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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS FITOPATOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE FITOPATOLOGÍA COMPILADORES: Principal: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez Colaboradores: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez Revisado por: Academia de Biologia 2011 Ciudad Juárez, Chihuahua Universidad Autónoma de Ciudad Juárez 2011 p. 81

M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biología

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biología

Dr. Alejandro Martínez Martínez Jefe del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas

M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomédicas

Aprobados por la Academia de Biología, 2011

 

Laboratorio de Fitopatología 

 

CONTENIDO Practica 1. Preparación de medios de cultivo……………………………………………..…1 Practica 2. Aislamiento de hongos, siembras y condiciones optimas para su desarrollo.4 Practica 3. Tipos de inoculación de patógenos en plantas sanas…………………………9 Practica 4: Montaje de hongos en muestras permanentes……………………………….13 Practica 5: Aislamiento de hongos y bacterias existentes en muestras de suelo………16 Practica 6: Cenicillas…………………………………………………………………………..18 Practica 7: Pudrición café de frutales con hueso…………………………………………..22 Practica 8. Hongos: Mildus…………………………………………………………………...25 Practica 9: Carbones………………………………………………………………………….29 Practica 10: Royas…………………………………………………………………………….32 Practica 11: Tizones y manchas foliares bacterianas……………………………………..35 Practica 12: Marchitez Bacteriana…………………………………………………………...39 Practica 13. Manchado del follaje y de los frutos………………………………………….43 Practica 14. Bacterias que producen prodición blanda……………………………………48 Practica 15. Aislamiento de nematodos del suelo…………………………………………52 Practica 16. Aislamiento de nematodos de plantas………………………………………..56 Practica 17. Enfermedades causadas por virus……………………………………………60 Practica 18. Selección de bacterias antagónicas para el control de enfermedades en plantas…………………………………………………………………………………………..64 Practica 19. Daños en granos y semillas mal almacenados……………………………...69 Practica 20. Aflatoxinas en granos y semillas………………………………………………74

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Practica 1: Preparación de medios de cultivo. Objetivo: Que el alumno obtenga un conocimiento práctico sobre los diversos métodos de preparación de medios de cultivo en laboratorio. Introducción: La preparación de los medios de cultico en las prácticas de laboratorio es importante, ya que se utilizan para sembrar microorganismos como bacterias y hongos, y al reproducirse s pueden identificar de acuerdo con sus características estructurales. Al asilar patógenos causantes de enfermedades es común utilizar medios apropiados para su cultivo. Algunos requieren de sustancias específicas para su crecimiento y desarrollo, para extractos naturales que facilitan la multiplicación de estos patógenos. El agar de dextrosa y papa se utiliza en microorganismos como parásitos facultativos y saprofitos; el agar bacteriológicos como su nombre lo indica, crecimiento y desarrollo, y a través de algunos experimentos se puede conocer que producto puede detener su crecimiento y aun mas cual puede eliminarlos por completo. Materiales: Autoclave Balanza analítica Termoplato Agua destilada Algodón Gasas Medio de cultivo PDA Matraz 500 ml Tape Cajas petri estériles Tubos de ensaye esmerilados con tapa

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Procedimient o: Se prepara el autoclave, llenándose hasta la parrilla de agua destilada y se prende en medio, mientras que calienta, se pesan en la balanza analítica el medio PDA el que se requiera (39g por 1 L de agua), se coloca agua destilada en un matraz y se vacía el PDA pesado, y se pone a calentar en el termoplato hasta que de una coloración oro oscuro y se desbaraten los grumos, mientras sucede eso se preparan los tapones para el matraz utilizando algodón, se tapa y se sella con cinta masking tape. Con esta preparación se coloca el medio PDA ya bien disuelto en cajas petri hasta ½ o ¾ y se llenan tubos de ensayo si se requiere hasta la marca de ¾ y luego se sellan con cinta. Posteriormente, el contenido del matraz, el de los tubos previamente sellados y envueltos en papel sanilta lo mismo para las cajas petri, se colocan en el autoclave para esterilizar (a 15 lb por 15 min). Al sacar los tubos de la olla se dejan cuajar el medio inclinado para dejar mayor superficie donde se desarrolle el hongo. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy, J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp.

Resultados :

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Conclusiones:

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Practica 2: Aislamiento de hongos, siembras y condiciones optimas para su desarrollo. Objetivo : El estudiante tendrá conocimiento de los diferentes tipos de aislamiento de hongos, métodos de siembra y purificación, además, mediante la observación de las condiciones optimas de desarrollo, identificará el tipo de patógeno y su estudio para aplicar la técnica de control más conveniente. Introducción : Al conocer los diversos tipos de aislamiento de hongos se podrá obtener una metodología practica para llevar a cabo estudios fitopatologicos dando especial atención a las plagas mas comunes y que afectan los cultivos de mayor importancia económica, además se contara con una buena guía para resolver problemas fitosanitarios después de conocer las condiciones optimas de desarrollo de los patógenos que atacan a los cultivos y causan diversas enfermedades. Materiale s: Microscopio óptico y de disección.

Papel secante

2 mecheros Fisher.

Cloro

2 cajas petri.

Etiquetas

Asa de platino.

Agua destilada

Caja petri con material vegetativo enfermo (hongo) Cinta scotch.

Fibra de vidrio.

Portaobjetos y cubreobjetos

Cutex

Procedimiento hongo:

para

aislar

el

Método de la cinta scotch. Se levanta al hongo, se coloca en el portaobjetos y se observa en el microscopio óptico para observar algunas de sus estructuras. Mediante el levantamiento de estructuras. Se levanta la cascara de algún material en forma, ejemplo: la papa) con una navaja y se coloca en el porta objetos, después se le agrega una gota de colorante rojo para luego observarlo en el microscopio de disección. (hacer uno sin colorante). 4

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Por el método de raspado. Se coloca un portaobjetos una gota de rojo colorante; luego la mancha del material vegetativo se raspa con un bisturí o una navaja y una vez que se monto la muestra en el portaobjetos con una gota de rojo colorante se procede a observarla en el microscopio. Procedimiento para siembra en PDA, todo bajo campana de flujo laminar: Se debe tener 3 cajas petri; en la primera colocar agua destilada, en la segunda cloro al 5% y en la tercera agua destilada. Después de haber aislado el material vegetativo infectado se coloca dos minutos en la caja con cloro al 5%, con la finalidad de limpiar la muestra de hongos contaminados y se pasa por ultimo a la caja con agua destilada para enjuagar y quitar el exceso de cloro. Para esto se tiene los dos mecheros prendidos, se coloca papel secante sobre la mesa en que está trabajando y se humedece la superficie de esta con cloro. Luego se esteriliza el asa de platino, se abre la caja petri y se coloca la muestra en ella, se acerca al mechero y se sella y a los pocos días se verá el desarrollo del hongo. Otro método es utilizando papel filtro, este papel se humedece con agua y se coloca en la caja petri, después se acomoda el hongo dentro de ella y se tapa. El hongo se desarrolla así en la humedad. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Herrera T. y M. Ulloa. 1990. El reino de los hongos. Fondo de Cultura Económica y UNAM, México, 552 pp. Romero C.S. 1968. Hongos Fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp. Smith I.M. 1992. Manual de enfermedades de las plantas. Mundi-prensa. Madrid, México. 671 pp.

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Resultados: Procedimiento 1 (cinta scotch)

Procedimiento 2 (levantamiento de estructuras)

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Procedimiento 3 (raspado)

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Procedimiento de siembra en PDA

Conclusiones:

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Practica 3: Tipos de inoculación de patógenos en plantas sanas. Objetivo : Aprendizaje sobre los tipos de inoculación de patógenos a una planta sana. Introducción : A través de la inoculación se introduce a una planta sustancias extrañas a la misma, como las bacterias, virus, hongos, entre otros, los cuales traerán como consecuencias alteraciones fisiológicas y morfológicas al organismo en tratamiento. Experimentalmente se realiza con el propósito de observar sintomatología general, ciclo biológico de la enfermedad, así como la resistencia del hospedero tenga hacia el patógeno, o bien la susceptibilidad. Materiale s: Licuadora

Placas con PDA inoculadas con hongo

Papel filtro Algodón Vaso de precipitado de 500 ml Jeringa desechable Planta sana nacida en suelo

Procedimiento 1: Se tienen 200 ml de agua en un vaso de precipitado, los cuales se colocan en la licuadora. Se macera el PDA con el hongo en desarrollo en la licuadora. Se agita el contenido durante 15 segundos y al extracto resultante se le coloca en el vaso de precipitado. Se toma con una jeringa una muestra de 4cc y se deposita en la base del tallo, abriéndose el tejido con la aguja y ahí se inocula. O bien, solo deposite el contenido (4cc) en la base del tallo de la planta. 9

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Procedimiento 2: Se saca un block de 1cm² y se deposita adherido a la planta a un lado del tallo, este block será del de los hongos en el medio PDA, esto reporta la ventaja de que si hongo llega al suelo y tiene medio para nutrirse, después se tapa con suelo. Procedimiento 3: Del licuado se empapan 5 ml en un algodón y se coloca cerca de la planta, después se tapa con papel filtro. Procedimiento 4: Se utiliza un atomizador al cual se le coloca el hongo macerado del vaso de precipitado y se asperja la parte foliar, o bien, se pueden empapar trozos de algodón o de papel filtro y se adhieren a la superficie foliar. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Romero C.S. 1968. Hongos Fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp. Smith I.M. 1992. Manual de enfermedades de las plantas. Mundi-prensa. Madrid, Mexico. 671 pp.

Resultados : Procedimiento 1:

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Procedimiento 2:

Procedimiento 3:

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Procedimiento 4:

Conclusiones:

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Practica 4: Montaje de hongos en muestras permanentes. Objetivo: El alumno aprenderá a realizar montas de hongos para su posterior identificación de acuerdo con sus características estructurales. Introducción: Un fitopatógenos es aquel microorganismo que causa o produce alguna enfermedad o algún cambio en la planta. La mayoría de los patógenos de plantas son hongos de las divisiones ascomicetes, basidiomicetes u oomycota, y las principales enfermedades causadas por hongos son mildius, oidios, royas, carbones, agallas, deformaciones, necrosis, chancros, marchiteces foliares, vasculares, podredumbres radiculares etc. Las bacterias colonizan espacios intercelulares en distintos órganos o el xilema, algunas como Agrobacterium, Erwinia, Xanthomonas, Pseudomonas, Corynebacterium Streptomyces, son algunas bacterias patógenas que se pueden encontrar entre las plantas. Materiales: Microscopio de disección Microscopio compuesto Muestra de hongo desarrollado en la caja petri Asa de platino

Formol

Porta y cubre objetos

Cutex

Azul o rojo colorantes Fibra de vidrio Etiquetas adheribles Procedimiento: Se abren las cajas petri cerca del mechero. En un porta objetos se coloca una gota de formal y una de colorante (rojo o azul). Se coloca cierta cantidad del hongo en el portaobjetos y se protege con pequeños trozos de fibra de vidrio. Lentamente se coloca el cubreobjetos. Se sella con cutex. Se pasa al microscopio y se observa, si no es muy visible utiliza aceite de inmersión.

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Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 5: Aislamiento de hongos y bacterias existentes en muestras de suelo. Objetivo : El alumno conocerá un método práctico de los tipos de aislamiento de hongos y bacterias existentes en el suelo. Introducción : El suelo es un compuesto orgánico natural que proviene de la transformación de sus agentes formadores a través de diversos procesos físicos, químicos y biológicos que le confieres propiedades características. Entre estas esta la capacidad de sustentar la vida vegetal y los microorganismos existentes en él; tales como bacterias y hongos, los cuales son diseminados por diversos agentes. Los organismos del suelo que más importancia tienen cuantiaba y cualitativamente son las bacterias. Entre estas merecen citarse especialmente las vinculadas con el ciclo del nitrógeno, ya que lo utilizan para su síntesis orgánica, además de que son capaces de atacar todo compuesto orgánico. Los hongos son heterótrofos estrictos que prosperan en suelos ácidos, porque en estas condiciones las bacterias no pueden competir con ellos. También son agentes activos de descomposición. Materiale s: Muestras de suelo. Material vegetal (manzanas, papas y zanahorias sanas) Recipiente de tamaño regular amplio y de poca altura Navaja 500 ml de agua Procedimient o: Se coloca la muestra de suelo en el recipiente. Se riega hasta que esté bien húmeda. Se parte en cortes laterales el material vegetal. Se colocan enterrados hasta la mitad cada uno de los cortes vegetales en la superficie del suelo contenido en el recipiente. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp.

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Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Resultados:

Conclusiones:

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Practica 6: Cenicillas Objetivo : Describir y dibujar los signos y los síntomas causados por las cenicillas. Demostrar la importancia de los apéndices en los cleistotecios para la identificación de los géneros. Introducción : Esta enfermedad es causada por hongos ascomicentos del orden Erysiphales los cuales son parásitos estrictos y se manifiesta por el desarrollo de una cubierta pulverulenta de color blanco grisaseo en las partes aéreas de las cuales plantas infectadas. Las cenicillas son de distribución mundial, habiéndose observado por primera vez en el año 1894 en algunas plantas de la familia cucurbitáceas. En la actualidad han sido reportadas más de 7100 especies de angiospermas hospedantes encontrándose en frutales, hortalizas, gramíneas y ornamentales. Este grupo de hongos produce, en la fase sexual de su ciclo de vida, ascocarpos del tipo cleistotecio, los cuales pueden contener en su interior, una o varas ascas, las que a su vez contienen de dos a ocho ascas. Por otra parte, el estado asexual o imperfecto puede estar representado por el género Oidium, Oidiopsis y Ovulariopsis. En los cleistotecios es importante observar la morfología de los apéndices que desarrolla, lo que permite identificar los géneros. Materiale s: Agujas de disección Porta y cubreobjetos Navaja de un solo filo Microscopio Estereoscopio Lactofenol Hojas de diversos cultivos dañados por la cenicilla

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Procedimient o: Observar y describir los síntomas y signos en las diferentes plantas indicando las siguientes características: aspecto de las lesiones, coloración, tamaño, forma y distribución. Examinar y dibujar bajo el microscopio estereoscopio las lesiones y los cuerpos de fructificación del hongo. Hacer preparaciones de un raspado de la lesión, observar al microscopio y dibujar las estructuras fructíferas. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp. Smith I.M. 1992. Manual de enfermedades de las plantas. Mundi-prensa. Madrid. 671 pp.

Resultados :

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Conclusiones:

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Microsphaera sp.

Podosphaera sp.

Erysiphe sp.

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Practica 7: Pudrición café de frutales con hueso Objetivo : Describir y dibujar los síntomas y signos de la pudrición café. Demostrar la capacidad patogénica del hongo. Introducción : Esta es una enfermedad de tipo necrótico causada por un hongo ascomiceto del género Monilinia del cual se conocen tres especies: M. fructigena causante de la pudrición café europea descubierta en 1796 y M. fructicola y M. laza causantes de la pudrición americana, descubiertas en 1807 en ciruelos silvestres, de los cuales posteriormente paso a durazneros cultivados. Los primeros síntomas de la enfermedad aparecen en las inflorescencias las cuales empiezan a marchitarse, apareciendo en un principio manchas cafés en los pétalos, estambres o pistilos y posteriormente toda la flor es invadida. Materiale s: Agujas de disección Bisturí Cajas de petri Cubre y portaobjetos Papel estraza Vasos de precipitados Cámara húmeda Estufa de incubación Medio de cultivo PDA Lactofenol Frutos de hueso sanos y enfermos

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Procedimient o: Describir y dibujar los signos y síntomas producidos por Monilinia. Aislar el hongo causante de la enfermedad en cultivo puro utilizando placas con medio PDA. Hacer una preparación de las estructuras fúngicas y observar al microscopio. Reproducir los síntomas de la pudrición café inoculando frutos sanos con el cultivo puro.

Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp. Smith I.M. 1992. Manual de enfermedades de las plantas. Mundi -prensa. Madrid. 671 pp.

Resultados :

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Conclusiones:

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Practica 8. Hongos: Mildus Objetivo: Conocer signos y síntomas de los mildus Identificar los principales géneros de hongos causantes de mildus. Introducción: Los mildus son enfermedades que afectan a una gran variedad de plantas, en regiones donde prevalecen condiciones ambientales de humedad y frio. Los hongos causantes comprenden alrededor de 300 especies, que incluyen a patógenos muy destructivos de las plantas cultivadas. Los mildus se caracterizan por la producción de gran numero de esporangioforos, los cuales se proyectan en forma aislada o en pequienos grupos a través de los estomas en el envés de las hojas. Sebreo los esporangioforos, se produce un gran numero de esporangios que inducen a la formación de manchas de color blanco, gris o violeta mostrando un aspecto algodonoso. Los hongos causantes de estas enfermedades, son oomicetos del orden peronosporales y presentan un parasitismo estricto. Algunos ejemplos son: Cebolla pernosopora destrictor, cucurbitáceas Pernosopora cubensis, lechuga Bremia lactucae, trigo Sclerospora macreospora. Material: Agujas de disección Cubreobjetos y portaobjetos Navaja de disección Microscopio Estereoscopio Plantas infectadas con mildus Agua destilada estéril Lactofenol

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Procedimiento: Observar y describir los diferentes tipos de signos y síntomas presentes en el follaje de algunos cultivos afectadas con mildus y hacer dibujos. Hacer una preparación a partir de un raspado de la lesión con una gota de lactofenol o agua, entre porta y cubreobjetos, para observar a microscopio. Dibujar los esporangioforos observados y compararlos con los esquemas de referencia. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edicion, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicion. Academic Press. 636 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autonoma de Chapingo. 345 pp. Smith I.M. 1992. Manual de enfermedades de las plantas. Mundi -prensa. Madrid. 671 pp.

Resultados:

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Conclusiones:

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FOTOGRAFIAS Y DIBUJOS PARA LA IDENTIFICACION DE HONGOS PERONOSPORALES

Bremia sp.

Peronospora sp.

Plasmopara sp.

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Practica 9: Carbones Objetivo : Describir y dibujar los síntomas carbones que se presentan en algunos cultivos de México. Identificar la morfología macroscópica de los telios y microscopia de las teliosporas. Introducción : Los carbones son enfermedades causadas por basidiomicetos del orden ustilafinales. En estas enfermedades hay desplazamiento del contenido del grano por una masa de esporas pulverulentas de color negro que se parecen al hollín denominadas soros y que disminuyen en forma drástica los rendimientos. Los hongos causantes de los carbones atacan las semillas de las gramíneas y se desarrollan en ellas destruyéndolas por completo. Sin embargo varios carbones atacan a las hojas, tallos o verticilos florales y algunos infectan semillas o plántulas antes de que emerjan del suelo y se desarrollan en el interior hasta la formación de las inflorescencias; otras solo producen infecciones locales sobre hojas, tallos y otros órganos. Hoy formación de soros que se mantienen unidos temporalmente por una membrana delgada y rara vez matan a su hospedero, en algunos casos, l as plantas pueden atrofiarse notablemente. Materiale s: Agujas de disección Bisturí Cajas de petri Cubre y portaobjetos Navaja de un solo filo Microscopio Estereoscopio Lactofenol Plantas enfermas con signos y síntomas de carbón. 29

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Procedimiento: Describir y dibujar las muestras de carbones. Hacer preparaciones a partir de un raspado de la lesión para observar las teliosporas en el microscopio. Dibujar los diversos tipos de teliosporas observados. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 10: Royas. Objetivo : Describir y dibujar los síntomas y signos producidos por las royas Identificar los géneros causantes de las royas. Introducción : Las royas son enfermedades causadas por hongos basidiomicetos del orden uredinales, los cuales son parásitos estrictos. En su gran mayoría, tienen una distribución mundial atacando en forma agresiva cereales y plantas forrajeras, forestales, frutales, hortícolas, industriales y ornamentales. Los géneros de hongos responsables de las royas, generalmente infectan las partes aéreas de las plantas produciendo lesiones pustilares conocidas con el nombre de soros, agallas y diversos tipos de ramificaciones conocidas como “escoba de bruja” o una reducción en su desarrollo. De las royas de los cereales, la del trigo mas importante económicamente, ya que se presenta en todos los lugares del mundo donde s cultiva esta gramínea, siendo la mas destructiva la causada por Puccinia graminiss, la cual forma uredosoros de color caférojizo oscuro en ambos lados de las hojas, en los tallos y en las espigas. Materiale s: Agujas de disección Bisturí Cajas de petri Cubre y portaobjetos Navaja de un solo filo Microscopio Estereoscopio Lactofenol Plantas enfermas con signos y síntomas de roya.

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Procedimiento: Describir y dibujar los signos y síntomas del material infectado. Hacer preparaciones a partir de un raspado de la lesión entre porta y cubreobjetos con lactofenol, agua o KOH al 3%. Dibujar los diversos estructuras fúngicas. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 11: Tizones y manchas foliares bacterianas. Objetivo : Observar y describir las enfermedades que afectan al tejido parenquimatico, así como los síntomas que se expresan como tizones y manchas foliares. Aplicar los métodos de aislamiento para bacterias fitopatogenas a partir de tejidos enfermos y practicar las técnicas para su identificación. Demostrar la patogenicidad de las cepas aisladas mediante la prueba de hipersensibilidad en plantas de tabaco. Introducción: Los tipos más comunes de enfermedades bacterianas son aquellas que aparecen como manchas de varios tamaños sobre las hojas, tallos, inflorescencias y frutos; otras aparecen como necrosis continuas de rápido alcance en tales órganos y son denominados tizones. Sin embargo, la mayoría de los tizones son comúnmente la expresión final de las infecciones severas de manchas sobre las hojas, tallos e inflorescencias. Las manchas pueden ser tan numerosas que destruyen la mayor parte de la hoja, pueden ser necróticas; a menudo: circulares o irregulares y en algunos casos están rodeadas por un halo amarillento o como en el caso de las monocotiledoneas, manifestarse como líneas paralelas a las nervaduras, definiendo estrías muy características. Los tizones y manchas foliares más comunes son: del algodonero, Xanthomonas campestris, del chile Xanthomonas axonopodis, del frijol Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, del nogal Xanthomonas arvoricola pv. juglandis, del maíz Pseudomonas rubrilineans. Materiales: Agua destilada esterilizada Agujas de disección Asa bacteriológica Cajas petri Cubreobjetos y portaobjetos Jeringas desechables Navajas de un solo filo Matraces Erlenmeyer

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Morteros Pinzas Tubos de vidrio Vasos de precipitado Microscopio Estereoscopio Medio de cultivo B de King Hojas enfermas con síntomas típicos de tizón bacteriano Plantas de tabaco sanas. Procedimient o: Examinar las hojas de las plantas enfermas. Describir y anotar los tipos de síntomas y signos. Lavar con agua corriente las hojas dañadas y posteriormente desinfectar con hipoclorito de sodio o agua jabonosa, para eliminar ambos, enjuagar con agua destilada estéril. Hacer cortes de los tejidos enfermos, con navaja o tijeras, tomando tejido sano y enfermo, aprox. De 0.5 cm de diámetro. En un mortero estéril, moler los tejidos infectados de las hojas, adicionando de 3 a 5 gotas de agua destilada estéril. Hacer aislamientos por estría cruzada en placas con medio de cultivo B de King. Escoger aquellas bacterias que produzcan fluorescencia o una pigmentación amarilla y crecimiento lento, seleccionar y purificar. Con las colonias que fueron positivas a la fluorescencia y pigmentación amarilla, preparar una suspensión de 3 x 10 8 células por mililitro e infiltrar por separado hojas de tabaco en la nervadura central, dejando una zona intervenal totalmente inoculada. Tanto las colonias fluorescentes como las de pigmentación amarilla serán asperjadas con una suspensión de 3 x 108 células por mililitro en pantas de frijol sanas. Observar la reacción de hipersensibilidad en tabaco en un tiempo de 24 horas a 48 horas y en frijol. Observar los síntomas típicos de tizón, según sea el caso. 36

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Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 12: Marchitez Bacteriana Objetivo : Describir los síntomas de marchitez inducidos por bacterias fitopatogenas. Aplicar un método de inoculación para inducir una infección en plantas de tomate. Introducción : La marchitez bacteriana es una de las enfermedades de tipo sistemático que se observa en muchas plantas vasculares y la cual tiene una distribución mundial ya que ha sido reportada en África, Argentina, Canadá, EU, Europa, Japón y México. Las bacterias responsables de esta enfermedad, entran en los tejidos de las plantas, se propagan y mueven a través de los vasos xilematicos, y debido a la gran cantidad de bacterias producidas así como a la producción de polisacáridos dentro de estos vasos se produce una interferencia en la translocacion de agua y nutrimentos. Material : Agujas de disección Cajas petri Porta y cubreobjetos Navaja de un solo filo Matraces erlenmeyer Tubos de ensayo Vasos de precipitados Micro y estereoscopio Placas con B de King Agua destilada estéril Equipos Gram Cepa de Clavibacter michiganense Plantas de tomate 39

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Procedimiento: Hacer una descripción de los síntomas y signos presentes en plantas de tomate y/o de papa con síntomas de marchitez bacteriana. Lavar con agua jabonosa y agua corriente las plántulas de tomates. Cortar la panta en pequeños trozos de aprox. 0.5 cm y desinfectar con hipoclorito de sodio al 2%. Moler los trozos de tejido ya tratado hasta obtener una masa bacteriana. Aislar el agente etiológico responsable de la marchitez bacteriana por estria cruzada a partir de la masa bacteriana. Seleccionar las colonias amarillo claro y de crecimiento lento Aplicar la tinción de Gram y de Rye a las colonias seleccionadas. Describir la morfología macroscópica y microscópica que hayan dado positiva ambas pruebas. Inocular mediante la técnica del palillo, mesa bacteriana, en la axila de las hojas. Observar las plantas periódicamente durante 20 días. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp.

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Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 13. Manchado del follaje y de los frutos. Objetivo : Describir los síntomas necróticos y manchados causados por diferentes hongos, tanto en frutos como en follaje. Aislar e identificar los fitopatogenos presentes en las muestras. Introducción : Las partes aéreas de las plantas cultivadas: follaje, flores, frutos, peciolos y ramas jóvenes, pueden ser dañadas por una serie de hongos imperfectos pertenecientes a diversos géneros como: Alternaria, Cercospora, Colletotrichum, Helminthosporium, Micosphaerella, Pestalotia, Phytophthora, Pseudooeziza, Pyricularia y otros. Las enfermedades que ocasionan esos hongos, se manifiestan en la forma de lesiones necróticas de tamaño y forma variable, siendo favorecido su desarrollo principalmente por la humedad relativa sobre todo en valores superiores al 80% así como por temperaturas ambientales entre 26 y 32 grados C. A las enfermedades que producen las diferentes especies del hongo Calletotrichum, se les da el nombre de “Antracnosis” las cuales se presentan en leguminosas como el frijol, en árboles frutales como: el aguacate, el cafeto y el mango, además, en otros cultivos como la sandia. Material : Agujas de disección Cajas de petri Cubre y portaobjetos Estufa de incubación Matraces erlenmeyer Navaja Vasos de precipitados Micro y estereoscopio Frutos y hojas con manchado necrótico Medio de cultivo PDA

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Agua destilada esterilizada. Hipoclorito de sodio al 2% Procedimiento: Determinar y dibujar los síntomas y signos presentes en hojas y frutos enfermos. Cortar trozos de tejido de 0.5 cm de diámetro y desinfectar las muestras con solución de hipoclorito de sodio al 2% durante cinco minutos. Decantar el hipoclorito y lavar dos veces con agua destilada estéril; colocar los trozos de tejido desinfectado en placas con PDA. Incubar las placas inoculadas a 28 grados C hasta la aparición de colonias fungosas. Describir la morfología macroscópica y microscópica de las colonias fungosas desarrolladas y dibujar las estructuras que observe al microscopio. Hacer cortes de tejido vegetal en el que se presenten estructuras de fructificación (acervulos, picnidios, peritecios). Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp.

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Resultados:

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Conclusiones:

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FOTOGRAFIAS PARA IDENTIFICACION DE HONGOS DEL FOLLAJE

Cylindrosporium sp.

Pestalotia sp.

Colletotrichum 47

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Practica 14. Bacterias que producen prodición blanda. Objetivo : Demostrar, por medio de una prueba rápida y sencilla, la producción de enzimas pectinoliticas en bacterias causantes de la pudrición de tejidos blandos. Diferenciar el tipo de pudrición inducido por Erwinia carotovora de aquel producido por Bacilluis spp. Introducción : Las bacterias que inducen desintegración de tejidos vegetales por efecto de las enzimas, se presentan con mayor frecuencia en hortalizas constituidas por tejidos carnosos tales como: Apio, berenjena, calabaza, cebolla, col, espinaca, papa, rábano, tomate y zanahoria; en estos cultivos se producen pérdidas considerables en el campo, durante su transporte, almacenamiento y mercadeo. Los síntomas son semejantes en todos los hospederos, al principio en dichos órganos aparece una pequeña lesión aguanosa que se extiende con rapidez tanto en diámetro como en profundidad, la zona afectada se ablanda y suaviza. Su superficie puede quedar manchada o hendida, o bien arrugarse y quedar vejigosa, los bordes al principio están bien definidos pero después se hacen irregulares. Los tejidos se vuelven opacos y en corto tiempo adquieren un color cremoso y se vuelven mucilaginosos desintegrándose hasta formar una masa de células desorganizadas. En los frutos y tubérculos la superficie externa permanece intacta a diferencia de sus contenidos que cambian hasta constituir un líquido turbio, pero es más frecuente que se formen grietas y exude un liquido mucilaginoso a través de ellas, casi no tiene aroma, hasta que se colapsan sus tejidos infectados después de lo cual, las bacterias secundarias hacen que los tejidos se descompongan y produzcan un olor desagradable. Material : Asa Bisturí Cajas de petri Cubreobjetos y portaobjetos Matraces erlenmeyer Pinzas Papel filtro o sanitas

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Vasos de precipitados Micro y estereoscopio Agua destilada estéril Alcohol Tubérculos de papa blanca Cepa de Erwinia carotovora Procedimiento: Examinar las muestras de tubérculos de papa y describir los tipos de síntomas y signos. Hacer cortes de tejidos enfermos y sanos con navaja o tijeras tomando aprox. 0.5 cm de diámetro. Colocar los cortes de tejido en tubos de caldo nutritivo o agua destilada estéril y/o forma directa a partir de la lesión/ Hacer aislamientos por estría cruzada, tomando una asada a partir de los tubérculos con agua destilada estéril y/o directa e incubar a temperatura ambiente. Describir las características tanto macroscópicas como microscópicas de las colonias desarrolladas, poniendo énfasis en las siguientes características. 1. Observar un cultivo de 24 hr. Bajo el microscopio estereoscopio. 2. Hacer incidir la luz reflejada mediante un espejo cóncavo, po la parte baja de la caja. 3. Reconocer las colonias de Erwinia carotovora por la presencia de reticulaciones. Para demostrar la producción de enzimas pectinoliticas, cortar rodajas de papa de un grosor 0.5 cm y colocarlas en cajas de petri conteniendo un papel húmedo. Hacer una incisión que pase por el centro de la rodaja teniendo cuidado de no llegar a los extremos, la profundidad de esta incisión no deberá ser mayor de 3 milímetros. Inocular por medio de una asa bacteriológica masa bacteriana a lo largo de incisión, a partir del cultivo puro de la cepa que se aisló. Incubar a 28 grados C durante 48-72 hr. 49

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Tinción de flagelos (Metodo de Pappeler) Hacer un frotis a partir de una suspensión bacteriana con una concentración de 3 x 10 8 células por mililitro de acuerdo a la escala de Mc Farland. Dejar secar el frotis al aire. Adicionar acido tánico con trióxido de cromo y dejar actuar por 10 min. Lavar con agua corriente teniendo mucho cuidado. Adicionar el cristal violeta y dejar actuar por 5 min. Lavar con agua corriente y secar la preparación al aire. Observar a microscopio. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicion. Academic Press. 636 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp. Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 15. Aislamiento de nematodos del suelo. Objetivo : Aislar e identificar nematodos de muestras de suelo. Introducción : Los nematodos, son un filo de gusanos pseudocelomados con más de 25 mil especies registradas y un número estimado mucho mayor, el cuarto del reino animal por lo que se refiere al número de especies, a estos organismos se conocen como gusanos redondos, debido a la forma de su cuerpo en un corte transversal, son organismos esencialmente acuáticos, aunque proliferan en ambientes terrestres, los cuales los podemos encontrar en el suelo, plantas (fitopatógeno), incluyendo el hombre. Estos gusanos cilíndricos y de piel dura habitan en todos los ambientes, efectuando una fecundación interna y disponen de una cavidad llena de líquido y de un tubo digestivo completo, algunos nematodos viven como parásitos intestinales, causando daños en el hombre. Todas las especies de fitoparásitos de nematodos poseen un estilete, lo que ayuda a diferenciarlas de las especies que pueden resultar benéficas, existen, sin embargo, especies que poseen estilete y que no son fitoparásitos, como el caso de Tylenchus, dentro de los géneros fitoparásitos se encuentra Meloidogyne, Xiphinema, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, etc. Estos organismos dañan las raíces de multitud de plantas introduciéndose en ellas y absorbiendo sus jugos, no hay un suelo que no tenga nematodos, aunque para producir daños, su número tiene que ser elevado y las especies de plantas tienen que ser sensibles a ellos, algunos síntomas que presentan las planas son: las hojas toman un color verde pálido o amarillo que se marchita cuando el clima es cálido (no confundir con falta de nutrientes), plantas raquíticas, con poco desarrollo, descoloridas, esto aumenta su susceptibilidad al frío, a hongos y a bacterias oportunistas, los vegetales afectados pueden llegar a morir por la acción directa del nematodo o por los parásitos de debilidad, el debilitamiento progresivo de la planta, marchitamiento sin explicación y sin poder observar nada, también suelen manifestarse por rodales o líneas de cultivo. Algunos puntos de control pueden ser una desinfección con fumigantes tóxicos, desinfección mediante solarización, prevenir antes de sembrar, desinfección de suelo y substratos etc., en cualquier caso es difícil recuperar plantas infectadas y lo más eficaz es la desinfección del suelo antes de plantar. Materiale s: Suelo fresco Embudo

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Tubo de goma

Agua

Abrazadera

Tela

Soporte universal Papel filtro Ligas Cajas petri Tamices (20, 60, 200 mallas)

Procedimient o: Utilizando una muestra fresca del suelo aproximadamente de 100 a 300 cc. Los nematodos pueden aislarse mediante el método del embudo de Baermann o mediante tamizado. Método 1: Baermann

Embudo

de

Este consiste en un embudo de vidrio bastante largo (de 12 a 15 cm de diámetro) al cual se encuentra unido un tubo de goma, con una abrazadera colocada sobre el tubo. El embudo se coloca sobre el soporte y se llena con agua. La muestra de suelo se coloca en el embudo sobre un papel poroso y resistente a la humedad (papel filtro), o en un vaso de precipitados sobre el cual se ata un trozo de tela con una liga. El vaso de precipitados se invierte entonces el embudo con el trozo de tela y todo el suelo que este bajo el agua se deja así durante todo el transcurso de la noche o por varias horas. Los nematodos vivos se mueven activamente y migran a través de la tela o el papel poroso en el agua y se sumergen hasta el fondo de tubo de goma inmediatamente por arriba del nivel donde se encuentra la abrazadera. Se colecta el primer volumen en una caja petri para examinarla y se aísla individualmente cada nematodo utilizando estereoscopio.

Método tamizado

2:

Por

Se basa en que una muestra pequeña de suelo (300cc) se mezcla con un volumen mucho mayor de agua (2Lts), los nematodos flotan en el agua y pueden ser colectados en tamices con poros de ciertos tamaños. 53

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Se realizara una mezcla el agua-suelo se agita y se permite que repose durante 30 segundos. El sobrenadante se cuela con un tamiz de 20 mallas (20 orificios por pulgada cuadrada), el cual retiene los residuos de gran tamaño pero permite que los nematodos se cuelen hasta el recipiente. El liquido que contiene los nematodos se vierte después en un tamiz de 60 mallas, el cual retiene a los nematodos de gran tamaño y residuos pero deja que los mas pequeños pasen, los residuos de este se pasan por otro tamiz de 200 mallas el cual retiene a los nematodos pequeños y algunos residuos. Y se observa a estereoscopio y microscopio. Finalmente, se lavan los tamices de 2 a 3 veces para dejar libre de residuos y de nematodos. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp. Resultados :

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Conclusiones:

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Practica 16. Aislamiento de nematodos de plantas. Objetivo : Aislar e identificar nematodos de muestras de plantas. Introducción: Todas las especies de fitoparásitos de nematodos poseen un estilete, lo que ayuda a diferenciarlas de las especies que pueden resultar benéficas, existen, sin embargo, especies que poseen estilete y que no son fitoparásitos, como el caso de Tylenchus, dentro de los géneros fitoparásitos se encuentra Meloidogyne, Xiphinema, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, etc. Estos organismos dañan las raíces de multitud de plantas introduciéndose en ellas y absorbiendo sus jugos, no hay un suelo que no tenga nematodos, aunque para producir daños, su número tiene que ser elevado y las especies de plantas tienen que ser sensibles a ellos, algunos síntomas que presentan las planas son: las hojas toman un color verde pálido o amarillo que se marchita cuando el clima es cálido (no confundir con falta de nutrientes), plantas raquíticas, con poco desarrollo, descoloridas, esto aumenta su susceptibilidad al frío, a hongos y a bacterias oportunistas, los vegetales afectados pueden llegar a morir por la acción directa del nematodo o por los parásitos de debilidad, el debilitamiento progresivo de la planta, marchitamiento sin explicación y sin poder observar nada, también suelen manifestarse por rodales o líneas de cultivo. Algunos puntos de control pueden ser una desinfección con fumigantes tóxicos, desinfección mediante solarización, prevenir antes de sembrar, desinfección de suelo y substratos etc., en cualquier caso es difícil recuperar plantas infectadas y lo más eficaz es la desinfección del suelo antes de plantar. Materiales: Planta contaminada Estuche de disección Agua Embudo de vidrio Tubo de goma Soporte universal Papel filtro Tela

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Ligas Cajas petri Estereoscopio Procedimient o: Sin tomar en cuenta el órgano de la planta que contenga a los nematodos, se cortan en piezas pequeñas ya sea con la mano o utilizando una mezcladora durante unos segundos y se vierte entonces en el embudo de Baermann según el método. Los nematodos salen de los tejidos y nadan en el aguan del tubo a partir del cual se colectan en caja petri. Método de Embudo de Baermann Este consiste en un embudo de vidrio bastante largo (de 12 a 15 cm de diámetro) al cual se encuentra unido un tubo de goma, con una abrazadera colocada sobre el tubo. El embudo se coloca sobre el soporte y se llena con agua. La muestra de suelo se coloca en el embudo sobre un papel poroso y resistente a la humedad (papel filtro), o en un vaso de precipitados sobre el cual se ata un trozo de tela con una liga. El vaso de precipitados se invierte entonces el embudo con el trozo de tela y todo el suelo que este bajo el agua se deja así durante todo el transcurso de la noche o por varias horas. Los nematodos vivos se mueven activamente y migran a través de la tela o el papel poroso en el agua y se sumergen hasta el fondo de tubo de goma inmedi atamente por arriba del nivel donde se encuentra la abrazadera. Se colecta el primer volumen en una caja petri para examinarla y se aísla individualmente cada nematodo utilizando estereoscopio. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp. 57

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Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 17. Enfermedades causadas por virus. Objetivo : Aprender la técnica de transmisión mecánica de virus fitopatogenos. Reproducir síntomas de mosaico y/o lesiones locales en plantas de Nocotiana tabacum como indicadora. Identificar las inclusiones de tipo viral Realizar la técnica de ELISA Introducción: Los virus a los que Beijerink les dio el nombre, se caracterizan por su tamaño ultramicroscópico, por su multiplicación intracelular obligada, porque no han sido cultivados en medio libre de células y por si composición nucleoproteinica diferenciandose de esta forma de otros fitopatogenos. Los síntomas que inducen los virus son primarios y secundarios, los primeros son manifestaciones iniciales en la planta y resultan frecuetnemente de las inoculaciones mecanicas artificiales y posteriormente de infecciones naturales. Los secundarios se manifiestan posteriormente y se pueden observar en partes no inoculadas como es el caso de las infecciones sistémicas. Materiales: Atomizadores Carborum Cubre y portaobjetos Hisopos Microplacas inmunológicas Morteros Matraces erlenmeyer Balanza analítica Agua destilada estéril Floxina Formalina al 2%

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Glicerol Solución amortiguadora de fosfatos pH 7.0 Hojas de plantas con síntomas virales Plantas de Gomphrenea globosa y Nicotiana tabacum Procedimiento: Aplicar una cantidad pequeña de carborundum en el haz de las hojas de las plantas de tabaco. Triturar en un mortero, hojas con síntomas virales y adicionar 5 ml de solución amortiguadora de fosfatos pH 7.0 Humedecer un hisopo en el triturado y frotar suavemente la superficie de las hijas previamente preparadas con carborundum. Inocular con solución amortiguadora una hoja de tabaco, la cual servirá como testigo. Mantener en condiciones de invernadero las plantas inoculadas y hacer observaciones periódicamente para registrar el tiempo transcurrido en que se ponen en evidencia los primeros síntomas. Etiquetar todas las hojas que hayan sido inoculadas. Inclusiones virales Desprender la cutícula y epidermis de la nervadura central o secundaria de las plantas infectadas con virus. Colocar las tiras de tejido en las microplacas serológicas, que contiene formalina al 2% y dejar actuar por 15 min. Colocar las tiras de tejido en microplacas serológicas conteniendo los colorantes, floxina y rosa de bengala al 2% y los dejara actuar por 5 a 15 min. Lavar dos veces los tejidos con agua destilada. Colocar los tejidos entre porta y cubreobjetos con glicerol. Describir y dibujar las inclusiones observadas en los tejidos. 61

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Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp. Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 18. Selección de bacterias antagónicas para el control de enfermedades en plantas. Objetivo : Aprender la metodología general para la búsqueda y selección de microorganismos antagónicos contra hongos fitopatogenos. Adquirir el conocimiento y habilidad para seleccionar bacterias con capacidad antagónica contar hongos en el suelo. Introducción : La búsqueda de sistemas de control biológico, que contribuyan a la solución de problemas fitopatologicos para eliminar la utilización de productos químicos que tanto dañan el ambiente, ha sido motivo de preocupación de los investigadores en los últimos años. Sin embargo realmente son pocos los sistemas biológicos de control de enfermedades de plantas que han tenido éxito y que se han llegado a comercializar. El éxito de estos sistemas depende de la eficiencia con la que controla el patógeno, la facilidad de manipulación del microorganismo antagónico para su producción a escala industrial y su bajo costo de producción. La necesidad de mantener un ambiente menos contaminado obliga a los investigadores interesados en cubrir estas áreas, a buscar sistemas biológicas de control, para reducir así loe efectos negativos en el hombre y en el medio ambiente debido al uso indiscriminado de plaguicidas. Material : Agitador de vidrio Frascos de vidrio para dilución Tubos de ensaye de 10 x 15 Pipetas de 1 ml Agujas de disección Cajas petri Estufa de incubación Balanza granataria

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Medio de cultivo PDA Medio de cultivo B King 500 gr de suelo de almaciago sin tratar (cualquier vivero) Cepa tipo de Fusarium sp. Agua destilada Cloruro de sodio Procedimiento : •

Preparar una suspensión del suelo para la obtención de colonias bacterianas.

Pesar 10 gr de suelo de vivero sin que haya sido tratado con algún plaguicida. Adicionar los 10 gr de suelo a 90 ml de agua destilada estéril. Preparar diluciones: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 a partir de la suspensión de suelo. Pipetear 0.1 ml de diluciones 10 -6, 10-7, 10-8, sembrar por duplicado y depositar en placas que contengan medio B King. Distribuir sobre la superficie del medio con una varilla acodada estéril e incubar a 28 grados C hasta la aparición de colonias bacterianas. •

Selección de cepas bacterianas con capacidad antagónica.

Sembrar en el centro de la placa PDA una porción del hongo aislado obtenido mediante un sacabocados de 0.3 cm de diámetro. Seleccionar las colonias bacterianas que presenten diferencia en tamaño, forma, aspecto, color y consistencia. Sembrar por la técnica de punto a una distancia de 2.5 cm del hongo cada una de las colonias bacterianas seleccionadas. Incubar las placas sembradas con el hongo y las bacterias a 28 grados C, hasta que se manifieste una zona de inhibición por parte de las bacterias con capacidad antagónica. Seleccionar y purificar las bacterias que hayan producido un halo de inhibición. Conservar las bacterias en solución salina o agua destilada estéril. Cuantificar cada una de las cepas que mostro capacidad antagónica.

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•

La capacidad será probada de manera independiente de la siguiente forma:

Sembrar el hongo exactamente al centro de una placa de PDA. Sembrar 16 puntos equidistantes por la técnica de punto una de las cepas seleccionadas en torno al hongo sembrado. Realizar el mismo procedimiento del 2 si se quieren probar otros aislamientos con capacidad antagónica. Dejar como testigo dos placas de PDA sembradas únicamente con el hongo. Medir el diámetro de la colonia del hongo, cada 24 hr hasta que el testigo haya cubierto la totalidad de la superficie del medio. Graficar en papel milimétrico los valores obtenidos. Determinar cual o cuales bacterias presentan la mejor capacidad antagónica. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp.

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Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 19. Daños en granos y semillas mal almacenados. Objetivo : Conocer los daños que causan los hongos Aspergillus, Penicillium y Fusarium en granos almacenados. Identificar mediante la morfología colonial y microscópica los géneros involucrados. Determinar el poder germinativo de las semillas dañadas y no dañadas. Introducción: El grupo de hongos de almacén esta constituido por géneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium los cuales además de reducir la calidad de los granos y semillas almacenados, son capaces de producir toxinas potentes que afectan la salud de los animales domésticos y del hombre. Ciertas especies de penicillium se encuentran en granos en estado de deterioro, especialmente en maíz, donde invaden los embriones, los cubren o reemplazan con una masa de esporas, dando una coloración azul al pericarpio en la región del embrión. Los factores que determinan un grado de infección de los hongos son los siguientes: contenido de humedad del grano, temperatura, humedad relativa, tiempo que permanece el grano en el almacén, condición física de la semilla e infestaciones por insectos. Todos estos aspectos se pueden encontrar interactuando, lo cual se traduce en problemas de contaminación por hongos de almacén los cuales pueden ser incrementados por cosecha de los gramos con un contenido de humedad alto, descuido del grano durante su transporte a largas distancias por un sistema de ventilación deficiente en el almacén. Material : Agua destilada estéril Cajas petri Cubre y portaobjetos Hipoclorito de sodio 2% Lactofenol Matraces erlenmeyer Pinzas de disección

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Toallas de papel secante Papel filtro Embudos de vidrio Soporte universal Pinzas de Mohr Jeringa de 20 ml Navaja de un solo filo Microscopio compuesto Microscopio estereoscopio Cámara húmeda Estufa de incubación Medio PDA Mac Harina de maíz Semilla sana y enferma Procedimiento: •

Aislamiento de hongos de almacén:

Examinar y dibujar los daños observados en semillas almacenadas bajo condiciones desfavorables y compararlas con semillas sanas. Desinfectar cinco semillas dañadas y cinco semillas sanas con solución de hipoclorito de sodio al 2% durante 5 min. Eliminar el exceso de hipoclorito mediante dos lavados con agua destilada estéril. Colocar las semillas en placas de medio PDA o Malta-Sal-Agar e incubar durante 5 días a temperatura ambiente. Anotar las características macroscópicas y microscópicas de las colonias fúngicas desarrolladas. Dibujar las estructuras observadas al microscopio.

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•

Pruebas de germinación

Tomar al azar semillas sanas y mal almacenadas (50). Las semillas seleccionadas serán lavadas con agua corriente para posteriormente ser sometidas por separado a una solución de hipoclorito de sodio al 2% seguido de dos lavados de agua destilada estéril. Una vez desinfectadas se colocaran en toallas de papel húmedas y ordenar en hileras de cinco para tener un total de 10 hileras. Enrollar la toalla de papel tendido cuidando que las semillas se mantengan en el mismo lugar donde fueron ordenadas. Los rollos formados serán etiquetados y colocados en una cámara húmeda y puestos a incubar a 28 grados C durante 6 días. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp. Resultados :

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Conclusiones:

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FOTOGRAFIAS PARA LA IDENTIFICACION DE HONGOS DE ALMACEN

Aspergillus sp.

Fusarium sp.

Penicillium sp.

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Practica 20. Aflatoxinas en granos y semillas Objetivo: Determinar cuantitativamente la presencia de aflatoxinas. Introducción: Las aflatoxinas son un grupo de compuestos que cobraron importancia a partir de la muerte repentina en Escocia (1960), de cien mil pavos alimentados con maní infectado con una especie fúngica: Aspergilus flavus proveniente del Brasil. Los micelios de esta y de otras especies afines productoras de aflatoxinas, son capaces de colonizar semillas y a especies oleaginosas de mani, girasol, algodón, soya, entre otros cereales. Las aflatoxinas B1, los mayores niveles de contaminación por aflatoxinas se han registrado en semillas de algodón y maíz, cacahuates, nueces, avellanas y otros frutos secos. En cereales como el trigo, arroz, centeno o cebada la presencia de estos tóxicos suele ser menor. Materiales: Semillas de maíz, algodón, etc. Licuadora Balanza analítica NaCl Metanol Filtro Jeringa de 20 ml Columnas aflatest Fluorometro Solución de bromo Procedimiento: Para la determinación de aflatoxinas mediante el sistema Aflatest (carácter demostrativo). Se utilizaran: 74

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Pesar de 50-100 gr de la muestra: semillas de maíz, algodón, cacahuate, sorgo o nuez y molerlas durante un minuto a alta velocidad en licuadora. Tomar 50 gr de la muestra anterior y se le agregan 5 gr de NaCl, adicionando 100 ml de metanol al 80% y filtrar. Colocar 10 ml del extracto filtrado en un vaso limpio y diluir con 40 ml de agua destilada. Filtrar nuevamente para obtener un liquido de aspecto transparente. Colocar 10 ml del extracto en una jeringa de 20 ml ensamblada a una columna que contiene adheridos anticuerpos monoclonales. Pasar a través de la columna, regulando la velocidad de flujo a 2 gotas por segundo. Hacer 2 lavados con 10 ml de agua destilada, procurando dejar un menisco en la columna monoclonal. Eluir la columna con metanol QP directamente con el propósito de obtener las alfatoxinas que se encontraban unidas a los anticuerpos monoclonales. Colectar el eluyente en un tubo de lectura especial para fluorometro. Adicionar 1 ml de la solución de bromo al extracto colectado para revelar la presencia de aflatoxinas y leer en el fluorometro. El fluorometro nos da un valor directo de la aflatoxinas presentes en la muestra analizada. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edición. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp. 75

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Resultados:

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Conclusiones:

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