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• Gonzalo Romero

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Biomarcadores Enzimología Clínica  Introducción Biomarcador es una prueba clínica de laboratorio que es útil para detectar disfunción de un órgano. Son cambios medibles y pueden ser bioquímicos, fisiológicos o morfológicos. En la práctica clínica el estudio de las enzimas séricas es muy importante para el diagnóstico, control y comprensión de una gran variedad de patologías. Por ejemplo, la detección de altos niveles de amilasa sérica contribuye al diagnóstico de pancreatitis o parotiditis. Las enzimas séricas, presentes en el plasma, pueden tener o no función en ese medio. En este sentido, se las clasifica como funcionales o no funcionales. Algunas enzimas tienen amplia distribución tisular, mientras que otras son específicas de un determinado tejido. Esta mayor o menor especificidad es importante para el diagnóstico. Una vez en el plasma cada enzima sufre un proceso de depuración que le es característico y por lo tanto resulta de gran utilidad conocer cuál es su vida media.  Clasificación Las enzimas que se encuentran en el plasma pueden dividirse para su estudio en dos grupos: enzimas funcionales y enzimas no funcionales. Las enzimas funcionales tienen una función definida y específica en este medio, por lo que el plasma constituye su sitio normal de acción, y su concentración plasmática es equivalente o mayor que la del tejido donde se producen. A este grupo pertenecen la seudocolinesterasa, ceruloplasmina, lipoproteinlipasa, así como las enzimas que intervienen en la coagulación. La determinación de la actividad de estas enzimas tiene interés clínico en la evaluación tanto de la función propia de la enzima en el estudio como de la función del tejido que la produce. Las enzimas no funcionales del plasma no tienen una actividad conocida en este medio, ya sea porque no dispone de la cantidad necesaria de sustratos, cofactores o activadores a nivel plasmático, o porque su concentración plasmática es considerablemente menor que los niveles titulares. Sin embargo, normalmente existen niveles circulantes detectables de la mayoría de las enzimas no funcionales debido a la renovación celular natural o pequeños traumatismos espontáneos. Su presencia en plasma en niveles más altos de lo normal sugiere un aumento en la velocidad de destrucción celular y tisular. La determinación de estos niveles de enzimas plasmáticas puede proveer información valiosa para diagnóstico y pronóstico. Sin embargo, niveles elevados de enzimas en plasma no sólo pueden ser interpretados como evidencia de necrosis celular, ya que existen ejemplos donde dicho aumento puede deberse a un cambio en la permeabilidad de la membrana celular, como ocurre en músculo ante la realización de ejercicio vigoroso. Un aumento en la permeabilidad de la membrana plasmática de diferentes tejidos puede conducir a la liberación de enzimas a la circulación general. Algunas de las enzimas que corresponden a este grupo son: aspartato amino transferasa (ASAT) o glutámico-oxalacético transaminasa (GOT), alanina amino transferasa (ALAT) o glutámico pirúvico transaminasa (GPT), lactato deshidrogenada (LDH), creatín quinasa (CK), amilasa, y-glutamiltranspeptidasa (y-GT), 5'nucleotidasa y aldolasa (ALS).

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Enzimas séricas de uso clínico más frecuente

ENZIMA

ORGANO O ENFERMEDAD DE INTERES

Fosfatasa ácida Fosfatasa alcalina Amilasa

Carcinoma de próstata Enfermedades hepáticas y óseas Enfermedades pancreáticas Enfermedades hepáticas

Transaminasa glutámico-pirúvico (GPT o ALAT) Transaminasa glutámico-oxalacético (GOT o ASAT) Lactato deshidrogenada (LDH) Creatina quinasa (CK) 5'nucleotidasa y aldolasa (ALS) Gama-glutamiltranspeptidasa (γ-GT), Aldolasa Arginasa Elastasa Seudocolinesterasa Plasmina Lipasa

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Hepatopatías y cardiopatías Hígado, corazón y eritrocito Corazón, músculo y cerebro hepatopatías hepatopatías Músculo, corazón hepatopatías Enfermedades del colágeno Hígado (intoxicaciones) coagulopatías Páncreas

Características generales de algunas biomarcadores y enzimas séricas frecuentemente utilizados:

Mioglobina (Mb) La Mioglobina es una hemoproteína que se encuentra en el citoplasma de músculo esquelético y cuya función es almacenar oxigeno. Ante un daño en miocardio o musculo esquelético se elevan sus niveles en plasma. En el infarto agudo de miocardio se produce una elevación precoz a las 2-3 hs de comenzado el evento, se observa un valor máximo entre las 6 y 12 hs, regresando a los valores de referencia a las 2432 hs. Troponinas cardíacas Actualmente se acepta a las troponinas como marcadores tempranos confiables para la detección de episodios isquémicos de miocardio y el posterior monitoreo del paciente. Existen tres tipos de Troponinas (Tn); TnC: une calcio, Tn I: inhibidor de la actividad de ATPasa de la miosina y TnT: fija a complejo proteico de troponinas a la tropomiosina. La TnI presenta tres isoformas, una de ellas es específica de miocardio, aumenta en sangre en las primeras 4 hs luego de establecida la isquemia, realiza un pico máximo entre las 14-24 hs y permanece elevada 3 a 5 días posteriores al infarto. La TnT presenta 3 isoformas, la TnT tipo 2 es un marcador cardíaco específico, aumenta dentro de las primeras 4 hs de producido el infarto, alcanza un pico máximo a las 72 hs y permanece elevada durante 7 a 14 dias. La medición de TnI y TnT es un biomarcador sensible y específico. Péptido Natriurético La familia de péptidos natriuréticos consiste en 3 péptidos:

ANP péptido natriurético atrial BNP péptido natriurético cerebral, se encuentra en SNC pero abunda en ventrículos cardíacos. CNP péptido natriurético tipo C Ante un estiramiento excesivo de las fibras cardíacas aumenta en sangre el BNP, para disminuir la retención de agua y sal. Los pacientes con alteraciones cardíacas congestivas tienen concentraciones plasmáticas elevadas de ANP y BNP. Elevados valores de BNP indican baja supervivencia a largo plazo. Los pacientes con EPOC que presentan valores elevados de BNP tienen un peor pronóstico. Lactato deshidrogenasa (LDH) La enzima LDH cumple su función en el metabolismo anaeróbico de la glucosa en una gran cantidad de tejidos. Está constituida por cuatro subunidades que se combinan dando cinco tipos distintos de isoenzimas. Los niveles séricos aumentados de LDH son característico de: anemias megaloblásticas, infarto de miocardio y pulmonar, anemias hemolíticas, leucemias, carcinomas, etc. El gran número de situaciones donde se observa aumento de la actividad de LDH, hace relativa su utilidad diagnóstica. Un aumento de los niveles plasmáticos de LDH se observa a partir de las 6-12hs del comienzo de infarto de miocardio, observándose un pico a las 24-48 hs. Sin embargo es importante destacar que por si sola, la determinación de LDH no es determinante de lesión de ningún órgano en particular. Sin embargo, es muy útil en el seguimiento de pacientes en tratamiento del cáncer con quimioterapia, puesto que la respuesta a la terapéutica se acompaña por una disminución del nivel sérico de esta enzima. Hay que tener en cuenta que es necesario evitar la hemólisis de la muestra de sangre para evitar falsos positivos, debido a la gran cantidad de LDH presente en los eritrocitos (110 veces mayor que en plasma). Transaminasas Las enzimas transaminasas intervienen en el metabolismo de los aminoácidos, están ampliamente distribuidas en los distintos tejidos, pero abundan fundamentalmente en músculo e hígado. La Glutámico Oxaloacético Transaminasa (GOT o ASAT) es una transaminasa bilocular, utilizada como marcador de hepatitis y neoplasias hepáticas. También aumenta en isquemia miocárdica, aumentando después de las 24 hs de ocurrido el infarto, con un pico entre el 4 o 5 día. La Glutámico Pirúvico Transaminasa (GPT o ALAT) es una transaminasa de actividad citosólica. Valores séricos muy elevados se observan en hepatitis aguda de origen viral o tóxica, siendo los valores de GPT mayores a los de GOT. Los niveles de GPT pueden dar aumentados incluso antes de que se observen signos clínicos de hepatitis. En enfermedades crónicas hepáticas como hepatitis C y Cirrosis, se observan aumentos moderados. Fosfatasas Fosfatasa alcalina: es una enzima no específica cuyo pH óptimo de actividad enzimática se encuentra entre 9 a 10. Presenta isoenzimas que se caracterizan por distinta localización tisular y diferentes temperaturas de actividad óptima. La fosfatasa alcalina de origen óseo constituye el 50% de la actividad normal total plasmática, por tal motivo los valores de referencia en niños es mayor que en los adultos. Aumenta drásticamente (10 a 25 veces el valor de referencia de Fosfatasa Alcalina Total) en enfermedades óseas en las que aumenta la actividad de los osteoblastos, es termolábil (se destruye a 56ºC en 10 minutos). La isoenzima de células epiteliales de canalículos biliares, representa el 10% de la actividad enzimática total normal en plasma, en ictericias obstructivas por litiasis o cáncer de cabeza de páncreas, aumentan de 10 a 12 veces los valores de referencia. La isoforma de origen hepático, representa un 25% de la actividad total normal en plasma. Un aumento moderado de 2 a 3 veces los valores de referencia, se observa en las enfermedades hepáticas como hepatitis viral, alcohólica o carcinoma hepatocelular.

Fosfatasa ácida: se denomina así por presentar valores de actividad óptima en un rango de pH entre 4 y 6. Se encuentra en células prostáticas, glóbulos rojos, plaquetas y glóbulos blancos. Aumenta en cáncer de próstata dando valores muy elevados en caso de metástasis ósea. Debido a que las células sanguíneas presentan la enzima, es importante que no se produzca la hemólisis de la muestra. Creatina quinasa (CK ó CPK) Es una enzima bilocular de células musculares y nerviosas, interviene en los procesos de obtención de energía. Presenta tres tipos de isoenzimas. Los valores séricos de referencia son mayores en hombres que en mujeres por presentar mayor masa muscular. Un aumento de los niveles totales séricos se observa en infarto de miocardio, miopatía, distrofia muscular y ACV. Para el diagnóstico diferencial es importante la medición de las isoenzimas.  Distribución tisular de las enzimas. En términos muy generales, las diferencias en el contenido enzimático son puramente cuantitativas, es decir, las mismas enzimas están presentes en su mayoría en diversos tejidos, pero sus actividades relativas muestran grandes diferencias de órgano a órgano. Por lo tanto el mapa enzimático es la descripción de un órgano en términos de su contenido enzimático. El mapa enzimático tisular está constituido, por la cantidad de cada una de las distintas enzimas que contienen todas las células de un determinado órgano. Tanto en condiciones normales como patológicas, esto se ve reflejado en un mapa enzimático sérico (presencia en el suero de las enzimas presentes en un órgano). Su determinación es de vital importancia en la clínica, ya que facilita el diagnóstico y es de fácil accesibilidad. La medida de los diversos mapas enzimáticos séricos, por su parte, constituye el intento de lograr la especificidad bioquímica de los diferentes órganos. Cuanto mayor sea la cantidad de enzimas que se determinen, más completo será el mapa y mejor podrá determinarse el cuadro patológico. Aunque desde el punto de vista biológico son muchas las enzimas objeto de atención, el interés clínico se centra en el estudio de aquellas cuyas variaciones son patognomónicas, es decir, indicadoras de enfermedad o, por lo menos, de determinadas alteraciones funcionales. Existen enzimas llamadas isoenzimas que son proteínas que difieren en la secuencia de aminoácidos pero que catalizan la misma reacción, estando presentes en la misma especie. Estas enzimas poseen diferentes propiedades físicas y químicas (punto isoeléctrico, especificidad de sustrato y cofactor, etc), suelen mostrar diferentes parámetros cinéticos (i.e. diferentes valores de KM), o propiedades de regulación diferentes. La existencia de las isoenzimas permite el ajuste del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un determinado tejido o etapa del desarrollo, por lo tanto su diferenciación es importante a la hora de realizar un mapa enzimático para diagnóstico. Por ejemplo, la creatina quinasa (CK) presente en el cerebro difiere fisicoquímicamente de sus isoenzimas específicas de músculo cardíaco y esquelético. Asimismo, las isoenzimas pueden tener distinta localización subcelular como por ejemplo la glutámico oxalacética transaminasa (GOT) presente en mitocondria difiere de la citosólica. En cambio las diferentes isoenzimas de la láctico deshidrogenada (LDH) están presentes en compartimientos citosólicos. Es adecuado determinar más de una enzima en el suero, por el hecho de no existir enzimas que sean simultáneamente órganoespecíficas y lo suficientemente sensibles.  Características clínicas La alteración del mapa enzimático sérico se correlaciona con distintas causas, entre ellas: - Procesos inflamatorios: aparecen en plasma en primer término enzimas de bajo e intermedio peso molecular (por ej: en las hepatitis, encima de entre 40.000 a 140.000 Da). - Lesión de la membrana celular: el nivel de enzimas en suero que se observa en una lesión, es generalmente proporcional a la magnitud de membrana celular afectada. - Daños celulares: ante daños mínimos pasan a la sangre las enzimas citoplasmáticas y en caso de daño extenso o más intenso, lo hacen las enzimas localizadas en las membranas de las

organelas (por ej: la glutámico deshidrogenasa (GLDH) mitocondrial). Factores que alteran la permeabilidad selectiva de la membrana celular: provocan la salida al espacio extracelular de enzimas intracelulares. Los más conocidos son: • Baja concentración de oxígeno (hipoxia). • Alteraciones en la osmolaridad del medio. • Agentes químicos (iodoacetato, cianuro, tetracloruro de carbono). • Agentes físicos (pH, temperatura). • Algunos virus. Para los fines diagnósticos, una elevación de las enzimas celulares en el plasma es equiparable a una lesión celular. Es importante tener en cuenta que las enzimas cuyos niveles aumentan en suero raramente derivan de una necrosis celular sino que lo hacen por un grado sucesivo de liberación debido a que la biosíntesis enzimática se conserva mientras la célula vive. En los casos extremos de necrosis, después de un breve lapso, las actividades en el suero disminuyen por falta de nuevos aportes debido a una biosíntesis proteica considerablemente disminuida o nula. -

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Depuración de enzimas plasmáticas no funcionales

Una vez en el plasma, la actividad de las diversas enzimas decrece con una velocidad característica para cada una de ellas: tiempo de vida media. Comparadas con otras proteínas del suero, las enzimas séricas poseen un tiempo de vida media muy corto. Esto significa, por una parte, que sus actividades en el suero son representativas del curso temporal de la lesión que les dio origen, y por otra, que en las lesiones agudas, como por ejemplo el infarto de miocardio, las determinaciones enzimáticas deben ser efectuadas según el tiempo transcurrido luego de la lesión:

Enzima

Vida media promedio

Transaminasa glutámico-pirúvico (GPT o ALAT) Transaminasa glutámico-oxalacético t (GOT o ASAT) Glutamato deshidrogenasa (GLDH) Lactato deshidrogenada (LDH) Creatina quinasa (CK) Fosfatasa alcalina Gama-glutamiltranspeptidasa (γ-GT), Colinesterasa (CHE) Amilasa Lipasa

47±10 horas 17±5 horas 18±1 horas 113±60 horas 15 horas aproximadamente 3-7 dias 3-4 días 10 días aproximadamente 3-6 horas 3-6 horas

Existen diversas vías de eliminación de las enzimas del suero: a- Eliminación renal: se cumple para aquellas de bajo peso molecular. Ej: amilasa y algunas fosfatasas b- Inactivación sérica: existen inactivadores o inhibidores para varias enzimas: Ej: tripsina, quimiotripsina. c- Para algunas enzimas existe recaptación por parte de los tejidos convalecientes, al restablecerse anatómica y fisiológicamente. Esta pequeñísima parte de las enzimas previamente liberadas sería utilizada, no para su función primitiva, sino como integrante de un “pool” (reservorio) de aminoácidos.

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Localización del lugar de la lesión

Se pueden utilizar distintos métodos: Medida de biomarcadores o enzimas específicas de órgano: se designa como específicas de órgano a las enzimas que se presentan con actividad relativamente alta en un determinado órgano o tejido. Por lo tanto, sus niveles séricos aumentados indican con seguridad una lesión en este órgano. Por ejemplo la CK es prácticamente específica de músculo, la sorbitol deshidrogenasa (SDH), y la glutamato dehidrogenasa (GLDH) son altamente específica de hígado, en tanto que la lipasa lo es de páncreas. El valor diagnóstico de la determinación de las enzimas específicas de órgano puede aumentarse considerablemente por la determinación simultánea de la actividad de otras enzimas. Al presentarse síntomas poco claros, sobre todo en casos de urgencia (ej: infarto de miocardio, abdomen agudo) tales mapas enzimáticos sirven para un rápido diagnóstico diferencial. Discriminación de isoenzimas: la determinación de la actividad de varias isoenzimas son metodológicamente más costosas que las medidas de la actividad total de una enzima. Sólo se emplea a algunos casos particulares. Por ejemplo: 1.- Bajo la sospecha de carcinoma prostático, resulta de interés la determinación de la actividad de la isoenzima de la fosfatasa ácida susceptible a inhibición por tartrato, ya que esta isoenzima es específica de la próstata. En la actualidad se utiliza como biomarcador la determinación de PSA ( antígeno prostático específico). 2.- Las cinco isoenzimas de la LDH tienen el mismo peso molecular pero difieren en la carga que contienen. Esta diferencia es el principio de la determinación diferencial, que se realiza por separación electroforética. La fracción con mayor movilidad hacia el ánodo (polo negativo) es la isoenzima de tipo LDH-1 y la de menor movilidad es la LDH-5. Como la vida media de las LDH-1 (HHHH) (específica de corazón) es diez veces mayor que la de la LDH-5 (MMMM), específica de músculo esquelético, después de un infarto de miocardio se puede comprobar la preponderancia de la isoenzima cardio-específica aún cuando la actividad de LDH total retorne a los valores normales. ISOENZIMA

SUBUNIDADES

LDH-1 LDH-2 LDH-3 LDH-4 LDH-5

HHHH HHHM HHMM HMMM MMMM

Tejidos en donde se encuentra mayoritariamente Miocardio, eritrocito Miocardio, eritrocito

Niveles normales en el adulto* 17-27% 27-37% Células linfoide, cerebro , riñón 18-25% Hígado, músculo esquelético 3-8% Hígado, músculo esquelético