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Universidad de las Fuerzas Armadas “ESPE” Departamento de Ciencias de la Vida y Agricultura Ingeniería en Biotecnología Microbiología II Nombres: Jara Wendy, Ordóñez David, Zurita Massiel NRC: 3564 Asignatura: Microbiología II Fecha: 31/10/2019 Nombre Docente: Andrés Izquierdo, Ph.D. 1. Tema: Staphylococcus: Aislamiento e Identificación 2. Resumen Los estafilococos toman importancia en la década de los cincuenta cuando empiezan a ser la principal causa de infecciones intrahospitalarias principalmente por Staphylococcus aureus resistente a la penicilina sintética por lo cual es importante central el estudio en estas bacterias, por ello aquí se busca identificar en mucosa de la nariz la presencia de estos extrayéndolos en medio enriquecidos con cloruro de sodio y aislándolos en agar manitol salado y agar de Sthapyloccocus 110 y realizando pruebas de coagulasa, hemólisis y tinción Gram para su verificación obteniéndose así aislamiento de colonias en medios MSA y SM110 tanto de nariz como de fómite, de igual manera en prueba de hemólisis en agar sangre de muestras de la nariz y tinción Gram, concluyendo que forman parte de la flora bacteriana de la nariz y del fómite a excepción del control donde se observa bacilos. Palabras clave: Aureus, agar sangre, coagulasa, MSA, SM110 3. Introducción a. Antecedentes. En la década de los cincuenta cuando empieza la aplicación de la penicilina y sulfonamidas, los estreptococos son desplazados por los estafilococos por las infecciones que se producían al interior de los hospitales en aquella época. Después en los años 70 predominan las enfermedades de microorganismos Gram negativos, pero por el uso de catéteres endovenosos y terapia inmunosupresora, estas bacterias Gram positivas, reaparece en el momento de causar infecciones principalmente Staphylococcus aureus resistente a la penicilina semisintética denominada meticilina que apareció en 1959 siendo un importante causante de infecciones nosocomiales (Gil, 2000). b. Justificación. Staphylococcus aureus son un grupo de bacterias etiológico siendo el principal causante de varias patologías humanas especialmente nosocomiales,

además de piel, tejidos blandos e infecciones del sistema nervioso central tanto en comunidad como a nivel intrahospitalario. En comunidad las infecciones sueles ser superficiales, pero también han llegado a causar profundas como osteomielitis, neumonía y endocarditis aguda. A nivel hospitalario son causantes de infecciones quirúrgicas de herida, también S. epidermidis y saprophyticus causan infecciones en zonas de la piel y vías urinarias respectivamente, por lo que su estudio se vuelve primordial al tratar de combatirlas (Gil, 2000; Seija, 2008). 4. Objetivos General Identificar Staphylococcus aureus mediante aislamiento de colonias y varias pruebas de laboratorio. Específicos   

Recolectar muestras de nariz, fómite y control desconocido en medios enriquecidos con cloruro de sodio. Aislar colonias de S. aureus agar manitol salado y agar Staphylococcus 110. Determinar la presencia de S. aureus mediante Tinción Gram, pruebas de coagulasa y hemólisis. 5. Hipótesis

La especie Staphylococcus aureus debe presentar resultados positivos en pruebas de coagulasa, en medio MSA y en medio agar sangre. 6. Marco Teórico Los estafilococos son bacterias en forma de coco Gram positivas dispuestas en racimo con borde irregular, crecen rápidamente en distintos medios de cultivo, tienen actividad metabólica, fermentan carbohidratos y producen pigmentos que van desde un color blanco hasta un amarillo intenso (Gallego Maldonado, Otálora Díaz, Urbano Cáceres, & Morales Súarez, 2018) Pertenecen al reino Bacteria, a la clase Bacilli, orden Bacillales, Familia Staphylococcaceae y género Staphylococcus. Staphylococcus aureus es el estafilococo más común causantes de enfermedades fuera y dentro de los hospitales, sin embargo, no es la única especie de Staphylococcus que presenta patogenicidad (CEFA, 2015). Su identificación se puede realizar por distintos métodos, por ejemplo: en las pruebas bioquímicas se deben realizar las pruebas de catalasa, coagulasa, presencia de nucleasas y desoxiribonucleasas; pero también existen otros métodos de identificarlo, tales como la aglutinación con partículas de látex (CEFA, 2015).

Para realizar un diagnóstico de laboratorio de Staphylococcus se debe tomar una muestra de pus, sangre, aspirado traqueal o líquido cefalorraquídeo, se realiza un frotis y se observa que sean bacterias Gram positivas en un microscopio óptico de campo claro. Se lo cultiva en agar sangre y se los incuba a 37°C durante 18 horas, solo S. aureus fermenta manitol, otras especies de Staphylococcus no. Finalmente se realizan pruebas de catalasa y coagulasa para determinar que Staphylococcus se trata. Adicionalmente se realizan pruebas de susceptibilidad a antibióticos para determinar que antibióticos recetar (Gallego Maldonado, Otálora Díaz, Urbano Cáceres, & Morales Súarez, 2018) S. aureus puede producir toxinas de acción general como las hemolíticas (α, β, γ y δ) y la leucocidina, y también toxinas especializadas como las exfoliatinas, toxina del shock tóxico y enterotoxinas. Las hemolisinas son importantes toxinas citolíticas sobre una variedad de células (Bush & Perez, 2016) 7. Metodología Primero Parte Usando largos hisopos estériles ser tomo la muestra del fómite (billete) y de la nariz, tomando en cuenta que se humedeció un poco el hisopo antes de recolectar la muestra para una mejor adherencia, con un asa bacteriológica, previamente esterilizada, se tomó una muestra del control (S. aureus). Las muestras fueron inoculadas en caldo nutriente. Se incubó durante 24 horas a 37 ºC. Segunda Parte Se observo el crecimiento microbiano en el caldo nutriente y se tomó muestras para inocular en medios de SM110 y MSA. Para todas las muestras se realizó la técnica de estrías por agotamiento. Para la muestra de fómite y nariz, se uso la misma caja Petri dividida en la mitad, mientras que, para el control, se uso una caja Petri individual para cada medio. Se incubó durante 24 horas a 37 ºC. Tercera Parte Se evaluó la presencia de un crecimiento correcto en cada medio, y de las distintas muestras se tomo colonias separadas para distintas pruebas. La primera se elaboró Tinción Gram, para identificar si los organismos son Gram positivos y si en efecto eran estafilococos. Luego con los resultados positivos de estafilococos se realizo la prueba de coagulasa, donde se colocó una colonia de la muestra de nariz y del control. Finalmente se inoculo el agar sangre con la técnica de estrías por agotamiento, de las muestras del agar MSA y el resultado de nariz del medio SM110. 8. Resultados

Fig. 1. Muestras de nariz y fómite cultivadas en caldo nutriente

Tabla 1. Resultados de inoculación de muestras en medios de cultivo SM110 y MSA Gráfico

Observación Muestra en medio MSA: Muestra de nariz presenta aislamiento de colonias bacterianas, muestra fómite mucho crecimiento bacteriano. Colonias de forma circular, puntiforme, amarillas y cóncavas.

Muestra en medio SM110: Tanto muestra de nariz, como muestra de fómite, presentan aislamiento de colonias. Colonias de forma circular, puntiforme, amarillas y cóncavas.

Muestra en medio MSA: Muestra control presento una considerable cantidad crecimiento. Casi no se llega a notar muchas colinas separadas.

Muestra en medio SM110: Muestra control, crecimiento bacteriano que permite notar las colonias bacterianas bien formadas.

Tabla 2. Tinción Gram de resultados aislados de medios MSA y SM110

Resultados

Observación Bacterias Gram positivas, forma de bacilos, organizadas en pequeñas duplas y triadas.

Fig. 2. Tinción Gram. Muestra fómite en medio MSA

Bacterias Gram positivas, forma de bacilos y unos cuantos cocos, organizadas en pequeñas duplas y triadas.

Fig. 3. Tinción Gram. Muestra fómite en medio SM110

Bacterias Gram positivas, forma de cocos, organizadas en racimos.

Fig. 4. Tinción Gram. Muestra nariz en medio MSA

Bacterias Gram positivas, con forma de cocos, organización en di, tri, tetra y pequeños racimos de cocos.

Fig. 5. Tinción Gram. Muestra nariz en medio SM110

Bacterias Gram positivas, forma de bacilos, organizadas en pequeñas duplas y triadas.

Fig. 6. Tinción Gram. Muestra fómite 2 en medio SM110

Bacterias Gram positivas, forma de bacilos, organizadas en pequeñas duplas y triadas.

Fig. 7. Tinción Gram. Muestra fómite 2 en medio SM110

Tabla 3. Gráficos de los aislamientos bajo el microscopio en 100x

Control

Nariz

Fómite

Tabla 4. Inoculación bacteriana en medios Agar sangre a partir de muestras de medios MSA y SM110

Resultados

Gráfico

Observación Aislamiento de colonias a partir de muestra de nariz de medio SM110. Hemólisis beta. Colonias un poco amarillentas.

Fig. 8. Inoculación en medio agar sangre, muestra nariz de medio SM110.

Crecimiento masivo, con aislamiento de muy pocas colonias en muestra de fómite a partir de medio SM110. Hemólisis alfa. Colonias medio verdosas. Fig. 9. Inoculación en medio agar sangre, muestra fómite de medio SM110

Aislamiento de colonias de muestra de nariz de medio MSA. Hemólisis beta. Colonias amarillentas.

Fig. 10. Inoculación en medio agar sangre, muestra nariz de medio MSA

Se visualiza aislamiento de colonias obtenido de la muestra de fómite de medio MSA. Hemólisis gamma. Colonias blanquecinas.

Fig. 11. Inoculación en medio agar sangre, muestra fómite 1 de medio MSA

Sin crecimiento bacteriano. Perdida del color del agar sangre, se degradó.

Fig. 12. Inoculación en medio agar sangre, muestra control de medio MSA

Tabla 5. Prueba de coagulasa de muestras bacterianas de medios MSA y SM110

Resultado

Gráfico

Observación Muestra control con coagulasa positiva, se nota un pequeño cambio.

Fig. 13. Prueba coagulasa, muestra control

Prueba coagulasa negativa

Fig. 14. Prueba coagulasa, muestra nariz 1 de medio MSA

Tabla 6. Tabulación de resultados en el curso Grupo Nariz Colonias de estafilococos MSA SM110 1 ++ +++ 2 +++ +++ 3 ++ + 4 + + 5 ++ ++ 6 ++ ++

Fomite Coagulasa Objeto de MSA Control prueba +++ Moneda + Lentes + 2a + 2b Celular + Billete

Colonias de estafilococos MSA SM110 +++ ++ +++ +++ + + + + + + + +

Coagulasa MSA Control + + + + -

9. Discusión El género Staphylococcus, es un grupo de bacterias que conjunto a los estreptococos son una de las principales causas de infecciones nosocomiales, a pesar de ser parte de la microbiota humana, pueden llegar a ser organismos oportunistas que pueden causar infecciones provocando enfermedades. Las bacterias Staphylococcus aureus, en particular, son de gran importancia clínica debido a considerarse uno de los patógenos que causan amplias manifestaciones clínicas (Lambert & suetens, 2011) (Jarvis, 2001). Esta bacteria se encuentra tanto en el ambiente como en la flora humana localizada en la piel y en las membranas mucosas, en especial en la nariz (Foster, 1996). Al momento de tomar nuestra muestra de la mucosa, se espera que se encuentra Staphylococcus aureus como parte de la microbiota, con el objetivo de diferenciar de los estreptococos que también forman parte, se aplicó en un medio con 10% de sal, se observó biomasa blanquecina en menor medida que en las muestras de fómite y del control, las cuales llegaron a formar natas, por lo que sirve como indicio de obtener bacterias tolerantes a la sal, característico de bacterias del género Staphylococcus (Myles & Datta, 2012). Para seguir guiándonos mediante la etiología, Tong (2015) nos dice que el S. aureus tiene la capacidad de fermentar el manitol lo que le diferencia del S. epidermidis, al cultivar la muestra del agar rico en sal hacia el medio MSA, mostró cambios de coloración de rojo a amarillo en los medio, en todas las muestras obtenidas, hubo pocas colonias aisladas pues hubo crecimiento masivo, por lo que no nos podemos cerciorar de que el cambio de coloración fue exclusivo de un grupo de bacterias, pero a su vez el cambio del rojo fenol nos permite observar que si hay presencia de S. aureus (Tong & Davis, 2015) (Taylor, 2019). En el medio SM110, se observa que la coloración de las colonias aisladas es blanquecina de aproximadamente 1 mm, este caso ocurre para todas las muestras. Al realizar la tinción Gram para las colonias aisladas, se encontró en el control bacterias Gram positivas que en observación 100X, su forma era alargada como bacilo, esto ocurrió para varias muestras control, lo que nos indica que el aislado no era de S. aureus o se presumen de una contaminación. Para la observación de la muestra de nariz, se observó bacterias cocaceas Gram positivas que se disponían en racimo, correspondiendo a la morfología de S. aureus (Myles & Datta, 2012). De las muestras de fómite, en medio MSA, se observó bacterias tipo bacilo Gram positiva, se presume se trata de una bacteria de género Bacillus; por el contrario, en el medio SM110, se encontró al igual que en la nariz, bacterias cocaceas Gram positivas.

Posteriormente, se realizó la prueba bioquímica de la coagulasa presentando resultado positivo para las colonias aisladas del medio MSA de la muestra de nariz, lo cual indica que se ha aislado con éxito colonias de S. aureus (Myles & Datta, 2012) (Tong & Davis, 2015) ya que un resultado negativo señalaría que hay especies tales como Staphylococcus epidermidis o Staphylococcus saprophyticus, como es el caso de las colonias de las muestras de control que en este caso no sería ningún Staphylococcus, mientras que la muestra de fómite se consideraría una cepa de Staphylococcus (Otto, 2010). En el medio de agar sangre, se comprobó que la muestra de la nariz existe una cepa de Staphylococcus aureus pues en el aislado de SM110 y MSA, se obtuvo una beta hemólisis pues presentaba una lisis completa alrededor de las colonias en el medio agar sangre (Foster, 1996) (Myles & Datta, 2012). En la muestra del fómite, no existe cambio mayor en el medio, las colonias se observan blanquecinas, por lo que se trata de una bacteria de estafilococos. 10. Conclusiones 





Se determinó que la muestra de mucosa de la nariz existe una cepa de Staphylococcus aureus, comprobando ser parte de la microbiota humana de las mucosas. Teniendo resultados positivos para las pruebas de coagulasa, manitol y alfa toxina. Se comprobó que el billete tomado como fómite, tenía bacterias de género Staphylococcus comprobado por ser cepas tolerantes a la sal, cocaceas y Gram positivas. Se identificó, a través de la tinción Gram con observación microscópica, que el tubo control no contenía colonias de Staphylococcus aureus, pues se observó bacterias tipo bacilo Gram positivas.

11. Bibliografía

Bush, L. M., & Perez, M. T. (06 de 2016). Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University. Obtenido de Staphylococcal Infections: https://www.msdmanuals.com/professional/infectious-diseases/gram-positivecocci/staphylococcal-infections CEFA. (02 de 06 de 2015). SECCION III. Obtenido de Etiopatogenia microbiológica: http://higiene.edu.uy/cefa/2008/Staphylococcus.pdf Foster, T. (1996). Medical Microbiology: Staphylococcus (Cuarta ed.). Galvenston: University of Texas Medical Branch at Galveston. Gallego Maldonado, G., Otálora Díaz, A. S., Urbano Cáceres, E. X., & Morales Súarez, C. M. (2018). Multirresistencia bacteriana: Reto terapéutico en trasplante renal. Universidad y Salud, 72-87.

Gil, M. (2000). Staphylococcus aureus: Microbiología y aspectos moleculares de la resistencia a meticilina. Chil Infec, 145-152. Jarvis, W. (2001). Infection control and changing health–care delivery systems. Emerging Infectious Diseases Journal, 7(2), 170-173. Lambert, M., & suetens, C. (2011). Clinical outcomes of health–care–associated infections and antimicrobial resistance in patients admitted to European intensive–care units: a cohort study,. The Lancet, 11(1), 30-38. Myles, I., & Datta, S. (2012). Staphylococcus aureus: an introduction. Seminary of Immunopathology, 34(2), 181-184. Otto, M. (2010). Staphylococcus colonization of the skin and antimicrobial peptides. Expert Reviiew Dermatology, 5(2), 183-195. Seija, V. (2008). Cefa. Obtenido de Etiopatogenia microbiológica: http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/Staphylococcus.pdf Taylor, T. (2019). Staphylococcus Aureus. Treasure Isalnd: StatPearls Publishing. Tong, S., & Davis, J. (2015). Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology, 28(3), 603-610.