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Antonio Ceron Gamez 5Qm2 Factores Sigma en Escherichia coli. y Staphylococcus aureus. 1.- Escherichia coli contiene un factor σ 54 y seis factores σ de la familia de σ 70, σ 70 (RpoD), σs (RpoS), σ 32 (RpoH), σ F (FliA), σ E (RpoE), y FceI (Gruber y Gross, 2003). Cada uno de ellos dirige la transcripción de grupos de genes específicos. En E. coli σs transcribe más de 100 genes implicados en supervivencia celular, protección contra diversas situaciones de estrés (estrés oxidativo, radiación UV, choque térmico, hiperosmolaridad, pH ácido) y expresión de la virulencia (Ishihama, 2000). Los niveles celulares de σs están cuidadosamente controlados, aumentando significativamente en la entrada en la fase estacionaria de crecimiento, momento en el que alcanza el 30% del nivel del factor “housekeeping” σ 70, aumentando así su habilidad de competir por el núcleo enzimático con otros factores σ disponibles en la célula (Jishage et al., 1996). Los estudios sobre los niveles de σs han revelado uno de los sistemas más complejos de regulación en bacterias, ya que tiene lugar a nivel de transcripción, de traducción y de estabilidad proteica, todo coordinado con la respuesta a diversas situaciones de estrés celular. Aunque Eσ 70 y Eσs reconocen básicamente las mismas secuencias promotoras, determinadas por las denominadas cajas -10 y -35, algunas características determinan la selectividad de Eσs . A nivel de secuencia son: utilización total o parcial de una secuencia UP situada aguas arriba de la caja -35 (las secuencias UP son un tercer elemento de reconocimiento en determinadas regiones promotoras localizado aguas arriba de la caja -35 y que interacciona con el dominio Cterminal de la subunidad α de la RNAP); una citosina en la posición -13 de la caja -10; una zona rica en A-T aguas abajo de la caja -10; una caja -35 degenerada; y, finalmente, un cambio en la distancia entre las cajas -10 y -35. Finalmente, la acción sobre una región promotora de determinados factores, como H-NS, Introducción 6 Lrp o IHF o la topología del ADN en esta misma región, juegan en ocasiones un papel decisivo en la especificidad de Eσs (HenggeAronis, 2002). Como se ha mencionado anteriormente en E. coli, la mayoría de los genes expresados durante la fase exponencial de crecimiento se transcriben por Eσ 70, mientras que Eσs es esencial en la transcripción de varios genes específicos de fase estacionaria. Algunos genes de respuesta al estrés se transcriben con el holoenzima formado por otras subunidades σ minoritarias. Eσ 54 transcribe genes activados por una deficiencia de nitrógeno y otros genes de respuesta al estrés. Eσ 32 transcribe genes que codifican para proteínas del choque térmico, y se induce por un número excesivo de proteínas citoplasmáticas que no se pliegan correctamente, resultado de un choque térmico y otros estreses. Eσ F activa los genes tardíos implicados en el ensamblaje del flagelo. Eσ E se induce por proteínas desplegadas de la envoltura celular y dirige la expresión de los genes para restaurar la integridad de las envueltas. Y, para finalizar, FceI, responsable de la transcripción de la maquinaria necesaria para el transporte por translocación de citrato férrico ante una situación de limitación de hierro y presencia de citrato férrico en el ambiente. FceI forma parte de la subfamilia de factores sigma extracitoplasmáticos (EFC) o sigmas del grupo 4, pertenecientes a la familia de σ 70 pero caracterizadas por tener una secuencia bastante divergente de otros grupos de la familia σ 70. Originalmente se les denominó factores sigma extracitoplasmáticos porque muchos miembros de este grupo identificados inicialmente regulaban aspectos relacionados con la superficie celular o el transporte, y se cotranscribían muy a menudo con un factor anti-sigma transmembrana. Sin embargo, se está demostrando que proteínas de función más amplia pertenecen a este subgrupo. Muchas bacterias, sobre todo las de genomas más complejos, contienen múltiples factores σ EFC que a menudo superan el número de otros tipos de factores sigma. Varios ejemplos son Bacillus subtilis (7 factores sigma EFC), Mycobacterium tuberculosis (10), Caulobacter crescentus (13), Pseudomonas aeruginosa (aproximadamente 19), y Streptomyces coelicolor (aproximadamente 50) (Helmann, 2002). 2.- En E.coli, el factor sigma 70 (σ 70) es la subunidad más abundante que reconoce al promotor. Adicionalmente, existen seis factores sigma alternativos de acuerdo a las condiciones sobre las cuales se ha observado su actividad. Muchos de los genes expresados durante la fase de crecimiento son transcritos por la acción del factor σ 70, mientras que el factor σ s es esencial

Antonio Ceron Gamez 5Qm2 en la transcripción de algunos genes durante la fase llamada estacionaria y en algunas condiciones de estrés El factor σ 54 se utiliza para la expresión de genes cuando la bacteria se enfrenta a una deficiencia de nitrógeno y otras condiciones de estrés. El factor σ 28 se requiere para la expresión de los elementos flagelares y de los genes involucrados en los procesos de quimio taxis. Mientras que el factor σ 32 transcribe a los genes necesarios para la respuesta adaptativa a estrés por calor; el factor σ 24 modula la expresión de los genes involucrados en la producción de proteínas

S. aureus Sigma (σ) factors in Staphylococcus aureus There are only four sigma factors have been identified in S. aureus to date. σA the housekeeping σ factor, which directs the transcription of the bulk cellular RNA and three alternative σ factors σB , σH and the newly defined σS. The S. aureus σB protein is closely related to the σB protein of B. subtilis and is mainly involved in stress response. The S. aureus σH protein is a homolog of B. subtilis σH involved in the regulation of sporulation-related genes.10 S. aureus relies on only four σ factors to direct the execution of its gene expression. In addition to a primary σ factor, σA, S. aureus, as with the majority of organisms possesses a σB alternative σ factor, which controls the general stress response. A third factor, σH, has recently been reported, demonstrating homology to σH from B. subtilis, and has been shown to regulate competence genes and the integration and excision of prophage. Recently it was demonstrated that the existence of a fourth σ factor, σS, belonging to the ECF family.

Somastotatina La primera proteína producida utilizando células bacterianas fue la somatostatina. Para ello se desarrollaron técnicas decisivas para la posterior producción de insulina. La somatostatina consta solamente de 14 aminoácidos y es una de las muchas hormonas que se producen en el hipotálamo, una región del cerebro medio. Desde allí llega hasta la glándula pituitaria con el flujo sanguíneo, donde se ocupa de parar la liberación de insulina y del “apagado” de la hormona del crecimiento humana. La somatostatina podría, por lo tanto, tener valor terapéutico. Por este motivo, en 1977 Hebert Boyer y sus colaboradores escogieron esta sustancia para sus investigaciones en el City of Hope National Medical Center y la Universidad de California en San Francisco. Hasta entonces no se había conseguido aislar el gen de la somatostatina de células humanas, pues su secuencia de bases se obtuvo del conocimiento del código genético a partir de la secuencia conocida de los 14 aminoácidos en el péptido. Así se construyó en bloques, de tres bases cada uno, un gen artificial. Consta de 52 pares de bases, de las cuales 14 x 3 = 42 contenían el plan de construcción codificado para la somatostatina. Los diez pares de bases restantes debían garantizar la expresión del gen (comprensión de las instrucciones de construcción) mediante el ribosoma, facilitar el aislamiento de la hormona y finalmente liberar “extremos pegajosos”, que serían importantes para incorporar fragmentos de ADN de doble hebra en un plásmido (el vector). Como huésped se eligió Escherichia coli. Para llevar a cabo la transferencia se combinó el gen sintético con un plásmido que llevaba la descripción pBR322, así como un fragmento del operón lac. Para una expresión efectiva de un gen clonado se requiere una señal clara que sea entendida por la célula huésped. Estos promotores vienen frecuentemente de un gen, que puede alcanzar un grado de expresión elevado en el huésped. Lo más sencillo es acoplar el ADN clonado al

Antonio Ceron Gamez 5Qm2 ADN de un gen propio de una célula y aprovechar al mismo tiempo sus promotores buenos funcionales. el gen de la somatostatina se incorporó en el extremo propio del gen bacteriano, en el cual se codifica la enzima β-galactosidasa. La β-galactosidasa es una enzima que se encuentra en grandes cantidades y degrada lactosa. Es una enzima inducible. Tras la transferencia con éxito del plásmido en una célula de E. coli se produce, por lo tanto, una somatostatina en forma de proteína de fusión somatostatina-β-galactosidasa. En realidad es sólo un “péptido cola” de 14 aminoácidos, más corto, colgado a la enzima galactosidasa. Mediante tratamiento con el producto químico bromocianuro (CNBr), la proteína se rompe sólo en el lugar donde se encuentra el aminoácido metionina, dejando la somatostatina finalmente separada de la β-galactosidasa. Debido a que el gen se había producido sintéticamente, era una menudencia incorporar la metionina requerida al inicio de la molécula de somatostatina. Para ello simplemente se instaló el codón ATG para la metionina. Este proceso previo no se pudo evitar. Si no, la somatostatina, si se intenta producir por sí misma, se degrada muy rápido mediante enzimas (proteasas) bacterianas fragmentadoras de proteínas. Esto es evidente gracias a que la “buena confidente” galactosidasa está “escondida” y no se muestran apéndices de la somatostatina, que en otro caso se fragmentarían. Científicamente se dice: mediante su expresión como “proteína de fusión con acción propia de las bacterias”, la somatostatina exógena de las bacterias se protege de la degradación por las proteasas bacterianas. El resultado fue que la somatostatina sintetizada en E. coli era completamente idéntica a la natural humana. Cada célula forma alrededor de 10000 moléculas de somatostatina. Esto era una hazaña extraordinaria, que animó a obtener otros péptidos. Después de todo, el descubridor de la somatostatina animal, Roger Guillemin(nacido en 1924, premio Nobel en 1977 con Andrew V. Schally y Rosalyn Yalow), tuvo que trabajar con 500000 hipotalamos de cerebro de oveja para obtener aproximadamente cinco miligramos de la sustancia purificada de la hormona somatostatina animal. Solamente ocho litros de la suspensión de las bacterias E. coli recombinantes aportaban ahora la misma cantidad de somatostatina humana.

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Obtención de somatostatina por ingeniería genética.

En el esquema se muestran los procedimientos para sintetizar y clonar un gene híbrido que permitió la producción de la hormona humana somatostatina en la bacteria Escherichia coli. Este fue el primer experimento en que se demostró que es posible producir proteínas humanas en bacterias. En este caso, el gene sintético que codifica para la hormona, el cual estuvo construido a partir de ocho fragmentos de ADN sintéticos, fue unido al extremo del gene que codifica para la enzima b-galactosidasa de la bacteria E. coli y ambos fueron clonados en el plásmido pBR322. Después de transformar a la bacteria con el ADN recombinante, el plásmido híbrido permitió la síntesis de una proteína híbrida b-galactosidasa-somatostatina (con el segmento de somatostatina en el extremo carboxilo de la proteína), que al ser purificada y tratada con bromuro de cianógeno, permitió liberar a la hormona somatostatina, a la cual se le comprobó su actividad biológica.