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FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

ASIGNATURA :

BIOQUIMICA I

PRACTICA N ° 2

TEMA: EXTRACCIÓN DE LA CASEINA Y DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO

DOCENTE:

Q.F. Enrique León Mejía

TURNO:

Mañana

CICLO:

VI

ALUMNA: ARAUJO CHUCOS DELIA MALENY

FECHA DE ENTREGA: 07/09/2019

2019-II

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INDICE

1- INTRODUCCION: ...................................................................................................................... 3 2- MARCO TEÓRICO: .................................................................................................................... 4 3- PARTE EXPERIMENTAL: ......................................................................................................... 11 4- RESULTADOS: .......................................................................................................................... 15 5- CONCLUSIONES: ...................................................................................................................... 16 6- CUESTIONARIO: ....................................................................................................................... 16 7- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: .............................................................................................. 17

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EXTRACCIÓN DE LA CASEINA Y DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO

1- INTRODUCCION: La leche es un líquido secretado por las glándulas mamarias de las hembras de los mamíferos, tras el nacimiento de la cría, de composición compleja blanco y opaco, de sabor dulce y reacción iónica (pH) próxima a la neutralidad. Contiene cuatro tipos de componentes importantes lípidos (triglicéridos), Proteínas (caseína, albúminas y globulinas), glúcidos (lactosa) y sales minerales1.

La leche contiene 30-36 g/l de proteína y alcanza cantidades nutritivas de muy alto valor biológico. Las proteínas de la leche se clasifican bien como caseínas o bien como proteínas del suero.

La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y con formación de masa blanca. Las fosfoproteínas son grupos de proteínas unidas a una sustancia con ácido fosfórico. Unidos a Serina y treonina por grupo hidroxilo.

En la leche representa cerca del 77 al 82 por ciento de las proteínas presentes en leche y 2.7 en composición liquida. Formada por Alpha (s1), Alpha (s2)-caseína, beta-caseína y kappa-caseína formando una micela o unidad soluble. Las caseínas precipitan a pH 4,6, que es su punto isoeléctrico2 (a temperatura ambiente). De entre las especies más comunes, las mayores diferencias se encuentran en el contenido de caseína κ que representa el 3% de las caseínas de leche de búfala, el 13% de las de la leche de vaca y el 26% de las de la leche humana.

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2- MARCO TEÓRICO: La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en pequeñas cantidades), proteínas (incluyendo todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C. Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas. Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones

intermoleculares

como

son

los

puentes

de

hidrógeno

(característicos de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales3. En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas globulares). La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida. La caseína está formada por alpha (s1), alpha (s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína formando una micela o unidad soluble4. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que el alfa y la beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio.

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La caseína es un conjunto heterogéneo de proteínas por lo que es difícil fijar una definición, sin embargo, todas las proteínas englobadas en lo que se denomina caseína tienen una característica común que precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4.6 por ello a la caseína también se le suele denominar proteína insoluble de la leche. La kappa caseína, sin embargo, tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella. También tiene todos sus residuos de serina y treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo, así como los carbohidratos dispuestos en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es fácilmente soluble en agua gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de su superficie se une fácilmente al alfa y la beta caseínas insolubles, lo que da lugar a la formación de la micela5.

La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada 5

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negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita.

La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares. El alto número de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insoluble en agua. En cambio, es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sódico y acetato sódico. La función biológica de las micelas de caseína es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago para favorecer una nutrición eficiente6. Además de caseína, Ca y P la micela formada también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche. Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante cuando precipitemos la caseína en medio ácido son proteínas globulares, hidrofílicas y fácilmente solubles en agua así como susceptibles de desnaturalización por calor. Las principales son ß -lacto globulina, alphalactalbúmina, bovine serum albumin (BSA), e inmunoglobulinas (Ig). La caseína se emplea en la industria para la fabricación de pinturas especiales y en el apresto de tejidos, la clarificación de vinos, la elaboración de preparados farmacéuticos y la fabricación de plásticos. La pintura de caseína ha sido usada desde la antigüedad por los egipcios7.

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CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LA CASEÍNA A diferencia de muchas otras proteínas, las caseínas no precipitan fácilmente por acción del calor, dado que, al ser ricas en prolina, tienen pocos tramos con estructura primaria definida. A pH ácido las micelas pierden su carga y su capacidad de repelerse, y las caseínas se agregan. Cuando se obtiene industrialmente, este material se le llama caseína ácida. La coagulación mediada por la acidificación es el proceso que se produce en los yogures. En la cuajada se produce la coagulación enzimática. En los quesos, dependiendo del tipo, se puede producir una combinación de ambos efectos8.

Las características de las caseínas de la leche de vaca se resumen en la tabla 2. La secuencia aminoacídica de la caseína contiene un número inusual de residuos del aminoácido prolina: entre 10 en la αs2-caseína y 35 en la β-caseína. Las caseínas son relativamente hidrofóbicas (poco solubles en agua).

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Otro dato interesante, utilizado para separar las caseínas del resto de las proteínas lácteas mediante su precipitación, es que su punto isoeléctrico (pI) promedio es de 4,6. A este pH, las caseínas se encuentra en su punto de menor solubilidad debido a la reducción de las repulsiones intermoleculares, por lo que precipitan (coloquialmente, se dice que coagulan). Ahora bien, el pH es diferente para cada una de las fracciones caseínicas, ya que varía entre el 4,444.97, para la αs1-caseína, y el 5,3-5,8, en la variante genética B de la κ-caseína. A este pH (4,6), la caseína precipita, debido a la reducción de repulsiones intermoleculares. A diferencia de muchas otras proteínas, la caseína no precipita al calor. Precipita bajo la acción de la renina (enzima proteolítica presente en el estómago de terneros) para formar la paracaseína. Al precipitar por acción de ácidos se le llama caseína ácida. Este precipitado blanco forma la base para la elaboración de todo tipo de quesos9. La secuencia peptídica de la caseína contiene un número inusual de residuos de prolina (Ca. 15%). Como resultado, es relativamente hidrofóbica (poco soluble en agua) y carece de estructura secundaria o terciaria definidas. En la leche se encuentra como suspensión de partículas que asemeja a las micelas de surfactantes (pequeñas esferas hidrofílicas en el exterior e hidrofóbicas en el interior). Estas micelas de caseína se estabilizan por iones de calcio e interacciones hidrofóbicas.

La caseína es una proteína de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico, por lo tanto su molécula contiene un elemento fósforo. La caseína 8

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representa cerca del 77 al 82 por ciento de las proteínas presentes en la leche y el 2.7 por ciento en la composición de la leche líquida. Cuando coagula con renina, es llamada paracaseína, y cuando coagula a través de la reducción del pH es llamada caseína ácida. Cuando no está coagulada se le llama caseinógeno. La caseína es un sólido blanco-amarillento, sin sabor ni olor, insoluble en agua. Se dispersa bien en un medio alcalino, como una solución acuosa de hidróxido de sodio: NaOH, formando caseinatos de sodio9.

USOS Y APLICACIONES Además de usarse directamente como adhesivo en la elaboración de productos alimentarios (derivados lácteos y cárnicos, panes y productos de repostería, etc.), la caseína se utiliza en la elaboración de productos no alimentarios: pegamentos y pinturas, cubiertas protectoras, plásticos (véase la tabla 3). Sus usos tecnológicos son la clarificación de vinos o como ingrediente en preparados de biología molecular y microbiología (medios enriquecidos para el cultivo microbiano). En la alimentación especial, la caseína sirve para la elaboración de preparados médicos y concentrados proteicos destinados a la alimentación de los 9

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deportistas, especialmente después de su entrenamiento. Así, se ha observado que la digestión de las caseínas es más lenta que la de las lactoproteínas solubles (también denominadas seroproteínas) y, por ello, más apropiada para reparar el anabolismo de los aminoácidos durante el período que sigue a una comida.

PUNTO ISOELÉCTRICO Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio. Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible). Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos. 10

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Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lisina estarían protonados (-NH3+). De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2). De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero10. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.

3- PARTE EXPERIMENTAL: 3.1. Materiales y Equipos a usar: - Beaker de 25 mL, 50mL,250mL - Probeta de 50mL - Matraz aforado de 50 mL - Pipetas de 5,0 mL, 1.0mL, 10mL - Embudo de vidrio mediano - Papel de filtro - Termómetro - Tubos

3.2. Reactivos:  Agua destilada

 Éter etílico

 Acetato sódico 0,1 N

 Etanol al 70%

 Ácido acético 0,01 N  Ácido acético 0,1 N  Ácido acético 1,0 N  NaOH 1N

- Materiales y reactivos de uso general: 11

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 Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para calibrar el potenciómetro  Potenciómetro (pH-metro)  Leche entera corriente (1 litro)

3.3. Procedimiento: a. Preparación de la Solución de Caseína

Se pesa 250 mg de Caseína

Se adiciona 5 mL de Ácido Acético 0.1N y aforar a 50 mL y filtrar.

Agregamos 5 mL de H2O destilada + 5 mL de NaOH 0.1N

Se vierte en matraz aforado de 50 mL.

12

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b. Determinar el Punto Isoeléctrico de la caseína.

Se toman 10 tubos de ensayo.



Se colocan los siguientes reactivos a cada tubo.

Tubo Acetato 0.1 Acético 0.1 N Acético 0.01 pH N

N

resultante

1

0.5

9.5

-

3.47

2

1

9

-

3.68

3

1.5

8.5

-

3.83

4

2

8

-

3.95

5

3

7

-

4.16

6

4

6

-

4.29

7

5

4

-

4.54

8

6

2

-

5.02

9

7

-

4

5.74

10

8

-

2

6.08

13

14

Se mide el pH.

Se agrega 1 mL de solución de caseína a cada tubo, se agita y se espera 3 minutos.

Se mide la Absorbancia a cada tubo a 640 nm.

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4- RESULTADOS: Determinación del Punto Isoeléctrico:

Tubo pH

Absorbancia

resultante 1

3.47

0.442

2

3.68

0.476

3

3.83

0.500

4

3.95

0.535

5

4.16

0.546

6

4.29

0.557

7

4.54

0.754

8

5.02

0.090

9

5.74

0.006

10

6.08

0.009

Punto Isoelectrico 7 6.08 6 5.74

P.I. = 4.78 5.02

5

4.54

4.29 4.16 3.95 3.83 3.68 3.47

pH

4 3 2 1 0 0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

absorbancia



Obtuvimos un valor de 4.78 correspondiente al pH del punto isoeléctrico de la caseína. 15

16



El método que se usó en la práctica, para la obtención caseína

fue mediante acidificación, con ácido

de

acético, a

la una

muestra de leche. A partir de esto, se obtuvo un precipitado blanco, esto debido a que la solubilidad de la caseína disminuye a un valor de pH 4,5 y el pH de la leche se encuentra a un valor de 6.6;

al

adicionar ácido, las cargas de

la

proteína se

neutralizaran y su desnaturalización produce la precipitación tal como se observó en la práctica.

5- CONCLUSIONES:  

 

La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y también una masa blanca. En la practica es posible su extracción parcial y el aislamiento de la caseína de la leche utilizando baja solubilidad a Ph 4.5 que es su punto isoeléctrico a temperatura ambiente. La caseína se caracteriza por un solido blanco amarillento con un ligero olor láctico. El contenido de proteínas presente en la leche es muy bajo, pese a que usando leche entera liquida marca GLORIA.

6- CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína? El punto isoeléctrico de la caseína es 4.5. A este pH, la caseína se encuentra en su punto de menor solubilidad, debido a la reducción de repulsiones intermoleculares, por lo que precipita. A diferencia de muchas otras proteínas, la caseína no precipita al calor. Precipita bajo la acción de la renina (enzima proteolítica presente en el estómago de terneros) para formar la paracaseína. Al precipitar por acción de ácidos se le llama caseína ácida. Este precipitado blanco forma la base para la elaboración de todo tipo de quesos. La enzima tripsina reduce la caseína a un hidrolizado fosfatado llamado peptona. La secuencia peptídica de la caseína contiene un número inusual de residuos de prolina (ca. 15%). Como resultado, es relativamente hidrofóbica (poco soluble en agua) y carece de estructura secundaria o terciaria definida. 16

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2. ¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el pI? Casi todas las proteínas globulares muestran un mínimo de solubilidad, aunque el pH al que ello ocurre varía de una proteína a otra. El pH al que una proteína muestra un mínimo de solubilidad es su pH isoeléctrico, definido como aquel valor de pH al que la molécula no posee carga eléctrica y es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico. En estas condiciones no existe repulsión electroestática entre moléculas de proteína vecinas y tienden a precipitar. Puesto que las diferentes proteínas poseen valores de pH isoeléctrico también diferentes, debido a que difieren en el contenido de aminoácidos con grupos R ionizables, con frecuencia pueden separarse unas de otras, mediante precipitación isoeléctrica. Cuando el pH de una mezcla de proteínas se ajusta al pH isoeléctrico de uno de sus componentes, la mayor parte o casi todo el componente precipitara, quedando en la disolución las proteínas cuyos valores de pH isoeléctrico se hallen por encima o por debajo de aquel. La proteína isoeléctrica precipitada permanece en su conformación nativa, y puede re disolverse en un medio de pH apropiado y concentración salina adecuada.

7- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: 1. López Camacho Y. Bioquímica. Sinaloa, México. Edit. Circuito interior oriente. 1era Edición. 2011.

2. Devlin Thomás M. Bioquímica con Aplicaciones Clínicas. Tomo I y II. Barcelona. Edit. Reverté Colombiana. S. 2000.

3. Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México.

4. Calvo Miguel. Bioquímica de los alimentos. recuperado el día 01 de setiembre de: http://milksci.unizar.es/ 17

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5. Gil Hernández, Á. (2010). Tratado de Nutrición: Composición y calidad nutritiva de

los

alimentos. Madrid: Editorial Médica

Panamericana, D.L.

6. Lacad Godina, A. (1985). Ciencia de la leche. Principios de técnica lechera. Barcelona: Editorial Reverté, S.A.

7. Segal, C., & Ortega, G. (2005). Manual de prácticas. Biología molecular de la célula I. México: UNAM.

8. Vian Otuño, Á. (2006). Introducción a la química industrial. Barcelona: Editorial Reverté.

9. Depósito de documentos de la fao, depto de agricultura. Recuperado el 01 de setiembre de: http://www.fao.org/

10. Alais Charles. Ciencia de la leche. (1985), ed. reverte

11. Comportamiento y evaluación de las proteínas de la leche (caseína y del lactosuero) frente al tratamiento térmico y ph .deyli díaz lezama, lima, 2010.

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