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“LABORATORIO BIOTECNOLOGIA” INFORME N° 01-RMV-LB-2016-EAPIA-UNAMBA PARA: Ing. Victor H. Sarmiento Casavilca DE:

Roger moina Villegas

PRACTICA N° 01 CONCERVACION DE CEPAS Y PREPARACION DE INOCULOS I.

INTRODUCCION

El punto de partida de cualquier fermentación es un recipiente limpio que ha sido esterilizado y rellenado con el medio de cultivo estéril. Posteriormente, el fermentador se inocula con el microorganismo adecuado. El tamaño del inóculo generalmente es del orden del 1-10% del volumen total del medio. Si es inferior a esta proporción puede existir un excesivamente prolongado período de latencia, lo que prolongará el período de fermentación. II. OBJETIVOS  Obtener copias fenotípicas idénticas de una cepa  Regenerar células  Obtener un inoculo a concentraciones conocidas

III.

MARCO TEORICO

Desde 1950, las enzimas lignocelulolíticas han incrementado su importancia en diferentes industrias como en la producción de alimentos, industria textil, industria papelera, agricultura e investigación (Bhat, 2000), principalmente debido a las ventajas que otorgan en la optimización de procesos. Además, por características como: su especificidad de sustrato, el requerimiento de condiciones suaves de pH, temperatura y presión para su actividad (comparando con procesos químicos), su contribución al cuidado del medioambiente haciendo los procesos más limpios y su posibilidad de inmovilización, evitando la presencia de éstas en los productos finales (MacCabe et al., 2002).

“LABORATORIO BIOTECNOLOGIA” Las enzimas lignocelulolíticas incluyen a celulasas y xilanasas. Las celulasas constituyen un sistema enzimático de cuatro enzimas: la endo β-glucanasa, que hidroliza randomizadamente celulosa a glucooligosacáridos; la exo β-glucanasa, que libera glucosa de la celulosa; lacelobiohidrolasa, que libera celobiosa de la celulosa cristalina; y la β- glucosidasa (Szijárto et al., 2004). Asimismo, las xilanasas constituyen también un complejo enzimático responsable de la hidrólisis de xilano, siendo las principales Cepas de niger enzimas involucradas la endo-1,4-β xilanasa, que rompe los enlaces glucosídicos de la cadena principal de xilano produciendo oligómeros de β-D xilopiranosil, y la β-xilosidasa que hidrolizan xilobiosa y xilanooligosacáridos (Polizeli et al., 2005). En respuesta a la demanda creciente de estas enzimas, se ha impulsado la investigación y el estudio de diferentes microorganismos lignocelulolíticos. Los hongos filamentosos son la fuente principal de hidrolasas, incluyendo celulasas y xilanasas, debido a su fácil manejo y costos reducidos. Los principales géneros incluyen a Aspergillus, Trichoderma y Penicillium (MacCabe et al., 2002). Aspergillus niger es uno de los microorganismos más utilizados en la producción de enzimas industriales, principalmente por sus altos niveles de secreción de proteína, y su estatus GRAS (generally regarded as safe) (Ward et al., 2006; Schuster et al., 2002; De Vries y Visser, 2001). De otro lado, el sistema de cultivo más empleado en la producción de enzimas comerciales es la fermentación sumergida (MacCabe et al., 2002). En este aspecto, en la producción de enzimas con hongos filamentosos, la morfología es de crucial importancia para lograr una mayor producción (Villena et al., 2010; Papagianni, 2004; Pazouki y Panda, 2000). Los factores que afectan la morfología incluyen el tipo y concentración de la fuente de carbono, la concentración del inóculo, los niveles de hidrógeno, fósforo y otros minerales traza, el O2 y CO2 disueltos, el pH y la temperatura, y factores físicos como geometría del fermentador, tipo de agitación, reología y sistema de cultivo (Grimm et al., 2005; Papagianni y Mattey, 2004). Las principales morfologías desarrolladas en sistemas de fermentación sumergida corresponden al crecimiento miceliar o filamentoso y el crecimiento tipo pellet, este último caracterizado por ser una esfera de micelio. Existen tres tipos principales de pellets, los de centro compacto

“LABORATORIO BIOTECNOLOGIA” y contorno laxo, los totalmente compactos, y los de interior vacío debido a autolisis (Pazouki y Panda, 2000). El objetivo del presente trabajo fue determinar, mediante cultivo sumergido, la influencia de la concentración del inóculo en la morfología y producción de celulasa y xilanasa de A. niger ATCC 10864. 5.- Preparación de inóculo elaborado. Conteo de esporas. Esta es la parte en la que un vivero puede encontrar mayor dificultad. Para solventarlo el Instituto del Corcho, la madera y el carbón Vegetal ponen a disposición de los viveros extremeños un servicio para la preparación del inóculo a partir de la suspensión elaborada previamente por el vivero. En el caso de que el vivero disponga de los medios para la preparación de inóculo, una vez preparada la suspensión esporal, siguiendo la metodología del apartado anterior, es necesario ajustar la concentración necesaria para la inoculación de las plantas en esporas/ml. Generalmente se utiliza una concentración de entre 5x105 y 5x107 esporas/planta, dependiendo de la dosis de riego, esto es, del número de ml a dispensar por planta. Esta cantidad de agua que va a ser añadida a la planta depende de: El volumen a aportar de la suspensión esporal debe estar ente 5 y 10 ml/planta por cada uno de los riegos que se realicen. Para realizar el ajuste de la concentración esporal, es necesario utilizar una cámara cuentaglóbulos o de recuento tipo Cámara Neubauer. Esta cámara permite hacer un conteo de esporas en una suspensión previa, por lo tanto podemos realizar el cálculo del agua que es necesario añadir para conseguir nuestra concentración objetivo. La cámara Neubauer dispone de una cuadrícula formada de recintos de 0,0025 mm2 y de 0,1 mm de profundidad, por tanto, de 0,00025 mm3 de volumen. El conteo se realiza en los 4 cuadrados de la diagonal de la cámara, formados a su vez por 16 cuadrados de 0,00025 mm3 Por tanto, realizaremos el conteo en 16 x 4 cuadrados de ese volumen. El procedimiento es el siguiente:

“LABORATORIO BIOTECNOLOGIA” - Limpiar bien la cámara con alcohol de 96º. - Colocar una gota de la suspensión esporal con la ayuda de una micropipeta. - Colocar el cubreobjetos de la cámara. - Introducir la cámara Neubauer en la placa del microscopio y realizar el conteo. El conteo se realizará en los cuadrados amarillos del siguiente gráfico. La secuencia el conteo se hará e acuerdo a las fechas indicas de rojo.

El número de esporas encontrado en esa diagonal se anotará, y se repetirá el proceso otras 2 veces (3 en total), agitando cada vez la suspensión esporal antes de tomar la dosis del recipiente de inóculo bruto con la micropipeta. Con los 3 datos de esporas contadas se calculará la media y se procederá a realizar el cálculo de esporas/ml. El cálculo es el siguiente: El volumen de 1 cuadrado de la cámara Neubauer es de 0,00025 mm3. Al hacer el conteo en la diagonal de la cámara, se cuenta el número de esporas en un volumen de: 0,00025 mm3 x 4 x 16 = 0,016 mm Si contamos X esporas en 0,016 mm3, podemos saber cuántas habrá en 1 ml. En resumen, el número de esporas por ml, nos lo dará la media de las esporas contadas dividido entre 0,000016. Esporas/ml= X/0,000016

“LABORATORIO BIOTECNOLOGIA” Como ejemplo, si la media de los 3 conteos nos da un valor de 20 esporas, la concentración será de 1,25x106 esporas/ml y queremos aportar 2,5x106 esporas/planta. Si hiciéramos un riego esporal con esa concentración (1,25x106 esporas/ml) añadiendo 10 ml por planta, estaríamos añadiendo 1,25x107 esporas/planta, de forma que la dosis sería excesiva. Con esa concentración podríamos hacer un riego esporal para 5 plantas, por lo que podríamos multiplicar por 5 el volumen de partida. Si este es de 1 litro, podríamos añadir 4 litros más de agua destilada de forma que regando con 10 ml/planta añadiéramos 2,5x106 esporas.

IV.

MATERIALES Y EQUIPOS

Equipos Cámara de new bawer Microscopio

Materiales Tubos de ensayo Pipeta Matraz Mechero de bunsen Alcohol Asa de siembra Agar agar 20 gr/1000ml Glucosa 15 gr/1000ml

“LABORATORIO BIOTECNOLOGIA” Extracto gr/1000ml

papa

20

V. PROCEDIMIENTO 1. Agar PDA (agar papa dextrosa)

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2. Los tubos se autoclavaron inclinados a 20 °c por 48 horas

3. Luego se utilizó la cama de new bawer microscopio

y poder mirar al

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VI.

RESULTADOS 60 65 62 52

∑ = 307 x

VII.

104

DISCUCIONES

La morfología de Aspergillus está influenciada por varios factores que incluyen las propiedades intrínsecas de cada cepa, la concentración y el tipo de inóculo, la velocidad de agitación, entre otros (El-Enshasy et al., 2006). Para A. niger se ha reportado la formación de pellets cuando la concentración del inóculo está por debajo de 108 esporas*mL-1 (Papagianni, 2004), sin embargo, en el caso de la cepa evaluada, la morfología de pellet se mantiene aún a concentraciones de 108 esporas*mL-1. Asimismo, se observó la formación de los pellets a partir de las 24 horas, los cuales fueron de tipo coagulativo, caracterizados por una agregación inicial de las esporas y micelio entrelazado, como ha sido reportado anteriormente (Villena y Gutiérrez-Correa, 2007; Znidarsic y Pavko, 2001; Pazouki y Panda, 2000; Ryoo y Choi, 1999). De otro lado, la diferencia en la concentración de esporas puede explicar el aspecto de los pellets obtenidos en cada caso. El color oscuro de pellets formados a la concentración de 108 esporas*mL-1 pudo deberse a inhibidorespropios, que inhiben la germinación de esporas cuando están en altas

“LABORATORIO BIOTECNOLOGIA” concentraciones (Barrios-Gonzáles et al., 1989). También, el tamaño de los pellets, particularmente para A. niger, se explica por el equilibrio termodinámico que existe entre la superficie del pellet y el medio; la alta hidrofobicidad de las esporas rompe la tensión superficial del medio dando lugar al crecimiento en forma de pellet, mientras mayor sea el inóculo, menor será la tensión superficial del medio y más pequeños los pellets formados (Ryoo y Choi, 1999). Los tamaños de pellets obtenidos en cada caso son coincidentes con este comportamiento. De otro lado, la morfología desarrollada por un microorganismo tiene una marcada influencia en la productividad. Para la producción de cada enzima o metabolito se tiene una morfología apropiada con la cual se alcanza una productividad óptima; por ejemplo, para la producción de ácido cítrico por VIII. CONCLUSIONES La concentración inóculo de esporas no muestra una marcada influencia en la morfología desarrollada por A. niger ATCC 10864 en matraz agitados de cultivo sumergido, la cual fue del tipo pellet. Sin embargo, esta influye considerablemente tanto en la velocidad de crecimiento como en la producción de celulasas y xilanasas, existiendo una relación lineal inversa entre el logaritmo de la concentración de inóculo y la tasa específica máxima de crecimiento μmax. Aunque no se evidencia una diferencia significativa de la productividad volumétrica (Γ FPA) de celulasa para las dos concentraciones de inóculo probadas, en xilanasa sí se obtiene mayor productividad volumétrica para la concentración 108 esporas*mL-1. En ambos casos las productividades específicas de celulasas y xilanasa (UI*g-1*h-1) fueron superiores a las obtenidas en estudios anteriores para otra concentración de inóculo. IX. BIBLIOGRAFÍA 1. Barrios-Gonzáles, J., Martínez, C., Aguilera, A., Raimbault, M. 1989. Germination of concentrated suspensions of spores from Aspergillus niger.Biotechnology Letters, 11: 551-554. 2. Bhat, M. K. 2000. Cellulases and related enzymes in biotechnology review.Biotechnology Advances, 18: 355- 383. 3. Chipeta, Z., du Preez, J .C., Szakacs, G., Lew, C. 2005. Xylanase production by fungal strains on spent sulphite liquor.Applied Microbiology and Biotechnology, 69: 71-78.