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PUNTAJE

NOTA

UNIVERSIDAD ANDRES BELLO FACULTAD CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Nombres: Carolina Acuña Iturra Gabriela Jofré Gutiérrez 1.- Objetivo del práctico (2 ptos) -Conocer las técnicas básicas de bioseguridad y asepsia para trabajar en el laboratorio de microbiología. -Comprender y analizar el procedimiento de cómo realizar una siembra bacteriana en distintos medios de cultivo. -Observar e interpretar las distintas características morfológicas coloniales y bacterianas tanto macroscópica como microscópicamente. -Aprender a realizar tinciones a través de un uso correcto de sus procedimientos. 2.- Resultados de las técnicas de siembra Dibuje en el espacio asignado, el resultado de su siembra y describa lo observado. En caso de que no obtenga resultados satisfactorios, discuta brevemente las posibles causas. a) Siembra en agar sangre Observaciones (5 ptos): El agar sangre es medio de cultivo del tipo no selectivo, utilizado en la recuperación de bacterias y hongos. Se cultivó Staphylococcus Aureus, cepa bacteriana que se clasifica como Gram positivo, haciendo este medio perfecto para su crecimiento. Se utilizó la técnica de Siembra en cuadrantes que pretende obtener colonias aisladas que permitan la observación macroscópica de la muestra, haciendo posible un análisis de la morfología colonial posterior. En este caso, fue exitosa tanto la elección de fue exitosa tanto la elección de la cepa a cultivar ya que pudo crecer convenientemente, como la técnica de siembra, obteniendo en el cuadrante final hileras de colonias aisladas y fácilmente diferenciables. Entre las características de la morfología colonial destaca su aspecto opaco, color amarillento, cuyos bordes son redondos, de superficie convexa y textura cremosa.

b) Siembra en agar McConkey: Observaciones (5 ptos): Para el cultivo en Agar McConkey, fue necesario seleccionar una cepa bacteriana del tipo Gram negativo, ya que este medio se define como selectivo para Gram positivo (que impide su crecimiento) , y diferencial en cepas del tipo Gram negativo, colaborando así en su crecimiento. Para obtener colonias aisladas de Proteus Vulgaris se procedió a hacer una siembra en cuadrantes, obteniendo desde el tercer cuadrante colonias aisladas de aspecto transparente, circular, con una elevación que pareciera ser convexa, apariencia de la superficie pretendiendo ser brillante, una consistencia de aspecto más bien friable y en cuyos bordes se puede apreciar una presentación del tipo entero.

c) Siembra en agar nutritivo: Observaciones (5 ptos): El agar nutritivo posee concentraciones de nutrientes estandarizados permitiendo que sea útil para el crecimiento y cultivo de gran variedad de bacterias, en esta ocasión, estas condiciones favorables sumado al mal uso de la técnica aséptica colaboraron en el crecimiento de dos cepas bacterianas, ya que se observan dos colonias bacterianas de características morfológicas notablemente distintas. Si bien hay una zona de clara contaminación (cercano al tercer cuadrante), la siembra en cuadrantes sobre el agar nutritivo permitió obtener colonias aisladas de Enterococcus exitosamente, cumpliendo con el objetivo de esta técnica. Se observan colonias aisladas en el último cuadrante con cualidades morfológicas regulares tales como: color blanco de aspecto brillante, elevación redonda, densidad opaca, puntiformes y una consistencia más bien cremosa.

d) Siembra en tubo en profundidad: Observaciones (5 ptos): El uso de tubos en profundidad es utilizado para obtener colonias bacterianas visibles comprobando principalmente sus condiciones limitantes de oxígeno. La siembra en tubos en profundidad expone a la cepa bacteriana de estudio, en este caso, correspondiente a Enterococcus, a un medio Anaeróbicas. Como resultado se pudo dilucidar que si hubo crecimiento bacteriano, sin embargo, de poca densidad, por lo tanto, se concluye que Enterococcus es una cepa capaz de resistir condiciones en ausencia de oxígeno, sin ser la condición anaeróbica su medio preferente, esto debido a que denota un crecimiento, pero de carácter escaso. Se observan colonias más bien opacas, de color blanco, pero sin poder ser definidas según su borde y superficie, ya que estas no se encuentran aisladas.

e) Siembra en tubo tendido: Observaciones (5 ptos): Para la siembra en tubo tendido, se buscó exponer la misma cepa ocupada anteriormente (Enterococcus), pero para esta oportunidad a condiciones aeróbicas, esto es, presencia absoluta de oxígeno. Se observa que esta cepa bacteriana tiene un mayor crecimiento en condiciones aeróbicas, ya que en esta oportunidad se observan colonias más definidas y en mayor cantidad al contrastarlo con la situación anterior. Debido a que se hizo uso de la siembra con asa de platino, la superficie del agar quedó impregnada de pequeñas colonias de color blanco con cierto aspecto brillante, pero de densidad opaca, sin embargo, resulta difícil poder diferenciar entre colonias ya que fue posible tener un cultivo con todas las colonias aisladas.

f) Siembra en tubo semitendido: Observaciones (5 ptos): La siembra en tubo semitendido es utilizada para exponer cepas bacterianas a condiciones aeróbicas y anaeróbicas simultáneamente. Para Enterococcus se observa que si bien hay crecimiento bacteriano en ambas condiciones (en presencia y ausencia de oxígeno), se muestra cierta tendencia para preferir condiciones aeróbicas, reafirmando los resultados obtenidos anteriormente con la misma cepa, pero sometida a ambos medios aislados. Además, es posible observar iguales morfologías coloniales descritas previamente. Tras el análisis de los resultados obtenidos en medios anaeróbicos y aeróbicos, ya sea estén aislados o de manera simultánea es posible concluir que Enterococcus es un tipo de bacteria anaerobia facultativa, ya que demuestra crecimiento en ambas condiciones, pero con preferencia predominante por el medio aeróbico. 3.- Resultados de las técnicas de esterilización y asepsia Dibuje en el espacio asignado, el resultado de su siembra y describa lo observado. En caso de que no obtenga resultados satisfactorios, discuta brevemente las posibles causas. a) Esterilización del asa (2 ptos)

Observaciones (5 ptos): En esta esterilización se sometió el asa de siembra a flameado hasta su incandescencia, (esto es esterilización por calor seco) produciendo la desecación de la célula efectos tóxicos por procesos oxidativos y fusión de las membranas. Primeramente, se dividió el agar en dos marcando con un lápiz un sector con la letra “s” en donde se sembró con asa de platino una muestra obtenida de una suela de zapato, luego se prosiguió a esterilizar el asa con flameado y luego a sembrar en el sector con la letra “c”. Se observó crecimiento de colonias en ambos sectores, pero hubo una menor cantidad de estas colonias en el sector con flameado. En ambos lados se obtuvo una descripción morfológica de las colonias similares, con bordes ondulados, un color blanco, brillo opaco y forma irregular.

b) Alcohol (2 ptos)

Observaciones (5 ptos): El alcohol es utilizado como agente Desinfectante. Su principal forma de acción antimicrobiana es a través de la desnaturalización de las proteínas, de esta forma se permite las rupturas de las membranas. En este agar primeramente se dividió en dos y se marcó un sector con la Letra “s” en donde se sembró una muestra de La suela de un zapato obtenida con una tórula, posteriormente se adhirió alcohol a esta tórula y se prosiguió a sembrar en el sector del agar con la letra “c”. se visualizó la morfología de las colonias en ambos sectores de características similares, cuya forma era ondulada, con un color blanco opaco, pero las colonias del sector con alcohol se ven más pequeñas y menos abundantes.

c) Yodo (2 ptos)

Observaciones (5 ptos): El yodo es un desinfectante y antiséptico halogenado cuya acción produce oxidación e inactivación de los componentes celulares. En el siguiente agar se dividió en dos sectores uno con la letra “s” en el que se sembró una muestra de la mesa del laboratorio a través del dedo índice. Se prosiguió a incorporar yodo al dedo que tenía la muestra y posteriormente se sembró en el sector del agar con la letra “c”. Se observó distintas morfologías de colonias, en el sector sin yodo se visualizan 4 tipos de colonias distintas, una con borde entero y color amarillentos, otra con borde filamentoso y color amarillento, otra con borde ondulado y color blanco, por último, una con borde lobulado y color Amarillento. En el sector del agar con yodo hay presencia de todas las colonias menos Aquella con borde lobular, indicando escasa eliminación de microorganismos por yodo.

d) Cloro (2 ptos)

Observaciones (5 ptos): Esta técnica de desinfección resultó la más efectiva en este práctico; el cloro es un compuesto halógeno que somete a los microorganismos a un estrés oxidativo, oxidando compuestos como DNA y proteínas, para así provocar daños irreversibles en bacterias, hongos y micobacterias, dejando viables a algunos virus y esporas bacterianas. En esta ocasión se tomó una muestra de mucosa bucal la cual se dispuso en la sección con un “s” sin el desinfectante y “c” con el desinfectante (cloro). Tras su aplicación sobre un agar nutritivo (con ayuda de una tórula estéril) se logró obtener como resultado la ausencia casi por completo de colonias microbianas en el sector donde se aplicó el desinfectante (“c”) en contraposición del sector que no está expuesto a desinfección (“s”), en el que se pueden observar colonias pequeñas de aspecto puntiforme. 4.- Análisis macroscópico: A partir de su cultivo en agar nutritivo (placa de Petri) realice la descripción macroscópica del agente, completando los siguientes cuadros informativos (8 ptos). Nombre bacteria Forma Borde Elevación Color Brillo Consistencia Superficie

Enterococcus Puntiforme Entero Redonda Blanco Opaco Cremosa Cremosa y brillante

5.- Análisis microscópico: Tinciones. Dibuje lo observado y describa sus observaciones: color, forma y agrupación y cualquier otra observación relevante. Indique el aumento utilizado. a) Tinción de Gram:

Observaciones (5 ptos): La tinción Gram consiste en utilizar colorante cristal violeta (tipo catiónico) que tiñe bacterias del tipo Gram positivo gracias a su alta penetrancia en dichas paredes celulares y con ayuda de un mordiente, el colorante podrá ser fijado en estas. Luego la muestra debe ser lavada y teñida con un colorante de contraste: safranina que será capaz de teñir aquellas bacterias que no lo estaban tras el lavado, las de tipo Gram negativo quedando así bacterias color fucsia tal como se observa en la fotografía, por lo tanto, en este frotis es posible concluir que Proteus Vulgaris es tipo Gram negativo. En el análisis microscópico se utilizó microscopio óptico con aumento total de 1000X y aceite de inmersión para obtener un ángulo de refracción mayor, y por consiguiente una mejor visualización. Fue posible observar una alta densidad de Proteus Vulgaris, la cual muestra una morfología bacilar y agrupación principalmente en diplos. b) Tinción de cápsula: Observaciones (5 ptos): Para la observación de cápsula es necesario generar una tinción del tipo negativa, esto quiere decir que se obtendrá una tinción de todo el frotis, exceptuando aquello de interés es decir, todo aquello menos las bacterias correspondientes a Klebsiella sp. que se verán de color fucsia por la Fucsina, y la cápsula que quedará exenta de tinción observándose como contornos o “halos” blancos. Las bacterias observadas son de forma bacilar de tamaño más bien pequeño y disposición en cadenas o estreptobacilos, inferido desde la disposición de las cápsulas observadas en hileras una al lado de la otra. Para el análisis microscopio se hizo uso del microscopio óptico, con un aumento total de 1000X (10X desde los oculares y 100X por lente objetivo); además se hizo uso de aceite de inmersión, por su alto índice de refracción, colaborando en una mejor resolución.

c) Tinción de esporas: Observaciones (5 ptos): Para un examen microscópico de esporas bacterianas, es necesario utilizar una técnica tintorial donde se utilizan las tinciones de verde de malaquita y safranina para su contraste. En este caso, por motivos de tiempo no fue posible la realización de esta tinción, sin embargo, nos fue posible observar una muestra preparada por otro grupo a través de un microscopio óptico haciendo uso de un aumento total de 1000X (10 del ocular más 100X del lente objetivo). Es posible observar una muestra de Bacillus, bacterias con forma de bacilos de color fucsia debido a la safranina, con sus correspondientes esporas, las cuales son dilucidados por su característico color verde proveniente de su afinidad con el verde de malaquita. En cuanto a la agrupación bacteriana se ven eventuales cadenas o estreptobacilo, sin embargo, es una mera aproximación. 6.- Responda las siguientes preguntas. Ocupe sólo el espacio designado a) Investigue qué es una infección nosocomial y cuáles son los patógenos bacterianos más prevalentes que producen este tipo infección en Chile (7 ptos). También denominadas infecciones intrahospitalarias (IIH), adquiridas durante la asistencia sanitaria en hospital o cualquier centro de salud(1), y que no estaban presentes ni en el periodo de incubación ni cuando el paciente ingresa, manifestándose tras 48 horas después de la asistencia y hasta 72 horas después del alta, incluyendo además toda infección post-quirúrgica dentro de los primeros 30 días, afectando al aumento de morbilidad y mortalidad asociada(2). En chile se notifican aproximadamente 70000 casos de IIH anuales, prolongando la estadía hospitalaria y el uso de camas, en 5 días promedio. Esto trae repercusión en el elevado costo que afectan al paciente, familia, hospital y comunidad. La localización más frecuente de IIH en Chile son en el tracto urinario (42%), heridas operatorias (24%), neumonías (11%), bacteriemias (5%), distribuyendo la etiología microbiana entre los siguientes gérmenes patógenos, Cocáceas (+): 21%, Enterobacterias: 16%, Virus: 55% y Hongos: 3%(3). En las infecciones del tracto urinario los 3 agentes etiológicos más importantes: Escherichia coli, P.aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. En heridas operatorias están: Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Streptococcus coagulasa (-). En neumonías encontramos: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. Por último en bacteriemias: Staphylococcus aureus, Streptococcus coagulasa (-) y Klebsiella pneumoniae(4).

b) Indique la clasificación, utilidad y componentes principales de los siguientes medios de cultivo (6 ptos, 2 ptos c/u) a) Agar sangre: Es un medio enriquecido y diferencial, adecuado para cultivar diversos microorganismos, incluyendo los que tienen una mayor exigencia para su desarrollo. Lo compone un medio base, más un agregado de sangre al 5 % generalmente de oveja. Este agar aporta muchos factores de crecimiento y permite observar la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos según los halos hemolíticos alrededor de las colonias que se pueden clasificar en hemólisis alfa, beta o gamma(5). b) Agar McConkey: En un medio selectivo y diferencial utilizado para aislar bacilos Gram negativos, fermentadores o no de lactosa. Contiene sales biliares y violeta cristal que inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas Gram positiva, además contiene lactosa y un indicador de pH rojo neutro que servirán para comprobar, con el cambio de color en el medio, la fermentación o no de aquella azúcar(6).

c) Agar nutriente: Es un medio de cultivo simple y sólido, compuesto de caldo luria y agar corriente, utilizado para propósitos generales como el aislamiento y crecimiento de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales, este puede ser enriquecido con sangre, carbohidratos u otras sustancias para enriquecerlo(7).

7.- Bibliografía (3 ptos) (1) Samuel Kaba Akoriyea, epidemiología de la infección nosocomial en neurocirugía(2009), Universidad de Santiago De Compostela, Santiago de compostela, p.8 (2) https://medicinainterna.wikispaces.com/Infecciones+Intrahospitalarias (3) http://www.hrrio.cl/documentos/eLearningIIH/profesionales/infeccionesintrahosp italaria.pdf (4) http://www.bibliotecaminsal.cl/wp/wp-content/uploads/2016/01/iih.pdf (5) Forbes, B., Sahm, D., Weissfeld, A. Diagnóstico Microbiológico(2009), Editorial Médica Panamericana, 12ª edición, Buenos Aires, p.98 (6) http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8770 (7) Rodríguez, E., Gamboa, M., Hernández, F., García, J. Bacteriología general: Principios y prácticas de laboratorio (2005), Editorial Universidad de Costa Rica, Costa Rica, p.118