas portaobjetos Láminas cubreobjetos Hisopos Estériles Lancetas de punción Algodón Alcohol Agua destilada Goteros Piscetas Catáfila de cebolla Aceite de cedro Pinza fina Cristal Violeta Lugol Alcohol Acetona Safranina Colorante Wright

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INTRODUCCIÓN: La célula es una unidad mínima de un organismo capaz de actuar de manera autónoma. Todos los organismos vivos están formados por células, y en general se acepta que ningún organismo es un ser vivo si no consta al menos de una célula. Algunos organismos microscópicos, como bacterias y protozoos, son células únicas, mientras que los animales y plantas están formados por muchos millones de células organizadas en tejidos y órganos. Aunque los virus y los

extractos

a

celulares

realizan

muchas

de

las

funciones propias de la célula viva, carecen de vida

independiente, capacidad de crecimiento y reproducción propias de las células y, por tanto, no se consideran seres vivos. La biología estudia las células en función de su constitución molecular y la forma en que cooperan entre sí para constituir organismos muy complejos, como el ser humano. Para poder comprender cómo funciona el cuerpo humano sano, cómo se desarrolla y envejece y qué falla en caso de enfermedad, es imprescindible conocer las células que lo constituyen Hay células de formas y tamaños muy variados. Algunas de las células bacterianas más pequeñas tienen forma cilíndrica de menos de una micra o µm (1 µm es igual a una millonésima de metro) de longitud. En el extremo opuesto se encuentran las células nerviosas, corpúsculos de forma compleja con numerosas prolongaciones delgadas que pueden alcanzar varios metros de longitud. Casi todas las células vegetales tienen entre 20 y 30 µm de longitud, forma poligonal y pared celular rígida. Las células de los tejidos animales suelen ser compactas, entre 10 y 20 µm de diámetro y con una membrana superficial deformable y casi siempre muy plegada. Pese a las muchas diferencias de aspecto y función, todas las células están envueltas en una membrana plasmática que encierra una sustancia rica en agua llamada citoplasma. En el interior de las células tienen lugar numerosas reacciones químicas que les permiten crecer, producir energía y eliminar residuos. Debido a la microscopía, se pudo evidenciar que existen dos tipos básicos de células, procarióticas y eucarióticas. Entre las células procarióticas y eucarióticas hay diferencias fundamentales en cuanto a tamaño y organización interna. Las procarióticas, que comprenden bacterias y cianobacterias (antes llamadas algas verdeazuladas), son células pequeñas, entre 1 y 5 µm de diámetro, y de estructura sencilla; el material genético (ADN) está concentrado en una región, pero no hay ninguna membrana que separe esta región del resto de la célula. Las células eucarióticas, que forman todos los demás organismos vivos, incluidos protozoos, plantas, hongos y animales, son mucho mayores (entre 10 y 50 µm de longitud) y tienen el material genético envuelto por una membrana que forma un órgano esférico conspicuo llamado nucleo. De hecho, el termino eucariotico deriva del griego „nucleo verdadero_, mientras que procariotico significa „antes del nucleo_. Las células bacterianas, así como las vegetales presentan una pared celular que difieren en composición, así mismo todas las células poseen una membrana plasmática que las delimita y le otorga una morfología en particular; un citoplasma, conformado por un verdadero medio acuoso (citosol) junto con un enmarañamiento de microtúbulos y microfilamentos (citoesqueleto), en donde se hallan las diversas organelas, cada una con un rol específico para el normal funcionamiento de la célula.

ACTIVIDADES A DESARROLLAR I. OBSERVACIÓN DE LA CÉLULA PROCARIOTA: Técnicas de Coloración Preparación de un frotis bacteriano Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.

COLORACIÓN COMPUESTA Para poder observar células procarióticas al microscopio compuesto se requiere de una coloración compuesta a través de la técnica Gram. Los métodos de coloración doble permiten la utilización de dos colorantes, uno es el colorante primario y el segundo es el colorante de contraste. Técnica de Gram Esta técnica, elaborada por Christian Gram en 1884, permite diferenciar dos grupos de bacterias: bacterias Gram (+) y bacterias Gram (-) de acuerdo a las estructuras de envoltura y, particularmente, de la pared celular que presentan las bacterias. Esta tinción emplea dos colorantes básicos, el cristal violeta, usado como colorante primario, y posteriormente la safranina empleado como colorante secundario o colorante de contraste. Las bacterias Gram (+) se tiñen de color violeta por la incorporación estable del colorante primario. En cambio, las bacterias Gram (-), las cuales pierden durante el proceso de tinción el colorante primario, se tiñen de color rosado por el empleo de la safranina como colorante secundario. Procedimiento Preparar los frotis bacterianos. Teñir con cristal violeta o violeta de genciana y dejar actuar durante 3min. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. Cubrir con Lugol y dejar actuar durante 1min. Lavar con agua el exceso de Lugol. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color (30seg) Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. Teñir con safranina y dejar actuar durante 1min. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. Secar la preparación al medio ambiente o al calor suave del mechero. Observar al microscopio, utilizando objetivo de 100x, y el respectivo aceite de inmersión.

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OBSERVACIÓN DE LA CÉLULA EUCARIOTA:

A) Célula Vegetal: OBSERVACIÓN DE CATÁFILO DE CEBOLLA:



Procedimiento:

Coloque una porción pequeña de catáfila de cebolla sobre una lámina portaobjeto. Adicione sobre el catáfila una gota de lugol. Cubra la muestra con una laminilla

Observe al microscopio. Esquematice sus observaciones

B) Célula Animal: OBSERVACIÓN DE CÉLULAS SEXUALES MASCULINAS (ESPERMATOZOIDES):  Procedimiento: Coloque una gota de semen humano recientemente colectado a una lámina portaobjeto. Cuba la muestra con una laminilla. Observe al microscopio. Esquematice sus observaciones

OBSERVACIÓN DE CÉLULAS SANGUÍNEAS:  Procedimiento: Limpie y desinfecte con alcohol la pulpa del dedo índice. Pinche con una lanceta estéril y coloque una gota de sangre en un extremo de la lámina. Hacer un frotis de la gota de sangre con otro porta. El frotis se hace extendiendo la sangre de forma rápida y continua arrastrando una lámina portaobjeto sobre la que contiene la sangre con un ángulo de inclinación de unos 45 y dejar secar al aire.

Cuestionario: 1. ëCuál es el fundamento de la coloración Gram? 2. Indique 5 características exclusivas de la célula procariota. 3. Indique 5 características exclusivas de la célula animal que no estén presentes en la célula vegetal. 4. ëQué función tienen las células qué observó en el frotis sanguíneo?

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PERMEABILIDAD CELULAR

OBJETIVOS: Comprobar algunas propiedades de las membranas biológicas, como lo es la permeabilidad selectiva. Conocer la importancia del entorno extracelular para el mantenimiento de su integridad.

MATERIALES: Hojas de Cebolla Láminas cubreobjetos Láminas portaobjetos Papel filtro Pinza fina Lanceta Hoja de bisturí Goteros Soluciones salinas al 0,2%, 0,9% y 5% Agua destilada Alcohol Algodón Microscopio compuesto

INTRODUCCIÓN: El transporte de materia puede realizarse gracias a la presencia de ciertas sustancias que conforman a las membranas: unas se encargan de formar una compleja estructura, otras de facilitar el paso de sustancias de una manera selectiva y controlada, y algunas más tienen como función relacionar a la célula con el medio circundante. Entre los compuestos básicos que conforman a las membranas podemos reconocer los lípidos, las proteínas y los carbohidratos. Los lípidos conforman la estructura o matriz de la membrana y están representados basicamente por los fosfolipidos, es decir, compuestos que presentan una “cabeza” hidrofilica constituida por grupos fosfato, y una “cola” hidrofóbica formada por cadenas de carbonos de naturaleza lipídica. Tanto la cabeza como la cola pueden tener diferente composición y complejidad, de acuerdo con el tipo de membrana de que se trate. Por la presencia de dos zonas (una hidrofílica y otra hidrofóbica) los fosfolípidos en presencia de agua forman una bicapa. El movimiento continuo que presentan las colas de las moléculas da una enorme flexibilidad a esta zona, por lo que se considera que en la membrana hay un flujo bidimensional continuo, ya que las moléculas tienen gran movimiento lateral a lo

largo de la membrana.En

general,

las

membranas

biológicas

son

más

permeables a las moléculas pequeñas y a sustancias liposolubles capaces de cruzar el interior hidrófobo de la bicapa. Aunque son polares (no liposolubles), las moléculas de agua pueden cruzar con rapidez las bicapas lipídicas fluidas que constituyen las membranas porque son lo suficientemente pequeñas para pasar por los huecos que se crean cuando una cadena de acido graso se desplaza en forma momentánea. También pueden atravesar con libertad algunos gases como el oxígeno, dióxido de carbono y nitrógeno; moléculas polares pequeñas como el glicerol, y sustancias no polares de mayor tamaño (hidrófobas), entre estas los hidrocarburos. Algunas moléculas polares un poco más grandes, como la glucosa, así como los iones con carga de cualquier tamaño, cruzan con mayor lentitud la bicapa. Si bien la bicapa es relativamente impermeable a los iones, las células necesitan desplazar iones y moléculas polares grandes y pequeñas, como aminoácidos y azucares, a través de las membranas. La permeabilidad de estas últimas a sustancias de esos tipos se debe sobre todo a actividades

de proteínas de membrana

especializadas. Las membranas biológicas que rodean a células, núcleos, vacuolas, mitocondrias, cloroplastos y otros organelos subcelulares son semipermeables a diferentes tipos de moléculas. En respuesta a las condiciones ambientales o a las necesidades celulares cambiantes, una membrana plasmática puede constituirse en barrera para una sustancia dada en un momento y promover de modo activo su paso en otro instante. Al regular el tránsito químico de esta manera, la célula ejerce algún control sobre su propia composición iónica y molecular interna, que puede ser diferente de la que corresponde al medio extracelular. La vida como la conocemos hoy no existiría si no existieran las membranas. Estas estructuras definen el límite entre lo que se considera una célula y su entorno. En el caso de las células eucariotas, las membranas también definen las organelas internas. Las membranas tienen una función más compleja que ser simples barreras delimitantes, son estructuras activas donde ocurren procesos metabólicos como transporte de moléculas, transducción de señales, respiración celular y generación de potenciales eléctricos entre otros.

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ACTIVIDADES A DESARROLLAR

Con la célula vegetal a .- Colocar en una placa petri con solución salina al 0.9./. el catafilo de la cebolla Luego observar al microscopio b.- Colocar en una placa petri con solución salina al 5./. el catafilo de la cebolla Luego observar al microscopio c.- Colocar en una placa petri con solución salina al 0.1./. el catafilo de la cebolla Luego observar al microscopio

Con la célula animal

Habiendo desinfectado el pulpejo del dedo anular pinchar con una lanceta estéril y colocar 1 gota de sangre en 3 láminas porta objeto a .- Adicionar una gota de solución salina al 0.9./. a la gota de sangre colocada en la lámina porta objeto Número 1, Luego observar al microscopio b.- Adicionar una gota de solución salina al 5 /. a la gota de sangre colocada en la lámina porta objeto número 2 Luego observar al microscopio c.- Adicionar una gota de solución salina al 0.1./. a la gota de sangre colocada en la lámina porta objeto Número 3 Luego observar al microscopio.

CUESTIONARIO 1. Qué es la Presión osmótica? 2. Qué tipos de soluciones existen en relación a la tonicidad? Explique. 3. Defina turgencia y plasmólisis. Ejemplos. 4. Qué es el transporte activo? 5. Qué es la difusión pasiva?

Célula vegetal Isotónica

Célula vegetal hipertónica

....Plasmólisis......

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CICLO CELULAR Y MITOSIS OBJETIVOS: Identificar las células en interfase y en división Diferenciar cada una de las fases de la mitosis

MATERIALES: - Bulbos de cebolla - Microscopio - Láminas portaobjetos y cubreobjetos - Papel filtro - Pinza fina - Hoja de bisturí - Luna de reloj - Mecheros - Orceína acética clorhídrica (alcohol acético 3:1)

DEFINICIÓN: El desarrollo de un organismo eucariótico radica en la capacidad que poseen sus células de multiplicarse, dar copias de sus estructuras fundamentales y principalmente transmitir el ADN a las células descendientes. El ácido desoxirribonucleico tiene una doble función: replicarse y transmitir su información en forma regulada a las células hijas. La célula tiene a su vez una doble función: copiarse así misma y que su copia sea regulada; es decir, diferenciada según las necesidades del organismo a la que pertenece. La división celular establece dos etapas en el ciclo de división (ciclo celular). La primera, aquella en la que la célula se divide y origina dos células hijas caracterizadas por la división del núcleo (cariocinesis), seguida de la división del citoplasma (citocinesis), y la segunda denominada interfase celular, en donde el ADN es replicado. La interfase y la división celular o mitosis (fase M), corresponden a las dos etapas del ciclo, que pueden definirse según sus contenidos: duplicación del contenido celular y duplicación del número de células, en donde básicamente los cromosomas previamente duplicados son distribuidos equitativamente a cada una de las células hijas, de tal manera que el número de cromosomas se mantiene constante de una generación celular a la siguiente. La interfase involucra un período inicial denominado G 1, en donde la célula se prepara para el siguiente período denominado S (fase de síntesis), en donde ocurre la duplicación del ADN y finalmente el período G 2, en donde la célula se prepara para la división celular. Es en este instante en donde ocurre la fase M o mitosis, que comprende 4 etapas:

. Profase desaparece la membrana nuclear, se condensan los cromosomas , desaparece el nucléolo.

Metafase: Aparece entre los centriolos el huso mitótico, el cual consta de un conjunto de microtúbulos. Los cromosomas se evidencian duplicados, conformados por sus cromátidas hermanas y ubicados radialmente en el plano ecuatorial de tal manera que se disponen en la periferia del huso por medio de sus respectivos centrómeros.

Anafase: Se caracteriza por la separación de las cromátidas hermanas, las cuales están unidas a las fibras del huso mitótico y por donde migrarán cada una de ellas a los polos celulares, de tal manera que se efectúa una distribución equitativa del material cromosómico.

Telofase: Una vez que las cromátidas llegan a los polos celulares se desenrollan; es decir empieza la descondensación, los nucléolos vuelven a reorganizarse y la envoltura nuclear se forma paulatinamente alrededor de los cromosomas; es decir se evidencian los núcleos hijos. Simultáneamente se produce la distribución citoplasmática o citocinesis.

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ACTIVIDADES A DESARROLLAR

Observación del ciclo celular y mitosis: Procedimiento: Llenar un vaso de precipitación con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4 días aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 o 4 cm de longitud.

Cortar con las

tijeras unos 2-3 mm del extremo de las raicillas y depositarlo en una luna de reloj en el que se han vertido Orceína acética clorhídrica. Someta al calor la luna de reloj en la llama del mechero hasta la emisión de vapores blancos evitando la ebullición del colorante y en consecuencia la deshidratación total de la muestra. Dejar enfriar y repetir la operación tres veces. Luego dejar enfriar y reposar por 15 minutos. Luego se les añade gotas de colorante (gotas de Orceína fría) sobre los meristemos seccionados y se deposita cuidadosamente una lámina cubreobjetos, golpeando suavemente con un lápiz de grafito a fin de lograr una extensión adecuada del preparado. Eliminar con un trozo de papel filtro el exceso de colorante y presionar con el pulgar en el cubreobjetos (Squash) Realizar la observación microscópica a menor y mayor aumento.

Cuestionario:

1. Por qué se emplea tejido meristemático de cebolla para la realización de la práctica?

2. Cuál es la finalidad de la mitosis? 3. Cuál es la diferencia entre la cariocinesis y la citocinesis? 4. Si tenemos una herida cicatrizando , que proceso biológico está sucediendo?

4. Identifique las siguientes fases de la mitosis:

___________________

___________________

__________________

__________________

MANUAL DE LABORATORIO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR RECONOCIMIENTO DE GRUPOS SANGUINEOS: SISTEMAS ABO y RH

OBJETIVOS: Reconocer los grupos sanguíneos de los sistemas ABO y Rh a través de aglutinación directa. Analizar e interpretar los resultados en relación con los factores responsables de la herencia. Conocer la importancia de la identificación de los grupos sanguíneos.

MATERIALES: Sueros anti A, anti B y anti D (anti Rh) Sangre fresca Alcohol yodado Algodón Lancetas de punción Láminas de aglutinación Palitos mondadientes Microscopio compuesto

INTRODUCCIÓN: El grupo sanguíneo al que pertenece un individuo está determinado por los antígenos de membrana de sus eritrocitos y los anticuerpos del suero. Algunos antígenos y sus anticuerpos se encuentran además en las secreciones. Los anticuerpos del suero suelen producir aglutinación de los eritrocitos portadores de antígenos de grupo distinto. Por ello, algunos grupos sanguíneos, como los del sistema ABO o el facto Rh, ha de tenerse en cuenta a la hora de realizar transfusiones sanguíneas o transplante de órganos. Por ejemplo, las reacciones de aglutinación que revisten peligro, son aquellas en los que los anticuerpos del receptor aglutinan los eritrocitos del donante. Es por eso que las personas AB pueden recibir transfusiones de todos los grupos sanguíneos (receptor universal), mientras que no pueden donar sangre más que a personas de su grupo. Sin embargo, a los del grupo O (donante universal), le ocurre lo contrario.

Fundamento teórico: A principios del siglo XIX, K. Landsteiner observó que al mezclar eritrocitos de una persona con el suero de otra, a veces, se producían aglutinaciones. Es así que estudiando este comportamiento de los eritrocitos, se percató de que en la población existen individuos de tres fenotipos diferentes correspondientes a los grupos A, B y O. El AB menos frecuente fue descubierto un año después por dos discípulos de Landsteiner. Su A

B

A

B

estructura está codificada por un gen I que tiene 3 alelos I , I , i; siendo los alelos I y I codominantes y ambos dominantes sobre el i. (IA= IB> i) (Tabla 1).

Tabla 1: Sistema ABO

FENOTIPO A B AB O

GENOTIPO I

A

IA, IAi IBIB, IBi IA IB ii

ANTIGENOS ERITROCITARIOS (Aglutinógenos) A (A1, A2, A3) B (B1, B2, B3) AyB No tiene

ANTCUERPOS EN EL SUERO (Aglutininas) anti B anti A No tiene anti A y anti B

En 1940, Landsteiner y Wiener descubrieron otra diferenciación hereditaria en la sangre. El llamado factor Rh. Inyectaron sangre de Macacus rhesus en conejos, obteniendo de estos un suero, capaz de aglutinar los eritrocitos de los monos y que al ser inyectados en humanos, se observó que podían aglutinar los eritrocitos de un 85% de los neoyorquinos, llamados Rh positivos, a diferencia del 15% que no reaccionaron, a los que se denominaron Rh negativos. Poco tiempo después se dieron cuenta de que el carácter Rh negativo es recesivo frente al Rh positivo. En el mismo año se comprobó que las transfusiones de sangre Rh positivos a individuos Rh negativos provocaban crisis hemolíticas, a pesar de que fueron del mismo grupo sanguíneo del sistema ABO, lo que llevó a reconocer que este factor está involucrado en la producción de la enfermedad hemolítica del recién nacido (eritroblastosis fetal).

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Existen 2 propuestas sobre la genética del factor Rh, tal como se indica en la tabla 2.

Tabla 2: Según Wiener (Un locus por tres subunidades = 8 posibilidades) Rh positivos R 1 R R2 RZ

Rh negativos r

r’ r’

Según Fisher (Tres loci adyacentes, tres parejas alélicas) Rh positivos Dce DCe DcE DCE

Rh negativos dce dCe dcE dCE

ACTIVIDADES A DESARROLLAR

La técnica que permite la identificación de los grupos sanguíneos se basa en la aglutinación o no de los eritrocitos, empleando para ello los respectivos sueros.

Procedimiento: 1. Desinfecte la pulpa del dedo índice con un algodón empapado de alcohol yodado e inmediatamente haga una punción con la lanceta. 2. Coloque de manera inmediata, tres gotas en cada uno de los tres depósitos cóncavos de la lámina de aglutinación. 3. Adicione una gota del suero anti A sobre la primera gota de sangre, una gota del suero anti B a la segunda gota de sangre y una gota de suero anti D (anti Rh) a la tercera gota. 4. Rápidamente homogenice, moviendo de manera circular, cada gota con su respectivo anticuerpo, empleando para ello diferentes palitos mondadientes. 5. Dejar reposar brevemente (aproximadamente 1 a 2 minutos). 6. Observe los resultados y determine a qué grupo sanguíneo corresponde su muestra, por medio de la aglutinación o no ocurrida. 7. Anote los resultados obtenidos de los integrantes de su mesa en la siguiente tabla, esquematizando lo observado.

GRUPO SANGUINEO Sistema Facto ABO Rh

ALUMNO

REACCION DE AGLUTINACION Anti A Anti B Anti D

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CUESTIONARIO 1. En qué se basa la técnica de aglutinación directa? 2. Por qué una vez extraída la sangre se debe proceder con rapidez? 3. Sabiendo que son los eritrocitos del dador, los que se aglutinan por las aglutininas del receptor, complete el siguiente esquema indicando con una flecha la dirección, en relación a que individuos de un determinado grupo del sistema ABO, pueden donarles sangre. 4.-La madre y el padre tienen grupos sanguíneos diferentes, los hijos tienen grupos distintos entre sí y diferentes al de los padres. Cuál es el genotipo y fenotipo de la familia? 5. Cual es la diferencia entre “Suero” y “Plasma” sanguineos?

EXTRACCIÓN DE ADN OBJETIVO: Observar la hélice del ADN, realizando una extracción sencilla a partir de sangre total.

FUNDAMENTO: Los ácidos nucleicos reciben este nombre porque fueron los primeros que se descubrieron en el núcleo de las células; se trata de moléculas orgánicas gigantes que contienen carbono, nitrógeno, hidrógeno, oxígeno y fósforo. Los ácidos nucléicos son de dos tipos: el primero, el ácido desoxirribonucleico (ADN), constituye el material genético dentro de la célula. Cada gen es un segmento de una molécula de ADN. Nuestros genes determinan los rasgos que heredaremos y, que mediante el control de las síntesis de proteínas, regulan las actividades que tienen lugar en nuestras células a lo largo de la vida y, el segundo el acido ribonucleico (ARN).

GENERALIDADES: La molécula de ADN es lineal sin ramificaciones, forma hebras largas, está formada por dos cadenas de polinucleótidos enrolladas alrededor del mismo eje, comúnmente conocida como doble hélice con giro a la derecha, cada una de ellas está formada por los fosfatos al exterior en contacto con el medio acuoso, éstos se unen en el C5 y C3 de un azúcar de cinco átomos de carbono llamado desoxirribosa se une a cada base en el ADN. Las bases púricas y pirimídicas se enlazan en el extremo opuesto del azúcar; las cuatro bases son: Adenina (A), Guanina (G), Timina (T) y Citosina (C). La adenina y la guanina son bases grandes de anillos dobles llamadas purinas; la timina y la citosina son bases más pequeñas de un solo anillo denominadas pirimidinas; se sitúan en la parte interna de la molécula, quedando perpendicularmente al eje, se enlaza una base púrica con una pirimídica por medio de puentes de hidrogeno, lo que le da mayor resistencia a la desnaturalización. Las cadenas de ADN son antiparalelas, es decir siguen direcciones opuestas, una va en sentido 5_ a 3_ y la 5_ (Ver Fig.).

opuesta en direccion 3_ a

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MATERIAL: Microscopio Cubreobjetos Portaobjetos Pipetas Probeta. Varilla de vidrio. Mortero Vasos de precipitado Arena Trozos de tela para filtrar o gasa.

MATERIAL BIOLÓGICO: Hígado de pollo.

REACTIVOS: Alcohol de 96_ Cloruro sódico 2M Dodecilsulfato de sodio. (SDS)

TÉCNICA: 1. Triturar un fragmento pequeño de hígado de pollo en un mortero. Añadir arena para que al triturar se puedan romper las membranas y se liberen los núcleos sueltos. 2. Añadir al triturado, 50 ml de agua destilada. Remover hasta hacer una especie de papilla o puré. 3. Filtrar varias veces sobre una tela para separar los restos de tejidos que hayan quedado por romper. 4. Medir el volumen del filtrado con una probeta. 5. Añadir al filtrado un volumen igual de cloruro sódico 2M. Con esto conseguimos producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina. 6. A continuación se añade 1 g de SDS. Así nos quedará el ADN libre de las proteínas que tiene asociadas. 7. Añadir mediante una pipeta 50 ml de alcohol de 96_. Hay que hacerlo de forma que el alcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos capas. En la interfase, precipita el ADN (Ver Fig.)

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8. Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma dirección. Sobre la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de la agrupación de muchas fibras de ADN.

OBSERVACIONES CON DIBUJOS: CONCLUSIONES: CUESTIONARIO: 1) Cómo se compone un nucleótido? Dibuja su estructura. 2) En que difieren el ADN y el ARN? 3) Elabora una tabla comparativa entre ADN y ARN.

BIBLIOGRAFÍA: 1. Nelson, J. 2002. Principios de Biología. Enfoque humana. México. D.F. Segunda edición. Editorial Limusa, S.A. Págs. 67-73 2. Lodish, H. 2005. Biología celular y molecular. México D.F. Quinta edición. Editorial panamericana. Págs. 104-111 3. Luque, J. 2003. Texto Ilustrado de Biología Celular e Ingeniería Genética. Madrid. Segunda edición. Editorial Harcourt S. A. Págs. 92-98 4. Ondarza R. 2000. Biología moderna: la célula, bioquímica, genética y biología molecular, biología general. México D.F. Décima edición. Editorial Trillas. Pág. 277 5. Tortora, G. 2002. Principios de anatomía y fisiología. México. Novena edición. Editorial Oxford. Págs. 53-55 6. Villee, C. 2003. Biología. Octava edición. México D.F. Editorial Mc Graw Hill. Págs. 583-593 7. http://www.arrakis.es/~rfluengo/anucleico.html 8. http://www.explora.cl/otros/biotec/adn.html

CÓDIGO GENÉTICO OBJETIVOS: Familiarizar al estudiante con la formación de proteínas como respuesta a una secuencia de codones específica (expresión de los caracteres hereditarios) teniendo como punto de inicio la información genética contenida en el ADN.

MATERIALES: 09 naipes de cada base nitrogenada (total 36), que serán repartidas entre tres alumnos. Cada uno recibirá 12 naipes al azar. Una tabla de codones con los aminoácidos específicos que será utilizada por el 4to alumno. Una baraja de 20 naipes que contengan los vocablos: Quimiotripsina, Tripsina, Exopeptidasa, Bromuro de cianógeno y Bromosuccinimida. 15 naipes en blanco, que los tendrá el 5to alumno.

INTRODUCCIÓN: Una vez que Crack (1958) propuso la hipotesis de la secuencia (“existe una relacion entre la ordenacion lineal de nucleotidos en el ADN y la ordenacion lineal de aminoacidos en los polipeptidos”), la comunidad científica la admitió y se plantearon dos preguntas:  Existe algún código o clave que permita pasar de la secuencia de nucleótidos en el ADN a la secuencia de aminoácidos en las proteínas?  Cómo se convierte la información contenida en la secuencia de ADN en una estructura química de proteína? La primera pregunta conlleva el estudio el desciframiento del código genético y el estudio de sus características. La segunda pregunta consiste en el estudio de los procesos genéticos de la síntesis de proteínas: la transcripción y la traducción.

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CARACTERISTICAS DEL CODIGO GENETICO Las características del código genético fueron establecidas experimentalmente por Francis Crack, Sydney Brenner y colaboradores en 1961. Las principales características del código genético son las siguientes: El código está organizado en tripletes o codones: cada tres nucleótidos (triplete) determina un aminoácido. El código genético es degenerado: existen más tripletes o codones que aminoácidos, de forma que un determinado aminoácido puede estar codificado por más de un triplete. El código genético es no solapado o sin superposiciones: un nucleótido pertenece sólo a un único triplete. La lectura es “sin comas”: el cuadro de lectura de los tripletes se realiza de forma continua “sin comas ” o sin que existan espacios en blanco. El código genético nuclear es universal: el mismo triplete en diferentes especies codifica para el mismo aminoácido. La principal excepción a la universalidad es el código genético mitocondrial.

ACTIVIDADES A DESARROLLAR

Procedimiento: Vamos a formar cadenas de proteínas uniendo aminoácidos según los codones que vayan apareciendo: El juego se desarrolla de la siguiente manera: 1. Cada grupo de 5 alumnos nominará a un compañero que pasará a otro grupo en calidad de veedor y será el jugador N 1. 2. Los jugadores que tienen las bases nitrogenadas barajarán sus naipes y el jugador N 1 depositará la primera que corresponde a una base nitrogenada. Lo mismo harán los otros dos jugadores, formándose así el primer triplete (codón). 3. El jugador N 4 seleccionará el anticodón respectivo, anotando en una hoja de papel el número de la jugada, el codón, el anticodón y el aminoácido respectivo. 4. El quinto jugador sacará al azar un naipe de su baraja. Si el naipe está en blanco, el juego continúa, si corresponde a los compuestos mencionados anteriormente (agentes químicos), se cumplirá con lo que se indica para su acción. (Cuadro 1). 5. Si la cadena ha sido cortada, en la siguiente jugada deberá darse inicio a otra nueva cadena. Se continuará con la numeración de la jugada que prosigue. 6. Se deben realizar un total de 120 jugadas, el juego será ganado por el grupo que pueda formar la cadena proteica más larga. 7. Cada grupo hará a su vez el análisis de la cadena más larga que logró formar. (Cuadro N 2), según el cuestionario.

Cuadro N 1: “Accion de diversos agentes sobra la cadena proteica en crecimiento ” AGENTE

CARACTERISTICAS

ACCION

Tripsina

Enzima proteolítica que ataca uniones Arg-X y Lys-X Se corta (siendo X cualquier aminoácido, menos prolina). No cadena ataca aminoácidos terminales y se requiere que la cadena tenga por lo menos 5 aminoácidos

Quimiotripsina

Enzima proteolítica que ataca uniones Trp-X, Tyr-X y Phe-X ) siendo X cualquier aminoácido menos Prolina). No ataca aminoácidos terminales y se Requiere que la cadena tenga por lo menos 5 Aminoácidos.

Exopeptidasa

Enzima que ataca al aminoácido terminal y lo separa de la proteína.

Bromuro de Cianógeno

Modifica el triptófano

Se corta cadena

la

la

Se descuenta un aminoácido y el juego continúa Se corta cadena

la

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Cuadro No 2: “Algunas características de los aminoacidos ”

Aminoácido Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina Serina Treonina Cisteína Metionina Acido aspártico Asparagina Acido glutámico Glutamina Arginina Lisina Histidina Fenilalanina Tirosina Triptófano Prolina

Abreviatur a Gli Ala Val Leu Ileu Ser Thr Cys Met Asp Asn Glu Gln Arg Lys His Phe Tyr Trp Pro

PM

Naturaleza Química

75 89 117 131 131 105 119 121 149 123 132 147 146 174 146 155 165 181 204 115

Neutra hidrofílica Neutra hidrofílica Neutra hidrofílica Neutra hidrofóbica Neutra hidrofóbica Neutra hidrofóbica Neutra hidrofílica Neutra hidrofílica Neutra hidrofílica Acida hidrofílica Acida hidrofílica Acida hidrofílica Acida hidrofílica Básica hidrofílica Básica hidrofílica Básica hidrofílica Neutra hidrofóbica Neutra hidrofóbica Neutra hidrofóbica Neutra hidrofílica

CUESTIONARIO

1. Cuántas cadenas se formaron? y ëCuántos aminoácidos contiene cada una? 2. De qué naturaleza es la cadena más larga formada? ëPor qué? 3. Cuál es el codón de iniciación en los procariotas? 4. Cuántos aminoácidos existen en la naturaleza y cuántos están constituyendo a las proteínas? 5. Qué tipo de aminoácido, proveniente del consumo de alimentos proteicos, es el que se asocia a la presencia de “migrañas”?. Por qué?

HERENCIA: LEYES DE MENDEL

OBJETIVOS: Familiarizarse con la terminología genética y con los experimentos que llevaron a Mendel a establecer las Leyes que rigen los mecanismos hereditarios en los seres vivos.

INTRODUCCION: La genética actual parte de las investigaciones realizadas por Mendel. Las leyes de Mendel que rigen la transmisión de los caracteres hereditarios se basan en el comportamiento de los cromosomas durante la meiosis y, sin embargo cuando Mendel enunció las leyes fundamentales de la herencia, nada se sabía sobre los cromosomas o la meiosis. Su descubrimiento se debe a experimentos cuantitativos y a un pensamiento abstracto y lógico aplicado a la interpretación de sus resultados. Lo extraordinario de la contribución de Gregor Mendel, que la diferencia de otras numerosas aportaciones del siglo XIX, fue: - Elegir el material de experimentación adecuado (Pisum sativum), que posee una flor autofecundable, con lo cual desarrolló razas puras en la naturaleza.

- Simplificar la tarea seleccionando caracteres con distribuciones alternativas claras (la más abundante o habitual con la menos abundante o frecuente), examinándoles uno por uno y luego procediendo a combinaciones más complicadas.

- Al evaluar los resultados, no quedó satisfecho con afirmaciones cualitativas, por lo que los cuantificó y esto le permitió establecer las leyes estadísticas que rigen estos fenómenos.

- Encontrar la interpretación biológica correcta para su ley estadística: las células germinales contienen los factores hereditarios (genes), cuya existencia se desprendía de sus experimentos.

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Fundamento Teórico: 1ra Ley o Ley de la uniformidad y la reciprocidad: “Del cruce de dos lineas puras la primera generacion filial está formada por individuos idénticos, que presentan sólo uno de los dos caracteres alternativos paternos, cualquiera que sea la direccion del cruce”. De los trabajos realizados se determinó que el carácter que se manifiesta en la F 1 es el llamado “ dominante”, quedando oculto el otro, al que se llamo “recesivo”

2da Ley o Ley de la segregación y de la pureza de los gametos: “Los caracteres hereditarios están controlados por pares de factores hereditarios, los cuales se separan durante la formacion de gametos ”. Cada guisante debe tener un par de homólogos de tales factores, de los cuales uno ha sido aportado por el óvulo y el otro por el grano de polen. Al dejar que se autofecunden de forma natural los híbridos obtenidos en las experiencias anteriores, se tuvo como resultado que el carácter que había quedado enmascarado (recesivo), reaparecía en la F2, en un individuo por cada tres que presentaban el carácter, obteniéndose una proporción fenotípica 3:1 y genotípica 1:2:1. Así mismo realizó lo que se denomina retrocruzamiento o cruce de prueba, que consiste en el cruce artificial entre los híbridos por la línea pura menos frecuente usada como parental, obteniéndose una F3 compuesta por la mitad de individuos que presentaban el carácter dominante y mitad con el recesivo.

3ra Ley o Ley de la distribución independiente o de la libre combinación de factores hereditarios: “ Cuando dos o más factores hereditarios se segregan simultáneamente, la distribución de cualquiera de ellos es independiente de los demas”. Esto es representado a través del cruce de dihíbridos (dihibridismo); es decir, de progenitores que difieren entre sí en dos caracteres, con lo que se obtiene en la F 1 las proporciones fenotípicas 9:3:3:1 y genotípicas 1:2:1:2:4:2:1:2:1.

ACTIVIDADES A DESARROLLAR Resolver 1.-

Zoila tiene los ojos azules , se casa con Victor que tiene ojos negros siendo heterocigoto para este carácter ¿ Qué color de ojos tendrán sus hijos? Exprese el fenotipo y genotipo.

2.

Verónica es hemofílica , heterocigota para este carácter , si se casa con Cesar que no es hemofílico , Exprese el fenotipo y genotipo de sus descendientes.

3.

Tony tiene grupo sanguíneo O , El es hijo de Carla y Mateo que son A y B heterocigotos respectivamente , ante dudas sobre la paternidad , como fundamentarías que Carla y Mateo son los padres de Tony.

4.

Quien es el padre del hijo de Carmen teniendo en cuenta que Pedro tiene grupo sanguíneo O , Cesar AB, Carmen es A heterocigoto y su hijo es B, Exprese el fenotipo y genotipo.

CUESTIONARIO 1. Es posible que 2 gemelos bivitelinos sean de diferente color? 2. Qué color de ojos pueden tener los hijos de una mujer de ojos negros (Aa) con un hombre de ojos verdes (aa)? 3. Describa de usted, 5 características fenotípicas indicando si provienen de su padre o de su madre. 4. Qué fenotipos son los más modificados en la sociedad? 3. Indique 10 enfermedades en humanos que se transmiten genéticamente.

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VIDEO EPIGENETICA

Objetivos

Reconocer la influencia del medio ambiente en la expresión genética Interpretar molecularmente la epigenética .

Introducción

El término fue acuñado por C. H. Waddington en 1953 para referirse al estudio de las interacciones entre genes y ambiente que se producen en los organismos Cuando hablamos de epigenética nos referimos a fenómenos que no afectan la secuencia de ADN de los genes pero que sí varían su expresión. La información epigenética modula, por tanto, la expresión de los genes sin alterar la secuencia de ADN. La expresión de nuestros genes están sujetos a variaciones como la ingesta de determinados alimentos como excesos de grasas o carbohidratos , presencia de pesticidas o por lo contrario hambrunas que resultan teniendo efecto fenotípico inclusive en generaciones posteriores. La comida contiene señales químicas que pueden inducir cambios fenotípicos Otro de los factores que influyen en la modulación génica es la temperatura , La actividad enzimática depende de la temperatura, pues cambios en la temperatura pueden afectar la manera en que las proteínas se doblan, y por lo tanto afectar su interacción con otros compuestos. Como el fenotipo depende de la actividad de muchas enzimas y de sus interacciones con proteínas en general, cambios en temperatura pueden resultar en cambios en el fenotipo.

Fundamento

Los cambios epigenéticos son cambios reversibles de ADN que hace que unos genes se expresen o no dependiendo de condiciones exteriores (polifenismo). Esta herencia alternativa viene fijada porque los genes se expresan o no dependiendo de ciertas condiciones bioquímicas como lo es la metilación del ADN o de las histonas, o bien la forma de la cromatina, y otras causas que aún no conocemos. El código epigenético está constituido por un sistema de moléculas unidas al ADN o a las histonas, y gobierna la expresión de los genes pues sus colas proteicas (las de las histonas) catalizan una gran variedad de adiciones químicas, como los acetilos que amplifican genes vecinos. •

Los patrones de metilación de ADN son los mejores estudiados y entendidos como marcadores de fenómenos epigenéticos

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información epigenética :

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La metilación del ADN ocurre, casi exclusivamente, en dinucleótidos CpG, teniendo un importante papel en la regulación de la expresión del gen.

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Esta regulación también denominada imprinting solo se dá en eucariontes mas no en organismos procariontes Un gen imprintado se manifiesta de una manera cuando su origen es paterno y de otra cuando proviene del gameto materno. Parece ser que existe un mecanismo celular que de algún modo "marca" o deja una impronta sobre todos los genes "imprintables" de acuerdo al sexo del individuo

La Epigenética y el cáncer •

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Frente al reconocimiento de niveles significativos de agentes cancerígenos hallados en la sangre de pacientes que padecen diversos tipos de cáncer , provenientes de una alimentación con restos de pesticidas , presencia de preservantes y colorantes ,que se dicen permitidos ,mientras que en laboratorio pruebas con roedores desarrollan tumoraciones ante estas sustancias ., Varias compañías se dedican casi exclusivamente a desarrollar medicamentos que restauren los cambios epigenéticos. Pharmion Corporation ha creado un nuevo fármaco llamado Vidaza, que bloquea la metilación del ADN en las células cancerígenas y estimula los genes que detienen el desarrollo tumoral. La empresa Epigenomics desarrolla pruebas de diagnóstico de los cánceres de mama y próstata basándose en la epigenética.

Cuestionario 1.-¿Qué recomendarías a un paciente con antecedentes familiares con diabetes? 2.-Investiga casos clínicos en donde se observe patologías desarrolladas mediante epigenética.