• Author / Uploaded
• Velasquez Neiser

Citation preview

Universidad Nacional de Cajamarca “Norte de la universidad peruana”

Facultad de Ciencias Agrarias Escuela Académico Profesional de Ingeniería en Industrias Alimentarías

ASIGNATURA

: Bioquímica

TEMA

: Factores físico-químicos que modifican la Velocidad de las reacciones enzimáticas.

.

DOCENTE

: MURRUGARRA ABANTO, Salomón.

ALUMNO

:Laura Huaman Johselin Melissa Tantalean Silva Evelyn Maria Valera Ramos Johana Ramos Vasquez Walter

CICLO

: III.

GRUPO

: “A”

Cajamarca, Mayo 2014

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS]

FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS

2.RESUMEN: En general, todas las enzimas, independientemente del tipo de reacción que catalizan, presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo, retardando o impidiendo su actividad. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones. Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo, temperatura, concentración de enzima, concentración de sustrato, pH, iones, etc,) sobre la serie infinita de enzimas que se conoce. Este patrón general, como se comprenderá, varia en forma característica para cada enzima en particular. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros. La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores, pH, concentración de enzima, concentración de sustrato, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática, tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática.

3.INTRODUCCION La temperatura, la concentración de sustrato, enzimas y la concentración de iones hidrogeniones, son algunos de los factores que actúan directamente sobre la actividad enzimática, produciendo consecuencias particulares según el efecto que tienen sobre la enzima, ya sea favoreciendo, retardando o impidiendo su actividad. El efecto que produce estos factores sobre las enzimas es diferente en cada una de ellas, pues dependen en gran parte de las condiciones en las que se realiza dicha reacción. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigación del factor variable no sea afectada por las variaciones que pudieran sufrir los otros. La finalidad de estos experimentos es observar el efecto de los iones activadores, PH, concentración de enzima, concentración de sustrato, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática, tomando como ejemplo la hidrolisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática.

1

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS] FUNDAMENTACION

La velocidad a la que las reacciones enzimáticas proceden depende de varios factores, dentro de los que destacan el pH del medio de reacción, la temperatura, la concentración de sustrato y de enzima, y el agua disponible en el medio, entre los más importantes.

a) Concentración del ion Hidrogeno (pH): La velocidad de casi todas las reacciones catalizadas por enzimas depende de manera importante de la concentración del Ion hidrogeno. La mayor parte de las enzimas intracelulares muestran actividad optima a valores de pH entre 5 y 9.la relación entre la actividad y la concentración del ion hidrogeno refleja el equilibrio entre la desnaturalización de la enzima a pH alto o bajo y los efectos en el estado cargado de la enzima, de los sustratos, o de ambos. b) Concentración de sustrato: Cuando la concentración de la enzima se mantiene constante y se va incrementando la concentración del sustrato, se obtiene una gráfica hiperbólica. Inicialmente, la velocidad de la reacción varía proporcionalmente a la concentración de sustrato obteniéndose una línea recta (reacción del primer orden) Luego el incremento de la velocidad de reacción va disminuyendo al incrementarse la concentración de sustrato llegando a un momento en que ya no hay más incremento y la velocidad se hace constante. c) Cinética de Michaelis –Menten Las reacciones enzimáticas se caracterizan porque aunque se aumente la concentración de sustrato la velocidad no aumenta linealmente, aparece un efecto de saturación. La saturación se debe a que todos los centros activos están ocupados .la velocidad depende de la cantidad de enzima con sustrato suficiente. d) Temperatura: En general los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10°C de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general ;sin embargo, al ser proteínas , a partir de cierta temperatura, se empiezan desnaturalizar por el calor .La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima .Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debido a la desnaturalización térmica , y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.

2

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS]

4. OBJETIVOS Objetivo general: Armando el sistema amilasa salival-almidón, de acuerdo a las especificaciones, se demostrara las modificaciones de las reacciones enzimáticas por acción de diversos agentes físico-químicos a través de la determinación de sustrato residual (solución yodada) y de los productos (solución cúprico-alcalina y solución fosfomolibdica), cuyos cambios de color serán valorados en relación a un tubo patrón.

Objetivos específicos:

 Demostrar la importancia de la coenzima en el sistema enzimático para la velocidad de reacción.  Verificar que la reacción enzimática es lenta en un medio acido o en un medio básico.  Comprobar que a una temperatura muy alta la enzima se desnaturaliza o muy baja, la enzima se inhibe.

5.MATERIALES Y METODOS Materiales    

18 Tubos de ensayo. Gradilla. Pipetas. Cocina eléctrica.

Reactivos: Reactivo Solución de almidón Buffer fosfato Buffer acetato Buffer fosfato Solución cloruro de sodio Amilasa salival dializada Ácido clorhídrico Solución yodada (yoduro de potasio). Solución cúprico alcalina Solución fosfomolíbdica Agua destilada

3

Concentración 1% 0.1M 0.1M 0.1M 2% 0.25% 0.05N

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

pH 6.6 3.6 10.0

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS]

Parte experimental: Colocar los componentes mencionados en la siguiente tabla, utilizando 8 tubos de ensayo (armar el sistema): Etapa A: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.)

I

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

Solución de almidón al 1 %

1.0

1.0

2.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Buffer acetato 0.1M pH 4.6

-

-

-

5.0

-

-

-

-

Buffer fosfato 0.1M pH 6.6

5.0

5.0

5.0

-

5.0

-

5.0

5.0

Buffer acetato 0.1M pH 10

-

-

-

-

-

5.0

-

-

Solución de ClNa al 2 %

1.4

-

1.4

1.4

1.4

1.4

1.4

1.4

Agua destilada

2.6

3.0

1.6

1.6

1.6

1.6

0.6

1.6

 Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al baño maría a 37°C, por 30 minutos, para el equilibrio de la temperatura.  El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0°C y 4°C durante 30 minutos.  Pasado 5 minutos agregar el preparado enzimático (amilasa salival dializada al 0.25%) y el preparado enzimático hervido (amilasa salival dializada al 0.25%), a los tubos: según se indica en el siguiente cuadro y tomar el tiempo: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.)

I

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

Preparado enzimático

-

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

-

1.0

Preparado enzimático hervido

-

-

-

-

-

-

1.0

-

 Mezclar y continuar la incubación.  Los controles de la actividad enzimática. Por el sustrato residual, se realizará en toda la serie de tubos del I al VIII pasado los 30 minutos de incubación. CONTROL DE RESIDUAL

ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA

POR

EL

SUSTRATO

 El control del sustrato no transformado se realizara por la acción del yodo, de la siguiente manera.

4

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS]

 Cumplidos los 30 minutos de incubación sacar los tubos del baño maría y agua helada y armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII, agregando a cada tubo marcado, 1 ml. del incubado de su correspondiente tubo. Etapa B: TUBOS DE ENSAYO Componentes (en ml.)

I

II 1.0

III 1.0

IV 1.0

V 1.0

VI 1.0

VII

VIII

1.0

1.0

Incubado correspondiente

1.0

Ácido clorhídrico 0.05N

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

Solución yodada

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

 Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos, valorando los cambios de coloración.  Se obtuvo los siguiente:

CONTROL DE FORMADOS

ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA

POR

LOS

PRODUCTOS

 El control de los productos formados se hará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa, maltosa) de la siguiente manera:  Luego procedemos a armar el siguiente sistema utilizando 2 tubos de ensayo nuevos.

5

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS]

RESULTADOS A continuación detallaremos que componentes contenía cada tubo, como estos reaccionaron, y el porqué de los colores que se muestran en las anteriores imágenes: TUBO I: Contenía:      

Solución de almidón al 1% (1ml) → sustrato. Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) → pH óptimo. Solución de ClNa al 2% (1.4ml) → Cl es el ión activador de la enzima. Agua destilada (2.6ml) → brinda el medio líquido a la reacción. HCl 0.05N (5ml) → detiene la reacción. Solución Yodada (0.5ml) → I2 es un indicador.

Explicación: Debido a que no hubo enzima (amilasa salival) el sustrato (almidón) no se degradó. Por ende al interactuar el almidón con el indicador (I2) la reacción se torna azul oscuro como observamos en la imagen. TUBO II: Contenía:      

Solución de almidón al 1% (1ml) → sustrato. Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) → pH óptimo. Agua destilada (3.0ml) → brinda el medio líquido a la reacción. Amilasa salival dializada al 0.25% (o.6ml) → enzima HCl 0.05N (5ml) → detiene la reacción. Solución Yodada (0.5ml) → I2 es un indicador.

Explicación: Debido a que no hubo Cl (ión activador) la reacción fue lenta por eso se obtuvo escasos productos. Como en la mezcla resultante había aun presencia de almidones no degradados y escasos azucares reductores, el indicador (I2) tiño la mezcla de un color naranja como se pudo observar. TUBO III: Contenido:    

Solución de almidón al 1% (2ml) → sustrato. Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) → pH óptimo. Solución de ClNa al 2% (1.4ml) → Cl es el ión activador de la enzima. Agua destilada (1.6ml) → brinda el medio líquido a la reacción. 6

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS]

 Amilasa salival dializada al 0.25% (0.6ml) → enzima  HCl 0.05N (5ml) → detiene la reacción.  Solución Yodada (0.5ml) → I2 es un indicador. Explicación: Debido a que la cantidad de sustrato estaba aumentada (era el doble comparando con los demás tubos), la velocidad de la reacción fue aumentando hasta que alcanzó un valor máximo y luego se mantuvo constante. A pesar de esto si se formaron productos por ello el indicador al interactuar sobre aquellos tiño la reacción de color naranja TUBO IV: Contenido:       

Solución de almidón al 1% (1ml) → sustrato. Buffer acetato 0.1M pH 4.6 (5ml) → pH ácido. Solución de ClNa al 2% (1.4ml) → Cl es el ión activador de la enzima. Agua destilada (1.6ml) → brinda el medio líquido a la reacción. Amilasa salival dializada al 0.25% (0.6ml) → enzima HCl 0.05N (5ml) → detiene la reacción. Solución Yodada (0.5ml) → I2 es un indicador.

Explicación: Debido a que el pH de la reacción fue ácido provoco la desnaturalización de la enzima, impidiendo su acción sobre el sustrato de esta manera no se formó productos (azucares reductores). Por ello el indicador al interactuar sobre el sustrato tiño la reacción de color marrón claro TUBO V: Contenido:       

Solución de almidón al 1% (1ml) → sustrato. Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) → pH optimo. Solución de ClNa al 2% (1.4ml) → Cl es el ión activador de la enzima. Agua destilada (1.6ml) → brinda el medio líquido a la reacción. Amilasa salival dializada al 0.25% (0.6ml) → enzima HCl 0.05N (5ml) → detiene la reacción. Solución Yodada (0.5ml) → I2 es un indicador.

Explicación: En esta reacción no hubo ningún factor que altere la acción de la enzima sobre el sustrato por ello la formación de productos (azucares reductores) se dio sin ningún inconveniente. Este tipo de reacción es ideal. Al interactuar el indicador con los productos tiño la reacción de color amarillo. 7

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS]

TUBO VI: Contenido:       

Solución de almidón al 1% (1ml) → sustrato. Buffer fosfato 0.1M pH 10.0 (5ml) → pH básico. Solución de ClNa al 2% (1.4ml) → Cl es el ión activador de la enzima. Agua destilada (1.6ml) → brinda el medio líquido a la reacción. Amilasa salival dializada al 0.25% (0.6ml) → enzima HCl 0.05N (5ml) → detiene la reacción. Solución Yodada (0.5ml) → I2 es un indicador.

Explicación: Debido a que el pH de la reacción fue básico provocó la desnaturalización de la enzima, impidiendo su acción sobre el sustrato de esta manera no se formó productos (azucares reductores). Por ello el indicador al interactuar sobre el sustrato tiñó la reacción de color azul oscuro. TUBO VII: Contenido:       

Solución de almidón al 1% (1ml) → sustrato. Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) → pH optimo. Solución de ClNa al 2% (1.4ml) → Cl es el ión activador de la enzima. Agua destilada (0.6ml) → brinda el medio líquido a la reacción. Amilasa salival dializada al 0.25% (0.2ml) → enzima HCl 0.05N (5ml) → detiene la reacción. Solución Yodada (0.5ml) → I2 es un indicador.

Explicación: Debido a que la cantidad de enzima fue baja (a comparación de los demás tubos) esta se saturo muy rápido. Por ello la cantidad de almidón no se degrado en su totalidad. Como en la mezcla resultante había aun presencia de almidón no degradado y azucares reductores, el indicador (I2) tiño la mezcla de un color azul oscuro. TUBO VIII: Contenido:     

Solución de almidón al 1% (1ml) → sustrato. Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) → pH optimo. Solución de ClNa al 2% (1.4ml) → Cl es el ión activador de la enzima. Agua destilada (1.6ml) → brinda el medio líquido a la reacción. Amilasa salival dializada al 0.25% (0.2ml) → enzima 8

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS]

 HCl 0.05N (5ml) → detiene la reacción.  Solución Yodada (0.5ml) → I2 es un indicador. Explicación: Debido a que la temperatura fue baja la enzima se desnaturalizo, en este caso el color de la reacción fue azul oscuro CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS III

V

RÁPIDA

MODERADA

ENZIMA SATURADA

ENZIMA NO SATURADA

MENOS PRODUCTOS

MAS PRODUCTOS

COLOR AZUL OSCURO

COLOR AZUL MUY OSCURO

TUBO III: Debido a que mucha cantidad de sustrato la enzima se saturo, y no alcanzo a degradar a toda la cantidad de sustrato (almidón), por ende hubo no hubo totalidad de productos (azucares reductores). Por eso el indicador (solución fosfomolibdica) lo tiño de un color azul no muy oscuro.

TUBO V: En esta reacción no hubo ningún factor que altere la acción de la enzima sobre el sustrato por ello la formación de productos (azucares reductores) se dio sin ningún inconveniente. Este tipo de reacción es ideal. Al interactuar el indicador con los productos lo tiño de un color azul más oscuro

9

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS] DISCUSIONES

 ¿Por qué las reacciones no fueron las esperadas? Las reacciones no fueron las esperadas en la práctica debido a muchos factores o errores humanos, los cuales pueden ser la mala medición o el mal uso de los equipos de medición de los reactivos (Pipeta). Además también se puede decir que las reacciones no fueron las indicadas porque no se siguió los pasos descritos en la guía para la preparación del experimento, obteniendo resultados no óptimos.

 ¿Por qué se desnaturalizo la enzima? La enzima se puede haber desnaturalizado por muchos factores como pueden ser la temperatura, pH, concentración del sustrato entre otros, principalmente en la práctica podemos influir o decir que fue el factor temperatura.

 ¿Por qué no hubo reacción en casi todos los tubos? No hubo reacción en los tubos I, II, IV, VI, VII y VIII. Debido a factores diversos ocurridos en la práctica. En los tubos III y V, hubo una reacción mínima ya que la presencia del sustrato residual fue mayor. Esto se puede haber debido a que la enzimas se haya desnaturaliza o inhibida. Para empezar, se ha de aclarar que las diluciones óptimas para salivas de diferentes personas son distintas porque las características y concentraciones de los compuestos varían de una persona a otra. Es tomismo ocurre con el pH salival y el tiempo de referencia.

10

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS] CUESTIONARIO

1. ¿Identifique en cada uno de los tubos el factor físico-químico que interviene modificando la velocidad enzimática? En casi todos los tubos, excepto en él tuvo II se adiciono la Solución de ClNa al 2%, la cual es el ion activaron de la enzima. Además en todos los tubos también se adiciono la solución de HCl 0.05N, para detener la reacción enzimática. 2. ¿Explique usted que finalidad tiene la utilización de la solución yodada? La solución yodada tiene la única finalidad de mostrar la actividad enzimática. En el sustrato la cual nos va indicar si hubo o no actividad mediante el color, la cual va desde azul oscuro hasta un amarillo claro. 3. ¿Explique usted que finalidad tiene la utilización de la solución cúprica alcalina? La solución cúprico alcalina tiene la finalidad controlar los productos formados en base a la capacidad reductora de la glucosa y maltosa.

4. ¿Explique los resultados obtenidos? Los resultados obtenidos no fueron los previstos por que solo hubo una reacción en los tubos III y V, y en los otros tubos bien es el caso de que la enzima se desnaturalizo o se inhibió por que no ocurrió ninguna reacción. 5. ¿Diga usted cuales son los componentes estructurales del almidón?

El almidón está constituido por dos compuestos de diferente estructura: 



11

Amilosa: Está formada por α-D-glucopiranosas unidas por centenares o miles (normalmente de 300 a 3000 unidades de glucosa) mediante enlaces α-(1 → 4) en una cadena sin ramificar, o muy escasamente ramificada mediante enlaces α-(1 → 6) . Esta cadena adopta una disposición helicoidal y tiene seis monómeros por cada vuelta de hélice. Suele constituir del 25 al 30 % del almidón. Amilopectina: Representa el 70-75 % restante. También está formada por α-D-glucopiranosas, aunque en este caso conforma una cadena altamente ramificada en la que hay uniones α-(1 → 4), como se indicó en el caso anterior, y muchos enlaces α-(1 → 6) que originan lugares de ramificación cada doce monómeros. Su peso molecular es muy elevado, ya que cada molécula suele reunir de 2.000 a 200.000 unidades de glucosa.

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS]

6. ¿diga usted a que se llama amilasa salival dializada y cuál es su acción sobre el almidón? Se llama amilasa salival dializada a amilasa que a perdido o extraído toda la sal y por lo tanto pierde el CHO3. La enzima amilasa degrada el almidón para así formar azucares más simples como la glucosa, es decir, de moléculas complejas pasa a moléculas simples. Las moléculas de glucosa atraviesan la pared intestinal y posteriormente llegan a la sangre.

12

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA

9 de mayo de 2014

[FACTORES FISICO- QUIMICOS] BIBLIOGRAFIA

 BIOQUIMICA LEHNINGER Albert L. Las Bases Moleculares de la Estructura y la Función Celular de la actividad enzimatica 2da EDICION.

 BIOQUIMICA DE HARPER MURRAY GRANNER MAYES RODWELL. Enzimas propiedades generales, cinética y regulación de la actividad. 15va. Edición Pag. 87- 144.  http://www.monografias.com/trabajos-pdf900/actividad-enzimaticaamilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf  http://es.wikipedia.org/wiki/Sustrato_(bioqu%C3%ADmica)  http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz1.htm  http://es.wikipedia.org/wiki/Almid%C3%B3n

13

| BIOQUIMICA- UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA