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FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ASIGANTURA: BIOQUÍMICA I

PRÁCTICA N° 13 TEMA: DETERMINACION DE TRANSAMINASAS DOCENTE: Q.F. Enrique León Mejía TURNO: FB6N1 CICLO: VI ALUMNA: MIRANDA ARRIAGA ESTEFANY LICET FECHA DE ENTREGA: 17/07/2020.

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ÍNDICE Pag. 1. Introducción……………………………………………………………………………………………..3 2. Marco teórico …………………………………………………………………………………………..4,5,6,7 3. Parte experimental 3.1. Procedimiento:………………………………………………………………………………………8,9 4. Resultados ……………………………………………………………………………………………….10, 11 5. Conclusiones…………………………………………………………………………………………… 11 6. Cuestionario……………………………………………………………………………………………..12, 13 7. Referencias bibliográficas……………………………………………………………………….. 14

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INTRODUCCIÓN Las transaminasas son dos: la alaninoaminotransferasa (ALT-GPT) y la aspartatoaminotransferasa (AST-GOT). La elevación de transaminasas se produce por una alteración en la permeabilidad celular, con salida de las enzimas desde el hígado al torrente circulatorio. La concentración de ellas en el hepatocito es muy elevada y cada vez que se altera difusamente la permeabilidad de la membrana citoplasmática, sea por necrosis o por inflamación, las transaminasas experimentan un aumento de actividad en sangre periférica. La actividad en plasma es importante en presencia de un daño hepático agudo, donde la inflamación y la necrosis celular son un fenómeno masivo (sobre 500 mU/mL y habitualmente sobre 1000 mU/ml). Mediante el siguiente informe se busca determina la concentración en suero de las transaminasas: alaninoaminotransferasa y aspartatoaminotransferasa.

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MARCO TEORICO Y CONCEPTUAL Las enzimas hepatocelulares más importantes se localizan en distintos sitios del hepatocito, lo que da lugar a diferentes patrones de liberación de enzimas para distintos mecanismos de daño. La alanina aminotransferasa (ALT / TGP) y la isoenzima citoplasmática de la aspartato aminotransferasa (AST/ TGO) se encuentran principalmente en el citosol del hepatocito. Cuando se produce daño a la membrana en el daño hepatocelular agudo, estas enzimas se liberan y pasa a las sinusoides, aumentando la actividad en plasma de la TGO y la TGP. La aspartato aminotransferasa mitocondrial (ASTm) se libera principalmente cuando existe daño mitocondrial, como el causado por la ingesta de etanol. Las enzimas son liberadas por los hepatocitos a través de diferentes mecanismos; estos determinan el patrón de aumento de los niveles enzimáticos. El patrón de daño más común es el daño irreversible en la membrana celular que acompaña a la muerte celular, que lleva a que se filtre las enzimas citoplasmáticas. El alcohol provoca rápidamente de liberación de TGO por los hepatocitos y su expresión en la superficie celular. Los marcadores más importantes del daño celular son las enzimas citoplasmáticas y mitocondriales. Estas enzimas no son específicas de los hepatocitos, sus niveles pueden aumentar debido al daño en otros órganos; sin embargo, la causa más común de los niveles elevados de TGP es la enfermedad hepática. La TGO citoplasmática presenta su actividad más elevada en los hepatocitos, con niveles aproximadamente 7.000 veces mayor que en plasma. También la TGP presenta una elevada actividad en hepatocitos, con niveles celulares aproximadamente 3.000 veces mayores que en plasma. Cuando existe deficiencia en la síntesis de piridoxina, la síntesis hepática de TGP está afectada; un fenómeno similar se produce en la fibrosis hepática y en la cirrosis, la vida media de la TGO citoplasmática es de 17 ± 3 horas, mientras que la TGP tiene una vida media de 42 ± 11 horas. La isoenzima mitocondrial de la TGO tiene una vida media de 87 horas. En la mayoría de las formas de daño hepatocelular agudo, al principio el nivel de TGO será mayor que el de la TGP, debido a la elevada actividad de la TGO en los hepatocitos, al cabo de entre 24 y 48 horas, sobre todo si persiste el daño, la TGP alcanza niveles mayores que la TGO, ya que su vida media es más larga. En el daño hepático alcohólico agudo, el aumento de los niveles de TGO normalmente persiste, debido al mayor vida media de la TGO mitocondrial y a la coexistencia de deficiencia de piridoxina 6 en muchos pacientes. En el daño hepático crónico, los niveles elevados de TGP son más frecuentes que los de TGO; sin embargo, a medida que progresa la fibrosis, la actividad de la TGP normalmente disminuye y la proporción de TGO respecto a la TGP aumenta gradualmente, de modo que para el momento en que se presenta la cirrosis, los niveles de TGO son a menudo mayores que los de TGP. HEPATOTOXICIDAD El fenómeno de hepatotoxicidad es un evento multifacético que incluye una gran diversidad de compuestos capaces de producirla y ha desafiado todas las categorizaciones. La absorción de diversas sustancias o compuestos químicos por diferentes vías (oral, dérmica y pulmonar), se distribuye rápidamente en los tejidos corporales y se metaboliza en el hígado. Existe una enorme diversidad de fármacos y productos químicos capaces de generar daño hepático además del daño ocasionado por agentes infecciosos, alteraciones del flujo biliar, causas metabólicas, congénitas o autoinmunes. Lo cual dificulta con frecuencia el diagnostico etiológico. .ENFERMEDADES HEPÁTICAS CRÓNICAS Algunos trastornos pueden causar hepatitis crónicas, pero se trata de trastornos raros o que producen características de laboratorio anormales. El hallazgo de niveles elevados de enzimas tanto citoplasmáticas como canaliculares (Típicamente TGP y Fosfatasa alcalina) debería 4

hacer sospechar la existencia de una hepatitis inducida por fármacos. A diferencia de lo que ocurre en la hepatitis alcohólica, a la que parece histológicamente, en la EHNA los niveles de TGO son mucho menores que los de TGP. RECONOCIMIENTO EN EL LABORATORIO DEL DAÑO HEPATOCELULAR CRÓNICO La hepatitis crónica normalmente se identifica por los niveles elevados de enzimas citoplasmáticas, en especial TGO. En la mayoría de los casos, los niveles de TGP son de una a cuatro veces superiores a los límites de referencia, siendo el aumento de los niveles TGO menor. Un pequeño porcentaje de pacientes en los que la biopsia demuestra la presencia de hepatitis crónica 7 (particularmente HCV crónica) presentan niveles normales de enzimas citoplasmáticas. El porcentaje de casos con niveles enzimáticos normales decrece con el número de mediciones de enzimas llevadas a cabo. En algunos casos, los pacientes con hepatitis crónica son identificados por primera vez a través de programas de búsqueda, como los programas de diagnóstico de hemocromatosis o las pruebas para HBV o HCV a los donantes de sangre. Las pruebas de función hepática son generalmente normales y también son normales los niveles de enzimas canaliculares. RECONOCIMIENTO DE LA CIRROSIS EN EL LABORATORIO En sus estadios tempranos, se produce un cierto número de cambios inespecíficos en las pruebas de laboratorio que, juntos siguieron a menudo la presencia de cirrosis. Los niveles de TGP disminuyen progresivamente, mientras que los de TGO permanecen aproximadamente iguales, lo que causa un aumento del radio TGO/TGP hasta niveles mayores a 1 en entre el 40 % y el 60% de los casos. Normalmente se encuentra un tiempo de protrombina prolongado y niveles bajos de albumina, junto a niveles bajos de otras proteínas producidas por el hígado. TRANSAMINASAS Las Transaminasas pertenecen a la clase 2, por ende, son un conjunto de enzimas principalmente localizadas en el hígado. Catalizan la transferencia de un grupo amino desde un alfa-aminoácido a un alfacetoácido. Son indicadores sensibles de lesión hepática. Los indicadores más frecuentemente utilizados de disfunción del hepatocito son la alanina aminotransferasa (ALT, conocida también como transaminasaglutamicopiruvica sérica o SGPT) y la aspartato aminotransferasa (AST, conocida también como transaminasas glutámico –oxalacetica sérica o SGOT). Estas enzimas catalizan la transferencia de los grupos alfa amino de la alanina y el ácido aspártico respectivamente, al grupo alfaceto del ácido cetoglutarico. Ambas requieren como cofactor el 5´-fosfato de piridoxal. En los tejidos, la ALT se encuentra en el citosol, mientras que la AST está en el citosol 8 y en las mitocondrias. Ambas aminotransferasas están presentes normalmente en el suero en bajas concentraciones (menos de 30 a 40 UI/L). La aspartato aminotransferasa se encuentra en: hígado musculo cardiaco, musculo esquelético, riñones, cerebro, páncreas, pulmones, leucocitos y eritrocitos, en orden decreciente de concentración. La alanina aminotransferasa está presente en su mayor concentración en el hígado y es una prueba más sensible y específica del daño hepatocelular agudo. La aspartato aminotransferasa se elimina más rápidamente que la ALT. La mayoría de las transaminasas se elimina por el sistema reticuloendotelial. Ni la ALT ni la AST tienen Isoenzimas específicas de tejido. Entre ellas destacan varias enzimas séricas, especialmente la aminotransferasa aspártica (AST o GOT) y la aminotransferasa de alanina (ALT o GPT) y constituyen un excelente marcador de lesión hepatocelular. Su aumento en sangre se debe a una destrucción celular o un trastorno de permeabilidad de la membrana de las células que las contienen. No existe una clara correlación entre las cifras de transaminasas y el grado de lesión hepática. Pero sí podemos decir que, 5

por debajo de 3 años, generalmente, la hipertransaminemia es debida a una participación hepática en un proceso no hepático, siendo en niños mayores donde es más probable encontrar como causa de dicha elevación una hepatopatía de base. ALANINA AMINOTRANSFERASA (ALT O TGP) Enzima del grupo de las transferasas, de considerable interés en la medicina clínica, esta enzima es una de las dos aminotransferasas que catalizan la transferencia de grupos amino en la interconversión de aminoácidos y αoxoácidos. Se encuentra normalmente en el plasma, líquido cefalorraquídeo, bilis y saliva; solo se halla presente en la orina en caso de lesión renal, la forma mitocondrial constituye el 81% de la enzima total presente en el hígado humano. La enzima está presente en concentraciones relativamente elevadas en el hígado y riñón; también en el musculo esquelético, en el corazón y páncreas. La ALT se encuentra en el suero de los individuos sanos en una cantidad de aproximadamente 6-25 U/I, si la determinación se realiza a 30°C, Se eleva en la hepatitis acompañada de necrosis, cirrosis, ictericia obstructiva, cáncer de hígado y congestión hepática secundaria a fallo cardiaco. La TGP se encuentra 9 con mayor frecuencia, pero no de manera exclusiva en el hígado, por ello pocas veces se ven incrementos séricos sin efectos hepáticos. Se requieren lesiones del hígado más graves o extensas para causar valores anormales, en el caso de la TGO. Puede decirse que la prueba de TGP es menos sensible pero mucho más específica que la TGO. La actividad enzimática se incrementa de 30 a 50 veces en personas con hepatitis toxica o viral, y solo 20 veces en los casos de mononucleosis infecciosa. ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST O TGO) También llamada oxaloacetato transaminasa sérica (TGO), necesita como coenzima al fosfato de piridoxal (vitamina B6). Está presente en casi todos los órganos, dentro de las células, y que cuando se encuentra en sangre en niveles muy elevados significa que ha habido destrucción celular, Es un enzima de localización intracelular que existe en dos formas una mitocondrial que es la más abundante y la otra citoplasmática. Su actividad sérica en condiciones normales es baja o nula. Los glóbulos rojos contienen diez veces más TGO. Se distribuye ampliamente en los tejidos corporales y su concentración es bastante elevada en tejidos con actividad metabólica alta. La concentración de la enzima se encuentra en orden descendente en los Siguientes tejidos: cardiaco, hepático, renal musculo esquelético y eritrocitos. La enzima existe en las células de pulmón cerebro y páncreas, pero en concentraciones menores que en el suero sanguíneo. El rango de nivel sérico normal de TGO es de 8-20 U/L, el nivel se eleva significativamente en el infarto al miocardio. Debido a su amplia distribución la TGO se considera una enzima inespecífica de tejido o de órgano, y por tanto es más útil cuando su concentración sérica se compara con los valores de varias enzimas séricas diferentes. Una cantidad muy escasa de TGO se excreta en la bilis debido a la barrera hematobiliar y no se sabe si la pequeña cantidad encontrada en la bilis procede de la sangre o directamente de los hepatocitos. BIOQUÍMICA Y FISIOLOGÍA Las transaminasas TGO Y TGP están ampliamente distribuidas por el cuerpo. La actividad en un órgano de la TGO por lo general es más alta que la de la TGP y ambas se encuentran en el citoplasma. Estas se catabolizan en el hígado; 10 ambas se encuentran en la bilis, que parece ser una ruta menor de eliminación. La vida media de la TGO es de 17± 5 horas, mientras que de la TGP es de 47± 10 horas. La variación diaria de la TGO está entre el 5 % y el 10 %, mientras que la TGP varía entre un 10 y 30 %; la mayor variación de la TGP se debe en parte a que esta muestra una variación diurna significativa, con resultados hasta un 45 % más alto por la tarde que a primera hora de la mañana. 6

MEDIDA Tanto la TGO como la TGP normalmente se miden a través de reacciones acopladas, utilizando el NADH como el producto final de la reacción que se mide. Los reactivos que contienen NH4 + harán que los niveles de ALT y AST sean engañosamente elevados debido a la conversión de NADH en NAD por el ion amonio en el proceso de aminación reductiva de α- cetoglutarato y glutamato deshidrogenasa endógena. El método recomendado por la Federación Internacional de Química Clínica (FIQC) añade P-5´ -P, pero no todas las pruebas comerciales contienen este reactivo debido a que aumenta la línea base de absorbencia. Además, los tampones de las diferentes pruebas pueden ser distintos, lo que da lugar a una estandarización deficiente. Esto es especialmente importante, ya que uno de los criterios más significativos en la determinación del tratamiento de la hepatitis C crónica es si el nivel de TGP es elevado. ESTABILIDAD Los especímenes para TGO y TGP son estables en sangre durante un máximo de 12 o 24 horas, pero aumentan gradualmente después de este tiempo debido a la liberación desde los glóbulos rojos. La TGO es estable en suero a temperatura de refrigerador durante hasta tres semanas e indefinidamente si es congelada. La TGP muestra una estabilidad similar cuando es refrigerada, pero muestra descensos muy claros al ser congelada que dependen del tampón utilizado en el ensayo. 11 RANGOS DE REFERENCIA 2.11. CAUSAS DE RESULTADOS ANORMALES La causa más importante de aumento de los niveles de TGO Y TGP es el daño en los hepatocitos. Los niveles de TGO y, en menor medida, de TGP son elevados cuando existe daño muscular. El aumento de los niveles de TGO también puede verse en pacientes con tumores malignos, aunque normalmente los niveles de TGP son menos susceptibles de ser elevados. En ocasiones raras, los infartos de riñón pueden causar niveles elevados de TGO y TGP. Los valores de estas pueden ser engañosamente bajos en caso de fallo renal, lo que produce problemas en el reconocimiento del daño hepático en los individuos afectados. Los niveles más altos se observan en las hepatitis toxicas (etanol, medicamentos) y en las virales, en las que puedan superar en 100 veces los valores de referencia. En la hepatitis viral es característico que los niveles de TGP sean mayores que los de TGO. Cuando la elevación de transaminasa ocurre con una relación inversa (más TGP), se debe sospechar hepatitis alcohólica.

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PROCEDIMIENTO:     

Muestra de sangre Blanco GOP Blanco GTP Muestra de GOP Muestra de GTP

Agregar a cada tubo: GPT/GOP Sustrato de cada enzima

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GRAFICA GRAFICA GPT GOT 0.3

0.3 0.4 0.35 0.25 0.3 0.20.25

ABSORBANCIAS

ABSORBANCIAS

0.350.45

0.33

0.14

0.15 0.2 0.1

0.31 0.38

0.15

0.080.11

0.19 0.21

GPT GOT

0.13

0.1 0.05 0

0.05 0

0

0

0 25 22

0

50 55 GPT GOT

8395

126 130

215 215

U/LU/L

RESULTADOS/CALCULOS: Interpolarlas las lecturas obtenidas para GOT y GTP en la curva de calibración para obtener las unidades respectivas de transaminasa. Valores de transaminasa referenciales: GOT 5 – 40 U/L GTP 5 – 45 U/L TUBO

GOT

1

0

2

0.111

3

0.131

TUB 4 O

5 1 6 2

GPT 0.205 0.326 0 0.383 0.08 2

3

0.13 5

4

0.18 7 10

5

0.30 0

6

0.31 3

GOT REFERENCIAL de 5 – 40 U/L GOT: 15, 06

GTP REFERENCIAL de 5 – 45 U/L GTP: 22, 56

GOT: 0,076

GTP: 0,074

0,111 ---------22

0,082----------25

0,076-----------X

0,074----------X

X = 15,06

X = 22,56

CONCLUSIONES:  Transaminasas ASAT (GOT) presentes en esta muestra es de 15,06, rango aceptable.  Transaminasas ALAT (GPT) presentes en esta muestra es de 22,56, rango aceptable  Se logró determinar la concentración en suero de las transaminasas.

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CUESTIONARIO 1. ¿QUÉ OCURRE, SI UNA PERSONA BEBE ALCOHOL EN FORMA PERMANENTE? ¿POR QUÉ? La exposición prolongada al alcohol lleva a que la química cerebral se adapte para contrarrestar el efecto tóxico del etanol y mantener las funciones cerebrales a un nivel normal. Como consecuencia, se produce la tolerancia, situación que implica que la misma cantidad de alcohol tiene menos efectos que antes. La dependencia llega cuando el cerebro se acostumbra tanto al alcohol que ya no puede funcionar bien sin él, de modo que el cuerpo lo pide con insistencia; si no lo recibe, el equilibrio químico se desestabiliza por completo y sobrevienen los síntomas de abstinencia, tales como ansiedad, temblores e incluso ataques. Además de alterar la química cerebral, el abuso del alcohol puede ocasionar atrofia y destrucción de las células, atentando así contra la propia estructura del cerebro. Aunque con la abstinencia absoluta es posible la recuperación parcial de algunos daños, otros son al parecer irreversibles, por lo que resultan aún más afectadas la memoria y otras funciones cognitivas. Los estudios indican que el cerebro sufre daños aun cuando los períodos en que se abusó del alcohol no hayan sido prolongados, sino relativamente breves Los daños que recibe el hígado por estar expuesto mucho tiempo a esta sustancia se suceden en tres etapas. En la primera, la descomposición del etanol hace que las grasas se digieran con mayor lentitud y se acumulen en el hígado, afección que se denomina esteatosis hepática, o hígado graso. En la segunda etapa se produce inflamación crónica, o hepatitis. Aunque por sí solo el consumo de alcohol puede causar hepatitis, por lo visto también favorece indirectamente su aparición al mermar la resistencia del organismo a los virus de las hepatitis B y C. Sino se pone freno a la inflamación, las células terminan reventando y muriendo. Para colmo de males, se cree que el alcohol activa la apoptosis, proceso natural por el que las células se autodestruyen. El alcohol ataca gradualmente al hígado desde otro ángulo: merma su capacidad de contrarrestar los efectos de los agentes cancerígenos. Además de favorecer la aparición de cáncer hepático, el 15 alcohol incrementa de forma significativa el riesgo detener cáncer de boca, faringe, laringe y esófago. Por si fuera poco, hace que las membranas mucosas de la boca se vuelvan más susceptibles a la penetración de las sustancias cancerígenas del tabaco, lo que eleva el peligro en el caso del fumador. Por otra parte, las mujeres que beben a diario tienen más probabilidades de padecer cáncer de mama. 2. EL DOSAJE DE LAS TRANSAMINASAS, SE PUEDE LLEVAR A CABO SIN LA PRESENCIA DEL PIRIDOXAL FOSFATO Las transaminasas requieren la coenzima piridoxal-fosfato, que se convierte en piridoxamina en la primera fase de la reacción, cuando un aminoácido es convertido en un ácido ceto. La piridoxamina enlazada a la enzima reacciona con alanina, oxalacetato o alfa12

cetoglutarato, dando piruvato, ácido aspártico o ácido glutámico, respectivamente 3. CÓMO DOSARÍA UD UN SUERO QUE DE ANTEMANO LE INDICAN, QUE TIENE MÁS DE MIL UNIDADES DE TGO El tejido miocárdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima acompaña a los procesos destructivos del corazón; sube al máximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo normal a los 4 ó 7 días. El ascenso es, en general, proporcional a la extensión del infarto; a veces da datos positivos en casos con datos electrocardiográficos de difícil interpretación, pero tiene el inconveniente de elevarse en diversos cuadros, sobre todo en la congestión hepática 4. EXPLIQUE A QUE SE DEBE QUE PARA CALCULAR LAS UNIDADES DE AMINOTRANSFERASAS NO SE UTILICE FACTOR. La administración de un aminoácido con nitrógeno isotópico va seguida de la aparición de dicho nitrógeno en numerosos aminoácidos de las proteínas tisulares; es decir, el organismo utiliza el nitrógeno de un aminoácido para las síntesis de otros. Esta reacción general de traspaso de nitrógeno de uno a otro aminoácido se denomina transaminación y en ella participan un aminoácido y un cetoácido. Las reacciones de transaminación más frecuentes son aquellas en las que participa en alfa-cetoglutarato cuya aminación produce glutamato. Por consiguiente, casi todos los aminoácidos pueden ceder grupo amino al alfacetoglutarato, a través de una reacción de transaminación para formar el cetoácido correspondiente y glutamato. 5. CONSIDERA UD, QUE UN SUERO HEMOLIZADO, NO SE PUEDE UTILIZAR PARA DETERMINAR AMINOTRANSFERESAS. No se puede utilizar debido a que el suero este hemolizado generara una interferencia en los resultados debido a que lo hematíes están parcialmente destruido. 16 7.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS • HAMES D. Bioquímica. Cuarta Edición. Editorial Mc Graw-Hill Interamericana. México D.F. 2014 • HARVEY R. Bioquímica. Sexta Edición. Editorial Lippincotts 2014 • HERRERA E. Bioquímica Básica. Primera Edición. Editorial ELSEVIER. 2014 • KOOLMAN J, KLAUS-HEINRICH R. Bioquímica Humana. Cuarta Edición. Editorial Medica Panamericana México D.F; 2012. • KREBS, GOLDESTEIN. Genes. Segunda Edición Editorial McGraw-Hill Interamericana México. 2012 • LAGUNA J, PIÑA E. Bioquímica. Septima Edicion. Editorial Manual Moderno. 2013 • LEHNINGER. Principios de Bioquímica. Sexta Edición. Editorial Omega 2014. • Allman, H. Tratamiento en gastroenterología, hepatología y Nutrición. Madrid: MARBAN. 2002 • Álvarez, A. &. Semiología Medica (Tercera ed., Vol. III). Buenos Aires, 2008 Argentina: Panamericana. • Bernard, H. El laboratorio en el diagnóstico clínico. Madrid: MARBAN. 200 • Cardenas, M. Farmacologia. Riobamba, Ecuador: Workcenter. 2011 • Castiñeiras, L. Bioquimica Clinica y Patologia molecular (SEGUNDA ed., Vol.II). Barcelona: Reverte S.A. 2008

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