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• David Ludeña Panta

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“AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCIÓN Y LA IMPUNIDAD” UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL

ESCUELA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL E INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

INFORME N°02 TEMA: INMOVILIZACION DE CELULAS MICROBIANAS

ALUMNOS: GARCIA CRISANTO SILVIA EDITH

DOCENTE:

McBLGO. JORGE LUIS BERMEJO BENITES

CURSO: BIOTECNOLOGÍA

FECHA: 10 DE JULIO DEL 2019

PIURA – PERÚ

I.

INTRODUCCIÓN

Los países desarrollados en la actualidad experimentan grandes avances en el campo científico y particularmente en el campo de la biotecnología. En el Perú existen pocos trabajos al respecto. No obstante, el interés de muchos investigadores en el estudio de inmovilización celular como técnica de aplicación de la biotecnología ha permitido desarrollar nuevos métodos que han vuelto rentables a muchos procesos y productos industriales por su simpleza y rendimiento.

Dentro de la industria alimentaria, la inmovilización de microorganismos en soportes naturales o sintéticos proporciona estabilidad a las funciones celulares. Esta técnica permite alcanzar altas concentraciones celulares en volúmenes reducidos, así como la reutilización como biocatalizador y la implantación de sistemas de continuos de producción.

En este caso, el uso de células inmovilizadas dentro de procesos continuos para la producción de bebidas fermentadas representa una línea de investigación de elevado interés debido a las ventajas económicas y técnicas que presenta en comparación a los sistemas discontinuos con células libres. En ese sentido, los procesos que utilizan levaduras inmovilizadas en soportes gelificantes, proporcionan la oportunidad de superar los largos tiempos de fermentación y maduración encontrados en las industrias cerveceras tradicionales; dichos geles que contienen levaduras inmovilizadas en su estructura, se utilizan para controlar el pardeamiento de bebidas que se produce con el paso del tiempo. Los geles comprenden una matriz de polisacárido natural como base del gel, y células de levaduras inmovilizadas en la estructura de dicha matriz. Los geles así constituidos permiten tanto corregir el color de una bebida que ya ha pardeado, como para prevenir el desarrollo de color en una bebida susceptible de pardear con el paso del tiempo. En el presente informe se desarrolla uno de los diversos métodos de inmovilizar levaduras con capacidad de reutilización, a fin de valorar su importancia en procesos industriales

El objetivo del presente artículo es revisar las aplicaciones de la inmovilización de diversas especies microbianas durante la biodegradación de contaminantes, con énfasis en la aplicación de esta tecnología para la biorremediación de suelos contaminados con compuestos orgánicos.

En la última sección se hace una revisión del estado del arte de la aplicación de los microorganismos inmovilizados en el tratamiento de suelos contaminados. En general los reportes se refieren a trabajos realizados a nivel de laboratorio, en los que se han empleado preferentemente soportes convencionales en forma de mezclas que permiten lograr una mayor resistencia del soporte. Estos estudios han reiterado el incremento de la eficiencia de las células inmovilizadas.

II.

OBJETIVOS



Conocer la técnica de inmovilización de la levadura (Saccharomyces cerevisiae) de agar - agar.



Evaluar y comparar la producción de alcohol de las células inmovilizadas y de las células libres.

III.

MARCO TEÓRICO

Los usos de nuevos métodos biotecnológicos están centrados en la optimización de un proceso, que nos permitan obtener productos metabolizados por microorganismos y que a la vez sea útil para el hombre. Tal es el caso de inmovilización de células, método que está basado en la limitación del movimiento de células vivas a cualquier parte de su entorno, promoviendo así la efectividad de tomar el sustrato y transformarlo en el producto deseado, y cuyas ventajas nos ofrecen que la célula se encuentre protegida a sustancias tóxicas y estrés ambiental, que aumente su optimización y reduzca los costos de su manejo. Existen diferentes técnicas para lograr una inmovilización celular, que están basadas en el micro encapsulamiento (rodear completamente a las células), comúnmente son polímeros no tóxicos y biocompatibles para la protección de la célula. Por ejemplo, la inmovilización en alginato y la inmovilización en agar, ambas técnicas permiten que las células no pierdan su actividad metabólica a pesar de encontrarse encapsuladas en una consistencia más sólida en caso del alginato o a comparación del agar que como matriz tiene menor rigidez. El encapsulamiento de microorganismos suele ser de mayor dificultad, ya que no todos los microorganismos responden favorablemente a una inmovilización, por lo tanto, para comenzar a inmovilizar es recomendable el uso de levadura, que nos asegurará la formación de esferas en alginato y/o en agar, y por ende una fermentación deseada.

3.1

INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

La investigación sobre inmovilización de organismos unicelulares ha generado gran interés en la comunidad científica, debido a sus grandes ventajas técnicas y económicas respecto a la fermentación tradicional. Entre las principales ventajas que presentan los sistemas biotecnológicos que utilizan células inmovilizadas se encuentra su facilidad para el manejo de una mayor densidad celular comparado con los procesos tradicionales, un mejor control en sistemas continuos y la posible recuperación de la biomasa para su posterior reutilización. En general, los materiales para inmovilizar células deben cumplir importantes requisitos como: ser grado alimenticio (según sea el caso), bajo costo, disponibilidad, no degradables y aptos para condiciones de pH y temperatura bajas.

Los métodos de inmovilización de células más usados son la autofloculación, la adsorción sobre soportes y la incorporación de levaduras en matrices sólidas. ha sido esterilizado y posteriormente inoculado con el microorganismo deseado.

3.2

PROBLEMAS CON LA INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

Si bien, el uso de células inmovilizadas en matrices sólidas ha permitido la implementación de procesos de fermentación en sistemas de flujo continuo. Existen numerosos problemas que se presentan a nivel industrial, los cuales se describen a continuación. Los sistemas floculados presentan un difícil manejo debido a que la floculación depende de factores como el pH, la concentración de Ca2+, temperatura y la agitación, Además, cada cepa de levadura presenta un comportamiento diferente (Jin y Speers, 1999). Otro caso, es el uso de membranas microporosas como filtros para retener las levaduras en el reactor, lo cual resulta muy costoso cuando se emplean reactores continuos. El mayor problema que presenta esta técnica es el bloqueo que eventualmente sufren los poros de la membrana debido a partículas o a las mismas levaduras (Lebeau et al., 1998). Por otro lado, la inmovilización de células por adsorción sobre la superficie de materiales es fácil de conseguir, pero al ser la adsorción un fenómeno fundamentalmente electrostático, durante los procesos en continuo, especialmente por efecto de la agitación, las células se liberan del soporte. Además, por este método es difícil inmovilizar grandes cantidades de biomasa (Verbelen et al., 2006).

3.3

OTROS MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS PARA PROCESOS DE FERMENTACIÓN

Si bien, existe una problemática alrededor del uso de células inmovilizadas, hoy en día se han enfocado esfuerzos en el desarrollo de rutas novedosas que permitan el desarrollo de sistemas inmovilizados mediante el uso de materiales porosos diferentes a los polímeros de origen natural que se han usado hasta ahora. Muchos de estos sólidos porosos podrían encontrar un lugar importante en los procesos de producción de vinos y fermentaciones alcohólicas en general. Las zeolitas y los diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados en diversos procesos catalíticos, prueba de ello es su extensa aplicación (Corma, 1995). Debido a su tamaño de poro pequeño, no sería posible inmovilizar levaduras dentro de sus cavidades. Sin embargo, el uso de membranas zeolíticas sí podría ser de gran utilidad en procesos de fermentación en los que se requiere eliminar el etanol del reactor de forma selectiva (Bowen et al., 2003). Para tal aplicación se podrían emplear materiales zeolíticos hidrofóbicos convencionales como la zeolita beta o materiales híbridos orgánicosinorgánicos como los metilaluminofosfatos-alfa y metilaluminofosfatos–beta (Maeda et 1997).

Cabe mencionar que la producción de membranas zeolíticas compactas y con propiedades mecánicas adecuadas no es sencilla y hoy en día sigue siendo un reto para muchos grupos de investigación.

Los materiales mesoporosos templados mediante aglomeraciones micelares, aunque siguen sin presentar el tamaño de poro adecuado para la inmovilización de levaduras, sí permiten la inmovilización de enzimas .Esto hace que estos sólidos tengan un interés especial en la industria vinícola ya que mediante el uso de enzimas podrían modificarse la naturaleza de algunas sustancias responsables de aromas y sabores característicos del vino consiguiéndose productos con propiedades organolépticas diferentes. Los materiales mesoporosos más adecuados para la inmovilización de enzimas serían los sólidos del tipo SBA-15 debido a su gran tamaño de poro La inmovilización de las enzimas se conseguiría por difusión de las mismas en los poros del sólido previamente funcionalizado con moléculas que “anclarían” la enzima a la pared del material. Sólidos como los que se proponen aquí podrían usarse en procesos en continuo o en sistemas fluidizados. (Hartmann, 2005)

3.4

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

En la actualidad, la industria requiere gran cantidad de enzimas con el fin de obtener productos con mejores características y menor costo. Por ello, la implementación de procedimientos que aumenten la estabilidad de las enzimas y permitan su reutilización ha sido por muchos años el objetivo de diversos laboratorios alrededor del mundo. La preparación y estabilización de enzimas ha sido un tema de estudio desde hace casi 50 años y es de interés tanto científico como económico. La inmovilización combina la actividad elevada y específica de las biomoléculas activas, como las enzimas o anticuerpos, con la estabilidad química y mecánica del soporte. Consiste en mantener la biomolécula unida o atrapada en un soporte físico, conservando su actividad catalítica y permitiendo el flujo de sustratos y productos. Las enzimas pueden ser inmovilizadas en sustratos naturales y/o sintéticos por medios químicos (uniéndolas al sustrato mediante enlaces covalentes) o físicos (fuerzas electrostáticas o membranas), y pueden además ser encapsuladas mecánicamente la adición de agentes que formen una película protectora alrededor de la enzima inmovilizada, permitiendo el paso de reactivos y productos de pequeño tamaño, pero no de proteínas (Heering et al., 2004; Wang y Caruso, 2005). Las enzimas inmovilizadas presentan varias ventajas sobre su contraparte en solución. Permiten un uso continuo, reutilización y control de las concentraciones de proteína empleada. Asimismo, es viable mejorar la estabilidad y actividad de la enzima en función del pH y la temperatura, además, al ser inmovilizadas quedan protegidas ante enzimas proteolíticas, aumentando así la eficiencia del sistema.

Sin embargo, la inmovilización también puede presentar ciertas desventajas, por ejemplo, la actividad de la enzima puede verse afectada por el proceso de inmovilización, además, la velocidad de reacción puede estar limitada por la velocidad de difusión de sustratos y productos hacia dentro y fuera del sistema.

3.5

CLASIFICACIÓN DE MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN

Los métodos de inmovilización de enzimas se clasifican en dos rubros: métodos reversibles y métodos irreversibles:

3.5.1 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN IRREVERSIBLES El concepto de inmovilización irreversible implica el enlace del biocatalizador a un soporte de manera permanente, por lo cual el biocatalizador no puede ser liberado sin destruir o modificar su actividad biológica o el soporte. Los procedimientos más comunes de inmovilización irreversible son el enlace covalente, enlace cruzado, atrapamiento y micro encapsulado.

a) Formación de enlaces covalentes Las inmovilizaciones de proteínas por métodos basados en la formación de enlaces covalentes están entre los más usados. La ventaja de estos métodos estriba en la naturaleza estable de los enlaces formados entre las enzimas y el soporte. De igual manera, las enzimas en este método no son liberadas en la solución en uso. Sin embargo, para lograr altos niveles de enlace, los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad catalítica no deben involucrar un enlace covalente con el soporte, aunque esto puede resultar difícil de lograr en algunos casos. Los métodos covalentes de inmovilización son empleados cuando existe un requerimiento estricto de ausencia de enzimas en el producto.

Los métodos de acoplamiento en general pueden dividirse en 2 clases: 1 activación de la matriz o soporte por adición de una función reactiva en un polímero y 2 modificación del polímero para producir un grupo activado. Los procesos de activación son comúnmente diseñados para generar grupos electrofílicos en el soporte, el cual durante el acoplamiento reaccionan con los fuertes nucleófilos en las proteínas. Los principios básicos que controlan el acoplamiento covalente con matrices son análogos con las usadas en la modificación química de proteínas. Las reacciones más usadas involucran las siguientes cadenas de amino ácidos: lisina (grupo amino), cisteína (grupo tiol), y ácidos aspártico y glutámico (grupo carboxilo).

En este método se enlaza covalentemente la enzima con un soporte insoluble natural o sintético. El enlace se da entre algún grupo funcional reactivo de la enzima (amino, Cis-tiol, Tir-hidroxil o Hisimidazol) y el soporte previamente activado, generalmente recubierto con grupos funcionales orgánicos en la superficie (Monocapas tiol autoensambladas, oro, CNBr-Sepharosa, etc.).

El seguimiento de la inmovilización se realiza cuantificando la concentración de proteína libre (generalmente por el método de Bradford), y de la proteína unida covalentemente al soporte (ej. ácido bicinconínico). Las desventajas de este método radican en el sitio del enlace, ya que puede modificarse el sitio activo o pueden ocurrir impedimentos estéricos que reduzcan la actividad. Sin embargo, esto es poco probable y puede verse reducido al dirigir el enlace a sitios específicos y/o con una orientación molecular definida. Además, la unión por enlace covalente confiere a la enzima una inmovilización más estable a cambios de pH y temperatura en el medio (Queiroz-Claret et al., 1997).

b) Formación de enlaces cruzados Con esta técnica los soportes no son necesarios, ya que la inmovilización se da por un enlace directo entre enzimas, que puede ser mediado o no por un agente de unión. Generalmente se añade el agente de bajo peso molecular (ej. glutaraldehído) a la enzima en solución, uniendo covalentemente los grupos funcionales de las enzimas para formar agregados. Este método tiene como ventaja su sencillez, sin embargo, es susceptible a cambios pequeños de pH y temperatura en las condiciones de operación (Gódia-Casablancas, 2005). c) Atrapamiento El método de atrapamiento está basado en la oclusión de las enzimas dentro de una red polimérica que permite al sustrato y a los productos pasar a través de ellos y retener las enzimas. Este método difiere de los métodos de acoplamiento covalente descritos anteriormente, ya que las enzimas no están enlazadas a la matriz o soporte. Existen diversos métodos de atrapamiento de enzimas como el de gel o atrapamiento por fibras, microencapsulado y por inclusión. El uso práctico de estos métodos es limitado debido a la baja transferencia de masa a través de las membranas o geles. Atrapamiento por inclusión. Con este método la enzima queda atrapada dentro de una matriz de gel que permite una fácil difusión de productos. La matriz puede ser de origen natural o sintético y de diversos materiales (Sílica gel, poliacrilamida, agarosa, carregnatos, entre otros), y pueden clasificarse como geles húmedos, geles secos (xerogeles) o geles en aerosol (aerogeles). En este método las enzimas son colocadas en una solución que posteriormente es gelificada (por temperatura o adición de polimerizantes), quedando atrapadas dentro de la matriz. En algunos casos el gel es sometido a un proceso de secado y molido, obteniendo así mayor área de contacto entre la enzima y la solución que contiene el sustrato (Figura 3B), dando como resultado esferas de 2 Sm con un tamaño de poro de 35 ± 7 Å También es posible incrementar la capacidad de inmovilización de los geles al utilizar agentes estabilizadores (sorbitol, polietilenglicol, diferentes mono- o disacáridos) y surfactantes (lecitina, lactosa, 3-sn-fosfatidilclorina, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) o al añadir agentes policatiónicos o polianiónicos con carga contraria a la enzima o a regiones de la superficie de la misma como el poli(1-vinilimidazol) (PVI) y la poli(etilamina) (PEI) antes de la polimerización .

La inclusión tiene la ventaja de prevenir el acceso de proteasas y mantener intacta la estructura de la proteína, por lo que su actividad no se ve afectada. Sin embargo, el tamaño de los poros no puede ser controlado, es difícil de escalar y reutilizar ya que el gel puede disolverse bajo ciertas condiciones o tras poco tiempo de uso, y un aumento en la cantidad de enzima cargada más allá de cierto punto no implica necesariamente un aumento de la actividad, debido a las limitantes de difusión que se podrían presentar.

3.5.2 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN REVERSIBLE En el método de inmovilización reversible, las enzimas inmovilizadas pueden ser desprendidas del soporte bajo condiciones no extremas. El uso de métodos reversibles para la inmovilización de enzimas es altamente atractivo, principalmente por razones económicas debido a que el soporte puede regenerarse y recargarse con enzimas nuevas cuando la actividad enzimática decae. Existen distintos métodos de inmovilización reversible, que a continuación se describen: a) Por adsorción El método de adsorción emplea soportes orgánicos o inorgánicos que presentan un adsorbente activo (monocapastiol auto ensambladas, oro, entre otros) en los cuales, las enzimas son atraídas y retenidas por medio de interacciones iónicas o fuerzas débiles (puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrofóbicas). Este método consiste en poner en contacto la enzima en solución acuosa con un soporte adsorbente por un lapso de tiempo dado (2-48 h), para después lavar el soporte y eliminar la enzima que no fue inmovilizada. Presenta la ventaja de mantener intacta la actividad de la enzima, ya que la unión es débil y no afecta su conformación, sin embargo, esta característica hace que al mismo tiempo la unión sea reversible y sensible a cambios de pH y temperatura. (Woodward, 1985). b) Adsorción no específica El método de inmovilización reversible más simple es la adsorción no específica, el cual se basa en la adsorción física o enlace iónico. En la adsorción física las enzimas son unidas a la matriz a través de puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, o interacciones hidrofóbicas; mientras que enlaces iónicos de enzimas son producidos a través de uniones con sales. La naturaleza de las fuerzas involucradas en la inmovilización no covalente resulta en un proceso que puede ser reversible cambiando las condiciones que influyen en la resistencia de la interacción (ej. pH, resistencia iónica, temperatura y polaridad del solvente). La inmovilización por adsorción es fácil de realizar y usualmente preserva la actividad catalítica de la enzima. Dichos métodos son, por lo tanto, atractivamente económicos, pero pueden presentar problemas como la liberación de enzimas cuando las interacciones son relativamente débiles. De igual forma es difícil encontrar condiciones bajo la cuales las enzimas permanecen enlazadas fuertemente y activas. (Woodward, 1985).

c) Adsorción hidrofóbica Otro método es el uso de interacciones hidrofóbicas, donde la adsorción hidrofóbica ha sido utilizada como un principio cromatográfico por más de 3 décadas. Consiste en variables experimentales conocidas como el pH, concentración de sales, y la temperatura. La resistencia de las interacciones radica en la hidrofobicidad del adsorbedor y de la proteína. La hidrofobicidad del adsorbedor puede ser regulada por el grado de sustitución del soporte y por el tamaño de la molécula ligante hidrofóbica. El éxito de la inmovilización reversible de la β-amilasa y amiloglucosidasa en soportes de hexilagarosa ha sido reportada. Muchos otros ejemplos de enlace reversible con adsorbedores hidrofóbicos han sido también. ( Woodward, 1985).

IV.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS:

4.1

MATERIALES:



INSUMOS

-

Agua helada

-

Aceite refrigerado

-

Levadura 0.5 gr

-

Agua destilada 100 ml

-

Agar



INSTRUMENTOS

-

Jeringa

-

Refractómetro

-

Matraz de Erlenmeyer

-

MEDIO DE CULTIVO

-

Sulfato de potasio 0.5 gr

-

Glucosa o sacarosa 10 gr

-

Ku2PO4

4.2 

PROCEDIMIENTO: Se coloca con la ayuda de una jeringa (gota a gota) la solución de agar .15gr de agar por 1 litro de agua helada (soporte) y la levadura, produciendo una mezcla.



Se retira el aceite y luego se extraen las esferas pequeñas formadas en el fondo del matraz.



Se lleva a una solución con extracto de levadura 0.5 gr, sulfato de potasio 0.5 gr, glucosa o sacarosa 10 gr y agua destilada 100 ml. Para la determinación de alcohol se puede utilizar la tabla específica ºBrix,



Se extrae una muestra y se miden el ° Brix con el refractómetro.

V.

DISCUCIONES: 

Las diferencias de producción de alcohol entre el biorreactor “A” y “B”, se deben a que al momento de ejecutar el ensayo en el biorreactor “A” se tuvo problemas en el corrimiento de agar agar - inoculado a través de las pipetas.



Esto no sucedió con el biorreactor “A” donde se desarrolló el ensayo con normalidad. Aunque también se deduce que hubo diferencias en el tamaño ya que este parámetro es manejado por el personal que realizó el ensayo, en la concentración de agar agar entre otros.



Así mismo en los biorreactores “A” y “B” se observó un sedimento que corresponde a: 1) proteínas del mosto precipitadas, 2) células y 3) las perlas de agar agar las cuales han precipitado, debido al crecimiento de las células y entrada de sustrato. Esto también se observó en el biorreactor.



Al realizar el ensayo se ha optimizado el proceso normal de fermentación de mosto de uva debido a la utilización de un inóculo de células (levaduras) comprobando una mayor producción en un corto tiempo (7 días), lo que no se obtendría en procesos normales.



Con respecto a la separación del producto (fermento - alcohol), esta es fácil cuando las células están inmovilizadas evitando pérdida de tiempo y dinero que si se gastaría al recuperar el producto de un biorreactor (como el biorreactor) donde las células están libres.

VI. 

CONCLUSIONES La producción de alcohol es mayor cuando en el proceso de fermentación se usan células inmovilizadas.



Al optimizar el proceso de fermentación normal es posible recuperar mayor cantidad de producto en un corto tiempo.



El aceite común utilizado fue un buen formador de perlas de agar-agar, debido a su propiedad hidrofóbica.



El Agar-Agar al resultó ser un eficaz inmovilizador celular.



La separación del producto es fácil cuando las células están inmovilizadas.

VII. BIBLIOGRAFÍA 

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