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• Susana Fuentes

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA Facultad de medicina DEPARTAMENTO DE TOXICOLOGÍA

LÍNEA DE PROFUNDIZACIÓN TOXICOLOGÍA ANALÍTICA GUÍAS ACADÉMICAS

DOCENTE. NANCY PATIÑO REYES

INTRODUCCIÓN. La toxicología de urgencias requiere la identificación rápida y confiable de las sustancias tóxicas que causan un cuadro clínico en estudio, presentado por un paciente recibido en este servicio. El examen físico y una historia clínica completa determinan el número y tipo de las pruebas analíticas que se deben solicitar. No se justifica el uso de un perfil analítico amplio para el diagnóstico o valoración global, sino que los exámenes deben ser ordenados en forma lógica y racional según las condiciones individuales de cada paciente. Con ello se logra una reducción de los costos de la atención médica y se aumenta la eficiencia y la efectividad del servicio de urgencias. Es por esto que el objetivo general de esta línea es Capacitar al estudiante en el análisis químico Toxicológico de las diferentes áreas y en la interpretación de resultados en el campo analítico, igualmente para lograrlo es indispensable reconocer un laboratorio de Análisis Instrumental y su Aplicación a la Toxicología Clínica, Ambiental Ocupacional y Forense. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

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Capacitar al Medico para diferenciar el análisis Químico Toxicológico de otros análisis paraclinicos, y desarrollar un criterio de diagnóstico frente a un resultado positivo en urgencias Toxicologicas.

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Preparar al estudiante para analizar los diferentes métodos que se utilizan en diagnostico de la Toxicología clínica, Ocupacional, Ambiental y toxicología de la fármacodependencia. y la confiabilidad de las pruebas.

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Preparar a los estudiantes para ampliar su visión hacia los análisis toxicológicos ocupacional y ambiental y su impacto en la salud.

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Capacitar al estudiante para analizar los resultados en exámenes Toxicológicos de niveles de medicamentos, para uso terapéutico.

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GUÍA ACADÉMICA No 1 Mediante consultas organizadas usando diferentes medios realizaremos un recuento de la toxicología a través de los tiempos, esto nos permitirá en una mesa redonda enriquecer nuestra información acerca de la toxicología y su importancia. HISTORIA DE LA TOXICOLOGÍA. Podríamos decir que la historia de la Toxicología se remonta a la misma aparición del hombre sobre la tierra. En efecto él debió discriminar tempranamente que alimentos de la naturaleza servían para nutrirlo de cuales podían envenenarlo: de esta distinción dependía su vida. El hombre fue aprendiendo de la naturaleza y utilizó de ella tanto para los tratamientos con bases empíricas, como para agredir a otros. La historia recuerda que los proveedores de venenos los ofrecían distinguiendo aquellos de acción rápida, de aquellos de acción retardada y otros de acción acumulativa. Así aparecen los primeros modelos experimentales “los probadores de alimentos” de los reyes, primero hombres y luego perros. Así fue creciendo el conocimiento. www.msal.gov.ar/redartox

La realidad es que la toxicología, como tantas otras ramas de las ciencias biológicas, pasó por sucesivas etapas de empirismo y misticismo antes de que se le llegara a reconocer como ciencia. La experiencia ha enseñado al hombre lo benéfico o perjudicial de ciertas sustancias. El hombre primitivo se auxilió de algunas de ellas para cazar; posteriormente las utilizó con propósitos estimulantes, terapéuticos o criminales. Es muy probable que los primeros tóxicos fueran de origen vegetal. Con frecuencia se ha reiterado que el conocimiento de los venenos es tan antiguo como el hombre mismo; de igual manera, la práctica del envenenamiento se pierde en la antigüedad. Entre los papiros más antiguos del milenario Egipto se encuentran anotaciones que demuestran que en esa época ya existía conocimiento de los venenos, pues los sacerdotes egipcios con pócimas preparadas con semillas de melocotón a la gente que revelaba secretos religiosos. El ácido cianhídrico contenido en las bebidas causaba la muerte de quien lo ingería. La Biblia revela que los hebreos ya tenían conocimiento de uvas y bayas venenosas, de la hiel mortal de las serpientes y de la baba fatal de los reptiles. En investigaciones arqueológicas de G. Saint-Hilare y Parrot, se ha descubierto que el hombre del Paleolítico usaba tóxicos que impregnaba en las puntas de sus lanzas o flechas. Alrededor del 2800 a. C., el emperador chino Shin-Nong cultivó varias plantas medicinales y describió sus propiedades medicinales y tóxicas. Su obra, que se tituló Pen Tsia Kang Mu, constituye un voluminoso tratado que fue publicado en el siglo XVI; cuenta con 52 volúmenes y describe alrededor de dos mil medicamentos. En Grecia, en el siglo V a. C., los venenos adquirieron una importancia social y política: Sócrates fue ajusticiado mediante la administración de un brebaje tóxico. En el célebre juramento de Hipócrates, el sabio de Cos, a quien se le considera justamente el padre de la medicina, se expresa claramente: “A nadie daré una droga mortal aun cuando me sea solicitada, ni daré consejo con este fin.” Teofrasto de Efeso, discípulo de Aristóteles, fue un gran botánico que estudió varios venenos de acción lenta; Nicandro de Colofón escribió una importante obra sobre los venenos animales, vegetales y minerales; Cratevas, médico privado del rey Mitridates VI de Ponto, proporcionó a su amo la manera de protegerse de ciertos tóxicos, tales como arsénico, mediante la ingestión de 1

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dosis progresivas y ascendentes. El tipo de resistencia adquirida se denominaba “mitriadismo”; Pedanio Dioscórides de Anazarbo, quien vivió en el siglo I, en su célebre De Universa Medicina, tiene un capítulo dedicado a los venenos, ya que en la corte del emperador existía un envenenador oficial; es el caso de Locuesta, esclava que fue condenada por asesinato, quien al ser indultada se convirtió en experta envenenadora que actuaba por iniciativa propia o cuando el estado requería sus servicios. En las excavaciones de Pompeya se han encontrado sortijas con cavidades para contener venenos y con punzones disimulados para su inoculación. Asimismo, en el siglo V Olimpioduro dio una detallada descripción del método para preparar venenos con arsénico. Arnoldo de Villanova, filósofo y alquimista, describió la semiótica de muchos envenenamientos; Aurelus Theofrastus Bombastus, llamado Paracelso, dio excelentes descripciones sobre las propiedades del arsénico blanco, del sublimado corrosivo y de otros tóxicos. Durante esa época la semiótica toxicológica avanzó poco, ya que la detección de los envenenamientos era difícil porque los signos eran semejantes en varios casos de envenenamiento. La única operación analítica toxicológica consistía en dar de comer a un animal los restos del alimento sospechoso. Por ello la única forma de descubrir al envenenador era atraparlo en el momento de contaminar el alimento. En Italia, Francia, Holanda e Inglaterra, los envenenamientos llegaron a constituir una seria amenaza pública; puede encontrarse una detallada relación de estos hechos en Poisons and Poisoners, de C. J. S. Thompson. Por el mismo tiempo apareció otro famoso veneno, conocido como “acquetta de Peruzzia”, que se preparaba espolvoreando arsénico a vísceras de cerdo; los líquidos obtenidos de la putrefacción disolvían el arsénico. A partir del siglo XV encontramos una intención de aproximación científica. El célebre alquimista Arnoldo de Villanueva escribió Tractus de arte cognoscendi venena cum quis timet sibi ea administrare; Santos de Arnodis aportó Opus de veneis, en Venecia; la obra de Matthioli de Siena aludió a los polvos del archiduque de Austria como antídoto del arsénico; Zachias, en su Medicina legal, discute el valor de la cantidad de tóxico que se encuentra en los cadáveres, las vías de penetración y de la absorción por las mucosas, afirmando que si el veneno es absorbido no produce ningún efecto aunque se introduzca al organismo; asimismo, Courten realizó experimentos toxicológicos en animales; y Antonio Trilla publicó en Toledo su Tratado general de todas las tres especies de venenos, como son minerales, Plantas y animales. En el siglo XVIII se encontró un creciente número de autores que estudiaron cada vez más la toxicología. De igual manera, Mead, Sindor y Neuman aplicaron a la doctrina de los venenos, la iatromatemática. En ese tiempo apareció un libro de Stenezel, que parece fue el primero de los que se titularon Toxicología patológica médica. Nebel relacionó signos de la intoxicación; Sprohuel experimentó con animales; Gmeli estudió medicamentos que pueden ser venenos. Aún más fecundo en autores se presentó el siglo XIX. Apareció el Manual de toxicología, de Duval; Orfila, en la primera edición de Toxicología general, relacionó la fisiología, patología y medicina general, al igual que Armand de Montgarny y Bernard. Además de éstos y otros autores que compilaron los esparcidos conocimientos, hay otros muchos que se especializaron en sustancias específicas, como estricnina, cólquico, belladona, venenos de serpientes y animales ponzoñosos, entre muchos otros. Más próximo a la época actual se encuentran Galtier con Toxicología general y su tratado de Toxicología médica, química y legal, y Pedro mata con su Compendio de toxicología. En este contexto, Briaud y Chaudi publicaron Química legal, texto que, además del análisis químico de los venenos, relaciona los procedimientos analíticos para manchas de sangre, esperma y materia cerebral, entre otros aspectos. En esa época dejaron de emplearse, en parte, los venenos tradicionales, dando razón a Tardieu, quien pugnaba que debía evitarse la profusión de los conocimientos toxicológicos. Sin embargo, aparecieron una serie de descubrimientos que tuvieron como fundamento la experimentación fisiológica en la identificación de venenos, que 1

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resultaron trascendentales para la toxicología. Claudio Bernard afirmaba que toda sustancia introducida al organismo era extraña a la constitución química de la sangre y que representaba un medicamento o veneno. Sin embargo, ha quedado bien comprendida la teoría de Paracelso respecto de que la toxicidad es, en el fondo, una cuestión de dosis. Se requería, entonces, del aporte de farmacólogos y fisiólogos. Había que saber primero cómo penetran los tóxicos al organismo, y a través de qué tipo de vías, además conocer los procesos de difusión en el medio interno. Por su parte, Ariens, Goodman y Gilman mostraron los esquemas de transporte, activación y desactivación de los fármacos. En ese sentido, era importante conocer la relación de dosis efecto, para lo cual aparecieron los conceptos de dosis tóxica, dosis letal, dosis letal media (Trevan), dosis letal mínima (Luchelli) y los importantes trabajos de Schackell, Carpenter, Powers y tantos otros que trataban de llevar a fórmulas matemáticas y gráficas los conocimientos farmacológicos aplicándolos a la toxicología. Todo este esfuerzo para profundizar la toxicología fue dirigido fundamentalmente a la prevención y el tratamiento de las intoxicaciones. En la actualidad comités internacionales de expertos se ocupan de la evaluación toxicológica de las drogas, las acciones teratogénicos, la relación con los trastornos metabólicos, las interrelaciones entre medicamentos, etcétera. Fuhner, en 1956, reconoció la obra de Zangger, Intoxicaciones, que trata de los errores más frecuentes en su tiempo acerca del diagnóstico y la terapéutica de las intoxicaciones. Decía Zangger que “los médicos diagnostican la cuarta parte de las intoxicaciones”, este lamentable hecho únicamente puede remediarse enseñando mejorar la toxicología. www.fmvz.unam.mx BIBLIOGRAFÍA 1. www.msal.gov.ar/redartox 2. www.fmvz.unam.mx

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GUÍA No 2 MUESTRAS PARA ANÁLISIS TOXICOLÓGICO Una Muestra es toda aquella sustancia o materia representativa de la estructura química a ser analizada, no se pueden establecer reglas fijas para elegir una muestra, ya que esta operación depende de la naturaleza del material y la cantidad del mismo que debe tomarse. Mientras sea posible el material recibido estará en condiciones óptimas para análisis. En el caso de análisis Químico Toxicológico existen 2 fuentes de obtención de muestra: a) Oficiales o Legales: generalmente tomadas bajo circunstancias que conllevan a investigación y posiblemente a una sanción ya sea por manejo del producto, del ambiente, o causa de muerte de una o varias personas u organismos vivos. Donde su análisis no es urgente pero sirve de apoyo para tomar medidas preventivas y legales a los entes de salud o policiales. b) Las urgentes cuyo único fin es ayudar generalmente al personal medico o paramédico debido a que está implicada la vida de una o muchas personas. Muestra Biológica: sangre orina o contenido Gástrico, lo más importante es conocer la toxicocinetica de la sustancia y su tiempo de acción ya que de estos parámetros depende el tipo de muestra. Dado que en intoxicaciones humanas y animales agudas la muestra es única en el espacio y el tiempo. La muestra debe ser tomada directamente por el medico o enfermera de la institución de salud, marcarla y sellarla correctamente y refrigerarla cuando no puede ser remitida inmediatamente por un tiempo no mayor a 3 días, en caso de quedar guardada debe considerarse la posibilidad de cadena de custodia cuando se requiera debe ser enviada al laboratorio con una solicitud de análisis que mínimo indique: • Fecha, nombre y edad de la persona, • clase de ocupación, • institución o localidad que remite, • clase de sustancia a analizar, • cuando se desconoce esto, se debe anexar un resumen de historia clínica para orientar el análisis. Muestra No biológica: líquidos, sólidos, alimentos, bebidas, suelo, agua, aire. A menos que sea el causante de una intoxicación aguda y sobre esta muestra repose la mayor evidencia de posible causa de intoxicación, en cada caso se deben seguir las recomendaciones que se harán dependiendo del grupo químico que se va a analizar Para muestras no biológicas debe tomarse y guardarse en frascos o bolsas nuevas o limpias, debidamente selladas, y marcadas, junto con el acta de toma de muestra que nos indique fecha, hora, procedencia, asegurarse de su envío inmediato al laboratorio, algunas veces cuando esta toma es causada por quejas, debe tomarse una contramuestra.

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GUÍA No 3 ALCOHOL ETÍLICO- METILICO OBJETIVO: Conocer las técnicas analíticas más apropiadas para identificar Alcohol Etílico y Metilico en sangre por ser la sustancia química de mayor impacto en la salud publica desde el punto de vista Toxicológico en la ciudad de Bogota FUNDAMENTO TEÓRICO: Dentro de los tóxicos volátiles, los alcoholes Etanol, Metanol son sustancias de importancia toxicológica dada su acción farmacológica depresora del Sistema Nervioso Central. El abuso creciente del consumo de bebidas alcohólicas representa importancia medico-social, debido a que los individuos alcoholizados pueden ser causa de trastornos y accidentes, independientemente de la clase de bebida (cerveza, vino, licores), los principales componentes de ésta son alcohol y agua. El grupo funcional OH, se conoce como hidroxi y puede estar sustituyendo a un H, de una cadena hidrocarbonada, o al H del benceno. Para la comprobación de la presencia de alcohol en sangre se han desarrollado varias técnicas analíticas ya sea para identificación directa del alcohol ó pruebas indirectas que desde el punto de vista enzimático nos permite conocer un dato aproximado del nivel de alcohol presente en el organismo. PRUEBAS RÁPIDAS PARA LA DETERMINACIÓN DE ALCOHOLEMIA El etanol es una sustancia de amplio uso industrial, que fundamentalmente produce patología por su consumo en bebidas y en menor grado por ingestión de productos cosméticos o medicamentos que lo contienen. DETERMINACIÓN POR EL MÉTODO DE WINNICK FUNDAMENTO El método de Winnick permite la determinación de etanol en muestras biológicas como sangre, suero, plasma, etc. El método se basa en la reacción de oxido-reducción del etanol con el dicromato de potasio en medio ácido, el producto final de la reacción es un compuesto coloreado el cual puede ser determinado espectrofotometricamente o por titulación con tiosulfato de sodio y almidón como indicador. La liberación del etanol de la muestra biológica se basa en la volatilidad del etanol a la temperatura del ensayo y la reacción con el dicromato de potasio, lo cual ocurre en la cámara de difusión de Conway. La cuantificación se hace con base en la curva de calibración realizada con un estándar certificado de etanol o utilizando los factores descritos en el método. MUESTRAS Sangre venosa recolectada con sistema de vacío o con jeringa desechable. Se debe tener la precaución de NO LIMPIAR LA ZONA DE LA TOMA DE LA MUESTRA CON UN DESINFECTANTE QUE CONTENGA ALCOHOL. La sangre, 5 a 7 ml, se recolecta en tubo de ensayo de vidrio o polipropileno, con fluoruro de sodio como agente conservante y oxalato de potasio como anticoagulante, tubo tapa gris por convención internacional. Almacenar las muestras en nevera a temperatura de refrigeración mientras se analiza. Es conveniente recolectar bajo las mismas condiciones una contramuestra para los fines legales pertinentes. Las muestras deben mantener en todo momento la cadena de custodia. 1

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EQUIPOS • Estufa de calentamiento programable hasta 240ªC • Balanza analítica • Bureta o microbureta, Clase A, de 10 a 25 ml de capacidad • Otros elementos de laboratorio para la realización del análisis comprende: cámaras de difusión de Conway, micropipetas, balones y otros elementos de uso rutinario en el laboratorio. REACTIVOS DICROMATO DE POTASIO (0,4 N), EN H2SO4 (10 N): Se puede utilizar ampolleta de titrisol de dicromato de potasio 1/10 N(1/60 mol/L), la cual se transfiere cuantitativamente a un balón de 250 ml, se enjuaga varias veces con ácido sulfúrico 10N permitiendo que los enjuagues sean recibidos en el mismo balón y se completa a volumen con el ácido, en todo momento se deben seguir las recomendaciones del fabricante descritas en el instructivo que acompaña al producto. En caso de no contar con ampolleta de titrisol, pesar 19,614 g de dicromato de potasio RA K2Cr2O7, previamente pulverizado y secado en estufa a 100°C, durante 4 a 6 horas y enfriado en desecador, disolver con ácido sulfúrico 10 N en un balón aforado de 1000 ml y completar a volumen con el ácido. ACIDO SULFURICO 10N: Medir 490 ml de ácido sulfúrico concentrado, de densidad 1,835 g/ml y pureza del 96%, completar a 1000 ml agua hervida, y fría; agregar el H2SO4 lentamente y refrigerando, luego completar a volumen con H2O hervida y fría. ADVERTENCIA: Se debe tener cuidado en la preparación de la solución de ácido sulfúrico debido a que esta reacción es exotérmica y produce desprendimiento de calor, el ácido se debe agregar al agua lentamente (Nunca al contrario). Se recomienda colocar el balón en el que se realiza la dilución en un baño de hielo o enfriar bajo chorro de agua. Se debe tener en cuenta que al enfriarse la solución se produce una contracción del volumen, por lo que una vez fría la solución se completa a volumen con agua destilada. TIOSULFATO DE SODIO 0.1 N: Se puede utilizar ampolleta de titrisol de tiosulfato de sodio 1/10 N (0,1 mol/L), la cual se transfiere cuantitativamente a un balón de 1000 ml, se enjuaga varias veces con agua destilada permitiendo que los enjuagues sean recibidos en el mismo balón y se completa a volumen con agua destilada, en todo momento se deben seguir las recomendaciones del fabricante descritas en el instructivo que acompaña al producto. En caso de no contar con titrisol, pesar 28,818 g de tiosulfato de sodio pentahidratado RA y completar a volumen con agua destilada hervida y fría. ALMIDON S.R. Pesar 1 g de almidón soluble, triturar con 10 ml de agua destilada y fría y verter lentamente con agitación constante en 200 ml de agua destilada em ebullición hasta obtener un líquido translúcido y ligero. Dejar decantar y emplear únicamente el líquido sobrenadante. Esta solución debe ser recién preparada. Se puede almacenar en recipiente limpio, tipo frasco gotero, en refrigeración hasta por dos meses, en estos casos debe verificarse que no se presenta crecimiento de hongos, en cuyo caso debe ser desechado. CARBONATO DE POTASIO O DE SODIO AL 20% Pesar 20 g de carbonato de potasio RA, disolver en agua destilada y completar a 100 ml. IODURO DE POTASIO 3N: Pesar 49,8 g de yoduro de potasio RA, disolver en agua y completar a 100 ml. Almacenar en frasco color ámbar, no utilizar el reactivo si ha cambiado su color original. 1

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PROCEDIMIENTO • Medir 0,5 ml de dicromato de potasio 0,4 N preparado en ácido sulfúrico y colocarlo en el compartimiento interno de la celda de Conway. • Medir 1 ml de carbonato de potasio al 20% y colocarlo en el compartimiento exterior de la celda. • Medir 1 ml de sangre y colocarla en el compartimiento exterior, en donde está el carbonato. Tapar la celda, agregándole vaselina u otra sustancia en el borde dela tapa para que quede herméticamente cerrada y evitar la evaporación del etanol. • Mezclar por rotación suave para que se reparta la sangre en el carbonato de potasio y colocar la celda en estufa a 50ª C durante dos horas o a temperatura ambiente durante 24 horas. El alcohol etílico se volatiliza y es atrapado por el dicromato de potasio. • Observar el color de la solución del compartimiento interno; si la prueba es positiva el dicromato cambia de color, pasa de amarillo a verdoso, y luego a azul por oxidación; si la prueba es negativa no se produce cambio del color amarillo del dicromato. Cuando se presenta color azul, se repite el ensayo con 0,5 ml de sangre, se titula y se duplica el resultado. • Antes de la titulación se aplica 0.5 mL de Yoduro de potasio 3 N y 1 gota de Almidón hidrosoluble al 1%. • Para los cálculos, se halla la diferencia entre la titulación del blanco y el problema, y se multiplica por el factor 1,15 para obtener en forma directa la concentración de etanol en mg / 100 ml. • También se puede calcular la cantidad de etanol en la muestra utilizando la siguiente ecuación: Etanol (mg/100ml) = N * (Vb – Vm) / volumen de muestra * 11,51 *100 Donde: N = normalidad del tiosulfato Vb: volumen de tiosulfato consumidos en la titulación del blanco Vm: volumen de tiosulfato consumidos en la titulación de la muestra 11,51: PM del etanol / 4 (reacción Redox) La cuantificación se puede realizar preparando una solución stock de etanol y a partir de ella preparar soluciones en el rango de 25 a 250 mg / 100 ml. • Procesar siempre bajo las mismas condiciones un blanco negativo y al menos un control positivo, de concentración cercana al límite de detección, con cada lote de muestras. Tiempo de duración del análisis: 3 horas CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO El rango de trabajo de es 20 a 225 mg %. La menor concentración de etanol que puede ser determinado con confiabilidad depende de la capacidad de la bureta, generalmente no es conveniente reportar valores menores al 20 mg%. La precisión es menor al 10 % y la exactitud se encuentra entre el 90 al 110% en el rango estudiado. El método no es específico para etanol, responde a sustancias oxidantes bajo las condiciones del ensayo, es decir otros alcoholes como metanol, 2- propanol, acetaldehído, formaldehído, propanaldehido, alcohol amílico, octanol, éter etílico y en general cualquier sustancia volátil que pueda reducir el dicromato en las condiciones de ensayo produce resultados falsos positivos. El cloroformo, benceno, tetracloruro de carbono, tricloroetileno no son falsos positivos. Otros parámetros del método de Winnick, se describen en la Tabla 1. Tabla 1 Parámetros de desempeño de los métodos de cromatografía de gases y de Winnick para la determinación de alcoholemia. PARÁMETROS DE LOS MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE ALCOHOLEMIA: CROMATOGRAFÍA DE GASES/HS/FID Y WINNICK 1

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MÉTODOS PARÁMETROS

UNIDAD

CROMAT. GASES

WINNICK

EXACTITUD:

%

99, 86 – 105,6

60 - 80

REPETITIVIDAD

%

100,8 – 106,6

85

REPRODUCIBILIDAD

%

LÍMITE DE DETECCIÓN

mg/dl

6

11,5

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

mg/dl

8

23

0,05731

5,75

PRECISIÓN:

SENSIBILIDAD

80

LINEALIDAD (RANGO)

mg/dl

8 - 396

23 - 224

PUNTO DE CORTE

mg/dl

15

24

SENSIBILIDAD DE LA PRUEBA

%

100

ESPECIFICIDAD DE LA PRUEBA

%

100

BIBLIOGRAFÍA • • • •

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Winnick T. Determination of Ethyl Alcohol by Microdiffusion. Ind. Eng. Chem. Anal. Ed.; 1942; 14(6) pp 523 – 525. Vanzetti G. BG. Winnick method of determination of alcohol in the blood and the problem of so-called physiological alcoholemia. Minerva Med. 1954 Apr 28;45(34):1185-91. Forero M. Determinación de Alcoholes Etílico y Metílico en material biológico. Instituto de Medicina Legal. Bogotá. 1975 Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses. Laboratorio de Toxicología, Regional Bogotá Manual de Técnicas de Laboratorio: Marcha Analítica para Determinación de Alcohol Etílico en Muestras de Sangre, Método de Winnick”, Santafé de Bogotá 1994. McBay A. Handbook of Analytical Toxicology”. CRC Press. 1989. pp. 145- 146. Sunshine I. Ed. Metodology for Analytical Toxicology CRC Press. Vol- 1. 1987. pp- 145-149 Besson R. Technic for determination of blood alcohol by means of Conway cell. Rev. Fr. Estud. Clin. Biol. 1956. 1(10):1150-1.

DETERMINACIÓN DE ALCOHOL ETILICO INMUNOFLUORESCENCIA POLARIZADA (FPIA)

(ETANOL),

POR

Este método de screening, automatizado, permite determinar alcoholemia o etanol en sangre total y etanol en suero o plasma en forma cuantitativa. Se utiliza en los laboratorios de toxicología de urgencias. Es un método registrado por la casa comercial Abbot, trae incorporado los reactivos, calibradores, controles y buffer de dilución, se realiza en un equipo TDx. La determinación del etanol se basa en la reacción de oxidoreducción entre el etanol y la enzima NAD (nicotinadenin dinucleótido) y la diaforasa, La concentración del etanol se mide a través de la intensidad de la fluorescencia por la técnica REA (Atenuación de energía radiante), y se cuantifica en la curva de calibración generada con los calibradores. Para la realización del ensayo se debe seguir los lineamientos dados por la casa fabricante. La curva de calibración se realiza en el rango de 25 a 300 mg/dl. La sensibilidad es de 10,0 mg/dl. La precisión es menor al 6% y la exactitud reportada es de 100,3 ± 2,7% para el rango estudiado. Puede presentar reactividad cruzada menor al 1% con acetona, etilenglicol, isopropanol, metanol y propilenglicol en concentraciones de 1000 mg/dl. Con el propanol presenta una reactividad cruzada del 36% a 100 mg/dl y con n-butanol de 10,7 % para 1000 mg/dl. 1 Guías ACADÉMICAS Línea de Profundización Toxicología Analítica 10 Docente: NANCY PATIÑO REYES

El tiempo de duración del análisis es de 30 minutos, se pueden correr desde 1 hasta 20 muestras simultáneamente. Las ventajas de este método es su rapidez y la facilidad de manejo.

BIBLIOGRAFIA 1. Abbott Diagnostics. Assays Manual. TDx/ TDxFlx. 1993. Etanol 45125-111 2. Taller de Alcohol Metílico y Etílico. Secretaria Distrital de salud de Bogotá. Noviembre de 2004 PRUEBAS PARA LA DETERMINACIÓN DE METANOL METANOL El metanol es el principal componente del destilado en seco, de la madera. Es uno de los disolventes más universales y encuentra aplicación, tanto en el campo industrial como en diversos productos de uso doméstico. Dentro de los productos que lo pueden contener se encuentra el denominado “alcohol de quemar” constituido por alcoholes metílico y etílico, solvente en barnices, tintura de zapatos, limpiavidrios, líquido anticongelante, solvente para lacas etc. Además, los combustibles sólidos envasados también contienen metanol. Se reportan en la literatura diversos métodos basados en técnicas diferentes para el análisis de metanol en muestras biológicas. Entre ellos el de cromatografía de gases con detector de ionización de llama y automuestreador de volátiles (head-space), en urgencias de toxicología se utilizan otras pruebas de rutina siendo la más empleada la del ácido cromotrópico, la cual está descrita para análisis cualitativo o cuantitativo por medio espectrofotométrico. La separación del metanol de las muestras biológicas se puede realizar por destilación, microdifusión o en el caso de la sangre por precipitación de proteínas. DETERMINACIÓN DE METANOL POR ÁCIDO CROMOTRÓPICO FUNDAMENTO Este método se basa en la oxidación de metanol a formaldehído, con formación posterior de un complejo coloreado con ácido cromotrópico, el cual se determina espectrofotometricamente. MUESTRAS Sangre venosa recolectada con sistema de vacío o con jeringa desechable. Se debe tener la precaución de NO limpiar la piel con un desinfectante que contenga alcohol. La sangre, 5 a 7 ml, en tubo seco o tapa roja, sin anticoagulante, y realizar la prueba en esta muestra. Después de ser procesada y purificada, puede ser utilizada para hacer análisis por cromatografía de gases. Almacenar las muestras en nevera a temperatura de refrigeración mientras se analiza. Es conveniente recolectar bajo las mismas condiciones, una contramuestra para los fines legales pertinentes. Las muestras deben mantener en todo momento la cadena de custodia. EQUIPO Espectrofotómetro UV/Vis Balanza analítica 1

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Tubos de ensayo, balones volumétricos, vasos de precipitados, pipetas, embudo, papel de filtro, agitadores de vidrio. REACTIVOS, ESTÁNDARES Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS • • • • • •

Estándar de metanol certificado Acido tricloroacético al 20% (p/v). Bisulfito de sodio (solución saturada) o preferiblemente reactivo sólido. Ácido cromo trópico R.A. Permanganato de Potasio 7% Acido Sulfúrico concentrado. R.A.

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE METANOL Solución stock de metanol: Medir 0,25 ml del estándar de metanol en un balón de 100 ml y completar con agua destilada. La concentración de esta solución es de 200 mg/100 ml. Solución intermedia: Realizar una dilución 1/10 de la solución stock para obtener una concentración de 20 mg/100 ml. Tabla 2. Curva de calibración para metanol Nivel de la curva 2 3 4 5

Alícuota de la solución de 20 mg/100 ml de metanol 2,5 5,0 7,5 10

Volumen final en ml 10 10 10 10

Concentración de la solución en mg / 100 ml 5 10 15 20

PREPARACIÓN DE REACTIVOS Permanganato de potasio acidificado: Pesar 7g, disolver en 15 ml de ácido ortofosfórico al 85% en agua. Completar a 100 ml con agua destilada. Conservar en frasco ámbar. Ácido tricloroacético al 20%:Pesar 20 g del ácido, disolver en agua destilada y completar a 100 ml. Utilizar guantes para la preparación de esta solución. Solución saturada de bisulfito de sodio: Pesar aproximadamente 5 g de sodio bisulfito y diluir a 10 ml, agitar y verificar un exceso de sólido en la solución. Solución de ácido cromotrópico: Pesar 50 mg de ácido cromotrópico y diluir en 10 ml de agua destilada. Preparar la solución cada vez que se vaya a realizar la prueba. PROCEDIMIENTO •

Tomar la muestra de sangre total (coagulada) y agregar 4 ml de ácido tricloroacético al 20% para desproteinizar, mezclar hasta completa destrucción del coagulo.

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Filtrar, tomar dos alícuotas de 1 ml del sobrenadante y colocar en tubos diferentes.

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A la primera alícuota, agregar 5 gotas de la solución de permanganato de potasio, si es necesario agregar las gotas necesarias hasta que el color violeta permanezca por 3 minutos, con el fin de oxidar el metanol a formaldehído.

•

La segunda alícuota no se oxida y queda lista para continuar la reacción.

•

Pasados los 3 minutos de oxidación de la primera alícuota, agregar gota a gota la solución saturada de bisulfito de sodio, o porciones del bisulfito en polvo, hasta obtener la completa decoloración de la solución.

•

Tomar los tubos que contienen la primera y segunda alícuota y adicionar aproximadamente 0,01 g (pizca) de ácido cromotrópico, o 0,2 ml de ácido cromotrópico al 0,5 % en agua, mezclar.

•

Colocar los tubos en un baño de hielo

•

Adicionar a los tubos lentamente por las paredes, con precaución (campana de extracción y uso de careta o gafas protectoras), 2 a 3 ml de H2SO4 concentrado. Un anillo de separación púrpura entre las fases indica la presencia de metanol. NO MEZCLAR la solución en este punto.

•

Observar el color del anillo o la interfase. La aparición de un anillo color violeta en la interfase indica la presencia de Metanol. Un color pardo indica negativo para Metanol. La Tabla 3 presenta una guía para la interpretación del resultado del ensayo.

•

Procesar siempre bajo las mismas condiciones un blanco negativo y al menos un control positivo, de concentración cercana al límite de detección, con cada lote de muestras. El control negativo se prepara con sangre normal y el control positivo con sangre adicionada de metanol en concentración de 10 a 30 mg%.

•

Para la determinación cuantitativa de metanol, preparar estándares en el rango de 5 a 20 mg % en sangre libre de metanol, aplicar el procedimiento, completando las soluciones de los tubos de ensayo a 5 ml y leer la absorbancia de las soluciones de los estándares y de las muestras a 580 nm. Leer de igual manera un blanco de reactivos y restar la absorbancia debida a esta solución. Realizar una curva de calibración ajustada por mínimos cuadrados y cuantificar las muestras. Leer al menos dos soluciones control positivas en el nivel mínimo e intermedio del rango de cuantificación.

Nota: Para mejorar la observación del anillo llevar el tubo de ensayo al baño Maria a aproximadamente 60ªC durante 3 a 5 minutos. Tabla 3. Interpretación del resultado de metanol por la prueba del ácido cromotrópico MUESTRA

BLANCO

PATRON

ALCOHOL METILICO

FORMALDEHIDO

+ +

+ -

-

+ +

-

+

-

+

-

-

-

+

(NEGATIVO POSITIVO INTERPRETACIÓN ) Hay presencia de metanol y formaldehído Hay metanol pero no alcanzó a metabolizar a formaldehído Ya no hay metanol porque todo se metabolizo a formaldehído (paciente grave) Negativo para metanol y formaldehído

CARACTERÍSTICAS DE LA PRUEBA El rango para la determinación cuantitativa está entre 10 a 80 mg%. 1

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El ensayo del ácido cromotrópico no es específico para metanol, debido a que es una reacción de oxidación y formación de color con el ácido cromotrópico, otras sustancias similares como el formaldehído puede dar reacción positiva. El gliceraldehido, arabinosa, fructosa y sacarosa producen un anillo amarillo, mientras que concentraciones elevadas de furfural producen un anillo de color rojizo. El límite de detección es de 0,5 mg%. BIBLIOGRAFÍA: Vallejo R. MC. Toxicología analítica. 2ª. Edición. Editorial Diario del Sur. Pasto. 1984. Toxicología y Química Lega. Guía de seminarios. http://www.biol.un.edu.ar/toxicologia/seminarios/guiasm.html. Consultado abril 2006.

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GUIA ACADEMICA No 4 ANÁLISIS DE SUSTANCIAS PSICOACTIVAS (SPA)

OBJETIVO: Conocer las técnicas analíticas más apropiadas para identificar Sustancias Psicoactivas mas consumidas en la ciudad de Bogotá. FUNDAMENTO TEORICO: Desde el punto de vista de la ciencia, fármaco o droga es toda sustancia química de origen natural o sintético que afecta las funciones de los organismos vivos. Los fármacos que afectan específicamente las funciones del Sistema Nervioso Central (SNC), compuesto por el cerebro y la médula espinal, se denominan psicoactivos. Estas sustancias son capaces de inhibir el dolor, modificar el estado anímico o alterar las percepciones, por ejemplo. ¿Cuáles pueden ser las vías de administración de una droga?

Para que un fármaco logre actuar, en primer lugar debe ser introducido al organismo y en segundo lugar, debe llegar al sitio de acción. En el caso de los psicofármacos, este sitio de acción está localizado en alguna parte del Sistema Nervioso Central, un sistema al que es difícil acceder porque cuenta con una protección conocida como la barrera hemoencefalítica. Gracias a ella, no todo lo que entra a la sangre puede pasar hacia el cerebro y la médula espinal. Para lograrlo, las drogas psicoactivas deben ser liposolubles, ya que los lípidos (grasas) pueden atravesar fácilmente las membranas de la barrera. Para introducir un psicofármaco al organismo existen básicamente tres vías de administración: oral (la ingestión de pastillas, grageas, tabletas, gotas, plantas, bebidas o alimentos que contengan alcaloides psicoactivos), pulmonar (a través del acto de fumar, por la aspiración de polvos o la inhalación de vapores) y parenteral (por medio de una inyección que puede ser intravenosa, subcutánea o intramuscular). ¿Cómo se determina la toxicidad?

Lo tóxico de una droga no es la droga en sí misma sino las concentraciones de ésta en proporción a cierta medida, que en el ser humano es el kilo de peso. Existe una estrecha relación entre la concentración de una droga en el organismo y la cantidad de complejos que se forman. El efecto de una droga varía con esa concentración hasta alcanzar un valor máximo, pasado el cual ningún incremento en la concentración resulta más efectivo. La dosis activa media es definida como aquella que produce el 50% del máximo efecto obtenible en un grupo de personas o animales sometido a estudio, mientras la dosis letal media es aquella que causa mortalidad en el 50% de los miembros del grupo estudiado. La toxicidad o el margen de seguridad de una droga está determinado por la proporción entre la dosis activa y la dosis letal. En la Aspirina®, por ejemplo, ese margen de seguridad es de 1/20, mientras que en la heroína es de 1/30 y en el LSD es de 1/650. Categorías en cuanto al uso de drogas 1

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1- Uso - consumo propiamente de la droga 2- Abuso - Situación que se caracteriza por continuar el uso aun cuando el mismo le genera al usuario problemas personales (físicos, psicológicos) y problemas sociales (trato con las personas, trabajo, etc.) 3- Dependencia - Situación en la que el uniusuario ha perdido totalmente el control respecto al uso de la droga. La urgente necesidad por el consumo le lleva a organizar su vida cotidiana alrededor del mismo (como adquirir la droga, cuando ingerirla, etc.). En términos de los efectos la persona se ve en la situación de tener que consumir la droga para evitar el conjunto de malestares que le provoca la ausencia de la misma. Otros conceptos relacionados 1- Síndrome de abstinencia o retiro - Conjunto de malestares físico (ej: nerviosidad, palpitaciones, presión alta, nauseas, mareos) y psicológicos (preocupación, ansiedad, falta de concentración, pesimismo, tristeza, depresión) que experimenta el usuario cuando han pasado los efectos de una droga. En la fase de dependencia estos efectos son más severos y persistentes. El usuario busca evitar a través del consumo que estos síntomas aparezcan. En ocasiones sucede que cada vez resulta más difícil su eliminación. 2- Tolerancia - Efecto de una droga sobre el organismo que consiste en la necesidad de aumentar la cantidad consumida para producir el mismo efecto inicial. La tolerancia agrava el consumo y puede ser un factor precipitante hacia la dependencia. Reacciones de coloración y precipitación: Para la comprobación de la presencia de alcaloides se han desarrollado un gran número de reactivos de coloración y precipitación. Algunos de ellos son considerados de aplicación general. Mientras otros son más específicos y pueden servir para clasificaciones parciales de sustancias; generalmente se considera que hay presencia de alcaloides si dan reacción positiva a por lo menos cuatro de estos reactivos. Los análisis pueden realizarse de variadas formas, en los métodos más corrientes se utiliza una placa de gotas, la muestra se coloca en una cavidad de la placa y se trata con los reactivos adecuados; esta placa suele ser blanca a fin de facilitar la percepción del color obtenido en el análisis. Los análisis a desarrollar en la práctica son: 1.- Análisis de Morfina, Heroína, Codeína, Cocaína, Anfetaminas Preparación de Reactivos. Reactivo de Marquis: Mezclar 1 ml de Acido Sulfurico y 3 gotas de Formaldehído. Se utiliza 2 gotas Acido Nitrico: Se utiliza Puro 1 gota 1

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Tiocianato de Cobalto: Se utiliza 2 a 3 gotas Cloruro de Cobalto 1 g Tiocianato de Potasio 1,5 g Acido acetico: 10 ml Agua: 90 ml Reactivo de Simon Adicionar 2 gotas de carbonato de sodio diluido a Nitropruiato de Sodio al 1%. Depositar 2 gotas de esta solución en contacto con la anfetamina ANALISIS E INTERPRETACION DEL COLOR Sustancia

Cocaína Heroína

Tiocianato de Cobalto o Scott AZUL DE PRUSIA AZUL DE PRUSIA

Acido Nítrico

Reactivo de MARQUIS

Prueba de Simón

INCOLORO Pasa de amarillo a verde

Anfetaminas

MORADO O VIOLETA Verde Amarillento

Morado

2.- Análisis de Cannabinoides: El Cannabis “normal” contiene habitualmente entre 0,5 a 5% de THC dependiendo de las diferentes técnicas de cultivo (desde el cultivo en huerta, pasando por el cultivo en macetas (luz natural o artificial) hasta el cultivo hidropónico). Las variedades desarrolladas por los bancos de semillas tienen un nivel de THC más alto, llegando las variedades más potentes al 24% de THC. El contenido en THC depende de la genética de la planta y de las condiciones ambientales en las que se desarrolla, siendo los polihíbridos comerciales los que alcanzan mayores concentraciones de alcaloides. Prueba de FAST BLUE B ó AZUL SÓLIDO B: 1. Prepare el reactivo usando la sal FAST BLUE B marca sigma al 0,2 % en solución de Hidróxido de Sodio 1N como el reactivo es poco estable prepárela solo en el momento de realizar la Prueba. 2. Extraer la muestra con alcohol, éter, cloroformo, o cualquier solvente orgánico. 3. Colocar una gota del extracto sobre un papel de filtro y dejar secar. 4. Sobre la muestra o al lado colocar una gota del reactivo y dejar correr hasta que hagan contacto reactivo y muestra. 5. Aparece un color Rojo- violáceo o Rojo morado si es positivo. 6. Hacer un control negativo con picadura o de cigarrillo.

Duquenois + Levine: .- Vainillina 2 gramos + Formaldehído 3 mL en Etanol, 100 mL. .- Cloroformo. 1

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Tratamiento de la Muestra: 200 mg. de la muestra con 25 ml. de éter de petróleo, filtrar y evaporar a sequedad en baño de maría, luego agregar 2 ml. de reactivo de Duquenosis. Agregar 2 ml. de HCL y dejar en reposo por 10 minutos. Adicionar Cloroformo 2 mL. Observar el color generado.

Procedimiento: .- Colocar la muestra o extracto de muestra (Eter de petroleo) 2 mL. .- Adicionar 0.5 mL de reactivo Duquenois, a la muestra. .- Adicionar 0.5 mL de Acido Clorhídrico (10 M) y agitar suavemente. Observar el color. .- Adicionar Cloroformo y notar si el color aparece. (azul verdoso). Interpretación: Cambio de color de Gris ---- Azul ----violeta. = Cannabinoides.

BIBLIOGRAFIA: 1. .- http://www.tuotromedico.com/temas/drogas_cannabis.htm 2. .- http://es.wikipedia.org/wiki/Cannabis_%28drogas 3. .- Clarkes “Isolatión and identificatión of drugs” The farrmaceutical Pres. London 1999, pag 113

3.- Análisis de cocaína: Prueba del Tiocianato de Cobalto: (Prueba de Scott) Color azul = positivo para alcaloide Confirmar adicionando acido nítrico a la misma sustancia incoloro Positivo para Cocaina

4. ANFETAMINAS La molécula de la anfetamina está emparentada estructuralmente con el alcaloide vegetal efedrina. Fue precisamente la efedrina, el sustrato usado inicialmente como reactivo para la obtención del nuevo compuesto. Como la efedrina, la anfetamina es también un agente con propiedades para mimetizar la acción de la hormona adrenalina y activar el sistema nervioso simpático, es decir, se trata de una amina simpaticomimética. Sin embargo, la segunda molécula logra atravesar mucho más eficazmente la barrera hematoencefálica, lo que explica su capacidad distintiva de estimular el sistema nervioso central. Esto último habilita su clasificación como amina simpaticomimética de acción central PRUEBAS INDIRECTAS : Porcentaje de error 25%

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MATERIAL: Tira reactiva para determinar marihuana y cocaína MATERIAL BIOLÓGICO: Orina TÉCNICA: 1.- Abra el sobre metalizado e inmediatamente escriba el nombre del paciente en la zona de identificación ID y fecha. 2.- Abra el cassette dejando al descubierto las partes inferiores de las tirillas. 3.- Sumerja en la muestra de orina los cojines de absorción a fin de que cada tirilla pueda absorber durante por lo menos 10 segundos suficiente muestra. Si así lo prefieres, puede mantener la prueba en contacto con la muestra hasta el final del proceso (máximo 5 minutos). RESULTADOS: Muestra de orina: Positiva para Cocaína Negativa para Marihuana ESQUEMAS:

CONCLUSIONES: Se trata de un examen para evaluar el tipo y la cantidad aproximada de drogas legales e ilegales que una persona ha consumido. Este examen puede emplearse para evaluar posibles sobredosis o intoxicación accidental o intencional, como cuando existe la necesidad de evaluar el tipo y cantidad de droga legal o ilegal utilizada por una persona. Este examen puede emplearse para determinar la causa de toxicidad aguda por drogas, para vigilar la fármacodependencia y para determinar la presencia de sustancias en el cuerpo (para propósitos médicos y/o legales). La presencia de drogas ilegales o drogas no recetadas es indicio de drogadicción. Este Procedimiento debe Confirmarse por otro método Dadas las inteferencias que presenta. Bibliografía: http://www.telemedik.com/articulos.php?id=120 http://es.wikipedia.org/wiki/Cannabis_sativa 1

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