• Author / Uploaded
• Voley Ball

Citation preview

CURSO DE FITOPATOLOGIA GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS 2018

CUERPO DOCENTE BALATTI PEDRO LARRAN SILVINA MALBRAN ISMAEL MONACO CECILIA MOURELOS CECILIA PERELLO ANALIA ROLLERI JORGELINA SISTERNA MARINA STOCCO MARINA

COLABORADORES ASTIZ GASSO MONICA

FITOPATOLOGIA Curso 2018 Reglamento de Cursada

Asistencias Se requerirá el 80% de asistencia a las clases teóricas y prácticas respectivamente para promocionar como alumno regular sin examen final y 60% de asistencia a las clases teóricas y prácticas respectivamente para promocionar como alumno regular con examen final.

Para las clases prácticas se requiere que el alumno estudie previamente la guía de trabajos prácticos correspondiente, y el material complementario que puede acompañar a la misma. Los auxiliares docentes y los profesores evaluarán el dominio del tema por parte de los alumnos de manera oral. El resultado de estas evaluaciones formará parte de la nota final. Parciales Se tomarán 2 (dos) para la Carrera de Ingeniería Agronómica y 2 (dos) para la Carrera de Ingeniería Forestal. Los mismos constarán de preguntas escritas y se deberá obtener el 70% como mínimo para la promoción como alumno regular sin examen final y 40% como mínimo para la promoción como alumno regular con examen final. Recuperación de parciales Cada parcial se podrá recuperar una sola vez existiendo además otra única oportunidad (parcial flotante) para cualquiera de ellos. El ausente a una fecha de parcial implica la pérdida de la misma. Las notas obtenidas en recuperaciones serán consideradas como definitivas. Informe Cada alumno deberá aprobar un informe del Trabajo “Práctica profesional: progreso de la enfermedad” que realizarán siguiendo las consignas establecidas en el Trabajo Práctico: Epidemiología de la presente Guía. La entrega deberá ser realizada con fecha previa al segundo parcial (primera instancia). Justificaciones Las inasistencias por problemas de salud deberán ser debidamente justificadas por la Dirección de Sanidad de la Universidad en un lapso de 7 días posteriores a la fecha de la inasistencia. Nota final Para los alumnos que promocionen sin examen final, la nota resultará del promedio de todas las evaluaciones efectuadas (parciales, Informe de la Práctica Profesional y nota conceptual de las clases).

2

CRONOGRAMA CURSO 2018 Fecha

Desarrollo

Tema

16 de agosto

Teórico-Práctico

Enfermedad, signo y síntoma.

17 de agosto

FERIADO

23 de agosto

Teórico

Patogénesis: Introducción, sus etapas. Inóculo: tipos, producción, liberación, diseminación y perpetuación.

24 de agosto

Práctico

Interpretación de ciclos de enfermedades (inóculo, fuentes de inóculo, dispersión, etapas de la patogénesis). Técnicas de detección de inóculo en suelo, semillas y aire, transmisión de virus por vectores.

30 de agosto

Teórico

Epidemiología. Características de las epifitias, condiciones necesarias para su desarrollo, factores que influyen en su avance y distribución. Predicción de epifitias. Estimación de daños y patometría.

31 de agosto

Práctico

Epidemiología I.

6 de septiembre

Teórico

Mecanismos de defensa de los vegetales; resistencia pasiva y activa. Predisposición. Control, pautas. Legislación. Control Biológico.

7 de septiembre

Práctico

Epidemiología II. EN ESTACIÓN EXPERIMENTAL DE LOS HORNOS.

13 de septiembre

Teórico

Resistencia, inmunidad e hipersensibilidad. Bases moleculares de la resistencia de las plantas a las enfermedades. Problemas de genética de fitopatógenos.

14 de septiembre

Práctico

Técnicas fitopatológicas I. Postulados de Koch. Observación, visualización de signos, preparados, repiques, cámara húmeda, aislamientos.

20 de septiembre

Teórico-Práctico

Hongos I: generalidades, morfología, fisiología, reproducción asexual, identificación, nomenclatura, taxonomía.

21 de septiembre

FERIADO

27 de septiembre

Teórico-Práctico

Hongos II: reproducción sexual, ciclos biológicos.

28 de septiembre

Teórico-Práctico

Introducción Teórica de Bacterias. Técnicas para el diagnóstico de bacterias.

4 de octubre

Teórico

Bacterias (continuación), fitoplasmas y rickettsias: naturaleza, morfología, fisiología y taxonomía.

5 de octubre

Teórico-Práctico

Introducción Teórica de Virus. Técnicas para el diagnóstico de virus.

11 de octubre

PRIMER EXAMEN PARCIAL INGENIERÍA AGRONÓMICA

12 de octubre

FERIADO

18 de octubre

Teórico

Virus y viroides: generalidades, naturaleza, morfología, propiedades, mecanismo parasitario, identificación, nomenclatura y taxonomía.

19 de octubre

Teórico-Práctico

Mildius y Oídios. Tizón tardío de la papa. Película de oídios. Observación macro y microscópica de material verde enfermo.

25 de octubre

Teórico

Royas y Carbones.

26 de octubre

Práctico

Películas de royas y carbones. Observación macro y microscópica de material verde y herborizado

1 de noviembre

Teórico

Manchas foliares, tizones e hiperplasias.

2 de noviembre

Práctico

Reconocimiento de enfermedades con síntomas de manchas foliares en diferentes hospedantes.

8 de noviembre

Teórico

Marchitamientos, podredumbres y virosis.

generalidades,

3

Fecha

Desarrollo

Tema

9 de noviembre

Práctico

Podredumbres y marchitamientos.

15 de noviembre

Teórico

Cancrosis y antracnosis.

16 de noviembre

Salida a campo. Reconocimiento de enfermedades.

22 de noviembre

Salida a campo. Reconocimiento de enfermedades.

23 de noviembre

SEGUNDO EXAMEN PARCIAL INGENIERÍA AGRONÓMICA EXAMEN PARCIAL DE INGENIERÍA FORESTAL

CRONOGRAMA DE EXÁMENES Fecha

Examen

11 de octubre

Primer examen parcial Ingeniería Agronómica

1 de noviembre

Recuperatorio primer examen parcial Ingeniería Agronómica

23 de noviembre

Segundo examen parcial Ingeniería Agronómica Examen Parcial Ingeniería Forestal

3 de diciembre

Recuperatorio Segundo examen parcial Ingeniería Agronómica Recuperatorio Examen Parcial Ingeniería Forestal

18 de diciembre

Examen flotante Ingenierías Agronómica y Forestal

4

TRABAJO PRACTICO Nº 1 ENFERMEDAD SIGNO Y SINTOMA

OBJETIVOS. - Dominar los conceptos de enfermedad, signo y síntoma. -Reconocer síntomas y signos.

CONTENIDOS: -Definición de enfermedad, síntoma y signo. -Tipos de síntomas y signos. -Agentes etiológicos

ACTIVIDADES: - Observar y diferenciar los distintos síntomas presentes en el material suministrado. -Observar y diferenciar macroscópica y microscópicamente los distintos signos presentados.

PROCEDIMIENTOS DIDACTICOS: -Exposición introductoria dialogada. -Ejecución individual del trabajo práctico.

BIBLIOGRAFÍA: •

Agrios, GN. 1991. Manual de Enfermedades de las Plantas. Ed. Limusa S.A. 199 pp. Tomo1.

•

Agrios, GN. 2005. Plant Pathology. Academic Press. 920 pp. (Fifth Edition).

•

Fernández Valiela, MV. 1978. 3º Ed. Introducción a la Fitopatología. Colección científica INTA. Volúmen III. Hongos. Parte General. 779 pp.

•

Jauch, C. 1976. Patología Vegetal. Ed. El Ateneo. 320 pp. Capítulos 3, 4 y 5.

•

www.agro.unlp.edu.ar Aula Virtual

INTRODUCCIÓN – CONCEPTOS BÁSICOS Se define enfermedad como un desorden fisiológico que se traduce en una anormalidad constitucional y de duración más o menos prolongada o permanente como para perjudicar la calidad y el valor económico. Debe aclararse que estos conceptos no son rígidos y que pueden ocurrir desórdenes temporales que debido a la rapidez con que se recuperan no suelen ser considerados como enfermedades a pesar de presentar síntomas visibles (tal el caso de los marchitamientos que se observan durante los días muy secos y cálidos y que desaparecen en cuanto se restablecen las condiciones de temperatura y humedad). 5

Es necesario diferenciar entre enfermedad y daño, dado que este último es una reacción instantánea generada por un insecto o agente físico y que no evoluciona. Se define como síntoma a los cambios de forma, color y estructura que ocurren en las plantas como respuesta a la acción de los agentes bióticos y abióticos, la visualización de síntomas sugiere la presencia de la enfermedad. El reconocimiento de los síntomas en una planta enferma es crucial para el diagnóstico de las enfermedades. Cada agente causal produce síntomas específicos que pueden variar dentro de ciertos límites. Se define signo como la presencia visible del agente causante de la enfermedad. La Etiología es la ciencia que estudia el origen o las causas de las enfermedades, definiéndose al agente etiológico como el elemento que propicia el desarrollo de una enfermedad. Las enfermedades de las plantas pueden ser ocasionadas por agentes parasitarios o no parasitarios. Los agentes parasitarios pueden ser microorganismos: bacterias, micoplasmas, ricketsias, hongos y pseudohongos, entidades: virus y viroides y vegetales: fanerógamas parásitas. Los agentes no parasitarios son condiciones del medio ambiente desfavorables para el normal desarrollo de las plantas, ej: temperaturas extremas; exceso o deficiencia de agua en el suelo; desbalances nutricionales; contaminación ambiental.

TIPOS DE SÍNTOMAS 1. NECROTICOS: en estos casos se produce la muerte rápida de los tejidos y según el órgano afectado y la forma de presentarse el síntoma tendremos: 1.1. MANCHAS: son lesiones frecuentes en hojas y tallos, tal es el caso de la mancha de la hoja del eucaliptus (Mycosphaerella nubilosa), viruela del apio (Septoria apiicola), viruela de la acelga y de la remolacha (Cercospora beticola), mancha amarilla del trigo (Drechslera tritici-repentis), viruela del tomate (Septoria lycopersici), mancha en hojas de álamo (Septoria musiva). 1.2. PODREDUMBRES: es una desorganización de los tejidos y posterior muerte de las células por despolimerización de los componentes de la laminilla media y paredes celulares. Según la naturaleza del órgano afectado pueden ser: 1.2.1. SECAS: se produce la muerte por deshidratación de los tejidos. Este tipo de podredumbre se da generalmente en órganos o tejidos con bajo contenido de agua. Ej.: podredumbre seca del maíz (Diplodia zeae), podredumbre morena de los frutales de carozo y pepita (Monilinia spp.), caries de la madera (Polyporus spp.). 1.2.2.HÚMEDAS: en los tejidos afectados se produce una considerable acumulación de agua. En estos casos generalmente hay infecciones secundarias por parte de bacterias saprófitas que completan la desintegración y originan olores desagradables. Ej: podredumbre húmeda de las hortalizas (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum = Erwinia carotovora subsp. carotovora), 6

podredumbre del fruto de la frutilla (Botrytis cinerea), podredumbre del pie en fresno y plátano (Phytophthora spp.) 1.3. CANCROS: son lesiones de tipo crónico de lento progreso, con tendencia a extenderse por ser heridas que no logran cicatrizar. Generalmente se producen sobre tejidos lignificados o algo suculentos. Ej.: cancrosis de los álamos (Mycosphaerella populorum), la bacteriosis de los frutales de carozo (Xanthomonas arborícola pv pruni). 1.4. MARCHITAMIENTOS: pérdida de turgencia de los tejidos en toda la planta que, como su nombre lo indica, se manifiesta por déficit en el contenido de agua. Estos síntomas suelen ser causados por las enfermedades provocadas por patógenos del suelo que atacan al cuello y las raíces. Ejemplos: marchitamiento del tomate (Ralstonia solanacearum), marchitamiento del girasol (Sclerotinia sclerotiorum y Verticillium dahliae), marchitamiento del clavel (Fusarium oxysporum f. sp. dianthi), marchitamiento en Pinus por estrés hídrico. La muerte de la planta puede sobrevenir por diferentes razones: •

Destrucción del sistema radicular, que impide la absorción de agua.

•

Oclusión de los vasos leñosos por el parásito. Es una acción mecánica de taponamiento que impide el ascenso del agua. También se llaman traqueomicosis o hadromicosis, porque generalmente son producidas por hongos.

•

Toxicogénica: la excreción de toxinas por el patógeno aumenta la permeabilidad de la membrana citoplasmática de las células del mesófilo produciéndose como consecuencia un desbalance hídrico.

•

Embolias: consiste en formación de burbujas de aire en los vasos del xilema lo que provoca la ruptura de las columnas de agua.

1.5. AUTOTOMIAS: Se generan ante la presencia de enfermedades que provocan manchas, como un desprendimiento del tejido en las hojas afectadas que se visualiza como perforadas. La planta intenta aislar al agente causal mediante la producción de suber. Finalmente el trozo muerto se desprende por lo que el órgano queda cubierto de perforaciones como si hubiese sufrido el efecto de una perdigonada. Ejemplos: el mal de la munición o viruela holandesa en frutales de carozo (Stigmina carpophila), la cancrosis de los frutales de carozo (Xanthomonas arborícola pv. pruni) la viruela de la acelga y de la remolacha (Cercospora beticola), antracnosis del tilo (Elsinoe tiliae). 1.6. ANTRACNOSIS: lesiones hundidas que se presentan en hojas, pecíolos, tallos y frutos. Generalmente producidas por hongos cuya fructificación asexual es un acérvulo. Ejemplos: antracnosis del poroto (Colletotrichum lindemuthianum), antracnosis de la frutilla (Colletotrichum fragariae) y antracnosis en fresno (Colletotrichum sp.). 1.7. TIZONES: muerte rápida y generalizada de hojas, flores y tallos. Ejemplos: tizón del fuego o fuego bacteriano de los frutales de pepita (Erwinia amylovora), tizón de las agujas de pino (Dothistroma septosporum = Mycosphaerella pini) y Tizón tardío de la papa y el tomate (Phytophthora infestans).

2. HIPERPLÁSICOS: consisten en el aumento del crecimiento del órgano afectado resultando esto en deformaciones de parte o la totalidad del mismo. En estos casos debemos distinguir, de acuerdo a la histología patológica, dos 7

tipos de hiperdesarrollos, que en definitiva producen el mismo síntoma macroscópico y en general se dan asociados a: •

un aumento del tamaño de las células constitutivas: hipertrofia.

•

una inducción de la actividad mitótica celular por el patógeno o por sus secreciones que resulta en una hiperplasia.

Constituyen síntomas de este tipo las agallas o tumores y las enaciones (pequeñas excrecencias o verrugosidades en las nervaduras de las hojas). Ej. Agalla de la corona (Agrobacterium tumefaciens), tuberculosis del olivo (Pseudomonas syringae pv savastanoi), torque del duraznero (Taphrina deformans), mal de Río Cuarto en maíz (virus del mal de Río Cuarto MRDV), roya del ceibo (Ravenelia platensis).

3. HIPOPLÁSICOS: En estos casos se observa una disminución del tamaño del órgano (atrofia) o del individuo (enanismo). La hipoplasia puede manifestarse también como una disminución del contenido de la clorofila (clorosis). Ejemplos: de atrofias el oídio del manzano (Podosphaera leucotricha), de enanismos las caries del trigo (Tilletia spp.) y clorosis en el caso de los mosaicos debido a diversos virus (virus del mosaico del tabaco TMV, virus del mosaico del álamo PMV).

4. METAPLÁSICOS: son cambios que se producen en el contenido celular y generalmente se manifiestan por la aparición de coloraciones atípicas en la planta. Se produce la síntesis o aparición de sustancias que normalmente no existen o se hallan enmascaradas. Ejemplos: el torque del duraznero (Taphrina deformans), la viruela de la acelga y de la remolacha (Cercospora beticola), hongos cromógenos sobre madera talada que producen coloración rojiza (Fusarium spp.) o azulada (Ceratocystis spp.). 5. OTROS SINTOMAS: 5.1. EPINASTIA: curvamiento en hojas o ramas hacia abajo debido al crecimiento diferencial en la cara superior de las hojas. Ejemplo: Peste negra del tomate (Tomato Spotted Wilt VirusTSWV). 5.2. HIPONASTIA: curvamiento de las hojas o ramas hacia arriba debido al mayor crecimiento diferencial de la parte inferior respecto de la superior. Ejemplo: Curly Top de la remolacha (Virus del Encrespamiento Apical de la Remolacha). 5.3. FILODIA: transformación en hojas de cualquier órgano vegetal, principalmente pétalos, sépalos y estambres. Ejemplo: Aster yellows en crisantemo (Fitoplasma). 5.4. PROLIFERACION DE MERISTEMAS: Formación de yemas en un órgano donde normalmente no se producen. Ejemplos: •

Proliferación de ramas en un nudo (escoba de brujas). Roya del abeto (Aecidium elatinum).

•

Proliferación de flores femeninas: Mal de Río Cuarto en maíz (Virus del Mal de Río Cuarto MRDV).

•

Proliferación de raíces adventicias: Necrosis de la médula del tomate (Pseudomonas corrugata).

8

5.5. FASCIACION: transformación de un tallo u otro órgano en aplanado, de sección elíptica en vez de circular. Ejemplos: Stolbur del Tomate (Fitoplasma); fasciación de frutos y tallos en frutilla por efecto de días demasiado cortos. 5.6. AHILAMIENTO: alargamiento anormal de entrenudos acompañado de clorosis. Ejemplos: se produce en cualquier vegetal por insuficiencia de luz.

SIGNOS Son las estructuras del patógeno que suelen aparecer sobre la superficie de las plantas. Algunos signos son visibles a simple vista, mientras que otros se deben observar con lente de aumento. Entre los signos más frecuentes se pueden mencionar: 1. EFLORESCENCIAS: de diferentes coloraciones, por ejemplo, blanquecinas (oídios, mildius), grisáceas o negras (fumagina u hollín), verdosas (Penicillum spp. y Aspergillus spp.)

2. PUNTUACIONES NEGRAS: generalmente aparecen sobre manchas necróticas, corresponden a fructificaciones de diferentes hongos (acérvulos, peritecios, apotecios, picnidios, etc.).

3. PÚSTULAS: conjunto de esporas de colores vivos (blancas, amarillas, anaranjadas, castañas rojizas o negras). Son características de las royas. 4. MASAS CARBONOSAS: conjunto de esporas de coloraciones oscuras. Son características de los carbones (carbón volador del trigo, carbón o bolsa del maíz). 5. ESCLEROCIOS: cuerpos oscuros, de forma y tamaño variable que están compuestos por una masa compacta de hifas entrelazadas. 6. ZOOGLEAS: exudados mucosos característicos de las bacteriosis.

9

TRABAJO PRACTICO Nº2 PATOGENESIS OBJETIVOS -Conocer e integrar las etapas del ciclo de una enfermedad y su significado en la patogénesis. -Manejar la información con contenidos fitopatológicos disponible en páginas WEB. -Conocer las técnicas apropiadas para la detección de inóculo a partir de diferentes fuentes.

CONTENIDOS: -Patogénesis, sus etapas. Fuentes y tipo de inóculo. Ciclos de enfermedades. -Técnicas para el aislamiento de hongos a partir de suelo, semilla y aire. -Transmisión de virus por insectos.

ACTIVIDADES: -Analizar el Ciclo de una enfermedad, sus etapas y definir el significado de cada una. -Seleccionar la técnica adecuada para la detección de inóculo, según la enfermedad estudiada en clase.

BIBLIOGRAFIA: • • •

Agrios, G. 2005. Plant Pathology. 5th Ed. Elsevier Academic Press. 952 pp. FAO. 1985. Manual para Patólogos Vegetales. FAO, Santiago (Chile). Regional Office for Latin America and the Caribbean; Commonwealth Mycological Inst., Kew (United Kingdom). 453 pp. Fernández Valiela, M. 1978/79. Introducción a la fitopatología Vol: III y IV. Ed. Colecciones INTA.

INTRODUCCIÓN

10

La patogénesis se refiere al desarrollo de la enfermedad considerando el origen de la misma y el conjunto de eventos que conducen a ella.

Guía de Actividades - Se inicia la clase con una descripción muy sucinta del tema y de la guía de actividades prácticas, para encuadrar el mismo en el programa del curso y en la práctica, ubicando esta actividad en el marco de la resolución de problemas en Fitopatología, señalando su importancia dentro del Manejo Integrado de Plagas (MIP). - Se formarán grupos de hasta 2 alumnos. - A cada grupo se le asignarán dos enfermedades de etiología diferente, correspondientes a un cultivo de interés económico. - Los alumnos deberán utilizar el ciclo de la patogénesis que está en la Guía de Trabajos Prácticos, el glosario de esta guía o el glosario ilustrado de la APS disponible en: http://www.apsnet.org/edcenter/illglossary/Pages/default.aspx - Buscarán datos de las enfermedades asignadas referidos a las características de la enfermedad, biología del agente patógeno, manejo y/o control utilizando diferentes páginas WEB. Se sugiere utilizar páginas oficiales de universidades, INTA, SINAVIMO, FAO, American Phytopathological Society (APS net). - Con la información adquirida describirán como se cumplen las etapas de la patogénesis para cada enfermedad seleccionada. Se les pide que: a. Analicen los ciclos cuidadosamente, para comprenderlos bien en todos sus pasos. b. Definan cuál es el inóculo y marquen en cada etapa dónde está el inóculo. c. Definan en cada etapa cuál es la fuente de inóculo. d. Definan dónde comienza la infección del cultivo. ¿Cómo se llama esta infección? e. Definan si luego hay dispersión de la enfermedad en el cultivo. ¿Cómo se llama esta infección? f.

Definan qué o quién transporta/ transmite al patógeno.

g. Señalen en qué momento sería más fácil/económico/inocuo actuar sobre el patógeno. h. Teniendo en cuenta las fuentes posibles de inóculo, y las formas en que el mismo llega al hospedante, ¿cómo harían, en cada caso, para determinar la presencia del inóculo antes de que se produzca la infección primaria en el cultivo de interés? Consultar las técnicas propuestas en la Guía de Trabajos Prácticos. ¿Alguna se adapta a su necesidad? i.

Ante la presencia de un Marchitamiento asociado a un problema vascular o podredumbre basal en un cultivo intensivo bajo cubierta (lechuga, tomate o clavel para flor de corte), en el que se observa un elevado número de plantas muertas como consecuencia de la enfermedad; el productor decide efectuar un tratamiento al suelo para disminuir la densidad de inóculo (aplicación de un fungicida fumigante, solarización, vapor, etc). ¿Qué técnica aplicaría para evaluar la efectividad del tratamiento? Consultar las técnicas propuestas en la Guía de Trabajos Prácticos

j.

Pongan en común con el resto de la clase sus hallazgos.

11

k. Pongan en práctica las técnicas ofrecidas en el Trabajo Práctico (algunas solo se describirán, mientras se observan los elementos usados). Antes de realizar las actividades, frente a los elementos que se les presentan en la mesada, expliquen a sus compañeros la técnica seleccionada y sus fundamentos, y describan su modo de utilización. Para ello, si no han estudiado, armen su explicación con la Guía de Trabajos Prácticos en mano, analizando las instrucciones de ésta en unos minutos antes de exponer. l.

Recapitulación y cierre de la clase.

ANEXO Técnicas TP2 (Patogénesis) 1.- Detección de hongos en el suelo 2.- Detección de hongos en semilla 3.- Monitoreo de hongos en el aire 4.- Transmisión de virus por vectores

1.- DETECCIÓN DE HONGOS EN EL SUELO (MICOFLORA PATÓGENA Y SAPROBIA) CONTENIDOS Técnicas de aislamiento generales y selectivas de hongos de suelo. Densidad de inóculo. BIBLIOGRAFIA • •

Gilman, J. Manual de los Hongos de suelo. 1963. Compañía editorial Continental. Mexico. 572 pp. Singleton, L.L.; Mihail, J.D.; Rush, C.M. (eds.). 1992. Methods for Research on Soilborne Phytopathogenic Fungi. American Phytopathological Society Press, St Paul, Minnesota. Lori, G.; Wolcan, S. 1996. Fusarium spp de suelo: Identificación directa en el medio de Nash & Snyder modificado. Revista Iberoamericana de Micología 13: 18-23

•

Aislamiento de hongos de suelo con métodos generales y selectivos El suelo es el hábitat natural de muchos hongos fitopatógenos, principalmente de aquellas especies que causan marchitamientos y podredumbres basales. También es el ámbito temporal de formas resistentes de muchos hongos parásitos de la parte aérea del vegetal. Considerando que los hongos patógenos de suelo comparten su hábitat con otros microorganismos como hongos saprobios y bacterias, para proceder a su aislamiento es necesario utilizar procedimientos y sustratos adecuados que inhiban el crecimiento de otros. Las técnicas que se describirán en este práctico podrían ser utilizadas para estudiar la dinámica poblacional fúngica en un suelo, la supervivencia, la prevalencia de determinadas especies sobre otras, la densidad de inóculo, la eficacia de la aplicación de técnicas o productos destinados al control de hongos del suelo, etc. Para efectuar cualquier estudio referido a estos hongos, es necesario recolectar adecuadamente cierto número de muestras representativas del terreno a investigar. Las mismas serán tomadas en puntos elegidos al azar, descartando los primeros 5 cm de la capa arable donde abundan restos orgánicos aún no desintegrados. Debe tratar 12

de cubrirse la mayor superficie posible y extraer porciones de suelo (50 a 100 g) con una cuchara flameada, depositándolas en bolsas nuevas de polietileno. El conjunto de las muestras conformará la muestra compuesta que se procesará en el laboratorio. Allí el suelo, una vez secado a temperatura ambiente, se tamiza para ser luego analizado.

1.- Métodos Generales. Método del suelo diluido. Permite cultivar y aislar para su posterior identificación y recuento, las especies de hongos (patógenos y saprofitos) presentes en un terreno de cultivo del cual se habrán tomado distintas muestras. Fundamento: en este método, las colonias fúngicas desarrollarán a partir del inóculo adherido a finas partículas de suelo "diluídas" en un volumen de agua. Técnica: se parte de 1 g de suelo seco y tamizado, que se suspende en 150 ml de agua destilada estéril, sometiéndolo a agitación durante 20 minutos. Se toma una alicuota de 1 ml de la suspensión y se deposita en una caja de Petri estéril, repitiendo la operación con otras 4 - 5 cajas. Paralelamente se funde el medio de cultivo, APG al 2 % + 4 g/l de bilis de buey (fungistático), dispuesto en tubos de ensayo y una vez enfriado a una temperatura soportable al tacto se vierte en las cajas de Petri a razón de 1 tubo/caja, juntamente con 1 ml de solución de estreptomicina (antibiótico) en agua al 1 %. El antibiótico por ser termolábil se agrega en este momento y no es esterilizado con el medio. Se debe homogeneizar el contenido de las cajas por rotación de las mismas y luego incubarlas a 28°C durante 4-5 días, al cabo de los cuales se procede a la conservación y repique de las colonias desarrolladas. Si no se dispone de bilis de buey puede reemplazarse el APG por el medio de Martin.

2.- Métodos Selectivos Están orientados, no sólo a aislar las especies fúngicas sino además a estimar la densidad población en un determinado suelo. Como ejemplo puede citarse el recuento de colonias de Fusarium spp. (patógenas y no patógenas) o bien de esclerocios, obtenidos a partir de las técnicas de Nash-Snyder y Adams, respectivamente. En el primer caso la densidad se expresa en unidades formadoras de colonias/g de suelo (u.f.c./g) y en el segundo como Nº de esclerocios/100 g de suelo.

13

a) Método diferencial del suelo diluido en placa. Fundamento: es el mismo que el del método general del suelo diluido, pero en este caso se agrega un fungicida que a determinada concentración es selectivo para cierto género fúngico.

Técnica para el aislamiento selectivo de Fusarium spp., indicado para cuantificar el nivel poblacional de Fusarium spp. (sin discriminar población patógena de la no patógena): se suspenden 2,5 g de suelo seco y previamente tamizado, en 25 ml de agua destilada estéril (dilución 1:10). Luego de someterla a agitación durante 15 minutos, se toma con pipeta 1 ml de la suspensión y se le adicionan 9 ml de agua destilada estéril, logrando así una dilución de suelo 1:100. Continuar diluyendo en la misma proporción dos veces más para obtener diluciones 1:1000 y 1:10000 sucesivamente. Se toman alícuotas de 1 ml desde cada una de las diluciones depositándolas en distintas cajas de Petri. Previamente se habrá vertido en cada caja 1 ml de la solución fungibacteriostática (PCNB y antibióticos). Al mismo tiempo deberá fundirse el medio de cultivo de Nash y Snyder, selectivo para Fusarium spp., y una vez enfriado a temperatura soportable al tacto (45ºC) se lo vuelca dentro de las cajas de Petri a razón de 9 ml/caja. Incubar luego en estufa a 24-26ºC durante 4-5 días, al cabo de los cuales se practicará el análisis directo de la placa, mediante la observación de las colonias en forma macroscópica y con la ayuda del microscopio estereoscópico y óptico. Si se dificulta la identificación directa de Fusarium spp., las colonias se repicarán para efectuar posteriormente el estudio taxonómico tradicional o molecular. El efecto selectivo del PCBN (Pentacloronitrobenceno) en el medio de Nash y Snyder puede demostrarse preparando cajas con las mismas diluciones arribas mencionadas, pero empleando el medio de cultivo sin el fungicida.

Técnica para el aislamiento selectivo de Trichoderma spp.: se suspenden 2,5 g de suelo seco y previamente tamizado, en 25 ml de agua destilada estéril (dilución 1:10). Luego de someterla a agitación durante 15 minutos, se toma con pipeta 1 ml de la suspensión y se le adicionan 9 ml de agua destilada estéril, logrando así una dilución de suelo 1:100. Continuar diluyendo en la misma proporción dos veces más para obtener diluciones 1:1000 y 1:10000 sucesivamente. Se toman alícuotas de 1 ml desde cada una de las diluciones depositándolas en distintas cajas de Petri. Previamente se habrá vertido en cada caja 1 ml de la solución fungicida (PCNB). Al mismo tiempo deberá fundirse el medio de cultivo específico, “Trichoderma Selective Medium” (TSM), que se caracteriza por poseer una alta concentración de sales, baja proporción de glucosa y como bactericida Rosa de Bengala. Una vez enfriado a temperatura soportable al tacto (45ºC) se lo vuelca dentro de las cajas de Petri a razón de 9 ml/caja. Incubar luego en estufa a 24-26ºC durante 4-5 días, al cabo de los cuales se practicará el análisis directo de la placa, mediante la observación de las colonias en forma macroscópica y con la ayuda del microscopio estereoscópico y óptico. Si se dificulta la identificación directa de Trichoderma spp., las colonias se repicarán para efectuar posteriormente el estudio taxonómico tradicional o molecular.

14

b. Método de Adams del suelo tamizado. Fundamento: es apropiado para aislar aquellos hongos que producen esclerocios (Sclerotium spp.; Sclerotinia spp.), los cuales pueden separarse del suelo mediante tamizado y flotación. Técnica: muestras de suelo oreado, se lavan con agua corriente a través de un tamiz de bronce Nº 50. La materia retenida en el mismo es transferida a un vaso de precipitación, se agrega agua corriente y el sobrenadante (semillas, esclerocios, restos vegetales, etc.) se filtra a través de un segundo tamiz de nylon de 50 mm; luego de sucesivas operaciones similares a la anterior (hasta que ya no queda sobrenadantes), se observarán bajo lupa los esclerocios retenidos en el tamiz procediéndose a su identificación o cultivo.

c. Método con el empleo de cebos. Fundamento: se basa en el uso de un sustrato selectivo (cebo), más susceptible de ser colonizado por ciertos microorganismos que por otros. El patógeno será luego aislado desde los tejidos infectados del cebo a un medio de cultivo apropiado. Estos cebos son por lo general frutos, semillas o trozos de otros órganos vegetales.

Técnica para el aislamiento selectivo de Phytophthora spp.: coloque suelo húmedo, trozos de raíces o cuellos con necrosis, dentro de agujeros hechos en un fruto de manzana con ayuda de un cuchillo o sacabocados estéril; cubra los orificios con cinta adhesiva y coloque el cebo a temperatura ambiente por espacio de 5 a 10 días. Phytophthora produce una podredumbre que oscurece los tejidos del fruto. Con el empleo de una aguja flameada transfiera entonces partes del borde de las áreas color café a cajas de Petri con agar agua y examine al cabo de 4-8 días

Morfología y características culturales de los principales hongos fitopatógenos del suelo Phytophthora de Barry Micelio continuo profundamente ramificado, con hifas hialinas y de paredes delgadas; esporangióforos solitarios a numerosos. Esporangios con forma de huevo o de limón, conteniendo zoosporas ovales y biflageladas. Oosporas esféricas, germinando por medio de un tubo. Colonias blancas de aspecto húmedo.

Rhizoctonia De Candolle Micelio tabicado con hifas gruesas, ramificadas en ángulo recto y frecuentemente con formación de células en cruz. Produce microesclerocios y carece de estructuras reproductivas sexuales o asexuales. Colonias color castaño de aspecto afelpado.

Pythium Pringsheim Micelio continuo con hifas muy finas. Esporangios terminales o intercalares en las hifas; en parte son filamentosos y no más gruesos que las ramas miceliales y en parte esféricos o en forma de limón. Zoosporas reniformes con 2 flagelos laterales. Oosporas esféricas de color amarillo o gris. Colonias blanquecinas de aspecto húmedo.

15

Fusarium Link Micelio tabicado, hialino con conidióforos ramificados, aislados o reunidos en forma de almohadilla; conidios terminales, simples en forma de huso o de hoz, multicelulares. Colonias blanco-algodonosas, a veces rosadas o verdosas.

Verticillium Nees Micelio tabicado, hialino o débilmente coloreado. Conidióforos erectos, septados, ramificados. Ramas primarias verticiladas, opuestas o alternas; ramas secundarias verticiladas, dicótomas o tricótomas sobre las ramas primarias. Conidio, uno de cada ramita, redondos a elípticos, hialinos o coloreados. Colonias blancas y/o coloreadas.

Sclerotium Tode Micelio tabicado, hialino, formando numerosos esclerocios globosos, alargados o aplanados, solitarios o agrupados, la mayoría de color café o negro. Carece de estructuras reproductivas sexuales o asexuales. Colonias blancas de aspecto densamente lanoso.

Sclerotinia Fuckel Micelio tabicado, hialino o levemente coloreado. Esclerocios blandos o duros, irregulares, negros exteriormente y blanco o blanco rosado en su interior, desde 1 mm a varios cm de largo. Los esclerocios germinan formando estructuras reproductivas llamadas apotecios. Colonias blancas a marrones de aspecto lanoso.

2 - DETECCIÓN DE HONGOS EN SEMILLA. CONTENIDOS: Importancia, perjuicios, tipos de asociación Normas de la Asociación Internacional para Test de Semillas (I.S.T.A.). BIBLIOGRAFIA: • • • • • •

Cram, M.M.; Fraedrich S. W. 2009. Seed Diseases and Seedborne Pathogens of North America Tree Planters Notes, 33:35-44. http://naldc.nal.usda.gov/download/41643/PDF Neergard, P. 1983. Seed Pathology. Volumenes 1 (839 pp.) y 2 (1191 pp.). Macmillan Press. Ltd. Reis E. M.; Barreto D.; Carmona M. 1999. Patología de semillas en cereales de invierno. 93 pp. Salerno M. I., Lori G. A., Giménez D. O., Giménez, J. E. Beltrano J. 2000. Use of soil solarization to improve growth of eucalyptus forest nursery seedlings in Argentina. New Forest 20: 235-248 Salerno M.I.; Lori G. 2007. Association of seed borne Fusarium spp on Pinus ponderosa with germination and seed viability in Argentina. For. Path. 37.263-271 Sisterna, M. 2014. Manchado de la semilla/ grano de trigo. p .77-91. En: Enfermedades del trigo: avances científicos en la Argentina. Eds. Cordo C., Sisterna M. Editorial de la Universidad de La Plata (EDULP). ISBN: 978-987-1985-35-7

El rendimiento de un cultivo depende entre otras cosas de iniciar el mismo sembrando semillas sanas. Entre los varios atributos relacionados con la calidad de la semilla se contemplan la pureza, el poder germinativo y el vigor. 16

Sin embargo, también la sanidad debe ser considerada especialmente. De manera general, se puede afirmar que la semilla infectada por patógenos constituye una excelente fuente de dispersión y supervivencia y, por lo tanto, está directamente relacionada con la continuidad del ciclo biológico de los patógenos de una generación a otra del huésped. La transmisión de fitopatógenos por la semilla es un medio que conduce a la introducción del patógeno en nuevas áreas, a la sobrevivencia de patógeno en ausencia del huésped cultivado, a la dispersión de nuevas razas y a la distribución del patógeno como focos de infección primaria. Los perjuicios acarreados por estos patógenos resultan muy variables de acuerdo con los diferentes cultivos. Tanto es así que algunos de ellos han provocado en los cereales pérdidas del orden del 50% de la cosecha. En líneas generales los daños ocasionados se constituyen en: •

aborto de las flores;

•

formación de semillas de menor peso y tamaño;

•

podredumbre o necrosis de las semillas;

•

fallas en la pigmentación;

•

mermas en la germinación;

•

reducción de su viabilidad. En aquellos años en que se verifican infecciones severas, el problema es serio debido al bajo poder

germinativo y a que al estar infectado no se recomienda el empleo del material como simiente. Asimismo, tampoco es aceptado por la industria por el deterioro en su calidad. A esto debemos sumarle, en el caso de los cereales principalmente, el riesgo que representan las micotoxinas que dificultan su utilización como forraje. Con referencia a estas últimas son muchos los hongos que las producen, tales como representantes de los géneros Penicillium, Aspergillus, Fursarium, y Claviceps entre los más importantes y su peligro radica en ingerir harinas, granos o alimentos balanceados que las contengan. Algunas de ellas son las aflatoxinas, zearalenonas, trichotecenos, ergotoxinas, patulina, citrinina, etc.

a) Patógeno acompañante de la semilla En este caso el patógeno se asocia a semillas sin adherirse a ellas. Es el caso de esclerocios de Claviceps purpurea en trigo, Sclerotinia sclerotiorum en soja y girasol, etc. El patógeno, también, puede encontrarse entre las semillas asociado a glumas, raquis y nudos. Es el caso de las glumas de trigo conteniendo peritecios de Gibberella zeae (Fusarium graminearum) encontrados junto a semillas de trigo.

b) Patógeno adherido a la semilla: En este tipo de asociación el patógeno es llevado pasivamente en la superficie de la semilla. Ej.: las teliosporas de Tilletia caries y de T. foetida, conidios de Bipolaris sorokiniana y de Fusarium graminearum, las células 17

bacterianas de Xanthomonas campestris pv. undulosa que se adhieren a las semillas de trigo y cebada, etc. En Argentina existen al menos 7 especies de Fusarium que acompañan a las semillas de Pinus ponderosa. Fusarium spp. y Pythium spp., por su parte, son patógenos de semillas de Eucalyptus sp. También es posible que algunos microorganismos se ubiquen sobre los tegumentos seminales, provocando una infestación de la semilla (es el caso del virus del mosaico del tabaco – TMV- y del tomate ToMV), pudiendo actuar sobre la plántula una vez producida la germinación o sobre otras semillas en condiciones de almacenaje inapropiadas. Hay algunos métodos como el lavado de la semilla que remueven los patógenos y que pueden ser cuantificados por el examen microscópico de alícuotas de líquido de lavado.

c) Patógeno localizado en el interior de la semilla: El patógeno es transportado internamente como estructuras vegetativas. Generalmente se encuentran como micelio en el pericarpio o endosperma (Alternaria, Bipolaris, Drechslera, Septoria). También puede encontrarse micelio de reposo o latente en el embrión, como es el caso de Ustilago tritici.

NORMAS I.S.T.A PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS PATÓGENOS DE SEMILLAS: Para la determinación de los patógenos de semillas debemos regirnos por una serie de normas establecidas por la Asociación Internacional para Test de Semillas (I.S.T.A.). Los pasos a seguir serían en primer lugar la observación a ojo desnudo o bajo lupa, visualizando de esta manera estructuras tales como esclerocios que acompañan el material. En segundo lugar, se suele realizar, una inmersión en agua con el fin de realizar el recuento de esporas, lo que suele utilizarse. Es el caso de Tilletia sp., Fusarium sp., Alternaria sp., Bipolaris. Drechslera sp., Pyricularia sp., etc. En una misma etapa en el lavado de la semilla en agua se pueden observar nematodes en el sedimento. Además, se efectúa una extracción y observación de embriones, para detectar carbón volador de los cereales. Finalmente, tenemos los procedimientos en los que resulta necesario un período de incubación y que son dos, el del papel de filtro y el del agar. Para ellos debemos tener en cuenta los siguientes pasos: 1- Almacenaje: se recomienda evitarlo, de ser necesario hacerlo en lugar fresco (10°C) y seco. 1. Uniformidad de procedimiento: en todos los casos se debe trabajar siguiendo ciertas normas a los efectos de obtener resultados comparables. 2- Pretratamiento (principalmente en el método del agar): deben sumergirse las semillas en agua con hipoclorito de sodio (2-5%) durante 10 minutos (se realiza únicamente en el método del agar). Luego se deben lavar en agua destilada estéril. 3- Recipientes: deben emplearse envases que permitan el pasaje de luz (cajas de Petri). 4- Humedecimiento del papel: en el caso del método del papel de filtro, deben humedecerse las tres hojas empleadas con una cantidad de agua suficiente como para mantener la humedad durante el período de incubación. 18

5- Incubación: es necesario efectuarla en cámara climatizada durante 7 días, con temperaturas entre 18 y 22 °C, humedad moderada a alta y luz. Con respecto a esta última, las semillas deben someterse a ciclos alternados de 12 h de luz y 12 h de oscuridad, acompañadas las primeras de luz con longitud de onda cercana a la ultravioleta (NUV). 6- Movimiento de las semillas: debe evitarse durante la incubación. 7- Luz de observación: cumplido el período de incubación deben observarse las semillas con microscopio estereoscopio (lupa) con dos fuentes lumínicas para evitarse partes sombreadas. 8- Registro: los patógenos determinados deben asentarse en planillas diseñadas para tales fines.

3. MONITOREO DE HONGOS EN EL AIRE. CONTENIDOS. Importancia de las corrientes de aire en la dispersión de los hongos Técnicas de monitoreo de hongos de dispersión aérea. BIBLIOGRAFIA • •

Agrios, G. 1986. Fitopatología. Ed. Limusa. 756 pp Jauch, C. 1985. Patología Vegetal. Ed. El Ateneo. 320 pp. El aire es uno de los principales medios de dispersión de esporas de los hongos fitopatógenos. Por este

medio se pueden infectar nuevas plantas del cultivo u otros cultivos muy distantes. Un claro ejemplo de ello lo tenemos en la dispersión o diseminación de las urediniosporas de las royas que pueden alcanzar alturas de hasta 4000 m y dispersarse en distancias de más de 2000 km. El agua de lluvia o de riego también es una vía de dispersión de los agentes fitopatógenos. Esta dispersión está influenciada por el tamaño y la velocidad de caída de la gota de lluvia, duración de la misma, canopeo del cultivo donde cae el propágulo, etc. En general el agua de lluvia es un agente de dispersión que transporta el inóculo a distancias cortas. La presencia de inóculo en el aire puede detectarse exponiendo medios de cultivo en cajas de Petri durante algunos minutos en los ambientes que se desea monitorear. Esas cajas se incuban durante 4-5 días, al cabo de los cuales se observan las colonias que se desarrollaron a partir del inóculo. Tener en cuenta que este método no sirve para monitorear el inóculo de parásitos absolutos. Otro de los métodos empleados para demostrar la dispersión de esporas mediante el aire es utilizando trampas cazaesporas. Estas, consisten básicamente, en un recipiente donde se alojan cintas transparentes engomadas o portaobjetos envaselinados perpendiculares a la dirección del viento. El aparato gira libremente sobre un eje vertical y se orienta mediante un timón. Pueden tener además tubos de vidrio para colectar las esporas dispersadas por la lluvia. El monitoreo de esporas de dispersión aérea aporta elementos para el conocimiento de la epidemiología de las enfermedades, permitiendo, por ejemplo: 19

- Determinar el patrón de dispersión de esporas durante un período prolongado de tiempo, para lograr un conocimiento preciso de la incidencia de cada fase del patógeno sobre el cultivo. - Relacionar el fenómeno de dispersión aérea con las variables agroclimáticas (lluvias, temperatura, humedad, vientos, etc.) e investigar el efecto de cada variable. -Elaborar modelos matemáticos predictivos de ocurrencia de una enfermedad que asocie la incidencia del algún tipo de esporas del patógeno en estudio con las variables agroclimáticas que predisponen para esa enfermedad. -Estimar la intensidad de una epifitia e implementar las medidas de control para reducirlas a partir del conocimiento del patrón de dispersión de esporas en el aire y su relación con las condiciones ambientales.

4. TRANSMISIÓN DE VIRUS POR VECTORES CONTENIDOS: principales vectores de virus fitopatógenos, formas de transmisión. BIBLIOGRAFÍA: • • •

Llácer G., López M.M., Trapero A., Bello A., eds, 1996. Patología vegetal, tomo1. España: Sociedad Española de Fitopatología. Capítulos 6, 7 y 8. Fernández Valiela M. 1969. Introducción a la Fitopatología, vol 1. Colección Científica, INTA, 1015 pp. Hull J. 2002. Matthews’s Plant Virology, Elsevier., 835 pp.

Los virus fitopatógenos son transmitidos en la naturaleza por jugos vegetales (savia), semillas y polen, aunque la forma más frecuente es por medio de vectores. Los vectores pueden ser insectos, ácaros, nematodes y/u hongos. Entre los insectos, los pulgones son los que transmiten mayor cantidad de virus, aunque también son vectores las chicharritas, los trips, las moscas blancas, vaquitas y cochinillas. Las formas de transmisión de los virus fitopatógenos por los insectos son de tres tipos, según la tabla que sigue: FORMA DE TRANSMISIÓN PERÍODO

No persistente

Semipersistente

Persistente Circulativo

Propagativo

Adquisición

Seg. – min

min

Horas- días

Horas- días

Incubación

0

0

días

días

Inoculación

Min

Min-horas

Días- semanas

Días - toda la vida

El virus no se multiplica en el vector

El virus se multiplica en el vector

20

TRABAJO PRACTICO Nº3 ESTIMACIÓN DE DAÑOS Y PATOMETRÍA

OBJETIVOS - Comprender la relevancia y necesidad de cuantificar los daños producidos por las enfermedades de las plantas. - Conocer y aplicar los principales métodos de muestreo y cuantificación de enfermedades.

CONTENIDOS - Requisitos que deben reunir los métodos para la cuantificación de enfermedades - Principales procedimientos de muestreo - Aplicación de los conceptos de: incidencia, severidad, prevalencia e intensidad. - Diseño y aplicación de diferentes escalas de cuantificación de enfermedades - Utilización de los resultados para predicción y estimación de pérdidas económicas

ACTIVIDADES - Determinación de severidad e incidencia - Cómo establecer el tamaño de la muestra en la práctica. - Diseño de la forma de muestreo. - Trazado de curvas de progreso de la enfermedad.

PROCEDIMIENTOS DIDACTICOS Exposición introductoria dialogada Actividades grupales en gabinete

BIBLIOGRAFIA •

Agrios, G.N.1980. Plant Pathology. Academic Press, New York.

•

Fernández Valiela, M.V. 1979 Introducción a la Fitopatología, 3a. edición. Vols. I a IV. Colección Científica del INTA, Bs. As..

•

Francl, L.; Neher, D. 2003. Exercises in Plant Disease Epidemiology. APS Press, Minnesota, 233 pp.

•

Madden, L.; Hughes, G.; van den Bosch, F. 2008. The Study of Plant Disease Epidemics. APS Press, Minnesota. 421 pp.

•

Nutter, F.; Scultz, P. 1995. Improving the accuracy and precision of disease assessments: selection of methods and use of computer-aided training programs. In: Can J. Plant Pathol. Vol 17 (174-184).

•

Sarasola, A.; de Sarasola, M.A.R. (eds.). 1975. Fitopatología, Curso Moderno. Vol. IV. Ed. Hemisferio Sud.

•

Stone, C.; Matsuki, M.; Carnegie, A. 2003. Pest and disease assessment in young eucalyptus plantation. Agriculture, Fisheries, Forestry, Australia. Disponible en: http://adl.brs.gov.au/brsShop/data/PC12783.pdf

21

INTRODUCCIÓN Las enfermedades constituyen el principal riesgo para la producción de alimentos, por lo que es importante cuantificar con precisión y exactitud las pérdidas que provocan en los cultivos. Si desconocemos la magnitud de las pérdidas que ocasiona una enfermedad, no estamos en condiciones de decidir en forma racional, cómo proceder para su control. El cálculo o estimación de los daños es un requisito esencial para desarrollar cualquier programa de protección vegetal. Para lo cual, es necesario conocer el costo de las pérdidas para poder compararlas con los costos inherentes al control. La epidemiología es el estudio cuantitativo del proceso de diseminación de una enfermedad en el cultivo en el tiempo y espacio. Si es así, su punto de partida es poder traducir la enfermedad en un determinado momento a un número. Este número puede representar la incidencia o la severidad.

Fases de una Epidemia La obtención de la curva de incremento de la enfermedad en el tiempo es de mucha utilidad ya que nos permite considerar a la epidemia como un sistema dinámico y unidireccional hacia un incremento de enfermedad. En la curva de progreso de la enfermedad se pueden distinguir tres fases. La primera se llama inicial y ocurre hasta llegar a un 5% de enfermedad. La segunda fase es la fase intermedia y se desarrolló desde el 5 hasta el 50% de enfermedad, o sea que el aumento es 10 veces. Muchas epidemias pueden ser controladas en esta fase. La tercera fase es la fase “Terminal” y se desarrolla desde aproximadamente un 50% hasta el 100% de enfermedad, aunque no necesariamente tiene que llegar hasta el nivel máximo, o sea que el aumento es de 2 veces. En esta fase es cuando es visible el daño en el cultivo y los tratamientos en general resultan inútiles. La solución es la detección y control de la enfermedad en las etapas anteriores.

Tasa epidémica Por ser la epidemia un proceso dinámico, es fundamental el estudio de la velocidad a la cual se desarrolla la misma. Al ajustar una curva a los datos de campo, podremos linealizar la curva mediante la transformación logarítmica. De esa manera la pendiente de la línea recta así obtenida para la proporción de enfermedad (y) transformada logarítmicamente vs el tiempo (t) es la tasa promedio para todo el desarrollo de la epidemia. La tasa epidémica entre dos observaciones es generalmente diferente a la que ocurre entre otras dos observaciones, siempre dentro de la misma epidemia en el tiempo y espacio. La tasa epidémica promedio es la que considera a las lecturas de enfermedad durante todo el desarrollo de la epidemia.

FITOPATOMETRIA Es la estimación cuantitativa de la enfermedad en el cultivo o el proceso de medición cuantitativa de las enfermedades. Se deben considerar dos parámetros: incidencia y severidad.

22

INCIDENCIA Es el porcentaje o proporción de individuos enfermos en relación con el total. Los individuos pueden ser plantas, hojas, flores, folíolos, frutos, espigas, etc. Se evalúa en cada individuo, la presencia o ausencia de enfermedad. No se determinan niveles de enfermedad. El uso de este parámetro en el cultivo es particularmente útil para estudiar la velocidad y patrón de avance de las enfermedades. Es un parámetro objetivo, de cálculo sencillo, y no se necesita un entrenamiento especial de parte del evaluador para su empleo.

𝐼𝑛𝑐𝑖𝑑𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 (𝐼) =

𝑁º 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑓𝑒𝑟𝑚𝑎𝑠 𝑥 100 𝑃𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑎𝑠 (𝑠𝑎𝑛𝑎𝑠 + 𝑒𝑛𝑓𝑒𝑟𝑚𝑎𝑠)

SEVERIDAD Es el porcentaje de la superficie del órgano enfermo, ya sea de hojas, tallos, raíces o frutos afectado por la enfermedad y varía entre 0 y 100. El ejemplo típico de esta forma de estimar la enfermedad es el que se realiza con respecto a las manchas foliares. La severidad es un parámetro que refleja con precisión la relación de la enfermedad con el daño que le provoca al cultivo. Su evaluación es más compleja que la determinación de la incidencia, porque pude ser subjetiva y por lo tanto requiere de un entrenamiento previo por parte del evaluador.

𝑆𝑒𝑣𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎𝑑 (𝑆) =

𝑆𝑢𝑝𝑒𝑟𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒 𝑑𝑒 𝑡𝑒𝑗𝑖𝑑𝑜 𝑒𝑛𝑓𝑒𝑟𝑚𝑜 𝑥 100 𝑆𝑢𝑝𝑒𝑟𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙

PREVALENCIA Se refiere a la incidencia de la patología en un área geográfica determinada. Por ej: 6 de 10 plantaciones revisadas en una zona presentaron la enfermedad. Por consiguiente, la prevalencia en esa área será de un 60 %.

REQUISITOS QUE DEBEN REUNIR LOS METODOS PARA LA CUANTIFICACION La ausencia de una adecuada estandarización del procedimiento es el principal problema de la mayoría de los modelos o guías empleadas por los patólogos y por los fitomejoradores, para evaluar una enfermedad. A menudo los daños se clasifican como leves, moderados o severos sin cuantificar el nivel real de la enfermedad. En ausencia de un método estandarizado no es posible comparar la información recolectada por diversos investigadores. Muchos son los requisitos para una determinación acertada o precisa, pero existen dos criterios que se deben cumplir antes de emplear un método en trabajos experimentales o en prospecciones, el procedimiento de evaluación debe ser simple y rápido; este último aspecto tiene particular importancia para realizar prospecciones extensas. También es importante que los métodos sean objetivos, es decir, debe evitarse la subjetividad del operador, procurando que los resultados sean consecuencia de una norma o conjunto de normas numéricas estandarizadas de manera que las observaciones por diversos técnicos o investigadores sean comparables. Los métodos deben tener además alto grado de exactitud. Muchas veces no depende del método empleado, sino de la escala asignada, la cual debe reflejar la intensidad relativa de la enfermedad. Por ej.: en la escala de 0,1, 2, 3 y 4, las 23

plantas u órganos afectados asignados al grado 4, deberán tener cuatro veces la intensidad de ataque de aquél del grado 1, y dos veces más la intensidad que en el grado 2. La apreciación de la intensidad de daños debe ajustarse en todo lo posible a la escala establecida.

Estimación de la severidad Puede determinarse mediante: 1. La observación y registro del valor porcentual del tejido afectado que le asigna el evaluador en el momento de la evaluación. Ej. 79 % de la superficie foliar afectada. Para ello es conveniente el uso de programas computarizados de entrenamiento para evaluación de enfermedades. Estos programas contribuyen a mejorar la precisión y exactitud de las evaluaciones visuales. Por ej. DISTRAIN (para enfermedades de cereales), DISEASE.PRO (para enfermedades del maní) y BARLEY.PRO y ALFALFA.PRO (para cebada y alfalfa respectivamente). Además, existe software como el Assess que permiten cuantificar la enfermedad por análisis de la imagen (Lamari Lakhdar. 2008. Assess 2.0 APS Press)

2. Mediante el empleo de escalas descriptivas. Para ello se establecen diferentes niveles de la enfermedad y se les asigna a cada nivel una categoría, número, grado, o porcentaje de infección (ver ejemplos al final de la unidad).

3. Suelen también utilizarse escalas publicadas como diagramas de áreas standard que tipifican el desarrollo de la enfermedad en parte o toda la planta. Se han publicado muchos diagramas estandarizados como los de Chiarappa (1971, 1982) y James (1971). Ej: escala rusa para estimación de Royas en Cereales. Ver ejemplos. Luego de la recolección de los datos se pueden utilizar fórmulas para su análisis como:

Porcentaje de área afectada:

𝑃𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 á𝑟𝑒𝑎 𝑓𝑜𝑙𝑖𝑎𝑟 𝑎𝑓𝑒𝑐𝑡𝑎𝑑𝑎 =

∑ 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑡𝑎𝑞𝑢𝑒 (%) 𝑥 𝑓𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑁º 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎𝑠

Si tomamos como ejemplo la sarna de la papa, y si establecemos el siguiente grado: 0%, 25 %, 50 %, 75 % y 100 % de ataque, y suponemos que del material examinado hemos encontrado respectivamente una frecuencia de 40-80-12010 y 0 tubérculos para cada porcentaje establecido en la escala, tendremos, de acuerdo a la fórmula precedente:

(0% 𝑥 40) + (25% 𝑥 80) + (50% 𝑥 120) + (75% 𝑥 10 ) + (100% 𝑥 0) = 35% 250

MUESTREO La importancia del muestreo reside en que permite obtener los datos cuantitativos que relacionan la epidemiología teórica con la forma de solucionar los problemas que representan las enfermedades de las plantas en campos, 24

bosques, etc. Por eso es uno de los pasos más importantes en los estudios epidemiológicos, ya que todos los análisis se basan en el muestreo. Un censo de población, por su parte es impracticable en la gran mayoría de los casos por el costo y el tiempo que insumiría. El objetivo del muestreo es obtener una estimación representativa de las características de la epidemia (severidad e incidencia de la enfermedad, duración del período de latencia, etc), por un costo razonable, con la mayor precisión y seguridad y con la menor perturbación posible del patógeno, el hospedante y el medio ambiente. Cuando se planifica el muestreo en el campo real hay que hacer concesiones en lo relativo a costo, seguridad y precisión de las estimaciones. La experiencia sobre el patosistema en cuestión junto con la opinión de un estadístico puede ayudar a determinar qué concesiones pueden ser aceptadas sin poner en riesgo la confiabilidad y utilidad del estudio, según los objetivos que se hayan fijado. Una parte muy importante de la cuantificación de enfermedades en un cultivo es la definición del tamaño de la muestra y el diseño del muestreo.

¿CÓMO SE TOMA LA MUESTRA? Tres tipos de procedimientos de muestreo se emplean comúnmente en los reconocimientos de campo: 1) muestreo al azar, 2) muestreo estratificado y 3) muestreo sistemático.

Muestreo al azar: Es un procedimiento que consiste en seleccionar un número definido de submuestras de tal modo que cada una tenga la misma oportunidad de ser elegida. La selección es enteramente al azar. Este procedimiento es satisfactorio cuando la población del muestro no tiene una alta variabilidad y el tipo de cultivo (altura, distancia entre plantas) permite el uso de elementos adecuados para determinar plantas a tomar por azar (circunferencia de alambre, metro de madera, etc).

Muestreo Sistemático: Las muestras se extraen a intervalos constantes dentro de la población en cuestión. Este método requiere el establecimiento, por elección al azar, de un punto de partida. Desde este punto de partida es posible muestrear cada una de las plantas con el mismo intervalo, por ej. cada décima planta.

Muestreo estratificado: Cuando la variabilidad de la población es alta, se puede emplear el muestreo estratificado: La población se divide primero en subgrupos o subpoblaciones, llamados estratos. Mediante la estratificación cabe la posibilidad de dividir una población heterogénea en subgrupos que internamente son más homogéneos. Así, se logra que las diferencias entre individuos de un mismo estrato resulten tan pequeñas como sea posible, mientras que las diferencias entre los estratos resulten tan grandes como sea posible. Una vez establecidos los estratos se extrae de cada uno de ellos un número predeterminado de muestras. Esta selección se hace al azar en los diferentes estratos. En cualquiera de los 3 procedimientos descriptos, la intensidad del muestro depende de diversos factores. Estos son: 1) la variabilidad entre las unidades de muestreo, 2) la precisión deseada, 3) el tamaño del lote y número total de unidades (campos, parcelas, invernáculos) que han de muestrearse y 4) el tiempo, dinero y mano de obra disponibles para la investigación. 25

DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA El número de muestras (n) tomadas para evaluar una enfermedad determina la calidad y confiabilidad de los datos, así como el costo. Para definir el número mínimo de integrantes de la muestra (n) se considerarán tres factores: la estimación estadística del promedio y la varianza obtenidos en un muestreo preliminar o estudio piloto, las características biológicas del patosistema y los recursos disponibles para el muestreo.

Procedimiento Hay muchos métodos para llegar al tamaño adecuado de la muestra. Algunos son informales, por ejemplo, decidir el tamaño de la muestra según el número de componentes que se pueden analizar. Para poder usar este abordaje tiene que evaluarse de algún modo la calidad del muestreo. Si no es posible evaluarla, es mejor no hacer el muestreo por falta de recursos antes que obtener estimaciones demasiado imprecisas. Será necesario realizar un pequeño estudio piloto. Para determinar que mediciones hay que realizar para responder las preguntas prioritarias. En este ejercicio se pondrá en práctica la metodología de uno de los abordajes posibles para determinar el tamaño adecuado de la muestra usando los valores de desviación estándar con un nivel determinado de confianza.

Técnica Vamos a determinar el tamaño de la muestra necesario para determinar la incidencia de virosis en un cultivo de lechuga/ la severidad de una epidemia de roya de la avena en un cultivo de trigo. Comenzaremos con una estimación aproximada del tamaño de la muestra basándose en la magnitud relativa del promedio y la desviación estándar a medida que aumenta el número de muestras preliminares. Es necesario tener previamente una idea acerca del tamaño esperado de la muestra y de la variabilidad que se espera encontrar en la población a muestrear. Esta variabilidad puede cambiar a lo largo de la estación debido a la maduración de las plantas y a los niveles cambiantes de la enfermedad. Estableceremos las estimaciones de la enfermedad para una muestra preliminar de 10 plantas. (% órgano afectado): 46, 42, 33, 47, 36, 41, 37, 35, 39 y 48% a. calcular el promedio de la muestra y la desviación estándar a medida que se agrega cada nueva unidad de muestreo (X1) (se obtendrán 9 valores para el promedio y la desviación estándar) b. grafique el promedio y la desviación estándar (calculados para tamaño de muestras que incrementan su tamaño) contra el tamaño de la muestra. El tamaño de la muestra será aproximadamente cuando ambas curvas se vuelven más o menos planas u horizontales. Basándose en este gráfico, haga una estimación del tamaño de muestra que se necesita, redondeando a la integral entera más cercana.

Fórmulas: 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = ∑

𝑉𝑎𝑟𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑠 2 ) =

𝑥𝑖 𝑛

∑(𝑥𝑖 − 𝑥)2 ∑ 𝑥𝑖 2 − [(∑ 𝑥𝑖 )2 /𝑛] = 𝑛−1 𝑛−1 26

𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑠) = √(𝑠 2 )

ESTIMACION DE LAS PERDIDAS QUE PRODUCEN LAS ENFERMEDADES Los métodos experimentales para la evaluación de las pérdidas de cosechas implican la apreciación de la intensidad de la enfermedad, la determinación de los rendimientos y la relación entre los niveles de enfermedad y las pérdidas de rendimiento. Las estimaciones de las pérdidas pueden estar basadas en la reducción del rendimiento o en la reducción del valor de mercado de la cosecha a raíz de la disminución de su calidad por las enfermedades. Para cuantificar esta pérdida, se llevan a cabo ensayos que consisten en comparar los rendimientos de dos parcelas experimentales, donde las plantas de una parcela están libres de enfermedad y las plantas de la otra parcela se dejan infectar naturalmente o se inoculan con el patógeno. El análisis experimental consiste en comparar los rendimientos resultantes de cada una de las parcelas tratadas y no tratadas y analizar estadísticamente las diferencias. Una forma de conocer el desarrollo de una enfermedad es utilizar la curva del progreso de una enfermedad. Esta puede construirse evaluando la cantidad de enfermedad en una población de plantas en el tiempo. El gráfico de la enfermedad en el tiempo ha sido referido como la “firma” de la epidemia y representa la integración del hospedante, el patógeno y el efecto del medio durante la epidemia. Esto permite analizar, comparar y entender las epidemias. Algunas características de una epidemia pueden investigarse mediante el análisis de la curva del progreso de la enfermedad: que permite identificar el momento del inicio de la epidemia (t0 ) llamado “onset”; cantidad inicial de enfermedad (y0 ); tasa de incremento de la enfermedad ( r ); área bajo la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE); enfermedad final (yf ); cantidad de enfermedad en el tiempo y sobre todo duración de la epidemia. El área bajo la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE o AUDPC, acrónimo en inglés de Area Under the Disease Progress Curve) es un resumen cuantitativo que estima la incidencia y/o severidad de una enfermedad acumulada en el tiempo y que resulta útil para comparar entre años, localidades o prácticas de manejo. El método más comúnmente utilizado para estimar la ABCPE es el del trapezoide que consiste en transformar el tiempo entre estimaciones en una variable discreta (horas, días, semanas, meses o años) y calcular la incidencia y/o severidad promedio de la enfermedad entre cada par de momentos adyacentes en el tiempo. Se consideran los momentos de muestreo en una secuencia (ti ), para los que el intervalo entre muestreos sucesivos puede ser constante o variar, y se asocian las estimaciones de la incidencia y/o severidad de la enfermedad (Yi ). Así, se define Y0 como la incidencia y/o severidad inicial de la enfermedad al momento de la primera observación (t0 ). Al momento k (tk) la ABCPE será el total de la enfermedad acumulada hasta ese momento y está definida por: 𝑁𝑖 −1

𝐴𝐵𝐶𝑃𝐸𝑘 = ∑ 𝑖=1

(𝑌𝑖 + 𝑌𝑖+1 ) (𝑡𝑖+1 − 𝑡𝑖 ) 2

27

Para ilustrar el concepto, se muestran el cálculo y la representación gráfica del ABCPE de una determinada enfermedad a partir de 4 mediciones de severidad (Y0 = 1; Y1 = 2; Y2 = 7 e Y3 = 7,5) tomadas en sendos momentos (t0 = 0; t1 = 2; t2 = 5 y t3 = 6).

𝐴𝐵𝐶𝑃𝐸 =

(1 + 2) (2 + 7) (7 + 7,5) (2 − 0) + (5 − 2) + (6 − 5) = 23,75 2 2 2

Se puede linealizar esta curva y algunas utilidades de la linealización de la curva consisten en: predecir mediante la extrapolación de la recta, estimar valores iniciales de enfermedad, amplificar valores bajos de enfermedad y el cálculo de la tasa epidémica con fines comparativos. Por ejemplo, diferenciar razas más virulentas del patógeno, cultivares más susceptibles, medidas de control, etc.

Para comparar y predecir el desarrollo de una enfermedad, es necesario cuantificar, o modelizar matemáticamente los cambios en el desarrollo de la enfermedad a través del tiempo.

Algunos modelos que describen el progreso de la enfermedad son los siguientes:

Modelos Simples •

Exponencial: este es el modelo más simple de progreso de una enfermedad, ya que los cambios de la enfermedad en el tiempo son proporcionales al nivel de enfermedad presente. La tasa de incremento de la enfermedad es directamente proporcional a la cantidad de enfermedad. Un mayor nivel de enfermedad conduce a un mayor incremento de la misma. Este modelo es apropiado para describir etapas muy

28

tempranas de una epidemia policíclica cuando y es baja, por ejemplo: y < 0.05 y el tejido del hospedante no es limitante. •

Monomolecular: este modelo se basa en asumir que el nivel máximo de enfermedad es 1 (100%). Los incrementos de la enfermedad en el tiempo son proporcionales al tejido “aparentemente sano” en la población de plantas (“aparentemente sano” se refiere a que no todas las plantas infectadas se vuelven automáticamente sintomáticas). El incremento de enfermedad disminuye en el tiempo desde un máximo al comienzo de la epidemia. Este modelo ha sido exitosamente usado para analizar epidemias de marchitamiento de la lechuga, podredumbre de la raíz del trigo, oídio de la cebada y el mosaico enano del maíz.

•

Logístico: en este modelo la proporción de incremento de enfermedad es proporcional tanto al nivel de enfermedad como al tejido “sano” de la planta. Cuando se grafica la curva de enfermedad, se puede observar que es simétrica alrededor del 50% de enfermedad. Es similar al método exponencial pero cuantas más plantas se enferman una mayor cantidad de tejido se enferma y esto es menos tejido disponible para ser infectado y la tasa de incremento de la enfermedad disminuye como en el método monomolecular. el punto máximo de infección aparece cuando y = 50% o 0.5.

Modelos más Complejos •

Gompertz: este modelo es similar al logístico, pero al graficar la curva de enfermedad, esta presenta una mayor asimetría debido a que el punto de inflexión es cuando la enfermedad es del 37%.

Ajuste de las curvas del progreso de la enfermedad utilizando el EPIMODEL Las descripciones matemáticas de las epidemias son herramientas utilizadas por los epidemiólogos para cuantificar y comparar el efecto de diferentes prácticas de manejo, para estimar el daño futuro en el cultivo, y finalmente ayudar a los productores y lograr tomar decisiones de manejo más baratas y efectivas. Uno de los aspectos más importantes del análisis temporal de la epidemia es la selección de un modelo apropiado para describir al progreso de la enfermedad. La selección del modelo es importante debido a que los parámetros estimados para el modelo forman la base para el análisis estadístico y comparación de curvas. La evaluación de los modelos se basa en el valor del coeficiente de determinación (R2), el error medio y la desviación estándar de los parámetros estimados. El EPIMODEL es un programa de computadora que realiza el ajuste de los datos del progreso temporal de una epidemia a 4 modelos de crecimiento usados comúnmente en el análisis de una epidemia de plantas, monomolecular, exponencial, logístico y Gompertz

29

ANEXO - EJEMPLOS DE ESCALAS

A- Descriptivas ●Escala de ataque para royas en trigo (Trans. Br. Mycol. Soc., 1948). Establece para cada grado, la intensidad de los daños correspondientes: 1= ausencia de pústulas 2= plantas atacadas muy débilmente 3= plantas atacadas débilmente 4= plantas atacadas medianamente 5= plantas muy atacadas.

●Escala en porcentaje de área foliar afectada para el Tizón tardío de la papa (Br. Mycol.Soc., 1947). 0% 0,1%

Planta sana, sin síntomas de tizón. Pocas plantas enfermas repartidas al azar. No más de 1 o 2 lesiones en 12 yardas (10,9 m) de radio.

1%

Hasta 10 lesiones por planta, o infección general leve.

5%

Alrededor de 50 lesiones por planta, hasta 1 de cada 10 folíolos infectados.

25%

Casi todos los folíolos infectados, pero las plantas conservan su posición normal. La plantación se ve verde, aun cuando todas las plantas estén infectadas.

50%

Todas las plantas afectadas y alrededor del 50 % del follaje se encuentra destruído. La plantación se ve verde, con manchones pardos, marrón.

75%

Alrededor del 75 % del follaje destruido, pero la plantación aparece entre verde y marrón.

95%

Solamente unas pocas hojas verdes en las plantas, pero los tallos aún verdes.

100%

Todas las hojas muertas, los tallos muertos o secos.

B- Diagramáticas

. Escala de Cobb para Roya de negra del trigo. a. Unidades rusas. b. Equivalente en número de pústulas. c. % correspondiente en la escala de Cobb. d. % equivalente en la escala de Cobb modificada por USDA. 30

Escala usada para establecer porcentajes aproximados de las superficies de hojas infectadas por Roya del Manzano (Gimnosporangium juniperi-virginianae)

Escala de dígitos dobles para evaluar la intensidad de las enfermedades foliares en el trigo y la cebada. Basada en la escala de Saari-Prescott Primer dígito: indica la altura que alcanza la enfermedad (1 a 9). Segundo dígito: indica el % de área foliar afectada: (1=10%; 2= 20%; 3= 30%; 4= 40%; 5= 50 %; 6= 60%; 7= 70%; 8= 60%; 8= 90%)

31

Escala para medir lesiones neróticas en Eucaliptus Tomado de Stone, C, Matsuki, M and Carnegie, A 2003. Pest and disease assessment in young Eucalyptus plantation. Agriculture, Fisheries, Forestry, Australia http://adl.brs.gov.au/brsShop/data/PC12783.pdf

Escala de evaluación de Rhynchosporium cerealis en cebada (Clive James, 1971). Cada división representa un 10 % del área de cada hoja. Las áreas oscuras representan un 1, 2 y 5 % de cada hoja.

32

ACTIVIDAD PRÁCTICA: EPIDEMIOLOGIA

Lugar: Estación Experimental J. Hirschhorn.

Desarrollo de la actividad:

En el aula, el docente realizará una explicación de las actividades a desarrollar en la “Práctica profesional: progreso de la enfermedad” para todas las comisiones de alumnos. Para ello, comenzará con una breve descripción, a través de medios audiovisuales, de la enfermedad “roya amarilla de la avena” ocasionada por Puccinia coronata f. sp. avenae, de la sintomatología y signo característicos sobre este hospedante. A continuación, se abordarán los parámetros de estimación de daños haciendo especial énfasis en la severidad y en el uso de diagramas estandarizados para el cálculo del área foliar afectada. Asimismo, se realizará un breve entrenamiento en la determinación de la severidad a fines de lograr una evaluación precisa y exacta entre los diferentes evaluadores. Para ello, se presentarán imágenes tomadas del Distrain, software de entrenamiento en enfermedades foliares (Tomerlin y Howell, 19881), con diferentes porcentajes de severidad que se resolverán entre todos y serán cotejados con los valores arrojados por el programa. Se mencionará que luego los alumnos realizarán un entrenamiento con material verde enfermo previo a las actividades de campo. Seguidamente, se mencionará que cada comisión tendrá a su cargo una sub-parcela de avena en la que realizará el seguimiento del avance de la roya amarilla. Para ello, deberán realizar cinco (5) monitoreos a intervalos de 7 días en los cuales se calculará la severidad de la enfermedad en una hoja de cada una de 20 plantas de avena muestreadas al azar utilizando una escala estándar. Luego, el docente explicará los pasos a seguir a partir de los datos obtenidos en cada uno de los monitoreos para la confección de la curva de progreso de la enfermedad y para el cálculo del área bajo la curva. Finalmente, los alumnos se reunirán en las comisiones y evaluarán el material verde enfermo brindado por el docente calculando el área foliar afectada utilizando las escalas estándar de la guía o de elaboración propia y aplicando la fórmula correspondiente. Finalmente, se realizará una puesta en común de los porcentajes obtenidos por cada grupo. Luego desarrollarán las actividades 1 y 2 que a continuación se detallan: 1. Cada comisión marcará su sub-parcela de 1 m x 10 m de avena sembrada en un lote de 8 m x 20 m. 2. Se muestrearán al azar un total de 20 plantas de avena sin considerar las borduras, determinando el porcentaje de severidad de la hoja media de cada una de las plantas utilizando la escala de Cobbs modificada. 3. A intervalos de 7 días, los alumnos deberán realizar los 4 muestreos siguientes calculando los porcentajes de severidad. Con los resultados obtenidos confeccionarán la planilla de datos que incluirá: fecha de evaluación,

1

Tomerlin J.R., Howell T.A., 1988. Distrain: a computer program for training people to estimate severity on cereal leaves. Plant Disease 72: 455-459. 33

estado fenológico del cultivo según la escala de Zadoks2 porcentajes de severidad de cada una de las hojas muestreadas y promedio de severidad para cada fecha de muestreo. 4. Durante los muestreos deberán registrar en observaciones la presencia de otras enfermedades o plagas u otras adversidades bióticas o abióticas o eventualidades que puedan afectar la enfermedad que se está evaluando. 5. Con los promedios de cada fecha deberán armar la curva de progreso de la enfermedad y calcular el ABCPE 6. Observando la curva de progreso de la enfermedad y el área bajo la curva deberán analizar el su avance considerando los datos meteorológicos de la zona del cultivo que les serán proporcionados anticipadamente. Los mismos se obtendrán de la Estación meteorológica de la EEJH y serán proporcionados en el Aula Virtual de la página de la Facultad. 7. Los alumnos elaborarán un Informe de la Práctica Profesional que deberá ser entregado con fecha previa al 2º examen parcial. El informe constará de: a. INTRODUCCION: i. Carátula con nombre y apellido de los integrantes; fecha de entrega; comisión (docente); turno. ii. Descripción de la enfermedad “roya amarilla de la avena”: agente causal; síntomas y signo; características del patógeno; clasificación de acuerdo con su hábito nutricional y con el número de ciclos durante el cultivo; propagación y perpetuación; fuentes de inóculo; inóculo primario y secundario; y condiciones predisponentes. b. OBJETIVOS i. GENERALES: 1. Que el alumno comprenda el avance de las enfermedades de las plantas en el tiempo. ii. ESPECIFICOS: Que el alumno: 1. Adquiera habilidades y destrezas para estimar daños ocasionados por las enfermedades a través de la determinación de la severidad de la roya amarilla utilizando escalas estandarizadas; 2. comprenda que el progreso de la enfermedad es función de las condiciones ambientales del sitio del muestreo; 3. se entrene en prácticas propias del ejercicio profesional necesarias para la toma de decisiones en el manejo de las enfermedades de las plantas. c. MATERIALES Y MÉTODOS i. Descripción de la sub-parcela utilizada para el muestreo considerando: ubicación del lote, tamaño total del lote y de la sub-parcela, cultivo, fecha de siembra y densidad de siembra. ii. Descripción de la metodología utilizada en la evaluación de la severidad: número y fechas de monitoreo (intervalos entre evaluaciones), muestreo (tipo, órgano evaluado y ubicación en

2

Zadoks J.C., Chang T.T., Konzak C.F., 1974. A decimal code for the growth stages of cereals. Weed Res 14: 415–421. 34

la planta), número de muestras evaluadas, determinación de la severidad de la roya amarilla de la avena con el uso de escalas. d. RESULTADOS i. Incluir los datos obtenidos de la severidad en cada una de las muestras evaluadas para cada fecha de muestreo y su promedio. ii. Incluir los datos meteorológicos del período correspondiente al muestreo en el sitio del cultivo. iii. Incorporar la curva de progreso de la enfermedad elaborada con los promedios de severidad de cada fecha de muestreo en el Excel. e. CONCLUSIONES: incluya una conclusión relacionando el progreso de la enfermedad en el tiempo y los datos meteorológicos. Considerar cualquier otra adversidad o eventualidad que se relacione con los resultados obtenidos. f.

BIBLIOGRAFÍA: mencionar la bibliografía utilizada por orden alfabético. Citar autor o autores, año de publicación, título, nombre del libro o revista, páginas.

35

TRABAJO PRÁCTICO Nº4 MICROORGANISMOS FITOPATÓGENOS PERTENECIENTES A LOS REINOS FUNGI, CHROMISTA (STRAMENOPILA) Y PROTOZOA (PROTISTA) OBJETIVOS: Reconocer las principales estructuras vegetativas y reproductivas y conocer sus funciones. Diferenciar los elementos de nutrición, sostén y resistencia. Diferenciar fructificaciones y esporas de origen asexual y sexual. Interpretar ciclos biológicos.

CONTENIDOS: Características generales de los hongos fitopatógenos Principales estructuras vegetativas y reproductivas Ciclos biológicos

ACTIVIDADES: Realice preparados microscópicos y observe e identifique las diferentes estructuras fúngicas. Analice los ciclos biológicos suministrados de acuerdo con la guía de actividades

BIBLIOGRAFIA: •

Agrios, G. Plant Pathology. 5 th Edition. 2005. Ed. Academic Press. 952 pp.

•

Fernández Valiela, M. V. Introducción a la Fitopatología. Volúmenes I, II, III, IV. Ed. Colección Científica INTA. 1969.

•

Jauch, C. 1976. Patología Vegetal. Ed. El Ateneo. 270 pp.

•

Müller, E. y Loeffler. Micología. Ed. Omega. 345 pp.

Guía de Actividades 1.- observación macroscópica y microscópica de diversas estructuras de hongos y Oomycetes (Stramenopila) 2.- Interpretación de ciclos biológicos de hongos y Oomycetes (Stramenopila) fitopatógenos Teniendo en cuenta el ciclo biológico del patógeno elegido se les pide a los alumnos que señalen en el mismo: a) la etapa de reposo del patógeno (etapa de saprogénesis). b) la etapa de infección primaria (etapa de patogénesis). c) la de infección secundaria (etapa de patogénesis). d) la estructura/s del hongo en cada etapa: nombre y función. e) identifique en el ciclo dónde se produce el proceso sexual y/o asexual del hongo.

36

f)

¿Cuál es la utilidad de conocer el ciclo biológico de un agente patógeno? En qué momento y sobre qué estructuras del hongo y fuentes de inóculo considera que sería más eficiente aplicar medidas de manejo integrado de plagas (MIP).

g) Al terminar, cada grupo explica el ciclo a sus compañeros, señalando las etapas, los elementos específicos (conidio, peritecio, ascas, etc.) y la función de cada uno.

Morfología de hongos y microorganismos semejantes a hongos Los hongos y organismos similares a hongos que causan enfermedades en las plantas constituyen un grupo diverso. Un conjunto de organismos que guardan ciertas similitudes con los hongos, que se conocen como hongos inferiores, pertenecen al reino Protozoa (Myxomycetes y Plasmodiophoromycetes) y al reino Chromista, también conocido como Stramenopiles (Oomycetes). Los hongos verdaderos (Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes) pertenecen al reino Fungi. El término hongo sensu-stricto comprende a los organismos pertenecientes a este reino. Dentro de cada reino, se agrupan en diferentes Phylum. Son organismos eucariotas, carentes de clorofila por lo tanto heterótrofos, llevando una vida de saprobismo y/o parasitismo. La pared celular de estos organismos es permeable y puede estar constituida por quitina, hidratos de carbono, (celulosa y hemicelulosa) y lípidos, variando según los distintos grupos taxonómicos. Su cuerpo recibe el nombre de talo y puede estar conformado de distinta manera: 1. Unicelular: se caracteriza por la presencia de células individuales en las que predomina la gemación frente a la formación de hifas o constituye la única forma de desarrollo, y en este caso la gemación sería la forma de crecimiento y multiplicación. Las producen representantes del Reino Fungi (como por ej. las levaduras). 2. Plasmodial: se caracteriza por ser una masa citoplasmática plurinucleada, a veces de grandes dimensiones, carente de pared celular. Lo producen representantes del Reino Protozoa (por ej. Pasmodiophora brassicae). 3. Filamentoso: el talo se organiza en filamentos llamados hifas y su conjunto recibe el nombre de micelio. Según sus características y funciones el micelio de los hongos puede ser de dos tipos: vegetativo y reproductivo. Lo producen representantes de los Reinos Fungi y Chromista (por ej. Alternaria alternata, Plasmopara vitícola).

MICELIO VEGETATIVO Cumple funciones de nutrición, sostén, absorción y resistencia y según su estructura puede ser: 1. MICELIO CONTINUO O CENOCITICO: constituyendo un sifón plurinucleado, como los representantes de los Phylum Oomycota (Reino Chromista/Stramenopiles,) Phylum Chytridiomycota y Zygomycota (Reino Fungi) 2. MICELIO TABICADO: en el que a intervalos más o menos regulares se forman tabiques. Estos pueden llevar un poro que permite el pasaje de citoplasma y núcleos, que en el caso del Phylum Ascomycota es simple. Los Basidiomycota presentan un poro de estructura muy compleja llamado doliporo que en un corte transversal 37

presenta dos engrosamientos en forma de barril, con los extremos abiertos y cubierto cada uno de ellos por una membrana en forma de paréntesis denominada parentosoma. La estructura impide el pasaje de los núcleos. Si bien en los hongos no se producen diferenciaciones anatómicas, semejantes a las que ocurren en los vegetales superiores, en los que existen tejidos organizados, en muchos casos se observan especializaciones diversas tales como: 1. Estructuras de nutrición y sostén 1.1. APRESORIOS: son estructuras de fijación al sustrato, tienen forma achatada, de las que suelen surgir hifas infectivas. Ej. Colletotrichum. 1.2. HAUSTORIOS: son prolongaciones del micelio a manera de evaginaciones que se introducen en las células del hospedante para absorber los nutrientes, son de forma variada: esféricos, alargados, estrellados, etc. Ej. Oidium, Peronospora, etc. 1.3. RIZOIDES: en algunas especies aparecen estas formaciones a manera de pequeñas raicillas, cuya función es la de sostén y absorción. Ej. Rhizopus. 2. Estructuras de resistencia: son estructuras somáticas con las que ciertos hongos resisten condiciones adversas. 2.1. ESCLEROCIOS: son masas de hifas firmemente entrelazadas que constituyen cuerpos duros, oscuros, de tamaños que varían entre 1mm y 4 cm, esféricos, reniformes, alargados, etc. Si se efectúa un corte de los esclerocios se observa una capa delgada oscura exterior, la corteza, luego otra más espesa, el pseudoparénquima y finalmente la masa interior constituida por un entrelazamiento más flojo de hifas hialinas, el prosénquima. Estos esclerocios una vez maduros y en condiciones adecuadas pueden germinar produciendo un micelio o una fructificación sexual. Ej. Claviceps, Sclerotium, Sclerotinia. 2.2. RIZOMORFAS: son hifas fuertemente entrelazadas que forman estructuras semejantes a cordones, oscuros, que pueden alcanzar en algunos casos más de 100 metros de longitud y un diámetro de 2 o 3 mm. Estas estructuras son subterráneas y comunes en algunas especies de Agaricales (hongos de sombrero). Ej. Armillaria mellea. 2.3. CLAMIDOSPORAS: son estructuras microscópicas formadas por el engrosamiento de una hifa u espora, ricas en materiales de reserva y pobres en agua, que se rodean de una doble pared. Según su ubicación en la hifa pueden ser terminales o intercalares, solitarias o en cadena. Una vez que muere el micelio que le dio origen quedan libres en el sustrato y cuando las condiciones del medio son favorables germinan desarrollando un tubo que regenera el nuevo talo. Ej. algunas especies de Fusarium, Phytophthora, etc.

MICELIO REPRODUCTIVO Las unidades de propagación más comunes de los hongos se agrupan bajo la denominación de esporas y los elementos especializados que las llevan, soportan o producen reciben la denominación general de esporóforos. De acuerdo con su origen las esporas se pueden agrupar en dos grandes categorías: asexuales y sexuales. 38

La mayoría de los hongos a lo largo de su ciclo de vida cumple con esos dos tipos de reproducción. Esta situación hace que algunos hongos cuando se hallan cumpliendo su ciclo asexual sean ubicados sistemáticamente como Hongos asexuales o imperfectos (Deuteromycetes). y posean un nombre genérico. Cuando desarrollan su ciclo sexual, el mismo hongo recibe otro nombre genérico y se ubica en otro grupo taxonómico dentro del Phylum Ascomycota o Basidiomycota. La forma asexual o imperfecta de un hongo se denomina anamorfo, mientras que la sexual o perfecta recibe el nombre de teleomorfo. 1. Esporas de origen asexual: definimos como reproducción asexual a aquella en la que no hay meiosis ni producción de gametas, las esporas se producen vegetativamente a partir del talo. 1.1. ESPORANGIOSPORAS: formadas dentro de esporangios, que son vesículas de paredes finas, que están soportadas por esporangióforos. Las producen representantes del Phylum Zygomycota (por ej. Mucor, Rhizopus). 1.2. ZOOSPORAS: se diferencian de las anteriores por ser móviles (1- 2 cilias) denominándose a la fructificación que las produce zoosporangio. Las producen representantes del Phylum Oomycota (por ej. Albugo, Phytophthora). 1.3. CONIDIOS: se originan a partir de una hifa denominada conidióforo. Los producen representantes de los Deuteromycetes. Pueden encontrarse: 1.3.1.Libres: los conidióforos y conidios no se encuentran contenidos en ningún tipo de fructificación. Ej. Cercospora, Oidium, Pyricularia, Alternaria, etc. Dentro de este grupo es necesario señalar algunas variantes: una de ellas es cuando las hifas se compactan formando una masa estromática sobre la cual se disponen los conidióforos y conidios recibiendo el nombre de esporodoquio. Ej. Fusarium, Sphacelia. En el caso de que la estructura anterior adquiera consistencia mucilaginosa recibe el nombre de pionnote. Ej. Fusarium. Otro caso sería cuando los conidióforos se unen a manera de haz formando una estructura alargada portadora de conidios llamada sinnema. Ej. Graphium, Arthrosporium, etc. 1.3.2.En fructificaciones: en estos casos quedan tanto conidióforos como conidios reunidos o protegidos por algunos de los siguientes tipos de fructificaciones: 1.3.2.1.

Picnidio: cuerpo fructífero hueco, de forma globosa, cuyas paredes formadas por varias

capas de hifas entrelazadas le confieren un apreciable grosor. Su interior se encuentra cubierto por conidióforos y conidios (picnidiosporas) los que son liberados a través del ostiolo. Ej. Septoria, Phomopsis, Phoma. 1.3.2.2.

Acérvulo: es una fructificación abierta en forma de plato o almohada tapizada por

conidióforos y conidios; que se integran a los tejidos del hospedante, emergiendo luego a través de la epidermis. Ej. Marssonina, Colletotrichum, Sphaceloma. 2. Esporas de origen sexual: la reproducción sexual de estos microorganismos, así como la de otros seres vivos, requiere la unión de 2 núcleos compatibles. En este proceso se verifica primeramente una plasmogamia en la 39

que, como resultado de la unión de los protoplastos, se obtiene una célula con dos núcleos haploides apareados (dicarión n-n). Posteriormente tiene lugar la cariogamia (unión de núcleos, 2n), finalizando el proceso con la meiosis que restablece la condición haploide de los núcleos. Los órganos sexuales de los hongos se llaman gametangios. Estos pueden formar células sexuales diferenciadas llamadas gametas, o en su lugar pueden contener uno o más núcleos gaméticos. Algunas especies de hongos no producen órganos sexuales diferenciados, estando delegada la función sexual a las hifas somáticas. 2.1. OOSPORAS: por poseer paredes engrosadas las mismas cumplen funciones de resistencia. Las producen representantes del Phylum Oomycota (como por ej. Albugo, Phytophthora, Phythium). 2.2. ZIGOSPORAS: como en el caso anterior poseen paredes gruesas. Las producen representantes del Phylum Zygomycota (como por ej. Mucor, Rhizopus, Absidia). Las Oosporas y Zigosporas son similares morfológicamente, pero difieren en cuanto al proceso de formación. 2.3. ASCOSPORAS: se forman en el interior de vesículas denominadas ascas. Las producen representantes del Phylum Ascomycota. Pueden hallarse: 2.3.1.Libres: formadas a partir de una capa fértil del micelio, como ocurre en el género Taphrina. 2.3.2.En fructificaciones: de distintos tipos (ascocarpos). 2.3.2.1.

Peritecios: son de forma más o menos globosa, abiertos por un ostíolo, conteniendo en su

interior ascas dispuestas en forma ordenada. Ej. Claviceps, Giberella, etc. 2.3.2.2.

Apotecios: son fructificaciones a manera de copa o plato sobre las que se implantan

ordenadamente las ascas; pueden tener o no pie. Ej. Pseudopeziza, Sclerotinia, 2.3.2.3.

Cleistotecios: son formaciones completamente cerradas, no guardando las ascas orden

alguno. Ej. Eurotium. 2.3.2.4.

Chasmotecios: son formaciones completamente cerradas, que guardan ascas ordenadas Ej.

Erisiphales. 2.3.2.5.

Ascostromas: las ascas se ubican dentro de huecos o lóculos en un estroma que, en algunos

casos, al ser uniloculados se asemejan al peritecio. Ej. Venturia, Elsinoe. 2.4. BASIDIOSPORAS: se producen sobre formaciones especiales, los basidios. Estos pueden originarse libremente a partir del micelio como en el caso de Puccinia, Tilletia, etc. o pueden estar protegidos por fructificaciones, los basidiocarpos, como ocurre en los hongos de sombrero y repisa (Trametes, Fomes). Las producen representantes del Phylum Basidiomycota.

40

CLAVE PARA LA DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS FITOPATÓGENOS PERTENECIENTES A LOS REINOS FUNGI, CHROMISTA (STRAMENOPILA) Y PROTOZOA (PROTISTA). REINO PROTOZOA: Protozoos. (REINO PROTISTAS). Microrganismos unicelulares, plasmodiales, coloniales, multicelulares muy simples ó fagotróficos. Este reino contiene varios microorganismos además de los similares a los hongos (Myxomycetes y Plasmodiophoromycetes) Phylum Myxomycota: producen un plasmodio o estructura tipo plasmodial Clase: Myxomycetes el cuerpo es un plasmodio anamórfico, producen zoosporas. Pueden crecer sobre o cubrir partes de plantas, pero no infectarlas. Los mixomycetes son los auténticos mohos mucilaginosos plasmodiales, y se caracterizan por presentar como talo (aparato vegetativo) a un plasmodio (masa multinucleada, desnuda, ameboidea y fagocítica. Se trata de organismos cuyo hábitat preferido es el bosque templado húmedo (aunque se pueden encontrar desde la alta montaña a los desiertos Algunos son comestibles y otros pueden aparecer sobre plantas cultivadas, a las que no causan daño, pero afean bastante. Orden: Physarales: Plasmodio saprofítico que da origen a fructificaciones que contiene esporas. Producen zoosporas con 2 flagelos. Géneros: Fuligo, Mucilago, y Physarum. Los géneros Physarum, Fuligo, Mucilago, etc., no son estrictamente fitopatógenos, sin embargo, en condiciones de humedad muy abundante puede ocurrir una proliferación de plasmodios y esporangios, que cubran las plantas y les den un feo aspecto (algo molesto en el caso de ornamentales, céspedes, etc.). Phylum Plasmodiophoromycota: Endoparasíticos. Orden: Plasmodiophorales: Plasmodio producido dentro de células de raíces y tallos de plantas. Producen zoosporas que tienen 2 flagelos. Son parásitos obligados. Géneros: Plasmodiophora (ej. P. brassicae en Crucíferas), Polymyxa (ej. P. graminis, parásito en trigo y otros cereales que puede transmitir virosis), Spongospora (ej. S. subterranea que causa powdery scab en tubérculos de papa)

REINO CHROMISTA (STRAMINIPILA) Unicelulares o multicelulares, filamentosos, primariamente fototróficos, algunos con apéndices flagelares tubulares o con cloroplastos dentro de un retículo endoplasmático rudimentario, o ambos. Aquí se pueden encontrar las algas pardas, las diatomeas y algunos hongos, que en realidad descienden de algas que han perdido la clorofila. Alexopoulos et al. (1996) denominaron a este reino Straminipila Phylum Oomycota: Poseen zoosporas biflageladas. Talo diploide. El resultado del contacto gametangial es una Oospora. Paredes celulares compuestas por glucanos y pequeñas cantidades de hidroxiprolina y celulosa. Clase: Oomycetes (royas blancas, mildius o tizones, hongos acuáticos) Poseen micelio continuo, zoosporas biflageladas formadas dentro de zoosporangios. La espora sexual de resistencia (oospora) es el resultado de la unión de dos gametangios morfológicamente diferentes: anteridio (masculino) y oogonio (femenino). Orden: Saprolengiales: micelio bien desarrollado, zoosporas formadas dentro de zoosporangios cilíndricos, usualmente con varias oosporas en un oogonio. Género: Aphanomyces Orden: Peronosporales: micelio bien desarrollado, inter o intracelular, a menudo con haustorios. Zoosporangios ovales o con forma de limón, en la mayoría de las especies, germinan produciendo zoosporas, pero en algunas germinan directamente produciendo un tubo germinativo. 41

Familia: Pythiaceae: zoosporangios solitarios producidos sobre hifas somáticas ó en el extremo de hifas de crecimiento inderterminado. Saprobios o parásitos no obligados (facultativos) Oogonio de paredes delgadas. Ej. Pyhium, Phytophthora. Familia Peronosporaceae: parásitos obligados (absolutos). Zoosporangios sobre zoosporangióforos de crecimiento determinado. Ej. Plasmopara, Peronospora, Bremia, Pseudoperonospora, Peronosclerospora, Sclerophthora, Sclerospora. Familia Albuginaceae: Parásitos obligados (absolutos). Zoosporangios en cadena. Ej. Albugo.

HONGOS VERDADEROS REINO FUNGI Producen micelio, con paredes celulares de quitina y glucanos, carecen de cloroplastos Phylum Chytridiomycota. Zoosporas con un flagelo posterior simple. Clase Chytridiomycetes. Micelio redondeado o elongado sin paredes transversales. Géneros: Olpidium, Physoderma, Synchytrium Phylum Zygomycota. Esporas asexuales no móviles en esporangios, no produce zoosporas. La espora sexual de resistencia es una zigospora, producida por fusión de dos gametas morfológicamente similares. Clase Zygomycetes. (hongos del pan). Saprofitos o parásitos de plantas, humanos y animales. Orden Mucorales: esporas asexuales no móviles formadas en un esporangio terminal. Géneros: Rhizopus, Choaenophora, Mucor. Orden Glomales: hongos que forman micorrizas vesiculo-arbusculares con raíces, también conocidas como endomicorrizas. Los arbusculos se producen en la raíz del hospedante. Esporas tipo clamidosporas producidas en el suelo raíces o esporocarpos. Géneros: Glomus, Acaulospora, Gigaspora, Scutellospora. Phylum Ascomycota. (Ascomycetes) La mayoría tiene estado sexual (teleomorfo) y asexual (anamorfo). Producen esporas sexuales llamadas ascosporas, generalmente en grupos de 8 dentro de un asca. Producen esporas asexuales (conidios) libres o en fructificaciones asexuales (picnido, acérvulo, etc.). I. Clase Archiascomycetes: es un grupo de hongos diversos difícil de caracterizar. Orden Taphrinales: ascos que emergen de células ascógenas binucleadas. Género: Taphrina. II. Clase Sacharomycetes (levaduras): Ascos desnudos, sin ascocarpos. Hongos en su mayoría unicelulares que se reproducen por brotación. Ej. Géneros Saccharomyces, Galactomyces III. Ascomycetes filamentosos Orden Erysiphales (Oídios). Ascos en cuerpos fructíferos completamente cerrados (cleistotecios). Micelio, conidios y cleistotecios sobre la superficie de las plantas hospedantes. Parásitos obligados. Ej: géneros Blumeria, Erysiphe, Leveillula, Microsphaera, Oidium (solo el anamorfo) Podosphaera, Sphaerotheca, Uncinula. A. Pyrenomycetes. Ascomycetes con peritecio o cleistotcecio en un estroma, inmersos en una mata hifal suelta o libres. Ascos unitunicados.

42

Orden Hypocreales. Estromas de color azul pálido, púrpura o de colores brillantes. Ascos ovoides o cilíndricos con poro apical. Ascosporas esféricas o en forma de agujas, uni o pluricelulares usualmente liberadas con fuerza. Conidios producidos desde conidióforos fialídicos. Pueden producir sustancias tóxicas para el hombre o los animales. Algunos producen reguladores de crecimiento, son antagonistas o parásitos de otros hongos y pueden ser endófitos de cereales y otras gramíneas con el consiguiente riesgo de intoxicación para el ganado. Ej. Géneros Hypocrea, Melanospora, Giberella, Nectria, Claviceps, Epichloe, Balansia. Orden Microascales. Sin estroma. En su mayoría con peritecios y en menor medida, cleistotecios. Ascos globosos u ovoides, delicuescentes. Ascosporas unicelulares. Ej. Géneros Ceratocystis, Monosporascus. Orden Phyllachorales. Peritecios inmersos en estroma, ascas oblongas o cilíndricas, con poro apical y con ascosporas hialinas u oscuras. Ej. Géneros Phyllachora, Glomerella. Orden Ophiostomales. Peritecios sin parálisis. Ascos globosos u ovoides, delicuescentes. Varias especies son dispersadas por Coleópteros. Ej. Género Ophio Orden Diaporthales. Peritecios en estroma que puede ser propio o de tejidos vegetales o de hifas sobre el sustrato. Ascos cilídricos con poro. Ascosporas con uno a varios septos, hialinas a marrones. Ej. Géneros: Diaporthe, Gaeumannomyces, Magnaporthe, Cryphonectria, Leucostoma. Orden Xylariales. Peritecios oscuros, duros, a veces embebidos en estromas. Ascos cilíndricos a subglobosos. Ascosporas de una a pocas células, hialina u oscuras. Ej. Xylaria, Eutypa, Hypoxylon, Rosellinia.

B. Loculoascomycetes. Ascomycetes con ascostroma, producen ascos dentro de lóculos (cavidades) preformadas en un estroma. El ascostroma puede ser unilocular (pseudotecio) o multilocular. Ascos con doble pared. Orden Dothideales. Lóculos sin hifas estériles y se abren por un poro apical. Ascos ovoides a cilíndricos, en fascículos. Ascosporas con una o varias células, hialinas a marrones. Géneros: Mycosphaerella, Elsinoe. Orden Capnodiales. Ascocarpos superficiales, producidos en una mata laxa de hifas oscuras. Género: Capnodium Orden Pleosporales. Ascos rodeados por pseudoparáfisis. Ascostromas variables. Cochliobolus, Pyrenophora, Pleospora, Leptosphaeria, Venturia, Gignardia, Setosphaera

Géneros:

C. Discomycetes: Ascomycetes con apotecio, los ascocarpos tienen forma de copa, plato o almohadilla. Ascos cilindricos u ovoides con paráfisis, ascosporas que se descargan con fuerza. Orden Rhytismales. Ascocarpos negros, esféricos, discoides o elongados y producidos en estroma. Ascos variables. Ascosporas hialinas o marrones, ovoides a filiformes. Géneros: Hypoderma, Lophodermium, Rhytisma. Orden Helothiales. Apotecios con formas de copa o disco. Ascos con los ápices ligeramente engrosados. Géneros: Monilinia, Sclerotinia, Stromatinia, Pseudopeziza, Diplocarpon

D. Deuteromycetes (hongos asexuales o imperfectos). Micelio bien desarrollado, tabicado, ramificado. Reproducción sexual ausente o desconocida. Las esporas asexuales (conidos) formados sobre conidióforos solitarios

43

o agrupados en estructuras especializadas tales como esporodoquio y sinnema, o producidas en fructificaciones conocidas como picnidios y acérvulos.

Phylum Basidiomycota. Esporas sexuales (basidiosporas) producidas externamente sobre basidios. Orden Ustilaginales (Carbones). Basidio contínuo o tabicado, éste es el promicelio de la teliospora. Teliosporas simples o unidas en costras o columnas permaneciendo en el tejido del hospedante o irrumpiendo a través de la epidermis. Fertilización por unión de esporas o hifas compatibles. Solamente producen teliosporas y basidiospras. Géneros: Ustilago, Tilletia, Urocystis, Sporisorium, Sphacelotheca. Orden Uredinales (Royas). Parásitos obligados. Basidio tabicado. Células sexuales llamadas espermacias que fertilizan hifas receptivas especiales en el espermogonio (picnio). Producen varios tipos de esporas: teliosporas, basidiosporas, eciosporas, y urediniosporas. Géneros: Cronartium, Gymnosporangium, Hemileia, Melampsora, Phakopsora, Phragmidium, Puccinia, Uromyces. Orden Exobasidiales. Basidiocarpo ausente. Basidio producido sobre la superficie del tejido parasitado. Género Exobasidium. Orden Ceratobasidiales. Basidiocarpo como una trama, inconspicuo. Basidios sin septos con 4 esterigmas prominentes. Géneros: Athelia, Thanatephorus, Typhula. Orden Agaricales (hongos de sombrero). Basidios sin septos producidos sobre laminillas. Muchos son hongos micorríticos. Géneros: Armillaria, Marasmius, Pleurotus, Pholiota. Orden Aphyllophorales: Basidios sin septos producidos sobre hifas formando un himenio y tapizando las superficies de pequeños poros o tubos. Géneros: Corticium, Heterobasidion, Ganoderma, Postia, Phellinus, Peniophora, Polyporus.

BIBLIOGRAFÍA •

Agrios, G. 2005. Plant Pathology. Fifth Edition. Ac. Press, New York.

44

45

46

47

48

49

TRABAJO PRACTICO Nº5 TECNICAS FITOPATOLOGICAS I OBJETIVOS Conocer los principios y técnicas empleados para el estudio de las causas de las enfermedades de origen parasitario. Adquirir las destrezas necesarias para seleccionar y aplicar las técnicas de laboratorio básicas para el diagnóstico de enfermedades causadas por hongos.

CONTENIDOS Postulados de Koch. Diagnóstico de enfermedades parasitaria. Técnicas básicas para el diagnóstico de hongos.

ACTIVIDADES Analizar y discutir los contenidos tomando como eje las enfermedades tratadas en el TP Nº1. Observar y describir el material a estudiar (signo y síntoma). Seleccionar las técnicas adecuadas para realizar el diagnostico, siguiendo las indicaciones de la guía de actividades.

BIBLIOGRAFÍA • Echandi E. 1971. Manual de laboratorio para fitopatología general. Ed. Herrero Hermanos Sucesores. 59 pp. • Fernández Valiela, M. V. 1969, Introducción a la Fitopatología. Volumenes I, II, III, IV. Ed. Colección Científica INTA. • Jauch, C. 1976. Patología Vegetal. Ed. El Ateneo. 270 pp. • Sarasola, A.A.; Roca de Sarasola, M.A. 1975. Fitopatología. Curso Moderno. Tomo I. Fitopatología GeneralControl. Hemisferio Sur. Buenos Aires. (364 pp.); Tomo II Micosis (374 pp.); Tomo III Bacteriosis-Virosis (222 pp.); Tomo IV. Fisiogénicas – Prácticas en Fitopatología. Hemisferio Sur. Buenos Aires. (285 p.) Hemisferio Sur, Buenos Aires • Marchionato, J. B., 1948.Tratado de fitopatología. Editorial del Colegio. 537 pp.

INTRODUCCIÓN Cuando se está en presencia de una planta enferma, es necesario conocer las causas de esa anormalidad (Etiología), lo que resulta imprescindible para poder establecer estrategias de manejo y/o control. Para estudiar la causa de una enfermedad es necesario utilizar una serie de técnicas. Si bien los pasos para realizar un diagnóstico son comunes para todos los patógenos, cada grupo de ellos requiere de la aplicación de técnicas específicas para su determinación.

1.- POSTULADOS DE KOCH Cuando se sospecha que una enfermedad está producida por un microorganismo, para confirmar el origen 50

de esa enfermedad, se deben cumplir los Postulados de Koch. El cumplimiento de los cuatro postulados es necesario principalmente cuando el agente aislado no ha sido señalado hasta el presente como causante de una enfermedad sobre el vegetal estudiado. De esto se desprende que durante la investigación debe realizarse una exhaustiva revisión bibliográfica. En caso de que el agente ya esté citado sobre el hospedante en estudio, sólo se debe cumplir con los dos primeros.

1. Primer postulado: El microorganismo siempre debe estar asociado con la enfermedad y la misma no debe presentarse sin que el organismo o agente causal esté o haya estado presente. 2. Segundo postulado: El microorganismo en cuestión debe aislarse en cultivo puro y estudiarse sus caracteres específicos. 3. Tercer postulado: Cuando el microorganismo aislado es inoculado deben desarrollarse los síntomas característicos de la enfermedad. 4. Cuarto postulado: El microorganismo debe reaislarse de los tejidos inoculados, cultivarse e identificarse con el original.

Con respecto al segundo postulado, el aislamiento se efectúa en medios de cultivo artificiales. Sin embargo, hay algunos patógenos que son parásitos absolutos, tales como las royas, los oídios, los virus, etc. Para aislarlos deberán utilizarse plantas criadas en condiciones controladas, que pueden ser o no de la misma especie de la que se lo está aislando. Por lo demás les caben exactamente el resto de los postulados.

51

GUIA DE ACTIVIDADES

Se inicia la clase con una descripción muy sucinta del tema y de la guía del práctico, para encuadrar el mismo en el programa del curso y en la práctica, ubicando esta actividad en el marco de la resolución de problemas en Fitopatología. Reflexionar sobre las siguientes cuestiones utilizando la Guía de Trabajos Prácticos: 1. Establecida la importancia del diagnóstico, y recordando la actividad realizada en el primer práctico, qué pasos sigo cuando encuentro los síntomas/signo que estoy observando? (material fresco y fotos de enfermedades causadas por hongos en cultivos de interés). 2. Con sus palabras y conocimientos actuales, utilizando como fuente de información la guía de TTPP, realicen un esquema/protocolo donde estén los pasos que Uds. crean necesarios cumplir para llegar al diagnóstico. Piensen que ese protocolo es lo que ustedes tendrán en la mano para hacer los experimentos en el laboratorio. También lo usarán para saber qué instrumentos y elementos necesitan para hacer el trabajo. 3. Con el protocolo en mano, observen elementos que tienen en la mesada y encuentren la aplicación de cada uno de ellos. 4. Organicen el trabajo. Un alumno/a explica lo que va a hacer, mientras los demás escuchan y hacen aportes. Se llega en común a un protocolo, y a una correcta comprensión del uso de los elementos de la mesada. 5. Realizan en grupos las etapas del TP. 6. ¿Qué resultados esperan obtener? ¿Cómo usarán esos resultados para llegar al diagnóstico? 7. Ya conocen el nombre del agente que han aislado. ¿Están seguros de que es el causal de la enfermedad? (Postulados de Koch) TECNICAS FITOPATOLÓGICAS 1. Visualización del signo: puede realizarse en algunos casos a ojo desnudo o de ser necesario mediante la utilización del microscopio estereoscópico (lupa). En caso de que el signo no esté presente en el momento de recolección del material, puede utilizarse la técnica de la cámara húmeda, que consiste en colocar un trozo del vegetal en condiciones que favorezcan el desarrollo del hongo. Estas condiciones se logran mediante el uso de bolsas de polietileno o campanas de vidrio produciendo un ambiente saturado de humedad que junto a temperaturas moderadas favorecen la aparición al exterior del agente patógeno. 2. Observación microscópica: el microscopio y la lupa se constituyen en elementos básicos para cualquier estudio fitopatológico. Para la observación microscópica de hongos y tejidos parasitados por ellos se debe realizar en primer lugar el montaje de preparados. Para ello se utilizan medios de montaje como el lactofenol de Amann, cuyos componentes son ácido láctico, ácido fénico, glicerina y agua destilada u otros a base de glicerina, que son menos nocivos para el hombre. Cuando se desean observar estructuras hialinas y uniformes que ofrecen muy 52

poco contraste, resulta de gran utilidad el empleo de azul de algodón, el que se agrega al lactofenol de Amann o a la glicerina. La concentración de colorante puede aumentarse o disminuirse según lo requiera la tinción del tejido a observar. Debemos aclarar que cuando se realiza el montaje de preparados en lactofenol se debe calentar a la llama a los efectos de lograr una clarificación, hinchamiento de estructuras plasmolizadas y eliminación de las burbujas de aire que suelen dificultar la observación. Cuando se realizan observaciones "in vivo" para comprobar movimientos de bacterias o zoosporas, el montaje se efectúa en agua destilada. El lactofenol de Amann, la glicerina con azul de algodón y el agua, se utilizan también para montaje de cortes histológicos y de estructuras de los microorganismos provenientes de raspados. Con referencia a los cortes, con los cuales se visualiza el interior de algunos elementos fúngicos, los más elementales pueden efectuarse a mano libre o alzada con navaja en médula de sauco o hinojo. También pueden realizarse los cortes mediante micrótomos, siendo el más recomendable el de congelación (eléctrico o por anhídrido carbónico). Consultar índices de hospedantes, compendios, boletines, libros, páginas web, y demás publicaciones relacionadas que describen e ilustran las enfermedades de un determinado hospedante. A partir del diagnóstico presuntivo se orientarán las técnicas y metodología a desarrollar para arribar al diagnóstico de certeza. 3. Aislamiento y cultivo 3.1. Aislamiento a partir de órganos vegetales: corresponden al 2º Postulado de Koch. Existen diversas técnicas para efectuar aislamientos de patógenos a partir de plantas enfermas, pero el más usado y que de ordinario brinda mayores márgenes de seguridad es el siguiente: se cortan trozos de material con síntomas, cuidando que los mismos correspondan a la zona de transición entre el tejido sano y el enfermo. Los trozos deben ser pequeños (0,5 a 1 cm), los que se desinfectan sumergiéndolos sucesivamente en alcohol etílico al 70º e hipoclorito de sodio al 10 ó 5%, aproximadamente durante uno a dos minutos (según tipo de tejido en estudio). A continuación, se enjuagan transfiriéndolos a una caja de Petri conteniendo agua destilada estéril, en la que pueden permanecer varios minutos. Nunca debe utilizarse la misma caja y agua para más de 4 ó 5 trozos. Luego, previa esterilización de la pinza en la llama, se transfieren a una caja de Petri estéril con el medio de cultivo agar de papa glucosado al 2% (APG) (* ver anexo), colocando entre 4 ó 5 trozos por caja en forma equidistante. Se incuban en estufa a 24-28º C y luego de unos días (3 a 7) se realizan las observaciones y repiques necesarios. 3.2. Aislamiento directo a partir del signo: se toma con una aguja histológica previamente flameada, una porción de micelio, espora o cuerpo fructífero del hongo y se siembra en APG al 2% suplementado con un antibiótico. 53

4. Inoculación: está estrechamente vinculada con el 3º postulado de Koch y corresponde a todos los mecanismos posibles que pueden utilizar los microorganismos para colonizar e infectar los tejidos vegetales. Las diferentes técnicas de inoculación consisten en poner en contacto el inóculo (de concentración conocida) con el órgano del hospedante (hoja, tallo, raíz, etc.) del cual se aisló el patógeno. 4.1. Con suspensión de esporas: consiste en suspender esporas o micelio en agua destilada estéril a la que se le suele agregar un tensioactivo para favorecer el mojado de los tejidos. Luego se pulveriza, rocía o pincela el vegetal o alguna de sus partes con la suspensión de esporas y posteriormente se realiza una cámara húmeda. 4.2. Con depósito directo: una vez desarrollado el patógeno en el medio de cultivo, se desmenuza y se coloca sobre el órgano del vegetal, efectuando o no, previamente, pequeñas lesiones epidérmicas. Luego se realiza una cámara húmeda. 4.3. Inoculación de suelo: consiste en mezclar el sustrato con el medio de cultivo en el que ha desarrollado el patógeno de suelo. 4.4. Por inmersión radicular: consiste en sumergir las raíces de las plántulas a inocular en una suspensión conteniendo una elevada concentración de inóculo por un lapso no inferior a los 15 minutos. Existen también otras técnicas como la del espolvoreo o la del hilo, aunque no son muy utilizadas. 5. Reaislamiento: se procede de la misma manera que la detallada para el aislamiento, pero efectuando el mismo a partir de plantas inoculadas artificialmente. Las características culturales del patógeno deberán corresponderse con las del microorganismo que se inoculó, con lo que se cumplirá con el 4º postulado de Koch.

(*) Anexo Medios de cultivo: los microorganismos fitopatógenos, como hongos y bacterias, pueden ser cultivados en medios artificiales. Estos medios deben reunir los siguientes requisitos: contener los nutrientes esenciales para el desarrollo del microorganismo, tener un pH adecuado y estar estéril. a) Medios convencionales: el medio más empleado en fitopatología para el desarrollo de hongos es el agar de papa glucosado al 2% (APG), cuyos ingredientes son papas peladas y cortadas, glucosa, agar-agar y agua destilada. Además, existen otros medios tales como agar de extractos vegetales, agar avena, medio de Czapek, agar malta, etc. Con referencia al pH debemos señalar que, si bien los hongos en su mayoría pueden desarrollar con pH entre 3 y 9, las bacterias lo hacen en medios neutros o ligeramente alcalinos; por tal motivo con una reacción neutra se compatibilizan los requerimientos de hongos y bacterias. b) Medios diferenciales: en muchas ocasiones, especialmente cuando se efectúan aislamientos de materiales 54

muy contaminados, es necesario separar hongos de bacterias o viceversa. Existen algunos medios que, si bien no tienen efectividad absoluta, suelen dar buenos resultados. i)

Para cultivar bacterias e inhibir hongos: la adición al medio de un colorante del grupo del fenil metano en pequeñas cantidades es suficiente. Se puede usar cristal violeta en una concentración entre 1:50.000 a 1:200.000; de esta manera se evita el desarrollo de hongos al mismo tiempo que posee un efecto bacteriostático para las bacterias Gram +. (1) Para cultivar hongos e inhibir bacterias: la acidificación del medio es por lo general suficiente para evitar el crecimiento de las bacterias sin perjudicar mayormente el de los hongos. De manera práctica se logra con la adición de tres gotas de ácido láctico al 25% por cada 10 ml de medio de cultivo.

55

TRABAJO PRACTICO Nº 6 TÉCNICAS FITOPATOLOGICAS II: BACTERIAS

CONTENIDOS: Diagnóstico, fundamentos y técnicas clásicas, serológicas y moleculares.

OBJETIVOS: - Conocer las estructuras y la fisiología bacteriana y su relación con la patogénesis (ciclo) y su uso en el diagnóstico Planificar y llevar a cabo los pasos necesarios para el diagnóstico de una enfermedad de posible etiología bacteriana.

ACTIVIDADES: 1. Analizar las estructuras y fisiología bacterianas y relacionarla con los métodos de diagnóstico 2. Realizar un esquema de los pasos necesarios para llegar al diagnóstico usando diferentes recursos. 3. Realizarlas, teniendo en cuenta incluir: 3.1. Observación de salida bacteriana 3.2. Aislamiento de bacterias fitopatógenas 3.3. Determinación de bacterias Gram + o - mediante técnica de solubilidad en OHK 3.4. Reacción de hipersensibilidad en tabaco 3.5. Observación de reacciones diferenciales. 4. Comparación de técnicas entre hongos y bacterias.

BIBLIOGRAFIA: • • • • • • •

Klement Z., Rudolph K., Sands D.C. (Eds.), 1990. Methods in Phytobacteriology. Academiai Kiado, Budapest, 568 pp. Llácer G., López M.M., Trapero A., Bello A. (Eds.), 1996. Patología vegetal, tomo1. España: Sociedad Española de Fitopatología. Schaad S. (Ed.), 1988. Laboratory guide for identification of Plant Pathogenic Bacteria. 2 Ed. APS Press, St. Paul, Minnesota, 158 pp. Scortichini M., 1995. Le malattie batteriche delle colture agrarie e delle specie forestali. Edizione Agricole, 436 pp. EPPO Databases - European and Mediterranean Plant Protection https://www.eppo.int/DATABASES/ databases.htm Janse, J.D., 2006. Phytobacteriology, Principles and Practice. Plant Protection Service. Wageningen, The Netherlands. CABI Publishing, 368 pp. Kado, C.I., 2010. Plant Bacteriology. University of California, APS PRESS, 336pp.

56

DIAGNÓSTICO Entre los síntomas causados por las bacterias fitopatógenas encontramos: manchas cloróticas y necróticas en hojas, pecíolos y tallos, muerte de flores, muerte de brotes y ramas, marchitamientos, destrucción del sistema radical, podredumbres blandas, formación de agallas, producción de sarnas o costras, etc (Cuadro 1).

Cuadro 1. Descripción de los Síntomas de los principales géneros de bacterias fitopatógenas Tipo de enfermedad Manchas foliares y en frutos

Síntomas Necrosis en hidroceles. Manchas angulares o alargadas. Manchas necróticas con halo. Clorosis de hojas jóvenes. Desecamiento foliar. Manchas en frutos. Exudados

Tejidos afectados Espacios intercelulares y necrosis del parénquima

Patógenos Pseudomonas y Xanthomonas

Cancros y Marchitamientos en plantas leñosas

Necrosis de la corteza. Marchitamiento o desecamiento de brotes jóvenes. Necrosis de yemas. Marchitamiento Enanismo Podredumbre en anillo Manchas en ojo de pájaro Pudrición blanda de tubérculos, bulbos o rizomas. Pie negro Tumores en cuello y raíz. Tumores en ramas. Hiperproliferación radicular Necrosis eruptivas, rugosas, con costras y suberificadas

Invasión del floema y xilema a través de heridas, yemas, cicatrices foliares, hojas jóvenes y flores. Invasión del xilema y floema

Pseudomonassyringaepv. syringae Erwiniaamylovora

Maceración de la laminilla media y pared celular primaria

Pectobacterium (=Erwiniaspectinolíticas) y algunas Pseudomonas

Estimulación anormal de la división celular y del crecimiento de tejidos meristemáticos. Tejidos más externos epidérmicos, subepidérmicos y parénquimáticos.

Agrobacterias Rhodococcusfascians P.s.pv. savastanoi

Marchitamientos en plantas herbáceas

Podredumbres blandas

Hiperplasia y proliferación

Sarnas

Clavibacter Ralstoniasolanacearum Curtobacterium, ErwiniasyXanthomonas

Streptomyces

Ante la presencia de material vegetal enfermo en el cual se observa este tipo de síntomas es necesario hacer un diagnóstico correcto de la enfermedad con el fin de aplicar las medidas de manejo adecuadas.

57

Para ello es preciso cumplir una serie de pasos que se detallan a continuación: 1) Observación microscópica in vivo 2) Aislamiento 3) Reacción de hipersensibilidad en tabaco: esta reacción se debe a una respuesta de defensa de la planta que ocurre rápidamente frente a un patógeno incompatible (ver técnicas) 4) Inoculación: se realiza para verificar la patogenicidad de la bacteria en cuestión y para cumplir con los postulados de Koch. 5) Solubilidad en KOH (alternativa de la reacción de Gram): el KOH produce la lisis alcalina de la pared celular en las bacterias Gram (-). La pared celular de las bacterias Gram (+) permanece intacta no permitiendo la liberación del ADN. 6) Observación de reacciones bioquímicas específicas. La sistemática de los géneros y especies bacterianos se ha basado tradicionalmente en las características bioquímicas y fisiológicas de los aislamientos bacterianos. La combinación de determinadas reacciones permite establecer la identidad con cierto nivel de precisión (Anexo 1). Existen kits comerciales que simplifican este análisis: * Método BIOLOG: se basa en la capacidad de cada especie o patovar de utilizar distintas fuentes de carbono. El procedimiento consiste en el uso de placas de 96 celdas conteniendo diferentes compuestos carbonados y un indicador de reacción de óxido reducción. Se siembra la cepa en cuestión y si el compuesto de la celda es metabolizado por la bacteria, el tetrazolio en cada celda toma un color púrpura por el cambio en el estado de óxido reducción, reduciéndose en forma irreversible. Los resultados de cada placa son analizados con un programa de computación. * Galerias API: también se basa en el metabolismo bacteriano. Estas “cúpulas” o celdillas en las cuales se siembra la bacteria problema, contienen diversos compuestos que son metabolizados por la bacteria inoculada, durante una incubación de 24 horas a 25ºC, luego de los cual se leen los resultados. 7) Serología: es un método valioso y preciso para el diagnóstico cuando se dispone de sueros específicos. Las técnicas más usadas son inmuno-fluorescencia y ELISA (enzime linked inmunosorbent assay). 8) PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esta técnica que permite amplificar fragmentos del genoma bacteriano, todavía se utiliza sólo para algunas especies de bacterias para las cuales existen primers específicos, por lo cual no es posible usar este método como una técnica de rutina.

58

ACTIVIDADES 1. Liberación de bacterias a partir de tejidos. Con el objeto de determinar si los síntomas de una enfermedad son causados por bacterias, una prueba preliminar consiste en observar si se liberan las mismas a partir de manchas foliares y/o marchitamientos vasculares, cuando estos son lacerados con bisturí. 1.1. Partiendo de lesiones en hojas, tallos o pecíolos se corta una pequeña sección rectangular en la zona límite entre el tejido sano y el afectado. 1.2. Colocar la sección del tejido en una gota de agua destilada entre un porta objetos y un cubre. 1.3. Observar al microscopio buscando la presencia de bacterias, que se manifiesta por un fluido continuo y denso que surge de los vasos seccionados. Asegurarse que el diafragma del microscopio esté lo suficientemente cerrado para incrementar el contraste.

2. Aislamiento de bacterias a partir de tejidos vegetales El aislamiento del patógeno a partir de una muestra vegetal en un medio de cultivo adecuado es el paso previo al uso del método de detección, que es la caracterización fisiológica. El aislamiento del cultivo es aún indispensable para caracterizar ciertas especies bacterianas, constituyendo el primer requisito de los postulados de Koch. El objetivo es obtener colonias de origen común, de una sola célula, las que posteriormente se deberán caracterizar. El método más usado para aislar o purificar bacterias es la técnica de diluciones

3. Aislamientos a partir de lesiones foliares: 3.1. Limpiar el área de trabajo con un desinfectante adecuado. 3.2. Lavar externamente la muestra con agua corriente durante 2 a 3 min, luego desinfectar con alcohol 70% y con hipoclorito de sodio (lavandina al 5%) durante 1 min, enjuagar en agua destilada estéril. Secar con papel absorbente estéril. 3.3. Dilacerar el fragmento en 5 ml de agua destilada estéril. 3.4. Dejar difundir durante 20 minutos. 3.5. Agitar vigorosamente 2-3 minutos. 3.6. Sembrar en estrías placas de Petri con medio de cultivo sólido adecuado a cada caso. 3.7. Incubar a la temperatura óptima de crecimiento. La mayoría de las bacterias fitopatógenas desarrollan entre 26 y 28°C.

59

4. Prueba de solubilidad en KOH (alternativa del Gram) 4.1. Sobre un portaobjetos, colocar una gota de KOH (3% p/v). 4.2. Tomar una ansada de una colonia bacteriana de 24 hs de edad (en fase activa de crecimiento) mediante un palillo estéril y mezclar el cultivo bacteriano en la gota con agitación circular para homogeneizar. 4.3. Levantar el palillo y observar: Las bacterias Gram (-) presentan viscosidad luego de 10-20 segundos pudiéndose visualizar un hilo translúcido. Las Gram (+) se dispersan en la gota sin presentar viscosidad.

5. Reacción de hipersensibilidad en tabaco La reacción de hipersensibilidad (HR) es una respuesta rápida de defensa por parte de la planta frente a patógenos incompatibles. La misma se manifiesta como una necrosis del tejido en el sitio donde se inyectó la solución bacteriana, que se produce en un corto período. Se utiliza para el diagnóstico rápido pues permite identificar las bacterias fitopatógenas entre todas las que desarrollan en una placa. No todas las bacterias fitopatógenas producen HR. A. tumefaciens que produce la agalla de la corona y las especies de Erwinia causantes de podredumbre blanda no la provocan, pero sí la inducen las bacterias de los géneros Pseudomonas, Xanthomonas y las especies de Erwinia que producen marchitamientos. Procedimiento: 5.1. Preparar una suspensión bacteriana en agua estéril de células cultivadas durante 24-48 hs, en una concentración del orden de 108cel/ml. 5.2. Se homogeneiza y se inyecta mediante agujas y jeringas hipodérmicas estériles en la lámina, entre la nervadura media y secundarias del envés de hojas de tabaco bien desarrolladas, constatando que los tejidos se infiltren con la suspensión bacteriana. 5.3. Observar a las 24 y 48 h la necrosis y desecamiento brusco del área inyectada (se observa exclusivamente en el parénquima de la zona infiltrada quedando circunscripta a la misma) y comparar con los síntomas provocados por una reacción compatible.

6. Comparación de técnicas de diagnóstico para hongos y bacterias Observe las dos imágenes que se presentan y responda 6.1. Describa: síntomas y hospedante. 6.2. ¿Observa diferencias o similitudes en ambas? 6.3. ¿Cuál podría ser la etiología de la enfermedad? 6.4. Si sospecha que se trata de una bacteriosis ¿qué pasos seguiría para identificar el agente causal? Esquematice 6.5. Si se tratara de una micosis ¿cuáles serían los pasos que tendría que realizar para identificar el hongo patógeno? Esquematice 6.6. Compare ambos esquemas e identifique las diferencias. 60

61

TRABAJO PRACTICO Nº 7 TÉCNICAS FITOPATOLOGICAS III: VIRUS OBJETIVOS: Adquirir los conceptos y el conocimiento práctico sobre las técnicas de diagnóstico de los virus. Ejercitarse en la selección de estrategias para resolver un problema planteado por una enfermedad en un cultivo: observación y definición de la hipótesis, selección y descripción de las acciones para confirmar la hipótesis,

CONTENIDOS: Métodos de Caracterización e Identificación de virus fitopatógenos Técnicas de diagnóstico

ACTIVIDADES: Observación de síntomas. Determinación de los pasos necesarios para la caracterización y el diagnóstico. Transmisión mecánica a hospedantes diferenciales. Técnica de ELISA Técnica de PCR Resolución de problemas

PROCEDIMIENTOS DIDÁCTICOS: Breve exposición introductoria Ejecución grupal del Trabajo Síntesis escrita del trabajo hecho

BIBLIOGRAFÍA •

Agrios G. 1986. Fitopatología. Ed. Limusa, Méjico. 756pp.

•

C.M.I. / A.A. Descriptions of Plant Viruses

•

Hampton R, Ball E, De Boer. Serological Methods. APS Press. 1990

•

Llácer G., López M.M., Trapero A., Bello A., eds, 1996. Patología vegetal, tomo1. España: Sociedad Española de Fitopatología. Capítulos 6, 7 y 8

•

Fernández Valiela M. 1969. Introducción a la Fitopatología, vol 1. Colección Científica, INTA, 1015 pp.

•

Hull J. 2002. Matthews’s Plant Virology, Elsevier., 835 pp.

62

NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN DE VIRUS El conocimiento de las especies de virus fitopatógenos que existen en la naturaleza, y de las relaciones entre ellos, es uno de los elementos indispensables para llegar al diagnóstico y poder así establecer las mejores estrategias de control de las enfermedades que estos causan. En 2005, el 8º Informe del Comité Internacional de Taxonomía de Virus registró más de 80 géneros de virus fitopatógenos, muchos de los cuales están agrupados dentro de las 18 familias existentes, mientras que aproximadamente 20 géneros no están asignados aún a ninguna familia. En cuanto a la nomenclatura, se han sucedido varias etapas caracterizadas por distintas formas de llamar a los virus. En los comienzos de la virología vegetal, se asignó a cada virus un nombre que derivaba del hospedante donde se lo había encontrado y del síntoma más evidente que causaba en él, debido a que se sabía muy poco del agente causal (por ej. virus del mosaico del tabaco -TMV-). Durante la década del ‘30 se sugiere que el nombre de los virus se forme con el nombre del hospedante, la palabra virus y un número indicando la cantidad de virus ya determinados en ese hospedante (por ej. tobacco virus 1). En 1939, por su parte, se adopta el sistema binomial latino que componía el nombre describiendo el síntoma y el hospedante (por ej. el virus del mosaico del tabaco pasó a llamarse Marmor tabaco). Estas tendencias en la nomenclatura fueron acompañadas por sistemas de clasificación que en su mayoría también se basaban en las características de la enfermedad y en el hospedante afectado. No tenían en cuenta que: (i) un virus puede tener varias razas que producen distintos síntomas en el mismo hospedante, (ii) virus distintos pueden dar síntomas similares en una especie vegetal, (iii) un mismo virus puede producir síntomas distintos en especies distintas, y (iv) una enfermedad puede estar causada por una mezcla de virus no relacionados. Otro obstáculo de importancia decisiva para clasificar a los virus de la misma forma que han sido clasificados los demás organismos es que no se tienen los conocimientos científicos que permitan decidir qué características tienen más jerarquía que otras. De hecho, ninguno de los sistemas de clasificación propuestos antes de los ’60 para los virus de plantas logró ser aceptado por un número importante de virólogos, situación que se repetía en todos los campos de la virología. Los virus eran entonces clasificados dentro de grupos. En 1966 durante el Congreso Internacional de Microbiología que se desarrolló en Moscú se creó el Comité Internacional para la Nomenclatura de Virus, con la misión de establecer las reglas para un ordenamiento taxonómico de los virus, determinando las características que debían ser tenidas en cuenta para la clasificación. Se afianzó con el nombre de Comité Internacional para la Taxonomía de los Virus – sus siglas en inglés son ICTV - y todos los criterios utilizados hoy son acordados por ese organismo. En 1970 el ICTV, entonces ICNV da a conocer una clasificación de los virus en familias y géneros. Mientras que los estudiosos de los virus patógenos de otros organismos se adaptaron rápidamente a este sistema, los especialistas en virus fitopatógenos se aferraron al sistema de grupos. Las excepciones estuvieron dadas por la 63

clasificación temprana de dos géneros dentro de familias que incluyen virus patógenos de animales: género FITORHEOVIRUS (Ej. virus causante del mal de Río Cuarto) en la familia Rheoviridae y género FITORHABDOVIRUS (Ej. lettuce necrotic yellows virus, virus del amarillamiento necrótico de la lechuga) en la familia Rhabdoviridae. En el año 1991 se crea el género TOSPOVIRUS a partir del Grupo del mismo nombre, y se lo ubica dentro de la familia de los Bunyaviridae que abarca otros géneros de virus patógenos de insectos y animales (Ej. hantavirus). Desde 1995, a partir de los antiguos grupos, se han establecido el resto de las familias. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, aún quedan géneros que no han podido ser asignados a ninguna familia. Si bien el conocimiento de las secuencias nucleotídicas del genoma viral clarifica la sistemática, toda clasificación de virus necesita considerar también sus caracteres fenotípicos. Actualmente, los siguientes criterios son tenidos en cuenta para la clasificación de los virus: (i) propiedades del ácido nucleico, (ii) características de la o las proteínas virales, (iii) estructura de la partícula viral, (iv) propiedades fisicoquímicas de la partícula viral, (v) relaciones serológicas, (vi) formas de transmisión, y (vi) actividad en las plantas. En cuanto a la nomenclatura, en la actualidad los virus se conocen con el nombre en inglés, compuesto por el síntoma más característico, el hospedante donde se lo encontró por primera vez y la palabra virus. De este nombre se forma el acrónimo que se mantiene en todos los idiomas (por ej. TMV, acrónimo de Tobacco Mosaic Virus). Esta forma convive con otra, en la cual la palabra virus se reemplaza por el nombre del género: Tobacco mosaic

tobamovirus

ESPECIE

GENERO

Nuestra opción es nombrar los virus con el nombre en castellano y sus iniciales en inglés: por ejemplo: “Virus del mosaico del tabaco TMV”; “Virus de la peste negra del tomate TSWV”, etc. A continuación se muestran ejemplos de especies de virus, mostrando cómo se forma el nombre de los géneros: ALFAlfa MOsaic Virus – ALFAMOVIRUS

CAULIflower MOsaic Virus - CAULIMOVIRUS

Icosaedric LAbile Ringspot Virus – ILARVIRUS

TOBAcco MOsaic Virus - TOBAMOVIRUS

TOmato SPOtted Wilt Virus – TOSPOVIRUS

POTato Virus X - POTEXVIRUS X

POTato Virus Y - POTYVIRUS Y

TECNICAS DE DIAGNÓSTICO DE VIRUS 1 - Transmisión Mecánica La transmisión mecánica experimental es esencial cuando el objetivo es estudiar el rango de hospedantes de un virus, así como para muchos otros estudios. De esta manera pueden transmitirse aproximadamente la mitad de los virus que se conocen hasta el momento. Esta técnica consiste en introducir savia de una planta enferma en una 64

sana. Cuando se frota el tejido de esta última, se producen abrasiones minúsculas por la presión mecánica y las partículas virales de la savia infectada toman contacto con el citoplasma de las células de la planta sana. En el campo, la transmisión mecánica puede ser producida mientras se efectúan prácticas culturales, como la poda, el desbrote, el trasplante, etc., pero sólo tiene importancia en el caso de virus muy estables, como el virus del mosaico del tabaco (TMV), del mosaico del tomate (ToMV) y virus X de la papa (PVX). Se consideran virus muy estables aquellos que conservan su capacidad de infectar al hospedante luego de ser sometidos a temperaturas y diluciones altas y de pasar largos períodos fuera de la planta.

Procedimiento: 1. Lávese las manos con cuidado con jabón y agua, para eliminar cualquier virus contaminante que pueda tener en ellas (los fumadores pueden llevar TMV). 2. Espolvoree carborundum fino sobre las hojas a inocular. 3. Corte hojas tiernas y con síntomas de una planta enferma y macérelas en un mortero con tampón fosfato 0,2 M, pH 7 (para cada virus existe un tampón adecuado por su composición, pH y Molaridad, así como por el agregado de otras sustancias, antioxidantes, inhibidoras, etc.). 4. Sature su dedo índice o una espátula con la savia infectada y páselo suavemente sobre las hojas de una planta sana previamente tratada con el abrasivo. Sostenga las hojas con la otra mano mientras las inocula. No pase el dedo con una fuerza excesiva, para no dañar demasiado el tejido 5. Rotule las plantas con los datos de fuente de inóculo y fecha. Marque las hojas inoculadas. 6. Lave las hojas inoculadas con agua corriente. Coloque las plantas inoculadas en un invernáculo en condiciones de temperatura y luz controladas. 7. Lávese las manos luego de la inoculación. 8. Realice observaciones periódicas de las plantas y registre el tipo de síntoma y el momento de aparición. 2 - Identificación de un virus desconocido por los síntomas en hospedantes diferenciales. La identidad de un virus se puede determinar de diversas maneras. Una de ellas es utilizando un set de hospedantes diferenciales. Se procede a inocular mecánicamente un virus a una serie de especies seleccionadas que responden con síntomas específicos al producirse la enfermedad. La selección de las especies del set se realiza teniendo en cuenta la especie en que se observa la enfermedad, los síntomas observados en la planta enferma, y los registros que sobre este tema existen en la bibliografía. En base al tipo de síntoma registrado en cada especie se establece identidad del agente viral Procedimiento: 1. Inocular las plantas seleccionadas como se describió en Transmisión Mecánica. 2. A partir de los 3 días, observar las plantas a intervalos de 6-7 días y registrar los síntomas en cada especie. Observar si son lesiones locales o síntomas sistémicos. 3. Compare los síntomas registrados con los característicos que cita la bibliografía. 65

Reacción de hospedantes diferenciales frente a virus

Especie Capsicum annum Chenopodium quinoa Datura stramonium Nicotiana tabacum cv. Samsum Nicotiana glutinosa Nicotiana rustica Petunia hybrida

Locales l.l.n. l.l.n. p.p./n. l.l.c.

TSWV Sistémicos mo.def. n. mo./def.

l.l.n. l.l.c./l.l.n. l.l.n

Locales l.l.n. l.l.n. l.l.n.

def./m. def./mo. -

Referencias: a.n.: anillos necróticos d.c.: dibujos cloróticos l.l.c.: lesiones locales cloróticas p.p.: lesiones en forma de punto mo.: mosaico m.: muerte de la planta

TMV Sistémicos mo. mo.

l.l.n. l.l.n. l.l.n.

-

Locales l.l.c. a.n.

CMV Sistémicos mo. d.c. mo./def./d.c. mo./def.

-

mo./def. mo./def. mo.

l.l.n.: lesiones locales necróticas def.: deformación foliar n.: necrosis

3 - Identificación de Virus por Serología – ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Esta técnica se desarrolló a partir de dos hallazgos: (i) que la unión covalente de una molécula de anticuerpo a una enzima conserva la inmuno-especificidad del anticuerpo y el poder catalítico de la enzima, y (ii) que las moléculas de proteínas (anticuerpos) se pegan de manera estable a las superficies de poliestireno. La técnica consiste en disponer sucesivas “capas” de reactivos, que culminan en la hidrólisis enzimática de un sustrato que pasa de sustancia incolora a coloreada y cuya intensidad de color se puede medir en un espectrofotómetro. Es una prueba sensible, rápida y relativamente económica que se usa también para el diagnóstico de varios hongos y bacterias. A continuación, se describe el procedimiento para la técnica de ELISA Double Antibody Sandwich (DAS-ELISA), la forma más usada para virus fitopatógenos: 1. Colocar en cada celdilla 150-200 l de antisuero diluido en buffer de cubierta. La dilución se establece según el marbete o una prueba de calibración. Incubar 4 hs a 37°C 2. Lavar 3 veces con buffer fosfato salino (PBS) y 0,05% Tween 20. 3. Agregar la muestra suspendida en buffer PBS (1:10 P:V) con el agregado de 3% leche descremada. Incubar toda la noche a 4°C. 4. Lavar como en 2. 5. Agregar el antisuero conjugado a la fosfatasa alcalina, en una concentración según el marbete o una prueba de calibración, en el mismo buffer que la muestra. Incubar 4 horas a 37°C. 6. Lavar como en 2. 7. Agregar el sustrato de la fosfatasa alcalina (p-nitrofenil fosfato) diluido en buffer con dietanolamina a una concentración de entre 0,6 y 1 mg mL-1. Esperar la aparición de color amarillo en los testigos positivos y leer en espectrofotómetro a longitud de onda de 405 nm. Se considerará positivo todo valor igual o superior al triple del promedio de los valores de los testigos negativos 66

Figura - Esquema de la técnica DAS-ELISA (Double Antibody Sándwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

4 – Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y electroforesis submarina La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite aislar un segmento de ADN muy específico de la vasta cantidad de material genético. La identificación de la presencia o no de determinado fragmento de ADN específico de un patógeno (PCR especie-específica) o la secuencia de nucleótidos de un determinado gen (obtenida por secuenciamiento de productos de PCR) pueden ser utilizados con fines diagnósticos. Dado que estos segmentos de ADN constituyen solo una pequeña parte del genoma, se necesitan muchas copias para tener suficiente para trabajar con ellos. La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, puede generar 100 mil millones de copias idénticas de una secuencia de ADN específica en pocas horas, utilizando solamente un microtubo, algunos reactivos simples y una fuente de calor. Para realizar una reacción de PCR se necesita partir de ADN que haya sido aislado de algunas células del organismo que se desea identificar o del vegetal enfermo. Como el propósito de la PCR es aumentar el número de copias, no es necesaria una gran cantidad de ADN para iniciar la reacción. El procedimiento para realizar una PCR se detalla a continuación: 1. Colocar una alícuota del ADN extraído en un microtubo para PCR. La PCR se realiza calentando y enfriando la solución numerosas veces por lo que estos microtubos están diseñados para permitir una distribución del calor homogénea. 2. Añadir los primers o cebadores al microtubo. Los primers son cadenas cortas de ácido nucleico (oligonucleótidos) que sirven como punto de partida para la replicación del ADN. Su secuencia de 67

bases es complementaria a alguno de los extremos de la porción del fragmento de ADN que se quiere aislar y actúa como punto de inicio para la adición de nucleótidos con el fin de copiar dicho fragmento. Dada su alta especificidad, son herramientas poderosas para copiar secuencias de ADN muy específicas. 3. Añadir nucleótidos al microtubo. Los nucleótidos son las bases nitrogenadas (adeninas, citosinas, guaninas y timinas) que conforman el ADN y que serán usados como bloques de construcción para crear miles de millones de copias del fragmento deseado. 4. Añadir la ADN-polimerasa al microtubo. La ADN-polimerasa lee la secuencia del fragmento y añade los nucleótidos complementarios para crear las copias. Las ADN-polimerasas actualmente utilizadas han sido seleccionadas para soportar las altas temperaturas de la PCR.

Una vez que se han añadido todos los componentes de la reacción al microtubo, se lo coloca en un termociclador. Esta máquina tiene la capacidad de calentar y enfriar con precisión el contenido del microtubo por períodos de tiempo determinados durante el proceso de copia de los fragmentos. Estos cambios precisos de temperatura son cruciales para el buen funcionamiento de la PCR. Dentro del microtubo, se repite la siguiente serie de pasos durante aproximadamente 30 ciclos: 1. Desnaturalización: el termociclador se calienta hasta los 95°C. A esta temperatura la doble cadena del ADN se separa, creando dos moléculas de cadena simple. 2. Anclaje o annealing: el termociclador baja la temperatura hasta valores cercanos a los 50°C. A esta temperatura las moléculas de ADN de cadena simple tienden a parearse. Sin embargo, al haber muchas más copias de los primers que cadenas de ADN en el microtubo, estos rápidamente se unen a la secuencia objetivo impidiendo que las hebras simples vuelvan a juntarse. 3. Extensión: el termociclador vuelve a subir la temperatura hasta los 72°C, que es la temperatura óptima de funcionamiento de la ADN-polimerasa. Cuando la enzima localiza un primer pegado a una hebra de cadena simple de ADN comienza a añadir los nucleótidos complementarios a esta cadena y continúa haciéndolo hasta que llega al final de la hebra.

Al final del tercer ciclo comienzan a aparecer las primeras copias del producto de reacción deseado, una cadena corta de ADN que comienza y termina con la secuencia de los primers utilizados. A pesar de que en este momento solo hay dos copias del fragmento deseado por cada copia de ADN de partida, con la continuación de los ciclos su número se incrementa hasta que se convierten en mayoría. Luego de 30 ciclos se habrán generado más de mil millones de fragmentos del objetivo. Una vez que la PCR ha finalizado es necesario visualizar el resultado de la amplificación. Para ello se utiliza la electroforesis submarina en geles de agarosa. Esta técnica permite ordenar cadenas de ADN y otras moléculas como proteínas de acuerdo con su longitud. La electroforesis permite separar las moléculas en función de su movilidad en un campo eléctrico. Los fragmentos cortos de ADN se mueven entre los poros más rápidamente que los largos y después de un tiempo de exposición a una corriente eléctrica se habrán alejado más del sitio de partida que los fragmentos más largos. Los fragmentos de ADN de igual longitud se habrán desplazado a la misma velocidad por lo que acabarán agrupados juntos. 68

La agarosa es un producto natural que se extrae de algunas algas y que forma una matriz inerte que “filtra” las moléculas de ADN en función de la dificultad que estas encuentran para moverse entre los poros que se generan en su interior. Los geles se preparan utilizando un buffer salino que permita que las cargas eléctricas fluyan dentro del gel. Para someterlo a un campo eléctrico, el gel se coloca en una cuba para electroforesis y se sumerge en buffer salino que conducirá la corriente eléctrica de un extremo al otro del gel e impedirá que el mismo se deseque. Los productos de PCR se siembran en el gel utilizando pequeños pocillos creados en un extremo del mismo para este fin. Un estándar de ADN de tamaño conocido se siembra simultáneamente. Este estándar servirá de referencia para estimar el tamaño de las cadenas de ADN en las muestras a analizar. Durante la electroforesis el gel es sometido a una carga negativa en el extremo sembrado del gel y positiva en el extremo opuesto. El ADN es una molécula cargada negativamente por lo que será repelida por la carga negativa y se verá forzada a moverse por la matriz de agarosa. Una vez que finaliza la corrida electroforética el gel se tiñe con un intercalante (el bromuro de etidio es el más comúnmente utilizado) que permitirá visualizar los agrupamientos de cadenas de ADN bajo luz ultravioleta en forma de bandas fluorescentes. La longitud aproximada de los fragmentos de ADN presentes en los productos de PCR podrá ser estimada por comparación con las bandas producidas por el estándar de longitud conocida.

5 - Resolución de Problemas Observe la planta o la foto que se le presenta. Defina el hospedante y describa los síntomas. 1. Determine si existen datos que necesitaría conocer y no están a la vista. Señale cómo resolvería esta situación. 2. Recurra a la bibliografía o al Anexo 1 y establezca una hipótesis sobre la etiología de los síntomas. 3. ¿Qué pasos seguiría para llegar al diagnóstico de esta enfermedad? 4. ¿Qué elementos necesitaría para desarrollar las técnicas elegidas? 5. En el caso de los hospedantes diferenciales: cuál es la cantidad mínima de especies necesarias en este caso.

Anexo I: virus que afectan al tomate en La Plata y reacción de plantas indicadoras Virus de mosaico del tabaco - TMV GRUPO : Tobamovirus HOSPEDANTES : tomate, pimiento, muchas otras especies SINTOMAS : mosaico ( verde claro o amarillo), deformación de folíolos hasta hoja de helecho, necrosis de brotes apicales, enanismo, frutos con manchas herrumbrosas TRANSMISION : por jugos, presente en semilla sólo en cubierta o en endosperma

Tomato spotted wilt virus - TSWV GRUPO : Tospovirus HOSPEDANTES : polífago 69

SINTOMAS : mosaico, clorosis, bronceado de hojas y tallos, necrosis de brotes, color morado sobre todo en el envez de los folíolos, deformación, reducción de tamaño y abarquillamiento de los folíolos, enanismo, anillos cloróticos en frutos TRANSMISION : por jugos, por insectos - trips, de manera persistente Cucumber Mosaic Virus - CMV GRUPO: Cucumovirus HOSPEDANTES: polífago, tomate, pimiento, espinaca, cucúrbitáceas. SINTOMAS: mosaico, deformación de folíolos, que puede ser muy severa, con reducción casi total de la lámina. TRANSMISION: por jugos, por insectos, áfidos de manera no persistente. Bibliografía • Büchen-Osmond Cornelia, The Universal Virus Database of the International Committee on Taxonomy of Viruses. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/index.htm • C.M. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger, and L.A. Ball (eds) Virus Taxonomy: The Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, 1162 pp. (2005) Elsevier. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm • Gibbs A.J. 2003. Viral nomenclature, Where next? Arch.Virol. 148:1645-1653 • Hull R. 2001. Matthews Plant Virology. Elsevier ed. • Plant Virus Online, VIDE database, URL: http://image.fs.uidaho.edu/vide/genindex.htm (Brunt, A., K. Crabtree, M. Dallwitz, A. Gibbs, L. Watson and E. Zurcher. eds. 1996). • Laboratorio Virtual, Centro de Enseñanza de Ciencia Genética de la Universidad de Utah, URL: http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/

70

TRABAJO PRACTICO Nº8: ROYAS Y CARBONES CONTENIDOS Caracterización e importancia de las royas. Síntomas y signo. Sistemática. Royas autoicas y heteroicas. Ciclo biológico.

ACTIVIDADES Observar síntomas y signos en material verde y herborizado. Observar al microscopio picnios, ecios, urediniosoros y teliosoros. Observar al microscopio teliosporas de distintos géneros. Interpretar ciclos biológicos de royas.

BIBLIOGRAFIA •

Alexopoulos, C.J., Introducción a la Micología.

•

Fernandez Valiela, M.V., Introducción a la Fitopatología.

•

Lindquist, J.C., Royas de la República Argentina y Zonas Limítrofes.

•

Sarasola, A. y M. Sarasola, Fitopatología (II).

Las royas son enfermedades que se caracterizan por presentar sobre diversos órganos del hospedante, soros pulverulentos en forma de pústulas, de colores diversos, que constituyen el signo de las mismas.

Los síntomas que presentan las plantas afectadas son generalmente de tipo hipoplásico, como la mayoría de los parásitos absolutos (clorosis, enanismos, disminución de rendimiento, etc.), aunque en algunas excepciones se producen síntomas hiperplásicos (roya del ceibo: Ravenelia platensis). Existen los hospedantes dentro de: cereales, forrajeras, frutales, forestales, hortalizas, ornamentales, industriales, etc. Las royas son ocasionadas por un grupo de hongos pertenecientes a la Subdivisión Basidiomycotina, Clase Teliomycetes, Orden Uredinales, caracterizado éste por la presencia de teliosporas con ubicación terminal en el micelio, las que al germinar producen un basidio o epibasidio tritabicado el cual soporta mediante esterigmas

71

laterales a las basidiosporas o esporidias, que son expulsadas con fuerza a la madurez. Estas tres características sirven para diferenciarlo del Orden Ustilaginales (productores éstos de los carbones).

El Orden Uredinales comprende desde nuestro punto de vista, dos Familias:

1. Teliosporas pediceladas, libres o unidas de diferentes maneras, pero nunca formando costras o estratos ....................................................................................................................................... Familia Pucciniaceae 1.1. Teliosporas unicelulares 1.1.1.Libres ................................................................................................................................Género Uromyces 1.1.2.Reunidas en capítulos .............................................................................................. Género Ravenelia 1.2. Teliosporas bicelulares 1.2.1.Libres ....................................................................................................................... Género Puccinia 1.2.2.Englobadas en estructura gelatinosa .......................................................... Género Gymnosporangium 1.2.3.Pedicelos reunidos en fascículos .......................................................................... Género Transzchelia 1.3. Teliosporas multicelulares ......................................................................................... Género Phragmidium

2. Teliosporas sésiles, unidas lateralmente formando costras, estratos o columnas ............ Familia Melampsoraceae 2.1. Teliosporas unicelulares 2.1.1.Unidas formando estratos o costras de una espora de profundidad ......................... Género Melampsora 2.1.2.Unidas formando estratos o costras de varias esporas de profundidad ......................Género Phakopsora 2.1.3.Unidas formando columnas .......................................................................................... Género Cronartium

Estos hongos son parásitos absolutos (= obligados), tienen micelio ramificado, intercelular, penetrando a las células mediante haustorios. Poseen un ciclo de vida muy complejo, a lo largo del cual se presentan varios estados esporales en diversas fructificaciones (polimorfismo), configurando cada una de ellas un estado del parásito. Estos son: 0 - Estado picniospórico I - Estado eciospórico II - Estado urediniospórico III- Estado teliospórico IV - Estado basidiospórico

Cuando a lo largo del ciclo evolutivo del patógeno se cumplen los estados enunciados, tendremos una roya de ciclo completo. Esto no siempre es así, ya que se conocen numerosas royas que carecen de uno o más de estos estados, no pudiendo en ningún caso faltar el teliospórico. Estas últimas se conocen como de ciclo incompleto. 72

Los 5 estados pueden desarrollarse sobre hospedantes de una misma familia, por lo que se denomina roya autoica, por ejemplo: roya del lino (Melampsora lini); roya del girasol (Puccinia helianthi); roya del haba (Uromyces vicia-fabae); etc. En otros casos, algunos estados como el 0 y I transcurren sobre un hospedante (llamado hospedante alternativo o intermediario) y otros, II y III, sobre otro perteneciente a una familia totalmente distinta a la de la anterior (llamado hospedante principal), en estos casos se trata de una roya heteroica. Son ejemplos las royas de los cereales (Puccinia graminis, P. recondita, P. striiformis, etc.); la de los álamos (Melampsora larici-populina); la de los frutales de carozo (Transzchelia discolor); etc. Estado picniospórico (0) Se caracteriza por presentar fructificaciones denominadas picnios, ubicadas generalmente en el haz de las hojas, más o menos globosas, ostioladas, subcuticulares o subepidérmicas, de colores amarillento o rojizo brillante. En su interior se producen esporas denominadas picniosporas, muy pequeñas, que son expulsadas en un exudado dulce que se aglutina en el ostíolo, sostenidas por las perífisis, que son células rígidas a maneras de pelos o leznas. Además, emergen al exterior del picnio filamentos más largos que los anteriores, flexuosos, que son las hifas receptivas o tricógines, cuya función es la de recepcionar a la picniospora compatible.

Estado eciospórico (I) En correspondencia con los picnios, pero generalmente en el envés de las hojas, aparecen fructificaciones en forma de copa alargada, de color amarillento, denominadas ecios. Haciendo un corte, se observa una membrana con células poligonales denominada peridio. En el interior se producen esporas amarillentas, eciosporas, dispuestas en cadena, que por presión rompen el peridio para quedar en libertad y producir infecciones.

Estado urediniospórico (II) Sus fructificaciones, los urediniosoros, son típicos por su aspecto herrumbroso del que derivó el nombre de roya. Se trata de pústulas pulverulentas, errumpentes, de colores que van del amarillo al pardo, en las que se encuentran las urediniosporas, que son unicelulares, de forma variada según las especies, con episporio espinulescente o verrugoso, con poros germinativos y soportadas por pedicelos. Son las encargadas de propagar la enfermedad ayudadas eficazmente por el viento.

Estado teliospórico (III) Sus fructificaciones, los teliosoros, son pústulas semejantes a las anteriores, pero de color oscuro (pardo o negro), que, a diferencia de aquellas, generalmente están cubiertas por la epidermis. En ellas se hallan las esporas de resistencia, denominadas teliosporas. Estas pueden ser uni, bi o pluricelulares, de membranas espesadas, con poros germinativos, lisas o espinulescentes, pediceladas o no.

73

Estado basidiospórico (IV) Se origina por la germinación de las teliosporas, que producen un basidio semejante a un tubo germinativo, corto y grueso, tritabicado y con esterigmas laterales, uno por célula, que soportan a las basidiosporas, que serán las encargadas de producir las infecciones que originarán los picnios.

CICLO BIOLOGICO (Ver figura) Consideraremos el de una roya heteroica y de ciclo completo, la Roya Negra o del Tallo de los Cereales (Puccinia graminis), que desarrolla su ciclo en forma alternativa en gramíneas (estados II y III) y Berberis vulgaris o agracejo (estados 0 y I).

Cuando el cultivo de cereal madura, se forman las teliosporas. En cada célula binucleda de la misma se produce la fusión de esos dos núcleos (cariogamia) con recombinación de material genético. Estas pasan en el rastrojo la época adversa y a comienzos de la estación favorable germinan produciendo un epibasidio al que migra el 74

núcleo diploide. En este momento se verifica una división reduccional, meiosis, que como resultado origina cuatro núcleos haploides y polarizados (2 plus y 2 minus). En este epibasidio tritabicado se forman cuatro esterigmas, sobre los que se ubican los cuatro núcleos formados, rodeados de citoplasma y con una tenue membrana. Son las basidiosporas o esporidias (2 plus y 2 minus). Estas basidiosporas a su madurez son expulsadas con fuerza (únicas con liberación activa en el ciclo) y las que logran alcanzar hojas tiernas de agracejo germinan emitiendo un tubo que ingresa directamente a través de la cutícula (únicas con penetración activa en el ciclo), dando lugar a los picnios en dicho hospedante. Cada picnio es del mismo signo que el de la basidiospora que lo originó y sus células y picniosporas, monocarióticas haploides. Las picniosporas son transportadas por los insectos, que son atraídos por el néctar que secretan los picnios. De esta manera, algunas picniosporas de signo minus, por ejemplo, pueden ser depositadas en las hifas receptivas o tricógines de un picnio de signo plus. A través de esta hifa penetran el núcleo y citoplasma de la picniospora, trasladándose hacia su base y alcanzar la "célula madre del ecio", momento en que se restablece la condición dicariótica del hongo (dicariótico haploide) y a partir de esa célula por divisiones sincrónicas sucesivas se forma el ecio con sus eciosporas. Las eciosporas son, como dijimos, dicarióticas (un núcleo plus y otro minus) y una vez liberadas ya no pueden infectar al agracejo, pero si a las gramíneas, las que son infectadas por los tubos germinativos que penetran por los estomas. Al cabo de una semana, aproximadamente, se forman los urediniosoros. Las urediniosporas formadas son dicarióticas e infectarán repetidamente al cultivo de las gramíneas. En condiciones ambientales favorables el período de incubación es de una semana y de mantenerse tales características pueden suscitarse 4 ó 5 oleadas de urediniosporas, con el riesgo de producirse una epifitia. Cuando el vegetal concluye su ciclo, el hongo cesa de producir urediniosporas (probablemente por falta de nutrientes esenciales) y comienza a formar teliosoros. Las teliosporas, en este género, son bicelulares y cada célula posee dos núcleos (uno plus y otro minus), tal como fuera mencionado al principio, con lo que se cierra el ciclo.

Ciclo biológico de la Roya ampollada del Pino Blanco

(de: http://www.forestpathology.org/rust.html ) 75

Causada por Cronartium spp., es una de las royas más difundidas en pino en el hemisferio Norte. Causa cancros perennes, alargados en tallos y ramas. Es una roya heteroica, que se desarrolla en Pino blanco y en Grosellero (Ribes sp). Las basidiosporas germinan y estos tubos entran en las agujas de pino por los estomas. Allí se puede ver una pequeña mancha clorótica en el lugar de la infección. Luego el micelio se desarrolla y coloniza la corteza, donde forma los cancros.

ROYAS DE LOS CEREALES • • • • • •

Roya negra o del tallo y la vaina del trigo – Puccinia graminis f.sp. tritici Roya de la hoja del trigo – Puccinia triticina (= P. recondita) Roya amarilla o estriada del trigo - Puccinia striiformis Roya amarilla de la avena – Puccinia coronata Roya del maíz – Puccinia sorghi Roya de cebada – Puccnia hordei

ROYA NEGRA O DEL TALLO Y LA VAINA DEL TRIGO – Puccinia graminis f.sp. tritici Es una roya importante y una de las más estudiadas. Es responsable de grandes pérdidas económicas en el mundo; en nuestro país durante la campaña 1949/50 se produjo una epidemia que ocasionó mermas de aproximadamente un 30% de la producción. Es una roya heteroica en la cual el hospedante principal son la Gramíneas y el hospedante alternativo o intermediario es el Berberis vulgaris (agracejo). En nuestro país se comporta como de ciclo incompleto dado que no se encuentra el hospedante alternativo. Difusión: Mundial. Hospedantes: Trigo, centeno, avena, Agrostis spp., Poa spp., pasto ovillo, rye-grass, cebadilla, etc. Síntomas: Es la roya más tardía de los cereales, se presenta en el momento de la espigazón. Afecta preferentemente tallo y vainas foliáceas, pudiendo la lámina y toda la parte aérea ante condiciones ambientales muy favorables. Sobre los órganos afectados se observan manchas cloróticas en correspondencia con pústulas herrumbrosas, urediniosoros, recubiertas por la epidermis en principio para luego romperla dejando escapar entonces un polvillo amarillo pardusco constituido por las urediniosporas. Posteriormente al lado de las pústulas señaladas aparecen otras de color negro, que también rompen la epidermis, pero su contenido no se desprende. Son los teliosoros con las teliosporas. Etiología: Puccinia graminis f.sp. tritici. Presenta urediniosporas oblongas o elipsoidales, pediceladas, unicelulares, color amarillo oscuro o anaranjado, episporio espinulescente y 4 poros germinativos a nivel ecuatorial, que al germinar emiten un tubo que será el encargado de originar el micelio infectivo luego luego de haber penetrado por los estomas. Las teliosporas son pediceladas, color castaño oscuro, con episporio liso, bicelulares con la célula basal alargada y la apical engrosada con el extremo agudo. Las teliosporas en el soro no presentan paráfisis. Ciclo biológico: Ver en INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LAS ROYAS Penetración: Por los estomas. Infección: El micelio desarrolla por los espacios intercelulares. 76

Incubación: 12-15 días. Propagación: Se verifica a través de las urediniosporas cuando el inóculo proviene del cereal u otras gramíneas. En lugares donde existe el hospedante alternativo, Berberis vulgaris, la infección primaria la realizan las eciosporas que se forman sobre el mismo. Perpetuación: Las esporas capacitadas para ello son las teliosporas, las que una vez transcurrido el período desfavorable germinan originando las basidiosporas que infectarán al hospedante intermediario, permidiendo así el reinicio del ciclo. En nuestro país al no existir el hospedante alternativo, esta roya no muestra los estados picniospórico y eciospórico. En este caso son las urediniosporas las encargadas de perpetuar a la especie mediante infecciones estivales de gramíneas susceptibles y plantas de cereales voluntarias. Condiciones predisponentes: Requiere una alta humedad relativa y temperaturas moderadas (superiores a 20°C). Daños: Provoca mermas de rendimiento y calidad de los cereales. Especialización fisiológica: Presenta una elevada especialización que se manifiesta por la existencia de variedades o formas especiales que infectarán distintos géneros de hospedantes: Puccinia graminis f. sp. avenae (avena), Puccinia graminis f. sp. dactylis, Puccinia graminis f. sp. lolii, Puccinia graminis f. sp. poae, Puccinia graminis f. sp. secalis (centeno, cebada), Puccinia graminis f. sp. tritici (trigo, cebada). A su vez las variedades presentan otra especialización dada por las razas que se diferencian por su acción patogénica sobre los distintos cultivares de las gramíneas. El número de razas asciende en el mundo a más 300, en nuestro país se presentan solo cinco: 11, 14, 15, 17 y 42. Control: Variedades resistentes, fungicidas.

ROYA DE LA HOJA DEL TRIGO – ROYA ANARANJADA Es la roya más común y difundida de los cereales. A pesar de presentarse todos los años pocas veces ha tenido carácter de epidemia. Es una roya heteroica heteroica en la cual el hospedante principal son la Gramíneas y los hospedantes alternativos o intermediarios son especies de los géneros Thalictrum, Clematis y Anchusa. En nuestro país se comporta como de ciclo incompleto dado que no se encuentra el hospedante alternativo. Difusión: Tiene difusión mundial. En nuestro país predomina en la región central y norte de la zona cerealera. Hospedantes: Trigo, centeno, cebada y algunas gramíneas silvestres. Síntomas: Es una roya temprana que se presenta en el estado de macollaje (2 ó 3 hojas). Afecta principalmente a las hojas en las que se observan manchas cloróticas que se corresponden con pústulas anaranjadas, dispersas, errumpentes (urediniosoros). En casos de ataques graves la infección puede progresar hacia vainas, tallos y espigas. A esas pústulas las suceden otras de color negro, cubiertas siempre por la epidermis (teliosoros). Etiología: Puccinia triticina (= P. recondita). Las urediniosporas son subglobosas, pediceladas, unicelulares, color anaranjado o castaño, episporio espinulescente, con 8-10 poros germinativos dispersos. Las teliosporas son oblongo-clavuladas , brevemente pediceladas, pardo oscuras, episporio liso, bicelulares con la célula superior de ápice oblícuo y más o menos obtuso, con paráfisis. Penetración: Similar a P. graminis 77

Infección: Similar a P. graminis Incubación: Similar a P. graminis Propagación: Similar a roya negra o roya del tallo. Perpetuación: Similar a roya negra o roya del tallo Condiciones predisponentes: Requiere inviernos benignos y primaveras húmedas o lluviosas, adaptándose a una amplia variedad de condiciones ambientales. Alta humedad y temperaturas entre 15 y 25°C. Especialización fisiológica: Al igual que en el caso de de Puccinia graminis tiene una gran variedad de razas fisiológicas, en nuestro país se encuentran las siguientes: 2, 5,13,15, 20, 26,31,49,52,57, 62,64,77,105 (220 en el mundo). Daños: Reduce el peso hectolítrico de la semilla y el número de granos por espiga.

ROYA AMARILLA O ESTRIADA DEL TRIGO - Puccinia striiformis Apareció en nuestro país en 1929 produciendo grandes pérdidas durante ese año y en 1930 y 1931. Es una roya heteroica en la cual el hospedante principal es el cereal y se desconoce el hospedante intermediario. Por lo que se comporta como de ciclo incompleto Difusión: Se encuentra mundialmente difundida. En la Argentina es endémica en toda la región cerealera. Hospedantes: Trigo, cebada, centeno, Agropiron spp., cebadilla, Poa spp., Phalaris spp. Síntomas: Es la roya más temprana de los cereales, aparece en estado de plántula. Ataca preferentemente hojas y glumas pudiendo afectar también a vainas y tallos. En las hojas se observan manchas cloróticas alargadas dispuestas linealmente siguiendo las nervaduras, sobre ellas aparecen pequeñas pústulas de color amarillo (urediniosoros), paralelas entre si, dominando especialmente la cara inferior de las hojas. En los primeros estados son subepidérmicas, pero terminan por romper la epidermis permitiendo la salida de las urediniosporas. Los teliosoros aparecen en la misma época que los urediniosoros, pero éstos los preceden en su desarrollo. Aquellos son negruzcox, alargados, dispuestos linealmente, pero con menos regularidad que los urediniosoros. Etiología: Puccinia striiformis. Las urediniosporas son globosas o elipsoidales, color amarillo pero con protoplasma anaranjado, episporio espinulescente y con 8-10 poros germinativos esparcidos. Las teliosporas son clavuladas, bicelulares con ápice engrosado y redondeado, pedicelos cortos, episporio liso y con paráfisis. Penetración: Similar a Puccinia graminis Infección: Similar a Puccinia graminis Incubación: Similar a Puccinia graminis Propagación: Tiene lugar por las urediniosporas. 78

Perpetuación: No obstante las investigaciones, no ha sido encontrado en el mundo el hospedante alternativo, por lo que no se le conocen los estados picniospórico y eciospórico. La perpetuación entonces se verifica mediante infecciones estivales sobre ciertas gramíneas susceptibles. Condiciones predisponentes: Es una roya muy influenciada por las condiciones ambientales, sobre todo por las temperaturas que deben oscilar entre 10-15°C (a 20°C se detiene) y humedad elevada. Especialización fisiológica: Al igual que otras royas está constituída por varias razas fisiológicas, citándose en nuestro país 30,37,38 y 39 (47 en el mundo). Daños: Las epidemias ocurridas en nuestro país se vieron favorecidas por la susceptibilidad de las variedades cultivadas y al igual que las royas anteriores, ocasiona mermas en calidad y cantidad de granos.

Cuadro comparativo de las royas de los cereales

NOMBRE

CULTIVOS AFECTADOS

SINTOMAS/SIGNOS

CONDICIONES AMBIENTALES FAVORABLES Humedad elevada y temperaturas med ias en torno a 15ºC 25ºC Temperaturas en torno a 20ºC y humedad elevada.

CONDICION

Roya de la hoja o roya parda (Puccinia triticina)

Trigo y triticale.

Pústulas ovaladas de color marrón rojizo en hojas

Royade la hoja de la cebada (Puccinia hordei)

Cebada.

Idem que P. triticina

Roya de la hoja de la avena (Puccinia coronata

Avena.

Pústulas principalmente en hojas, pequeñas, ovales, color anaranjado brillante

Temperaturas en torno a 20ºC y humedad elevada.

Heteroica (Rhamnus cathartica)

Roya amarilla o lineal (Puccinia striiformis)

Seriamente trigo y cebada. Moderadamente triticale y centeno.

Líneas de esporas angostas y amarillas, preferentemente en hojas y espiguillas

Temperaturas en torno a 10-15 ºC y humedad elevada. Con Temp. >20ºC se detiene.

Heteroica (desconocido – 2010 Berberis vulgare)

Roya del tallo o roya negra (Puccinia graminis)

Trigo, cebada, triticale, avena y centeno

Pústulas grandes, ovaladas o alargadas, color marrón oscuro y residuos de tejido epidérmico, mayormente en tallos y vainas

Temperaturas superiores a 20ºC.

Heteroica (Berberis vulgare)

Roya común del maíz ( Puccinia sorghi)

Maíz

Pústulas uredosóricas de color marrón en las hojas, generalmente ocurren en bandas y se ubican en la parte media de la hoja

Alta humedad (cercana al 100%) y temperaturas entre 16 y 23 °C.

Heteroica (Oxalis spp.)

Heteroica (Thalictrum spp., Anchusa spp., Clematis spp.) Heteroica (Ornithogalum umbeiiatum)

79

CARBONES DEL TRIGO

Introducción Los carbones son patógenos de las plantas que pertenecen a la División Basidiomycota; Clase Ustilaginomycetes que fueron reclasificados por estudios moleculares que se organizaron según esquema 1. Estos patógenos se caracterizan por formar una masa pulverulenta de teliosporas de color oscuro en diversos órganos en los hospedantes. Los carbones constituyen un importante grupo de hongos fitopatópatogenos con más de 50 géneros y 1200 especies que afectan aproximadamente 4000 especies de plantas en 75 familias de angiospermas. Además, son más conocidos en monocotiledoneas que en dicotiledóneas. Entre las especies de Ustilaginales fitopatógenas podemos citar a Ustilago tritici (carbón volador del trigo), U. nuda (carbón volador de la cebada, U. hordei (carbón cubierto) y U. maydis (carbón de agallas) del maíz, U. nigra (carbón volador negro) de la avena. Entre las especies de Tilletiales: Tilletia laevis y T. tritici (carbones hediondos o cubiertos) y T. controversa (carbón enano) (Hirschhorn, 1986; Vanky, 1985). Actualmente se los consideran patógenos secundarios del trigo, pero poseen el potencial de causar severas epifítias e importantes pérdidas económicas a la agricultura, aún con el uso de tratamientos químicos a las semillas y la utilización de cultivares parcialmente resistentes a estas enfermedades (Lory et al 2014). Esquema 1 de reclasificación de carbones

Orden Ustilaginales con dos géneros de importancia económica en los cultivos agrícolas: Sporisorium sp y Ustilago sp., son patógenos que poseen teliosporas solitarias con o sin células estériles, metabasidios generalmente fragmentados con basidiosporas laterales. 80

Orden Tilletiales Tilletiales con un género predominante de importancia en los cultivos agrícolas: Tilletia sp. son patógenos que poseen teliosporas teliosporas solitarias con o sin células estériles, metabasidios no septado con basidiosporas terminales muy alargadas y se aparean inmediamente (dando unas estructuras en forma de “H” “V”).

CARBÓN HEDIONDO O CUBIERTO DEL TRIGO Las caries del trigo o carbón hediondo son producidas por el hongo del género Tilletia. La enfermedad se manifiesta en la espiga afectando a los granos, formando el típico soro o grano carbonudo, que produce la disminución en el rendimiento de las cosechas, transfieren mal olor a la harina e importantes pérdidas económicas al productor. El control de las caries del trigo se realiza mediante la aplicación de agroquímicos, pero el problema adquiere cierta magnitud a causa de fallas, tanto en la efectividad de los fungicidas como en los métodos de aplicación, unido a la difusión de cultivares susceptibles. El método más efectivo para el manejo de la enfermedad es la resistencia genética al patógeno, como así también conocer su variabilidad o especialización fisiológica. Síntomas: Los carbones hediondos o caries son patógenos que atacan al trigo y pueden infectar además a la cebada y algunas especies de pastos. Las plantas enfermas tienen generalmente menor altura y con frecuencia presentan una mayor producción de macollos. La enfermedad se hace más evidente después de la emisión de la espiga. Las espigas infectadas son de color verde azulado y las glumas tienden a separarse ligeramente para acomodar las masas de carbón que han reemplazado los granos normales. A medida que madura el cultivo, las espigas atacadas pueden distinguirse por su color más oscuro y olor a pescado debido a la presencia de trimetilamina, por las glumas expandidas con las puntas de las masas del carbón sobresaliendo, por la variación de la altura y las anormalidades de forma-tamaño de las espigas. Las masas de carbón son de color café grisáceo, de forma similar a los granos sanos, aunque usualmente más esféricas. El grado de desarrollo de los síntomas del carbón hediondo se lo consideran de moderado a severo cuando no se trata la semilla antes de la siembra. Organismo causal: Carbón hediondo, carbón cubierto, caries del trigo, “Common bunt” Tilletia laevis Khühn (= T. foetida) Tilletia tritici (Bjerk)Wint. (= T. caries) Carbón enano,” dwarf bunt” Tilletia controversa Kúhn (= T. contraversa) Condiciones favorables: La temperatura óptima para la germinación de las teliosporas es entre 18-20º C. La germinación ocurre después de 45 días a 15º C y 14-15 días a 5° C. La presencia de cultivares susceptibles o parcialmente resistentes favorecen a las infecciones de este patógeno. Transmisión y Dispersión: Cuando los granos carbonudos se rompen liberan esporas negras (teliosporas), pulverulentas y con olor a pescado. Las esporas de las plantas enfermas se dispersan durante las operaciones de cosecha (trilla) contaminando las semillas y el suelo. Estas esporas se adhieren a la punta de la semilla (cepillo) y a los granos infectados se los denomina “punta negra”. No confundir con el oscurecimiento de la punta del embrión causada por otros hongos que también se denomina “punta negra”. Las teliosporas son de resistencia y persisten en el grano y/o suelo seco y cuando la humedad está disponible comienza el ciclo de la enfermedad. Al germinar forman un promicelio (metabasidio) con 8-16 basidiosporas, las cuales se fusionan en pares compatibles formando estructuras en forma de H y eventualmente desarrollan basidiosporas secundarias infecciosas. Las basidiosporas infectan los coleóptilos de las plántulas o los puntos de crecimientos de los macollos jóvenes antes que emerjan del suelo. El micelio del patógeno crece dentro de la plántula (intercelularmente) y avanza a medida que se desarrolla la planta, eventualmente invade los tejidos meristemáticos produciendo manchas clóroticas en hojas (Fig. 1). La dispersión de la enfermedad a larga distancia es por el hombre, a diferencia de las royas que se difunde por el viento. La enfermedad es de distribución mundial y se la considera que produce efectos en el rendimiento de moderado a importante. 81

Fig. 1: Ciclo del carbón hediendo o cubierto causado por Tilletia spp. en trigo. Referencias: Ciclo del carbón hediondo o cubierto del trigo: 1- Teliosporas diploides, 2- Teliosporas dicariotica y germinación, producción de basidiosporas primarias haploides, 3 y 4- fusión de basidiosporas y formación de cuerpo H, 5- basidiosporas secundarias binucleadas de forma de media luna, 6- basidiosporas secundaria germinando y formación micelio dicariótico infectivo que ataca plántulas de trigo, 7- micelio penetra directamente y se desarrolla entre las células, 8- micelio se hospeda en el meristema vegetativo de las plantas de trigo, 9- micelio intercelular, 1011- micelio moviliza hacia las espiguillas en formación intracelularmente reemplazando a la semilla, 12- micelio se fragmenta y se trasforma en teliosporas, 13- grano carbonudo, 14- las espigas pueden estar parcial o totalmente afectadas por el hongo, 15- semillas sanas y granos carbonudos. (Esquema realizado por el Dr. Marcelo Lovisolo). Epidemiología: Los carbones del trigo son enfermedades del tipo biotrófica, porque cumplen su fase parásita de la esporogénesis con formación de teliosporas sobre el hospedante. El carbón hediondo o cubierto es una enfermedad monocíclica cuya fuente de inóculo se encuentra acompañando a la semilla y/o en el suelo, cuya penetración la realiza cuando germinan las semillas y el micelio penetra en las plántulas, por lo tanto la infección se produce al inicio del cultivo de trigo. El desarrollo de la enfermedad es del “tipo sistémico” cuyo signo no se evidencia hasta la formación y emisión de las espigas del trigo. Medidas de control y manejo de la enfermedad: El control más importante de este patógeno es utilizando metodologías preventivas tales como el curado de semilla y la utilización de cultivares tolerantes. Por lo tanto, actualmente el tratamiento con agroquímicos asegura el control a cierto nivel del patógeno en el campo. En cuanto al uso de alternativas para al manejo integrado de la enfermedad, se han realizados investigaciones en relación a la compatibilidad del uso de terápicos y un formulado biológico para aplicarlo sobre semillas de trigo. (Astiz Gassó et al., 2009; Astiz Gasso & Lovisolo, 2016). 2.- CARBÓN VOLADOR DEL TRIGO El carbón volador del trigo es producido por el hongo del género Ustilago y a partir de 1890 fueron diferenciadas tres especies que producen la infección por vía ovárica: Ustilago tritici (trigo), Ustilago nuda (cebada) y Ustilago nigra 82

(avena) (Fischer y Holton, 1956). La diferenciación taxonómica entre U. tritici y U. nuda no se basa en la morfología de las ustilagosporas (=teliosporas) o porque son biológicamente similares, sino por: a) la morfología del metabasidio (=promicelio) donde la hifa monocariotica y dicariotica después de la germinación de U. nuda es diferente a la de U. tritici. Además, el metabasidio de U. tritici es delgado y levemente curvado. b) los soros de U. nuda están inicialmente cubiertos por una membrana que persiste más tiempo, en cambio U. tritici es desnudo o se desprende fácilmente (Lory et al 2014). Síntomas: Ustilago. tritici destruye totalmente las espiguillas en trigo dejando solamente el raquis. La aparición de la enfermedad comienza desde la época de la floración y se manifiesta antes que las espigas salgan de la vaina que la rodea. Cuando éstas emergen ya están completamente destruidas hallándose cubiertas de una abundante masa pulverulenta, color castaño verdoso a negro, que termina por desprenderse muy fácilmente. Las plantas enfermas no alcanzan a veces la altura de las plantas sanas, pero hasta la espigazón parecen ser de las más precoces. Es importante mencionar que se han observado espigas infectadas con U. tritici asociadas con otros patógenos que afectan la espiga tales como: Fusarium spp., Claviceps purpurea y Tilletia spp. (Russell y Mills, 1994). Organismo causal: Carbón volador o desnudo (loose smut; carvão, carvão-nú, carvão descoberto) Ustilago tritici (Pers.) C.N. Jensen, Kellerm. & Swingle Uredo tritici Pers. Ustilago segetum var. tritici (Pers.) Brunaud, (1878) Condiciones favorables: La influencia del ambiente es limitante para la infección del patógeno, su diseminación a través del embrión y su desarrollo en la planta infectada. El patógeno para producir una óptima germinación de la teliospora requiere 95% de humedad relativa y temperatura entre 20-25º C. El micelio tarda 10-15 días en penetrar al embrión y hasta 3 semanas para que el hongo se desarrolle y las hifas comiencen dormancia en la semilla madura (Figura 3 C). Las condiciones ambientales influyen en la apertura de las espiguillas y por lo tanto puede reducir la entrada de la espora por los estigmas florales. También se limita la presencia de la enfermedad cuando se siembran las semillas infectadas en suelos compactos, de bajas temperatura, con sequías, a profundas y suelos anegados (Wilcoxson Roy y Saari, 1996). Transmisión y Dispersión: La liberación pasiva de las teliosporas de U. tritici coincide con la floración de las plantas sanas y normales del trigo. La infección del hospedante puede ocurrir solamente en la floración y la planta se hace resistente al ataque aproximadamente una semana después de la polinización, por lo tanto es crítica la presencia del inóculo para que se produzca la infección en un período tan corto. El viento es el principal diseminador dentro del cultivo y el hombre a grandes distancias. Esta enfermedad tiene distribución mundial (Wilcoxson Roy y Saari, 1996). Epidemiología: El carbón volador es una enfermedad monocíclica cuya fuente de inóculo se encuentra localizado en el embrión, como micelio durmiente dentro de la semilla y cuya penetración se realiza cuando el cultivo de trigo se encuentra en el estadio de antesis en el campo. El signo de la enfermedad no se evidencia hasta la formación y emisión de las espigas. Al no observase macroscópicamente en las semillas afectadas antes de la siembra, se debe realizar una prueba en el laboratorio para detectar su presencia en el embrión y recomendar la aplicación de un terápico para control. Medidas de control y manejo de la enfermedad: El carbón volador es efectivamente controlado por fungicidas de tratamiento sistémico de la semilla. Se recomienda no sembrar las semillas infestadas con carbón volador y seleccionar cultivares de trigo tolerantes a la enfermedad.

83

Fig. 2: Ciclo del carbón volador causado por Ustilago tritici en trigo. ( Dr. Marcelo R Lovisolo). Referencias: Ciclo del carbón volador: 1- El micelio invade partes del embrión; 2-3- El micelio invade el tejido intracelularmente de plantas jóvenes; 4- El micelio se localiza en el meristema vegetativo; 5-6-7-El micelio invade el meristema reproductivo; 8- Células miceliales se fragmentan para formar las teliosporas; 9- Espigas de trigo infectadas con teliosporas que son transportadas por el viento para infectar espigas sanas en el campo; 10- Espiga sana en antesis receptora de las esporas del carbón; 11- Teliosporas germinando para penetrar en espiguillas sanas. (Esquema realizado por Dr. Marcelo Lovisolo). BIBLIOGRAFÍA •

Astiz Gassó M.M., Lovisolo M., 2016. Manual de doencas do trigo: Etiología, sintomatología, diagnose e manejo integrado Capitulo: 2.2 Fungos biotróficos em espigas. 2.2.1 Cárie e carvão. Págs 83-100, Editor: Dr. Erlei Melo Reis. ISBN 978-85-7912-233-0. Pág. 446

•

Astiz Gassó M.M., Pagliocca R., Varaschin C., 2009. Comportamiento del formulado biológico BIAGRO TL en el manejo integrado del carbón hediondo (Tilletia laevis) en trigo. XIII Jornadas Fitosanitarias Argentinas, Termas de Rio Hondo, Santiago del Estero. 2009: PV05

•

Fischer G. W., Holton C. S., 1957. Biology and control of the smut fungi. The Ronald Company New York, 622 pp.

84

•

Hirschhorn E., 1986. Las Ustilaginales de la Flora Argentina. Publicación Especial, Editor CIC (Comisión de Investigaciones Científica de la Provincia de Buenos Aires), 530 pp.

•

Lory G., Sisterna, M., Astiz Gassó M.M., 2014. Actualización de enfermedades del trigo: avances científico en la argentina. capítulo 3: Enfermedades fúngicas de la espiga y la semilla. Págs. 91-121.Editores: C. Cordo y M. Sisterna Publicación Ed. UNLP. Subsidiado: C.I.C. AAF Pág. 400

•

Russell B.W., Mills D., 1994. Morphology physiological and genetical evidence in support of a conspecific status for Tilletia caries, Tilletia controversa and Tilletia foetida. Phytopathology. 84: 576-582.

•

Wilcoxson R. D., Saari E., 1996. Bunt and smut disease of wheat. Concepts and Methods of Disease Management. México, D.F. CIMMYT, 66 pp.

85

TRABAJO PRACTICO Nº8: MILDIUS Y OIDIOS

BIBLIOGRAFIA •

Agrios, G. N., 2005. Plant Pathology. Fifth Edition, Elsevier Acdemic Press.

•

Alexopoulos, C. J. Introducción a la Micología

•

Fernández Valiela, M. V. 1978. Introducción a la Fitopatología. Hongos.

•

Stadnik & Rivera, Eds. 2001. Oídios, Jaguariúna. SP. Embrapa Meio Ambiente.

•

Thines M & Choi Young-Jon. 2015. Evolution, diversity and taxonomy of the Perosporaceae with focus on the genus Peronospora. Phytopathology Extra 1 -13. http://dx.doi.org/10.1094/PHYTO-15-15-0127-RVW

MILDIUS Mildiu, downy mildew, mildiu velloso, es el nombre común de una enfermedad causada por un grupo de patógenos biotróficos altamente especializados, que afectan hospedantes herbáceos de diversas familias de Dicotiledóneas y de Monocotiledóneas. Pueden infectar plantas en todos los estadios de crecimiento, desde plántulas hasta en el momento de fructificación. Se caracterizan por la velocidad de la evolución de la enfermedad y las importantes pérdidas económicas que pueden ocasionar por ese motivo. Pertenencen al Reino Straminipiles o Straminipila; Phyllum Oomycota; Orden Peronosporomycetes (= Oomycetes); Familia Peronosporaceae (mildius). Las diferencias más notorias entre los reinos Fungi (hongos) y Straminipiles (pseudohongos) están dadas por la constitución de la pared celular y la movilidad de las esporas. En los hongos las paredes de las células tienen quitina y en los pseudohongos celulosa, y las esporas de los hongos no tienen movilidad propia y sí la tienen en los pseudohongos por acción de dos flagelos que les permiten desplazarse o “nadar” en agua libre. Los síntomas de los mildius se observan en el haz de las hojas como lesiones cloróticas a necróticas, típicamente angulares, limitadas por las nervaduras. Pueden ser similares a los que producen algunas deficiencias de nutrientes, nematodos foliares o enfermedades de origen bacteriano. A veces los bordes de las manchas pueden ser redondeados, semejantes a las presentes en enfermedades causadas por hongos. Pero la enfermedad se puede reconocer fácilmente porque en correspondencia con esas manchas, en el envés de las hojas se destaca el signo, formado por las estructuras reproductivas asexuales: zoosporangióforos (“conidióforos”) y zoosporangios (“conidios”), que emergen por los estomas. Tiene aspecto velloso de color grisáseo, violáceo, oliváceo o blanquecino según el mildiu y cuando es muy abundante, esa apariencia puede confundirse con las eflorescencias blanquecinas producidas por los oídios (Erysiphaceae) o por moho gris (Botrytis). Las manchas necróticas se hacen confluentes, las hojas se secan rápidamente, se reduce el proceso de fotosíntesis, se detiene el llenado de los frutos, éstos quedan desprotegidos del sol y se producen lesiones de quemaduras. 86

En algunos mildius la infección comienza en los brotes y se desarrolla en el hospedante sistémicamente, produciendo síntomas de malformación de las ramas o infrutescencias, enanismo y decoloración de la planta (mildiu del girasol). Los organismos patógenos producen estructuras vegetativas asexuales: micelio continuo, apresorios y haustorios; reproductivas asexuales: zoosporangióforos (conidióforos) y zoosporangios (conidios) y reproductivas sexuales: oogonios (femenino) y anteridios (masculino) que al unirse forman oosporas. La morfología y dimensiones de estas estructuras tienen valor taxonómico para diferenciar a los distintos géneros.

Ciclo de la enfermedad: Los mildius son enfermedades policíclicas (muchos ciclos asexuales y uno sexual por temporada). Cuando un conidio entra en contacto con la superficie de un hospedante susceptible, en presencia de agua libre emite un tubo germinativo donde se forma un apresorio que se fija al tejido vegetal y que forma una “hifa de penetración” que atraviesa la cutícula. También pueden penetrar por estomas. Dentro del tejido se desarrolla micelio intercelular que se ramifica y genera haustorios dentro de las células, de las cuáles extrae nutrientes. El crecimiento del patógeno coloniza el mesófilo y se forman zoosporangióforos (conidióforos) que salen a través de los estomas. En sus extremos, generalmente ramificados, se forman los zoosporangios que pueden germinar en forma directa (actuando como conidios) o indirecta, liberando las zoosporas que contienen. Los zoosporangios se liberan dispersando la enfermedad y al entrar en contacto con el vegetal reinician el ciclo asexual.

Este proceso dura entre 7 y 10 días y en algunos casos 4 días. La velocidad del ciclo y la gran cantidad de conidios que maduran en ese período hace que esta enfermedad sea devastadora para muchos cultivos si las condiciones del ambiente son favorables y no es tratada preventivamente o en su inicio. En todos los géneros de mildius los zoosporangios pueden actuar como conidios y germinar directamente. En dos géneros: Plasmopara y 87

Peronosclerospora, en condiciones favorables el citoplasma de los esporangios se fragmenta y se forman zoosporas biflageladas. Estas se liberan por un poro y se dispersan por salpicaduras de agua de riego o lluvia. Al entrar en contacto con el hospedante inicialmente se enquistan y en presencia de agua libre germinan y el tubo germinativo actúa como se describió para los conidios. La cantidad de inóculo en este caso se multiplica considerablemente. El ciclo se completa con el estado sexual, que puede no estar presente, en el que la unión de los oogonios y anteridios dentro del tejido infectado determina la formación de oosporas, que son las estructuras de resistencia. El patógeno se perpetúa principalmente como oosporas en el rastrojo y en el suelo, como micelio en bulbos y semillas e infectando plantas voluntarias u hospedantes de la misma familia botánica.

Diagrama donde se representan las dos funciones de los zoosporangios (1) como conidios al germinar directamente o (2) como zoosporangios formando zoosporas.

Condiciones favorables: Temperaturas frescas (15-23 °C), humedad relativa mayor de 85%, superficie de la hoja mojada.

Manejo de la enfermedad: Eliminar rastrojo y quemarlo, desmalezar, mantener ventilación, evitar siembras densas, monitorear los cultivos para detectar la aparición de los primeros síntomas-signos y aplicar productos para control de oomycetes, a base de focetil aluminio o metalaxil. 88

El género Peronospora tiene el rango más amplio de hospedantes de distintos géneros y especies botánicas. El género Bremia está acotado a la familia Asteraceae.

Ejemplos de mildius presentes en el país: 1. Hyaloperonospora brassicae. En especies de la familia Brassicaceae, cultivadas y malezas. 2. Peronospora destructor: en cebolla; P. manchurica: en soja; P. sparsa; en rosal 3. Plasmopara viticola: en vid; P. halstedii: en girasol 4. Bremia lactucae: en lechuga. 5. Pseudoperonospora cubensis: en Cucurbitaceae. 6. Sclerophthora macrospora (Sclerospora macrospora): “panoja o escoba de bruja” en maíz

Tizón tardío de la papa, mildiu o fitoftora Es la enfermedad más importante del cultivo de la papa en nuestro país y en el mundo dado que provoca rápidamente la destrucción total de cultivo. También afecta al tomate. El patógeno que la ocasiona es Phytophthora infestans que, al igual que los pseudohongos causantes de mildius, pertenece al Reino Straminipiles o Straminipila; Phyllum Oomycota; Orden Peronosporomycetes (= Oomycetes), pero a la Familia Pythiaceae, que incluye a los géneros Pythium y Phytophthora, causantes de damping-off, pudriciones de raíz y corona, tizones, afectando plantas herbáceas y leñosas de Dicotiledóneas y Monocotiledóneas. Los estudios filogenéticos realizados recientemente han demostrado una gran cercanía entre esta especie de Phytophthora y los Mildius. La diferencia con los Mildius es que los organismos integrantes de la familia Pythiaceae son pseudohongos hemibiotróficos. P. infestans se diferencia de otras especies de Phytophthora, que son típicos patógenos de suelo, porque crece y se multiplica en la parte aérea de las plantas. Los síntomas dependen de las condiciones ambientales, de los cultivares de papa y de las razas del patógeno: En el follaje se observan 1) manchas circulares oliváceas-marrones en folíolos (tizón) que pueden avanzar hacia los pedúnculos, en ese caso se produce defoliación; 2) eflorescencia pulverulenta blanquecina (mildiu) en el envés de las hojas, al emerger los esporangióforos (conidióforos) por los estomas. En los tubérculos (si se infectaron porque cayeron conidios o zoosporas al suelo) se observa podredumbre marrón corchosa (por fuera y por dentro). El ciclo es semejante al de los mildius. Se inicia con la germinación de oosporas que quedaron en el rastrojo o en papas enterradas o almacenadas. Con la germinación se produce un esporangio que puede actuar como conidio o

89

como zoosporangio e infectar los brotes de las papas. El desarrollo del patógeno en la planta produce nuevo inóculo que es dispersado por el viento o agua de lluvia dentro del cultivo y hacia otros cultivos.

Ciclo del tizón tardío, mildiu o fitoftora de la papa

OIDIOS Los oídios, también llamados blanco, cenicilla, o mildiu pulverulento, son enfermedades de tipo crónico causadas por hongos biotróficos (parásitos obligados o absolutos). Algunos se encuentran entre las enfermedades más destructivas que se conocen. En general disminuyen la productividad de sus hospedantes. Se caracterizan por presentar un típico signo en forma de eflorescencia blanca, de aspecto pulverulento, que puede cubrir distintos órganos de los hospedantes, especialmente el follaje. El signo está constituido por estructuras vegetativas (micelio) y reproductivas asexuales (conidióforos y conidios). Las estructuras reproductivas consisten en conidióforos erectos, formados por una célula basal más larga seguida por 1 o más células y conidios de forma cilíndrica o de barril, simples (uno solo) o varios dispuestos en cadena. Los conidios son las estructuras de dispersión y de infección. Tienen alto contenido de agua y sustancias lipídicas en la membrana, por lo que pueden soportar períodos de sequía y no necesitan película de agua en la superficie del vegetal para poder germinar (la superficie debe estar seca). Se producen, se liberan en forma pasiva y se dispersan con el aire e infectan nuevas plantas en menos de 24 h por lo que son un muy efectivo medio de 90

propagación de esta enfermedad policíclica. Son muy livianos por lo que pueden ser llevados por el viento a través distancias muy grandes. El micelio o el tubo germinativo de los conidios desarrollan apresorios, por medio de los cuales se fijan a los tejidos vegetales y penetran en las células epidérmicas donde forman haustorios, a través de los cuales se nutre el hongo. En caso de desarrollarse la forma sexual o teleomorfo, los cuerpos fructíferos llamados chasmotecios se observan como puntuaciones negras. Son ascocarpos esféricos y cerrados, con ascas dispuestas ordenadamente, que presentan en su exterior fulcros o apéndices de distinta morfología. Los chasmotecios le permiten al hongo cumplir con el estado de saprogénesis, en época invernal, sobre el hospedante. En las regiones tropicales del mundo y gran parte de nuestro país, así como en cultivos conducidos en invernaderos, la formación de chasmotecios no es necesaria para el hongo, el cual se perpetúa infectando por medio de los conidios a hospedantes alternativos, plantas voluntarias, yemas del cultivo o en plantas de cultivos producidos de forma escalonada.

La forma, disposición y dimensiones de todas estas estructuras vegetativas y reproductivas asexuales y sexuales, tienen valor taxonómico para la clasificación de los distintos géneros y especies de este grupo de hongos. Las características de los chasmotecios (número de ascas, morfología de los apéndices (fulcros) que cubren exteriormente los chasmotecios) tienen valor taxonómico y en ellos se han basado la mayoría de las claves para identificar los géneros y especies. Sin embargo, actualmente, con el apoyo de herramientas como el uso del 91

microscopio electrónico y de técnicas moleculares que lo respaldan, la observación de las estructuras del estado vegetativo y reproductivo asexual del hongo, en relación con la familia botánica del hospedante, es suficiente para realizar las identificaciones.

Hospedantes: Los oidios han sido citados sobre más de un tercio de las especies cultivadas, exceptuando a todas las Gimnospermas y a algunas Angiospermas tales como la mayoría de las Monocotiledoneas (sí afectan a las gramíneas cultivadas, menos al arroz y al maíz).

Síntomas: Pueden observarse en cualquier órgano de la parte aérea de las plantas. En correspondencia con el signo de la enfermedad producen síntomas de tipo hipoplásico: clorosis, atrofias de hojas jóvenes (en rosal, manzano, plátanos, robles), metaplasia. También pueden producir necrosis en los órganos afectados.

Etiología: Pertenecen al Phylum Ascomycota, Orden Erysiphales, Familia Erysiphaceae. Los géneros más importantes por los cultivos que patogenizan o por la gravedad de las infecciones son: Blumeria, Podosphaera (actualmente este género incluye a las especies que antes estaban dentro del género Sphaeroteca), Erysiphe (actualmente este género incluye a las especies que antes estaban dentro de los géneros Microsphaera y Uncinula), Golovinomyces, Leveillula, y Phylactinia. El anamorfo del hongo o estado asexual está siempre presente en los oídios y es el que cumple el estado de patogénesis durante el ciclo vegetativo. Se ubica dentro del Phylum Ascomycota, grupo Deuteromycetes (conidios libres) y comprende tres géneros: Oidium, Oidiopsis, y Ovulariopsis.

Ejemplos de oidios: 1. Golovinomyces orontii (ex G. cichoracearum) (Anam: Oidium ambrosiae) sobre Cucurbitaceas, Asteraceas, Solanaceas (herbáceas, leñosas, cultivadas, malezas) 2. Podosphara fusca (ex Sphaeroteca fusca) distintos biotipos que afectan a un amplio rango de especies botánicas (herbáceas, leñosas, cultivadas, malezas); P. pannosa en el rosal 3. Erysiphe pisi (Anam: Oidium erysiphoides) en Leguminosas; 4. Erysiphe necator (ex Uncinula necator) (Anam: Oidium tuckeri) en Vid 92

5. Leveillula taurica (Anam: Oidiopsis secula) distintos biotipos que afectan a un amplio rango de especies botánicas (herbáceas, leñosas, cultivadas, malezas) 6. Blumeria graminis (Anam: Oidium monilioides) en Gramineas, con distintas formas especiales según el hospedante B. graminis f sp tritici, B. graminis f sp avenae, etc.

DIFERENCIAS ENTRE OÍDIOS (POWDERY MILDEWS) Y MILDIUS (DOWNY MILDEWS)

OIDIOS (HONGOS) ES MÁS VISIBLE

+ Signo

MILDIUS (PSEUDOHONGOS) + Síntomas

SIGNO

+ Ambos lados de las hojas

+ Envés de las hojas (estomas)

+ Micelio, conidióforos y conidios

+ “Conidióforos” y “conidios”

TEMPERATURAS

+ rango amplio, templado-cálido

+ Rango amplio, frescas - frías

ESPORULACIÓN

+ amplio rango de HR

+ Más de 90 % HR

INFECCIÓN

+ Sin agua libre en superficies

+ Con presencia de agua libre

93