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• Juan Jose PC

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I.

INTRODUCCIÓN.

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo. La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. La base de la espectrofotometría se centra en dos leyes principalmente: LEY DE BEER La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución. Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azúcar diluida y en otro tenemos un vaso con la misma cantidad de agua pero con más azúcar

diluida. El vaso es una celda fotoeléctrica, y la solución de azúcar es la que se mide su concentración. Según la ley de Beer, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado seria mayor que si repitiéramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos y/o moléculas y son absorbidos por estos. LEY DE LAMBERT En la Ley de Lambert se dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz. Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pero ahora, pensemos que ambos tiene la misma cantidad de agua y la misma concentración de azúcar, pero, el segundo tiene un diámetro mayor que el otro.

Según la ley de Lambert, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado seria mayor que si repitiéramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos y/o moléculas y son absorbidos por estos; de la misma forma que se explicó en la ley de Beer. Un espectrómetro típico posee cuatro componentes básicos: una fuente de radiación que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre (usualmente es lámpara de tungsteno para luz visible, y deuterio para ultravioleta), un compartimiento para la muestra, un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra, y un fotodetector, que mide cuantitativamente la radiación que pasa por la muestra.

II.

OBJETIVOS: 1 . Identificar los instrumentos y equipos que se utilizan en un laboratorio de Bioquímica. 2.

III. 3.1

Conocer el manejo de la Espectrofotometría.

MATERIAL Y PROCEDIMIENTO: Materiales y equipos 3.1.1. Materiales: A.

De vidrio: 

10 tubos de ensayo 10x75



02 Pipetas 10 ml

B.

De polipropileno: 

C.

20 tips para micropipetas Reactivos:



Azul de Metileno 0,1 mg/mL



Safranina 0,1 mg/mL



Agua destilada 500 mL

3.1.2. Equipos e instrumentos:

3.2



01 Espectrofotómetro Genesys 10 UV



02 Micropipetas: 100-1000 µL / 10 - 100 µL.

Procedimiento: 3.2.1. Espectrofotometría: DETERMINACIÓN DE LOS ESPECTROS DE ABSORCIÓN: Según la tabla, determinar los espectros de absorción de cada una de las soluciones de colorantes (azul de metileno y safranina), leyendo las absorbancias en cada una de las longitudes de onda del espectrofotómetro, llevando el equipo a cero con agua destilada(calibrarlo). Nuestro grupo trabajo con el reactivo: Safranina, el cual nos dio los siguientes datos:

λ

Safranina

410 nm

0,143 A

460 nm

0,754 A

510 nm

2,082 A

560 nm

0,447 A

610 nm

0,027 A

660 nm

0,010 A

Con estos datos construir una gráfica para cada espectro de absorción, colocando en las ordenadas las absorbancias y en las abscisas las longitudes de onda. Debe indicar cuál es la longitud de onda de máxima absorbancia para cada una de las soluciones.

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN: Preparar 5 diluciones de la solución de safranina 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y 1:32,

utilizando agua destilada como diluyente. Leer cada dilución a la longitud de onda seleccionada en la experiencia anterior. Graficar absorbancia vs. concentración. IV.

RESULTADOS:

EXPERIENCIA 1: Al tubo de ensayo se le coloca safranina

Y este es colocado en la cubeta

Luego es llevada al espectrofotómetro para la medición respectiva

(solución patrón)

EXPERIENCIA 2:

Solución Patrón (SAFRANINA)

FUNDAMENTACIÓN:

V.

CUESTIONARIO: 1.

¿Qué es transmitancia y absorbancia?

Transmitancia: La transmitancia o transmitencia es una magnitud que expresa la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en la unidad de tiempo (potencia). Transmitancia óptica La transmitancia óptica que se define como la fracción de luz incidente, a una longitud de onda especificada, que pasa a través de una muestra. Transmitancia térmica Es la cantidad de energía que atraviesa, en la unidad de tiempo, una unidad de superficie de un elemento constructivo de caras plano paralelas cuando entre dichas caras hay un gradiente térmico unidad. Es el inverso a la resistencia térmica. Absorbancia: La absorbancia, , es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una muestra. Está definida como:

Siendo la intensidad después de haber habido la absorción e intensidad de la luz que se hace incidir en la muestra.

la

Se suele emplear en la química analítica ya que se cumple, la llamada, Ley de Beer-Lambert:

Siendo el coeficiente de extinción molar, la concentración y la longitud atravesada por el haz de luz. La ley de Beer es una ley aditiva, y por tanto si se tienen diferentes sustancias en una muestra la ley de beer se tiene como: }

2.

¿Qué utilidad tiene la espectrofotometría en la bioquímica clínica?

El espectrofotómetro constituye una herramienta fundamental en el laboratorio clínico. Más del 90% de las determinaciones que se realizan en Química Clínica tienen como paso final la lectura de una absorbancia o una transmitancia. El correcto desempeño de los espectrofotómetros es entonces determinante, en última instancia, de la calidad analítica de los resultados que emite el laboratorio. Tiene aplicación en bioquímica clínica para realizar análisis de parámetros bioquímicos. Como principal ventaja, es la gran versatilidad de parámetros bioquímicos que pueden ser realizados, pudiendo analizar marcadores bioquímicos que otros equipos automatizados no pueden.

Como inconveniente, es que es un método menos exacto y preciso que los métodos automatizados; y además, requiere una cantidad de tiempo considerable para realizar cada determinación.

QUÍMICA CLÍNICA Test

Métodos

Bilirrubina total Bilirrubina Directa

Espectrofotometría visible. Espectrofotometría directa 540 y 454 nm Espectrofotometría visible

Fosfatasa Alcalina

Espectrofotometría cinética 405 nm

Amilasa

Cinético espectrofotométrico a 405 nm

Transaminasa glutámico oxalacética (AST)

Gamaglutamil-transpeptidasa (GGT)

Espectrofotometría Cinética UV 340/360 nm Espectrofotometría Cinética UV 340/360 nm Espectrofotometría cinética a 405 nm

Lacticodeshidrogenasa (LDH)

Espectrofotometría-UV 340 nm.

Transaminasa glutámico pirúvica (ALT)

3.

¿En qué se basa el funcionamiento del espectrofotómetro?

Los espectrofotómetros de reflectancia miden la cantidad proporcional de luz reflejada por una superficie como una función de las longitudes de onda para producir un espectro de reflectancia. El espectro de reflectancia de una muestra se puede usar, junto con la función del observador estándar CIE y la distribución relativa de energía espectral de un iluminante para calcular los valores triestímulos CIE XYZ para esa muestra bajo ese iluminante.

El funcionamiento de un espectrofotómetro consiste básicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. Lo más usual es que los datos se recojan en 31 intervalos de longitudes de onda (los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm… 700 nm). Esto se consigue haciendo pasar la luz a través de un dispositivo monocromático que fracciona la luz en distintos intervalos de longitudes de onda. El instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparación con una superficie de reflexión difusa perfecta. La reflectancia de una muestra se expresa como una fracción entre 0 y 1, o como un porcentaje entre 0 y 100. Es importante darse cuenta de que los valores de reflectancia obtenidos son valores relativos y, para muestras no fluorescentes, son independientes de la calidad y cantidad de la luz usada para iluminar la muestra. Así, aunque los factores de reflectancia

se midan usando una fuente de luz concreta, es perfectamente correcto calcular los valores colorimétricos para cualquier iluminante conocido.

VI.

CONCLUSIONES  



La espectrofotometría nos ayudo a medir la concentración que el azul de metileno. Pudimos observar a través del espectrofotómetro como es que varían las absorbancias con diferentes longitudes de onda. Hemos concluido que a mayor concentración de soluto mayor va ser la absorción de dicha solución.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.