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Universidad de Guayaquil Facultad de Ciencias Químicas Carrera: Química y Farmacia Guía de Prácticas de Laboratorio BACTERIAS GRAM POSITIVAS.- IDENTIFICACIÓN DE Staphylococcus PATÓGENOS

Objetivos de la práctica de laboratorio 1. Diferenciar el tipo de Cocácea Gram positiva correspondiente mediante la prueba de catalasa. 2. Identifica los Staphylococcus patógenos mediante la prueba de la coagulasa 3. Identifica los Stapyilococcus coagulasa negativa mediante la prueba de la novobiocina . Marco Teórico De acuerdo al Manual de Bergey, las cocaceas positivas de importancia clínica para los seres humanos comprenden los géneros Streptococcus y Staphylococcus. Su morfología es muy parecida, pero existen pruebas para diferenciar los dos géneros y cada una de sus especies

Género Staphylococcus Dentro de este grupo destacan algunas especies de importancia clínica como son:  Staphylococcus aureus  Staphylococcus epidermidis  

Staphylococcus sapropyticus Staphylococcus hominis

En general, este género se caracteriza por desarrollar colonias relativamente grandes, redondas, lisas y brillantes. Al microscopio y mediante la tinción de Gram, los Staphylococcus se ven como cocáceas Gram positivas, redondas, de un mismo tamaño, aisladas, o agrupadas en racimos o en cadenas cortas. Poseen una pigmentación blanca, amarilla o dorada según la especie. Al cultivar estas bacterias en agar sangre (incubada 18-24 h a 37oC) aparecen como colonias redondas, blancas o amarillas, con o sin hemólisis por la presencia de enzimas especiales para este fin. Tienen la característica de crecer en medios con elevada concentración de sal o cloruro de sodio, lo que les brinda una característica diferencial importante. El S. aureus es un microorganismo patógeno capaz de producir una gran variedad de síndromes clínicos. Poseen enzimas que hidrolizan un amplio espectro de sustratos y producen diversas toxinas: Hemolisinas, exfoliativas y enterotoxinas. La presencia de cepas toxigénicas en aguas envasadas y de recreo puede ser causa de infecciones. Otras características que permiten su identificación son la producción de Catalasa, coagulasa y susceptibilidad a la Novobiocina. Pruebas de identificación

Catalasa Es una característica de todas las especies de Staphylococcus. La catalasa es una enzima que desarrollan como mecanismo de defensa que les permite neutralizar los productos tóxicos derivados del metabolismo del oxígeno. Los Streptococcus no poseen catalasa, por lo que esta prueba es muy importante a la hora de diferenciar ambos grupos.

Coagulasa Esta prueba es útil para identificar una especie de Staphylococcus en especial, el Staphylococcus aureus. La síntesis de esta enzima permite la coagulación del plasma y una prueba positiva identifica con certeza a la especie mencionada.

Susceptibilidad a la noboviocina Esta prueba diferencia el Staphylococcus saprophyticus de otras especies coagulasa negativo. Se pone en contacto las bacterias con el antibiótico, lo que permite evaluar si hay o no desarrollo bacteriano. La prueba positiva indica que existe resistencia a la novobiocina, porque aún cuando el antibiótico está presente, existe crecimiento. PRUEBA S. aureus S.epidermidis S.saprophyticus S.hominis Hemólisis + -/+ -/+ Catalasa + + + + Coagulasa + Novobiocina + (Sensible) - (Resistente) -

MATERIALES

MEDIOS DE REACTIVOS CULTIVO/CEPAS

EQUIPOS

Algodón

Cepa Staphylococcus Agar Manitol Sal Caldo Nutritivo Caldo Soya tripticasa Agar Mueller Hinton

Plasma

Mechero

Agua Oxigenada al 3% Discos de Novobiocina Discos de Antibioticos

Incubadora Refrigeradora

Fósforos Asa de inoculación Pinzas

Lápiz graso Placas portaobjeto Gasa Gradilla Elaborado: QF..Mariana Rendón M. MSc.

Kit de Gram

PROTOCOLO DE PROCESAMIENTO

1. Diferenciación de Cocaceas Gram Positivas Frotis Técnica de Gram Seguir el procedimiento de la Práctica de Tinción de Gram COCACEAS GRAM POSITIVAS

2. Diferencia entre de Staphylococcus y Streptococcus Prueba de la catalasa 1. 2. 3. 4. 5.

Tome una colonia de la placa de cultivo con un asa. Peróxido de hidrógeno al 3% Si se producen burbujas la reacción es positiva. Prueba positiva indica que es un Staphylococcus Prueba negativa es un Streptococcus

Prueba de catalasa

3. Identificación de Staphylococcus patógeno Prueba de la coagulasa 1. 2. 3. 4. 5.

Tome una colonia de la placa de cultivo con un asa. Sumerja el asa en un tubo con aproximadamente 1 ml de plasma. Incube a 37º C en estufa de cultivo y observe periódicamente hasta 4 horas de incubación. La formación de un coágulo en el fondo del tubo indica una prueba coagulasa positiva. Si el plasma sigue liquido indica una prueba coagulasa negativa

PRUEBA DE COAGULASA

4. Diferenciación de Staphylococcus coagulasa negativos Prueba de la Novobiocina (30 ug) 1. 2. 3. 4.

Realice una siembra de la colonia en estudio en un agar sangre. En medio de la siembra coloque un disco de novobiocina. Incube por 24 horas aproximadamente a 37º C. Transcurrido el tiempo de incubación observe si existe un halo alrededor del disco para ver si hay o no crecimiento bacteriano. 5. Si no existe crecimiento de las bacterias alrededor del disco, mida con una regla el diámetro del halo o circulo que se observa alrededor de la novobiocina. 6. La prueba es negativa cuando existe crecimiento alrededor del disco y se dice que es resistente. 7. La prueba es positiva cuando se observa un halo de inhibición alrededor del disco de más de 21 mm y

se dice que es sensible.

Resultados obtenidos

. Conclusiones 123Recomendaciones 123Bibliografía 1- Granados R., Microbiología, Ed. Paraninfo 1999