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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR Facultad de Ciencias Químicas INFORME DEL PROYECTO DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

TEMA: Aislamiento Identificación y Preservación de Cepas de bacterias fermentadoras de Embutidos cárnicos tipo Salami INTEGRANTES:  Cadena Sandra  Guerrero Carol  Pazmiño Estefani  Pinto Alejandro 8vo. Semestre Alimentos Tutor: Dra. Blanca Estela Bravo

2010

INFORME

Tabla de contenido 1. TEMA: Aislamiento Identificación y Preservación de Cepas de bacterias fermentadoras de Embutidos cárnicos tipo Salami............................................................ 3 2.

RESUMEN............................................................................................................................. 3

3.

INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 3

4.

OBJETIVOS .......................................................................................................................... 4 4.1.

OBJETIVO GENERAL: ...................................................................................................... 4

4.2.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ............................................................................................... 4

5.

MARCO TEORICO ............................................................................................................... 4 5.1.

Información General ..................................................................................................... 4

5.2.

Clasificación de las cepas según su propiedad ............................................................. 5

5.3.

Características de las cepas ........................................................................................... 5

6.

MARCO METODOLOGICO.................................................................................................. 6 6.1.

Métodos Generales de Análisis ................................................................................... 6

6.2.

Métodos Específicos de Análisis: ................................................................................ 6

6.2.1. Caldo de enriquecimiento y Medios De Cultivo Para Su Aislamiento E Identificacion De Lactobacilos Plantarum ............................................................................. 6 6.2.2. CALDO DE ENRIQUECIMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO PARA SU AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE MICROCCUS .......................................................................................... 6 6.2.3. CALDO DE ENRIQUECIMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO PARA SU AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE MOHOS Y LEVADURAS. ......................................................................... 8 7.

RESULTADOS: ..................................................................................................................... 9

8.

DISCUSIONES .................................................................................................................... 12

9.

CONCLUSIONES................................................................................................................. 13

10.

Bibliografía ................................................................................................................... 14

11.

ANEXO ............................................................................................................................ 15

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1. TEMA: Aislamiento Identificación y Preservación de Cepas de bacterias fermentadoras de Embutidos cárnicos tipo Salami 2. RESUMEN El objetivo principal fue el aislamiento de los microorganismos que proporcionan sabor, olor y color en los productos cárnicos fermentados. Para el asilamiento de microorganismos se empleó medios específicos que proporcionen las condiciones adecuadas de crecimiento. Con lo que se obtuvo un total de 7 cepas en las que están mohos (3), levaduras (2) y bacterias (2). Con lo que se concluyó que este producto tiene dos tipos de fermentaciones una aerobia causada por los mohos y las levaduras y otra anaerobia causada por las bacterias.

3. INTRODUCCIÓN Los productos cárnicos fermentados se pueden definir como una mezcla de carne picada y otros aditivos, que es introducida en las tripas naturales o artificiales y sometida a un proceso de fermentación llevado a cabo por microorganismos, seguida de una fase de secado. El producto final se almacena normalmente sin refrigeración y se consume sin tratamiento térmico. Los cambios en la composición, sabor, olor y color que tienen lugar en los productos cárnicos fermentados se deben fundamentalmente a la microflora natural o añadida, que se desarrolla en el producto durante la fermentación y maduración de este y ejerce una actividad enzimática intensa. Los tipos de cepas de microorganismos usados en la industria de la charcutería son: las bacterias lácteas, las micrococáceas, los mohos y la levadura de diferentes especies. El propósito del presente estudio es buscar un método efectivo para aislar, seleccionar y preservar los microorganismos, encargadas de la fermentación de un producto cárnico, tipo salami, a partir de un embutido comercial, del muestreo en el lugar de almacenamiento y maduración del producto y usando para su aislamiento medios específicos tanto comerciales como formulados en el laboratorio según la cepa. Este estudio se realizó debido a que el país tiene empresas que se dedican a la elaboración de estos embutidos y no existen investigaciones publicadas respecto al tema de selección de microorganismos específicos o elaboración de un cultivo iniciador propio para nuestros embutidos, en unos casos las empresas usan cultivos iniciadores comerciales importados y otro caso la fermentación se realiza sin adición de cultivo iniciador. Una vez realizado el estudio de logró aislar 7 cepas de los microorganismos encargados de la fermentación del producto, de que la mayoría son mohos y levaduras; estas cepas son las encargadas de la fermentación en la parte externa del producto. Se logró identificar algunas de las cepas que la bibliografía indica que son usadas como cultivos starter entre las que se que están el micrococcus y el Lactobacilos.

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4. OBJETIVOS 4.1.OBJETIVO GENERAL: El propósito del presente estudio es buscar un método efectivo para aislar, seleccionar y preservar los microorganismos, encargadas de la fermentación de un producto cárnico, tipo salami, a partir de un embutido comercial y del muestreo en el lugar de almacenamiento y maduración de los mismos.

4.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS:     

Establecer puntos clave de muestreo que permita colectar en su totalidad todos los microorganismos encargados de la fermentación del embutido. Establecer las características mas propicias para que los microorganismos puedan desarrollarse en laboratorio. Establecer cuales son los medios mas adecuados para el aislamiento especifico de microorganismos fermentadores de embutidos tipo salami Seleccionar y dar un medio propicio para el desarrollo solo de los microorganismos de interés. Buscar el método mas adecuado para la conservación de las cepas puras de microorganismos seleccionados.

5. MARCO TEORICO 5.1. Información General Tradicionalmente la elaboración de embutidos ha sido empírica, ya que no se conocía la relación entre la actividad microbiana, y los cambios, fundamentalmente sensoriales, que se desarrollaban en el producto durante el curado. En la actualidad sabemos que los cambios en la composición, sabor, olor y color que tienen lugar en los productos cárnicos fermentados se deben fundamentalmente a la microflora natural o añadida, que se desarrolla en el producto durante la fermentación y maduración de este y ejerce una actividad enzimática intensa. Hoy en día los productos cárnicos fermentados se pueden definir como una mezcla de carne picada, grasa, sal, agentes del curado, azúcar, especias y otros aditivos, que es introducida en las tripas naturales o artificiales y sometida a un proceso de fermentación llevado a cabo por microorganismos, seguida de una fase de secado. El producto final se almacena normalmente sin refrigeración y se consume sin tratamiento térmico. Los tipos de cepas de microorganismos usados en la industria de la charcutería son: las bacterias lácteas, las micrococáceas, los mohos y la levadura, como se indica en la tabla No. 1, que brindan las características especiales al producto, Tabla No. 2, interviniendo en su color, sabor, bioprotecciòn, etc. Tabla No 1. Algunas cepas involucradas en la fermentación del salami Bacterias Lactobacillus sake, curvatus, Plantarum Pediococos acidilactici, pentosaceus Staphylococcus xylosus,carnosus Micrococcos varians

Mohos Levaduras Penicillium nalgiovense, Debaryomyces hansenii, chysogenum, cantarellii, kloeckerii. roquefortii, frecuenstans, verrucosum. Aspergillus Eurotium Página 4 de 18

5.2. Clasificación de las cepas según su propiedad Las bacterias responsables de la fermentación del salami contribuyen al desarrollo de las características organolépticas y reológicas del alimento, sino que generan en los mismos ambientes poco favorables para el desarrollo de microorganismos patógenos debido a su marcada capacidad antagonista, la cual favorece su proliferación en el alimento (tabla 2). Además de este importante papel en procesos de bioconservación, se ha podido comprobar que algunas cepas de bacterias lácticas, son beneficiosas para la salud. Tabla No 2 Propiedades que brindan las cepas Características

Cepas Pediococcus cerevisiae Lactobacillus plantarum Micrococcus varians Staphylococcus carnosus Lactococcus lactis

Acidificantes sabor/color Bioprotectoras

5.3. Características de las cepas En la tabla No. 3 se indica algunas características de las cepas involucradas en la fermentación del salami que se trataran en el presente trabajo:

Tabla No. 3 Características microorganismos

Necesidades nutricionales

Micrococos Mayoría tiene necesidades NaCl de hasta 1015%

BAL

Mohos

Levaduras

Exigentes

Requerimientos bajos

Requerimientos mas altos que los mohos.

Temperaturas

25º - 30ºC

Mésofilas (40ºC)

20 – 30ºC

20 – 30ºC

Requerimiento de Oxígeno

Aerobios (anaerobias facultativas)

Aerotolerantes Anaerobios

Aerobios

Aerobios

Positivo

Negativos

Negativos

Negativos

6.0-8.0 Positiva

4.5 – 6.4 Negativo

5,6 --------

5.0-7.5 --------

Reducción de nitratos a nitritos pH Tinción Gram

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6. MARCO METODOLOGICO 6.1.Métodos Generales de Análisis Muestreo: Las muestras fueron recolectadas de la Industria Cárnica “El Salinerito” seleccionando al azar la o las unidades que conformaron la muestra. Se realizó un hisopado sobre la superficie del salami y el hispo se lo colocó en un frasco con 60 ml de agua de peptona. Además se cortó asépticamente una pequeña porción de carne de partes diferentes de una pierna, la muestra se puso en un frasco plástico de boca ancha y se la refrigeró. Se utilizó material estéril tanto para la toma como para contener la muestra.

6.2.Métodos Específicos de Análisis: 6.2.1. Caldo de enriquecimiento y Medios De Cultivo Para Su Aislamiento E Identificacion De Lactobacilos Plantarum 

Preparación del medio de cultivo:

El plasma se obtuvo a partir de sangre fresca de bovino mediante la técnica descrita por Barboza Y. y col. 1994 (se utilizó como fuente proteica). Luego se le adicionó dextrosa al 1 % y los demás componentes. El pH del medio se le ajustó a 6,2 con ácido acético. En el caso en que se necesitó preparar el medio en forma sólida se le adicionó 15 gramos de agar. 

Condiciones de cultivo:

Las bacterias ácido lácticas crecieron a 37ºC en medio MRS y Medio plasma de Bovino. 

Selección de las cepas:

De las cepas se hicieron observaciones al microscopio, conservándose únicamente aquellas con morfología de bacilos. Posteriormente se realizaron coloraciones de Gram. 

Medio de conservación:

Como método de conservación a largo plazo se congelaron a –20ºC en caldo MRS con 30 % de glicerol. 6.2.2. CALDO DE ENRIQUECIMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO PARA SU AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE MICROCCUS 

Caldo de enriquecimiento Infusión Cerebro Corazón:

Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno y la peptona, son la fuente de Página 6 de 18

carbono, nitrógeno, y vitaminas. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer. Fórmula (en gramos por litro) Infusión de cerebro de ternera Infusión corazón vacuno Peptona Cloruro de sodio Glucosa Fosfato disódico



200.0 250.0 10.0 5.0 2.0 2.5

Instrucciones Suspender 37 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta disolver completamente. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar rápidamente sin agitar.

Medio de cultivo Agar Manitol Salado:

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de especies del Genero Micrococus, a partir de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria. Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.

Fórmula (en gramos por litro) Extracto de carne Pluripeptona d-Manitol Cloruro de sodio Agar Rojo de fenol

1.0 10.0 10.0 75.0 15.0 0.025

Instrucciones Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

 Condiciones de cultivo: Los Micrococcus crecen bien en este medio, formando colonias rojas, relativamente grandes, elevadas, cupuliformes y opacas, de consistencia cremosa, a las 18-24 horas de incubación a 35-37 °C, en aerobiosis. No fermentan el manitol.  Selección de las cepas: De las cepas se hicieron observaciones al microscopio, conservándose únicamente aquellas con morfología de micrococcus. Posteriormente se realizaron coloraciones de Gram.  Medio de conservación: Como método de conservación a largo plazo se congelaron a –20ºC en caldo infusión cerebro corazón con 30 % de glicerol.

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6.2.3. CALDO DE ENRIQUECIMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO PARA SU AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE MOHOS Y LEVADURAS. 

Caldo de Enriquecimiento Extracto de malta: COMPOSICIÓN EN g/l Extracto de malta Dextrina Peptona de gelatina

13.0 2.5 5.0

Se sugiere para el crecimiento de las levaduras, la utilización de caldo extracto de malta acidificado ya que es un medio más rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo microbiano.  Medio de Cultivo Agar papa glucosa (PDA): Medio de cultivo utilizado para el aislamiento y recuento de hongos y levaduras. Tanto la glucosa presente como la infusión de papa favorecen el desarrollo exuberante de hongos y levaduras, mientras que el desarrollo bacteriano es inhibido con el agregado de ácido tartárico luego de la esterilización hasta alcanzar un pH: 3.5 ± 0.2. Una vez agregado el ácido no se puede recalentar ya que el agar se hidroliza. Fórmula (en gramos por litro) Infusión de papa 4.0 Glucosa 20.0 Agar 15.0

Instrucciones Disolver 39 g de polvo en un litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar hasta ebullición con agitación continua. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Si se desea ajustar el pH a 3.5 agregar aproximadamente 14 ml de una solución estéril de ácido tartárico al 10 %.

 Condiciones de cultivo: En aerobiosis, a 22-25 ºC ó 30-32 ºC, durante 5 días o mayor tiempo.  Selección de las cepas: De las cepas se hicieron observaciones macroscópicas de su morfología.  Medio de conservación: En cajas petri que contienen medio PDA con micelio de hongo crecido se lavan las esporas con 3,75ml de caldo Extracto de malta, se coloca esta suspensión en un frasco que contiene 1,25ml de glicerol estéril (autoclavado). Homogenizar y alicutar a razón de 1,5ml en crioviales estériles, rotular los tubos con la identificación correspondiente. Conservar los tubos a – 20ºC en el congelador.

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7. RESULTADOS:

Tabla No. 1.- Codificación Muestras tomadas RECIPIENTE

CODIFICACIÓN

MUESTRA

Tubo 1

Muestra 1

Hisopado superficie

Frasco 1

Muestra 2

Hisopado superficie

Frasco 2

Muestra 3

Hisopado superficie

Frasco 3

Muestra 4

Frasco 4

Muestra 5

Bolsa 1

Muestra 6

Trozo pierna Hisopado superficie pierna Producto (salami)

Tabla No. 2.- Resultados de crecimiento de mohos y levaduras por caja de siembra

RECIPIENTE

CRECIMIENTO CAJAS +

levaduras blancas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

moho azul halo blanco

+

levaduras amarillas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

levaduras blancas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

moho azul halo blanco

+

moho verde

+

levaduras blancas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

moho blanco, de textura algodonosa

+

moho azul halo blanco

+

levaduras amarillas redondas, brillosa de aspecto baboso

10-2

Muestra 1 10-4

10-2

MORFOLOGÍA

Muestra 2

10-4

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+

levaduras blancas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

moho blanco, de textura algodonosa

+

levaduras blancas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

moho verde

+

levaduras amarillas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

levaduras blancas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

levaduras blancas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

moho verde

+

levaduras amarillas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

levaduras blancas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

levaduras blancas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

moho verde

+

levaduras amarillas redondas, brillosa de aspecto baboso

+

levaduras blancas redondas, brillosa de aspecto baboso

10-2 Muestra 3 10-4

10-2 Muestra 4 10-4

10-3 Muestra 6 10-5

Simbología: + Crecimiento positivo Crecimiento negativo

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Tabla No. 3.- Resultados de crecimiento de bacterias por caja de siembra Muestra 4

Muestra 5

Muestra 6

10 E-02

10 E-04

10 E-02

10 E-04

10 E-02

10 E-04

+

-

+

+

+

+

MICROCOCCUS

CRECIMIENTO

MORFOLOGÍA

bacterias pequeñas, redondas blancas

----

Cocos

---

(color azul)

---

10 E-02

10 E-04

10 E-02

+

+

+

LACTOBACILOS (PLASMA BOVINO)

LACTOBACILOS (PLASMA HUMANO)

TINCIÓN GRAM

bacterias bacterias bacterias bacterias pequeñas, pequeñas, pequeñas, pequeñas, redondas redondas redondas redondas blancas blancas blancas blancas Cocos

Cocos

Cocos

Cocos

(color azul)

(color azul)

10 E-04

10 E-02

10 E-04

-

+

+

(color rojo) (color rojo)

CRECIMIENTO

MACRO MORFOLOGÍA

bacterias bacterias bacterias pequeñas, pequeñas, pequeñas, redondas redondas redondas blancas blancas cremas

bacterias bacterias pequeñas, pequeñas, redondas redondas blancas blancas

---

Bacilos

Bacilos

Cocos

----

Positivo

Positivo

(color azul)

(color azul)

(color rojo)

----

(color azul)

(color azul)

10 E-02

10 E-04

10 E-02

10 E-04

10 E-02

10 E-04

+

+

-

-

+

+

TINCIÓN GRAM MICRO MORFOLOGIA

CRECIMIENTO

MORFOLOGÍA

bacterias bacterias pequeñas, pequeñas, redondas redondas blancas blancas

-- -

---

bacterias bacterias pequeñas, pequeñas, redondas redondas blancas blancas

Positivo

Positivo

---

---

Positivo

Positivo

(color azul)

(color azul)

---

---

(color azul)

(color azul)

TINCIÓN GRAM

Simbología: + Crecimiento positivo Crecimiento negativo

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Tabla No. 4.- Identificación de mohos y levaduras. #

MORFOLOGÍA

IDENTIDFICACIÓN

1

levaduras blancas redondas, brillosa de aspecto baboso

Debaryomyces hansenii

2

levaduras amarillas redondas, brillosa de aspecto baboso

Sin identificación

3

moho verde

Penicillum commune

4

moho blanco, de textura algodonosa

Penicillum nalgiovense

5

moho azul halo blanco

Penicillium roqueforti

Tabla No. 5.- Identificación de bacterias.

#

MORFOLOGÍA

IDENTIDFICACIÓN

1

bacterias redondas blancas

Microccus variens

2

bacterias pequeñas, redondas blancas

Lactobacillus plantarum

8. DISCUSIONES  Las muestras originales, pese a ser de los mismos productos fueron tomadas de diferentes áreas. Hisopado de la parte externa para ver crecimiento de Mohos y Levaduras e hisopado de la parte interna para ver el crecimiento de Bacterias, debido a que son aerobios y microaerofílicos respectivamente.  Para el crecimiento de Lactobacilos se utilizó dos formulaciones diferentes del medio con plasma, una con plasma humano y otra con plasma de bovino, obteniendo un crecimiento similar, esto se debe a que los componentes generales de ambos plasmas son parecidos como fuente de nitrógeno, diferenciándolos solo en los anticuerpos que poseen.  Cabe destacar que existió un poco de dificultad al momento de realizar los medios con plasma, debido a lo difícil que se hizo conseguir este componente, por la gran cantidad de sangre que se necesita para obtenerlo y gran diversidad de técnicas de preparación del medio que existe en la bibliografía utilizada.

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 En el proceso de aislamiento de mohos y levaduras se adicionó al agar PDA una solución de gentamicina al 2% como inhibidor de bacterias, para evitar el crecimiento de la flora acompañante que pese a que el medio es exclusivo para este tipo de cepas, se obtuvo también un crecimiento de bacterias principalmente gram negativas (identificadas por tinción) sobre las cuales la gentamicina tiene un gran espectro de acción.  Pese a que el medio (agar manitol salado), utilizado para el aislamiento de micrococcus no es específico para esta cepa, se obtuvo gran cantidad de colonias, acompañadas de otras bacterias principalmente staphylococcus gram negativos, identificadas al microscopio.  En la identificación de las levaduras aisladas se determinó la especie de una de las dos cepas obtenidas, mientras que la otra no fue factible caracterizarla, debido a que no contamos con el conocimiento ni la bibliografía adecuada que nos ayude a su tipificación.  Por falta de tiempo no se alcanzó a realizar la caracterización de especies de las cepas aisladas por medio de pruebas bioquímicas, sino que su precaracterización se la realizó solo basándose en la bibliografía utilizada, que nos muestra las morfologías de cada microorganismo responsable de la fermentación del producto.  Al momento de la entrega del informe se está aun trabajando en la preservación de las cepas, mediante las técnicas mencionadas en el proyecto.

9. CONCLUSIONES  En la siembra de las muestras originales, se obtuvo colonias mezcladas de todo tipo, las que se identificaron por medio de tinción gram para su posterior aislamiento.  En el reconocimiento de los diferentes mohos encontrados en la flora natural del salami, se determinaron tres cepas diferentes que fueron Penicillum de las especies: commun, roqueforti y nalgiovence, que pudieron ser identificados por morfología y comparando con bases de datos electrónicos.  Las cepas de mohos y Levaduras aisladas son las encargadas de la fermentación del producto por la parte externa, debido a que son aerobias.  Se aisló Lactobacillus plantarum, que fue determinado por medio de tinción gram y observación al microscopio por la formación característica de redes de bacilos de color azul como indica la bibliografía.

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 Se logro comprobar que las cepas eran efectivamente de Lactobacilos al sembrarlos en una caja con ausencia de oxigeno en la que no se logro desarrollar la cepa debido a que es microaerofílica.  El reconocimiento de micrococcus de la especie varians, se efectuó por medio de su micromorfología al compaginar la imagen de la cepa aislada en el laboratorio con las imágenes encontradas en la red.  Basado en los resultados obtenidos, se concluye que aunque el agar que utiliza plasma como fuente proteica, es muy inestable se logro aislar las cepas de lactobacillos deseadas.

10.

Bibliografía

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7.

FAO. Guia para Muesrteo de Alimentos. Ginebra : FAO.

8. P., Doyle Michael. Microbiología de los Alimentos Fundamentos Fundamentos y fronteras. Zaragoza España : Acribia, 2001.

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11.

ANEXO

ANEXO 1: FOTOS DE CAJAS DE 1era SIEMBRA

Página 15 de 18

ANEXO 2: FOTOS DE MICROORGANISMOS AISLADOS. BACTERIAS Lactobacillus Siembra en agar Plasma de bovino

Siembra en agar Plasma humano

Tinción Gram

Micrococcus Agar Manitol Salado

Tinción Gram

Foto obtenida del internet

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MOHOS Siembra en agar PDA Penicillium nalgiovense

Penicillium común

Penicillium Roqueforti

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LEVADURAS Debaryomyces

Levadura amarilla (sin identificar)

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