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• Luis Leonardo Luna Ojeda

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DOCENTE: Blgo. Enrique Erasmo, Barrientos Aguilar AUTORES:         

COLONIO HUAMAN, Antoni DAVILA MUÑOZ, William DE LOS SANTOS RAMÍREZ, Zaira LUNA ESCOBAR, Keren MUÑOZ CABANILLAS, Mitzy NUÑEZ PRADA, Esthalyn RODRIGUEZ CONSTANTINO, Julio SERPA QUISPE, Rocio VARGAS HUAYLLA, Blanca

CICLO: V SEMESTRE: 2017 B GRUPO: 90 G Nº DE INFORME: 5 FECHA DE REALIZACION: 18 de noviembre del 2017

I.

RESUMEN

En el presente laboratorio se presenta la elaboración de un cultivo fúngico a partir del Medio de cultivo OGGY (Agar oxitetraciclina-glucosa-levadura) con oxitetraciclina el cual es utilizado para el aislamiento selectivo y enumeración de levaduras y moho. Se hace la respectiva siembra por agotamiento a partir de una muestra de agua contaminada, garantizando al máximo condiciones de esterilidad durante el proceso. Pasado los 3 y 5 días se realizó la respectiva lectura, observando macroscópicamente características morfológicas de las colonias presentes, obteniéndose el reconocimiento de la presencia tanto de mohos miceliares como de Levaduras.

II.

INTRODUCCION

Antiguamente los hongos se incluían generalmente en el reino vegetal, no obstante, más tarde los taxónomos reconocieron que, de hecho, los hongos son muy diferentes a los vegetales y merecen ser clasificados en un reino independiente, Fungi. El estudio de los hongos se denomina Micología, que deriva de la palabra griega mykes que significa “hongo”. El interés de los hongos y las micotoxinas es enorme, no sólo desde el punto de vista científico, sino desde la perspectiva económica. Son muchos los problemas que originan, desde el agricultor hasta el consumidor final. Por ejemplo, las bajadas de rendimientos de las cosechas, los empeoramientos en los índices técnicos de los animales de granja, enfermedades en los mismos, alteraciones en los alimentos, pérdidas de características organolépticas y nutricionales, costes derivados de la prevención o el tratamiento descontaminante por citar algunos de ellos. El presente estudio constituye una guía para realizar una adecuada técnica de análisis de hongos, así mismo, adquirir el conocimiento para identificar y reconocer las colonias.

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III.

FUNDAMENTO

Micología (ciencia que estudia los Hongos) ha sido tradicionalmente una disciplina de la Botánica. Los análisis filogenéticos indican que los hongos están más relacionados con los animales que con las plantas. Sin embargo, los hongos producen esporas (sexuales y asexuales) para su multiplicación y reproducción, lo que no ocurre en los animales. En la actualidad los hongos se consideran un reino independiente (Reino Fungi), separado de las plantas y de los animales. Los hongos son eucariotas, es decir, poseen núcleo, mitocondrias, sistemas de endomembranas y otros rasgos típicos de las células eucariotas. Estos rasgos permiten distinguir los hongos microscópicos de las bacterias procariotas. Los hongos carecen de plastidios por lo que no pueden realizar fotosíntesis (son heterótrofos), su pared celular contiene quitina (un polisacárido nitrogenado) y almacenan glucógeno en sus células como compuesto de reserva. En todos estos rasgos se diferencian de las algas y las plantas terrestres, y se asemejan a los animales. La mayoría de los hongos son terrestres pero algunos ocupan hábitats acuáticos. El tamaño de los hongos varía considerablemente. Algunos son unicelulares (por ejemplo, los quitridios y las levaduras) pero la mayoría tienen cuerpos vegetativos compuestos por filamentos microscópicos ramificados llamados hifas. El conjunto de hifas recibe el nombre de micelio. Los micelios de algunas especies alcanzan grandes tamaños. El micelio de un individuo de Armilaria gallica, un hongo basidiomicete patógeno que crece en los bosques de Oregón (USA), puede ocupar hasta 15 hectáreas, y vivir más de 1000 años.

Foto microscopio de hifas septadas (izquierda) y no septadas (derecha)

Su forma es filamentosa y de tipo tubular con paredes celulares, pudiendo presentar tabiques (hifas septadas) o no (hifas aseptadas) y que contienen en su interior citoplasma que viene a ser una sustancia similar a la clara de huevo junto con pequeñas estructuras con morfologías y funciones determinadas denominadas organoides. 

La estructura del hongo está soportada a veces por hifas de tipos esqueléticas y envolventes, sin embargo otras hifas no tienen tabiques y se hinchan. Se las denomina esferocistos, y suelen estar presentes en los géneros Coprinus, Amanita, Cystoderma, Russula o Lactarius.

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Cuando los esferocistos están presentes en la trama se la denomina Trama heterómera y cuando están ausentes Trama homómera.

Por otra parte existen unas hifas terminales ampulosas que se denominan de forma diferente en función de donde estén situadas. En el himenio (órgano donde se generan las esporas), pueden dar lugar a la formación de basidios, cistidios, cistidiolos, etc. y en otras partes del cuerpo fructífero pueden o no estar formadas por terminaciones esféricas cubriéndolas, por ejemplo, la estipitipellis (cutícula del pie) o la pileipellis (cutícula del sombrero).

MICOTOXINAS En el Reino Vegetal hay múltiples tipos de hongos que van desde los típicos hongos que se pueden ver crecer en los bosques y campos hasta aquellas especies microscópicas que pueden infectar cultivos en el campo o durante su almacenamiento. La mayoría de estas especies viven sobre materia orgánica en descomposición y su presencia contribuye a estos procesos de descomposición, mientras que otros hongos pueden ser causa de enfermedades en las plantas. Los mohos pueden ser muy beneficiosos para el hombre como fuente de nutrientes o como fuente de antibióticos y otros compuestos químicos de interés. Pero, por otro lado, la ingesta directa de hongos tóxicos (por ejemplo, por un error en su identificación) es una causa bien conocida de enfermedad e incluso muerte. El término “micotoxina” normalmente está reservado a los productos químicos tóxicos producidos por unas pocas especies de hongos o mohos con capacidad para infestar cosechas en el campo o después de la cosecha y que representan un riesgo potencial para la salud de las personas y los animales a través de la ingestión de alimentos o piensos elaborados a partir de dichas materias primas. ((AFHSE), 2015) CONDICIONES DE CONTAMINACIÓN El desarrollo de los hongos y la producción de micotoxinas requieren ciertos condicionantes ambientales, entre ellos los siguientes: 

Factores físicos: Humedad y agua disponible, temperatura, zonas de microflora (pequeñas zonas del alimento con alto contenido en humedad), e integridad física del grano o del alimento.  Agua disponible: Merece especial mención el concepto de actividad de agua o agua disponible, normalmente designada como aw. La aw indica la cantidad de agua disponible para el desarrollo de los microorganismos, una vez se ha alcanzado el equilibrio hídrico en el sistema alimento/medio ambiente. La aw se expresa como la relación existente entre la tensión de vapor de agua en el sustrato (P) y la del agua pura (Po), a la misma temperatura, (aw = P/Po). El agua pura tiene una aw = 1. En los alimentos, la aw será siempre inferior a 1.La mayor parte de los hongos que contaminan los cereales, por ejemplo, necesitan valores superiores a 0.7.

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Factores químicos: Composición del sustrato, pH, nutrientes minerales y disponibilidad de oxígeno.

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Factores biológicos: presencia de invertebrados y estirpes específicas (en una misma especie fúngica existen estirpes productoras de micotoxinas y otras que son incapaces de producirlas) Los factores ambientales mencionados son los que condicionan la contaminación fúngica de los alimentos almacenados. La investigación aplicada a la calidad de los piensos y los granos se ha dirigido en las últimas décadas al control de los hongos, pues se han identificado como una de las principales causas del deterioro nutricional y organoléptico del grano y pienso almacenado.

PRINCIPALES HONGOS Y MICOTOXINAS Dentro de la gran variedad de hongos existentes, son pocos los que juegan un papel importante en el campo zootécnico. Las micotoxinas son producidas principalmente por 5 tipos de hongos: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Claviceps y Alternaria. En el cuadro siguiente se muestran las toxinas producidas por estos géneros. Los hongos que invaden los granos pueden clasificarse en dos grupos diferentes: 

Hongos de campo: invaden los granos antes de la cosecha o tras la siega (siempre previo a la trilladora). Incluye distintas especies que requieren altos niveles de humedad en el grano (20-22%). Son típicos los géneros Alternaria y Fusarium.

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Hongos de almacenaje: invaden el grano a contenidos inferiores de humedad. Géneros como Aspergillus y Penicillium.

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Mortalidad Del elevado número de micotoxinas, las aflatoxinas son las más estudiadas. Producidas esencialmente por Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus, se conocen hasta el momento 18 variedades de aflatoxinas. Los datos relativos a la toxicidad de las más nocivas se reflejan en la siguiente tabla, en orden decreciente de toxicidad. A

Hay que tener en cuenta además las posibles interrelaciones que hay entre las micotoxinas y su efecto sobre la salud, ya que estas pueden ser sinérgicas, aditivas, antagónicas y potenciales. MICOTOXINAS IMPORTANTES Y HONGOS QUE LAS PRODUCEN HONGO

MICOTOXINA

Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus

Aflatoxina

Aspergillus ochraceus

Ochratoxina

Fusarium sp.

Penicilillum sp

Zearelenona Toxina T2 Vernotoxina Citrinina Tremorgenos Patulina

CARACTERISTICAS PRINCIPALES - Altamente cancerígeno - Produce toxicidad y cáncer del hígado - Detectado en diferentes cultivos en el campo, cosecha , transporte, almacenamiento y en el hogar. - Productos contaminados con facilidad: Maní y Maíz Causa Nefropatía crónica o intoxicación del riñón en cerdos y aves -Produce efectos estrogénicos en animales, vómitos y muerte - Causa enfermedad en los riñones - Causa temblores

La presencia de micotoxinas en los productos alimenticios, depende de cepas específicas de hongos y éstas cepas de hongos están sujetas a la influencia de factores ambientales como la humedad y la temperatura. Por lo tanto, la contaminación micotóxica de los productos alimenticios puede variar según las condiciones geográficas, climáticas, métodos de producción, tipos de almacenamiento y también según el tipo de alimento. Algunos productos Microbiología general

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alimenticios son sustratos más aptos que otros para el crecimiento de los hongos y producción de tóxinas. La invasión de Aspergillus flavus y producción de aflatoxinas ocurre frecuentemente en el campo, cuando el maíz es atacado por gusanos de la mazorca. Los años con fuerte incidencia de gusanos producen mayores problemas de A. flavus y sus micotoxinas. Los productores deben realizar una buena selección de mazorcas especialmente durante estos años. La micotoxicósisi es la enfermedad causada por el consumo de alimentos contaminados con micotoxinas. La enfermedad incluye cánceres, hemorragias, tumores, abortos, defectos de nacimiento, problemas digestivos y diarreas. ENFERMEDAD Beriberi Cáncer del hígado

Enfermedad del maíz mohoso Síndrome estrogénico

Enfermedad del pavo

SÍNTOMAS PRINCIPALES Similar a la deficiencia de vitamina B Depresión del sistema inmunológico. Aumento de bilirruvina (ojos y piel amarilla) y tumores del hígado Muerte en pocos días Sacos aéreos inflamados, cirrosis, mal crecimiento y mala salud en general Sacos aéreos inflamados, cirrosis, mal crecimiento y mala salud en general

HONGO CAUSANTE Penicillium sp Aspergillun flavus A. Parasiticus

Penicillum rubrum Fusarium roseum F. Graminearum Aspegillun flavus A. parasiticus

CONTROL Es claro que la presencia de microorganismos causantes de micotoxinas en los granos y alimentos representa un peligro considerable. Dejarlos crecer libremente puede traducirse en la producción de micotoxinas y micoxoticosis con todos los efectos. Las pérdidas económicas causadas por el rechazo de granos contaminados son considerables. Pero son más importantes las pérdidas no detectadas, debido a la reducción de la productividad en la explotación de animales. El mejor método para disminuir la contaminación de granos con micotoxinas, es la adopción de medidas preventivas para el control de hongos. I.

Antes de la Cosecha   

Utilizar variedades que se cosechen cuando no exista mucha lluvia o modificar la fecha de la siembra para que cuando se cultive no haya mucha humedad. Destruir las malezas y residuos de la cosecha anterior, ya que pueden servir como criaderos de hongos. Reducir al mínimo el daño mecánico de los productos durante el cultivo y la cosecha.

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II.

Durante el Almacenamiento 

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IV.  

V.

Limpiar cuidadosamente de sustancias extrañas el producto antes del secamiento y almacenamiento, ya que pueden contaminar con esporas el fruto. Es importante no prolongar el tiempo de contacto con éstas. Secar el grano lo más pronto posible después de la cosecha. Almacenar con contenidos de humedad mínimos que impidan el desarrollo de hongos en el almacén. Almacenar los productos bajo condiciones adecuadas. Las estructuras de almacenamiento tienen que estar secas para no permitir la entrada del agua. Adicionalmente, deben estar limpias y en buen estado físico. Es necesario mantener el lugar del almacenamiento a temperaturas y humedades relativas desfavorables para el desarrollo de los hongos. Los granos almacenados deben estar secos, frescos y libres de insectos.

OBJETIVOS Disponer de un método para detectar los hongos en alimentos (comino). Identificar el tipo de hongo.

ALCANCE

Laboratorios de mediana complejidad.

VI.

CONDICIONES GENERALES

Los metodos de siembra de diluciones en placas y siembra directa en placa pueden utilizarse para detectar hongos en los alimentos.

VII.

RECURSOS NECESARIOS

RECURSOS HUMANOS 

Personal adiestrado en microbiología.

EQUIPOS Y MATERIALES        

Placas descartables esterilizadas. Pipetas serológicas de 5ml y 1ml. Gradilla. Tubos con tapa. Drigalsky. Propipeta. Mecheros. Hoja bulky.

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MEDIOS DE CULTIVO  

Agua peptonada (90ml). Agar OGY con oxitetraciclina.

MUESTRA 

VIII.

Comino.

PROCEDIMIENTO

METODO: siembra por diseminación. TECNICA DIA 1: antes de realizar cada paso, se tiene la mesa de trabajo preparada. Con dos mecheros a cada lado para hacerlo de la forma más aséptica. PRIMERA PARTE       

Fundimos el agar OGY en el microondas hasta que se disuelva y quede sin grumos. Temperamos a 47°C. Agregamos la oxitetraciclina (esto para inhibir el crecimiento de cualquier otro microorganismo) a la botella que contiene el agar OGY. Homogenizamos la mezcla. Colocamos 6 placas esterilizadas en la mesa de trabajo (ya limpia). Vertemos la mezcla en cada placa aproximadamente de 10 a 15ml. Esperamos a que solidifique.

SEGUNDA PARTE   

En el agua peptonada de 90ml vertemos la muestra a analizar, en nuestro caso, comino (10 gramos). Homogenizamos esta mezcla y dejamos reposar por un lapso de 15 minutos, para que la muestra sedimente. En dos tubos agregamos 9ml de agua peptonada que serán usadas para las diluciones.

TERCERA PARTE     

Procedemos a hacer las diluciones la botella (agua peptonada + comino) es la dilución 10-1. Sacamos 1ml de la botella y lo vertemos al primer tubo, sería la dilución 10-2, homogenizamos. Sacamos 1ml del tubo 10-2 y lo vertemos al segundo tubo, sería la dilución 10-3, homogenizamos. Sacamos 1ml de tubo 10-3 y lo desechamos. Una vez hecha las diluciones procedemos a sembrar.

CUARTA PARTE Microbiología general

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Vamos a pipetear 0.1ml de cada dilución a dos placas (con agar OGY ya solidificado). Procedemos a sembrar. En un envase con alcohol tenemos la espátula de Drigalsky. Vamos a ponerla al fuego, esperamos un momento a que enfríe y comenzamos a sembrar. Damos a cada placa movimientos suaves y envolventes. 5 vueltas en sentido horario, 5 vueltas en sentido anti horario, 5 movimientos hacia los costados y 5 movimientos de arriba hacia abajo. Dejamos que seque, por unos 15 minutos. Envolvemos en hoja bulky, la placa va de forma invertida. Rotulamos e incubamos a una temperatura de 22 – 25°C, de 3 a 5 días. Observamos las colonias a los 3 días y a los 5 días.

Observación:  La siembra con la espátula de Drigalsky es del centro hacia afuera de forma muy delicada para no romper el medio de cultivo (agar OGY).  El tiempo de siembra no debe de superar los 20 minutos, es recomendable un tiempo de siembra de 15 minutos.

IX.

RESULTADOS

LECTURA: Tomar todas las precauciones necesarias al manipular las placas Petri, para evitar la contaminación del área de trabajo. Las esporas de los mohos se dispersan con gran facilidad.

Cuadro del ministerio de salud del Perú (Miriam Guevara Robles, 2007)

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Las colonias de levaduras se presentan en forma de colonias opacas, blancas o amarillas. Las colonias de hongos filamentosos son de aspecto algodonoso de diverso tamaño y color.

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Colonias verdosas, algunas brillantes. Textura algodonosa (hifas).

A los 3 días

DILUCIONES

PLACAS

DILUCION 10-1

DILUCION 10-2

DILUCION 10-3

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Aspergillus niger, Colonias algodonosas, amarillas en 3 días.

A los 5 días

DILUCIONES

PLACAS

DILUCION 10-1

DILUCION 10-2

DILUCION 10-3

Aspergillus niger, Colonias negras y esporuladas en 5 días.

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X.

CONCLUSIONES   



XI.

Se observó una gran presencia de mohos y levaduras en la muestra de orégano, quizá por su exposición al ambiente. se evidencia como este medio de cultivo efectivamente solo permite el crecimiento y desarrollo de Hongos (mohos y levaduras). La velocidad de crecimiento de Levaduras es mayor a la de los mohos pero contrario a esto los mohos luego de cierto tiempo tiene mayor capacidad de invasión ya que el tamaño de sus colonias es mucho más grande. Escherichia coli, Inhibido completamente: Ni una sola colonia. Bacillus, Inhibido completamente: Ni una sola colonia.

BIBLIOGRAFIA

(AFHSE), A. D. (2015). MINISTERIO DE AGRICULTURA, ALIMENTACIÓN Y MEDIO AMBIENTE. Obtenido de http://www.mapama.gob.es/imagenes/es/textomicotoxinas18122015_completorev_n ipo_tcm7-411648.pdf L., l. f. (2014). SENA. Obtenido de https://issuu.com/tgpa533801/docs/info_micro_m_y_h__1_.docx Microbiología, g. d. (24 de octubre de 2008). Obtenido de http://www.ispch.cl/lab_amb/doc/microbiologia_alimentos/PRT-031.pdf MICROKIT. (s.f.). Obtenido de http://www.medioscultivo.com/ogye-agar-base/ Miriam Guevara Robles, F. U. (2007). Obtenido de http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manual%20Hongos.pdf VERDU, G. (1986). Obtenido de http://www.mapama.gob.es/ministerio/pags/Biblioteca/Revistas/pdf_plagas%2FBSVP -12-02-237-272.pdf

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XII. 

ANEXO Flujograma de secuencia de análisis. PROCEDIMIENTO RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS NORMA ISO 7954 (Microbiología, 2008)

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