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ENZIMAS 1) DEFINICIÓN DE ENZIMA, CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS EN UNA REACCIÓN QUÍMICA Rta/ Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible, pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. 1. Naturaleza proteica Las proteínas están formadas por numerosos aminoácidos, que se agrupan a través de uniones peptídicas, formando largas cadenas. Esas cadenas suelen formar espirales, enrollamientos y plegamientos. Es por ello que las enzimas adoptan una estructura característica que es muy importante a la hora de ejercer su función catalítica. En general las enzimas son proteínas globulares. 2. Especificidad Las enzimas en general tienen una alta especificidad de sustrato, lo que significa que pueden “reconocer” al compuesto químico que deben procesar y anclarlo en lo que se conoce como “sitio activo”. El sustrato “encaja” en dicho sitio activo, tal como una llave encaja en el diseño de una cerradura. A veces, compuestos muy parecidos entre sí pueden insertarse en el mismo sitio activo, a esto se le llama “inhibición competitiva” de una reacción. 3. Diferente localización Si consideramos la estructura de la célula, algunas enzimas se localizan en el citosol, otras en las membranas plasmáticas, otras en ciertas organelas (ejemplo: mitocondrias, peroxisomas, cloroplastos), aunque también hay enzimas que se pueden localizar en diferentes estructuras. También vale la pena aclarar que algunas enzimas son liberadas hacia el exterior de la célula (extracelulares), en tanto que otras permanecen siempre en el interior de aquellas (intracelulares). 4. Diferentes condiciones óptimas Las enzimas suelen ser activas en determinado rango de condiciones de temperatura y pH, con un óptimo donde su velocidad de reacción es máxima. La mayoría de las enzimas del cuerpo humano funcionan bien a 36-37 °C, que es la temperatura corporal. Para algunas bacterias que viven en ambientes extremos, la temperatura óptima puede ser bastante diferente que esa, también el pH óptimo. A veces hay subgrupos dentro de un mismo tipo de enzima con diferentes óptimos de pH (por ejemplo: fosfatasas ácidas y fosfatasas alcalinas). 5. Se requieren en mínimas concentraciones Dada esta especificidad que las caracteriza, solo es necesario una cantidad muy pequeña de estas proteínas para llevar adelante los procesos metabólicos normales, pues funcionan como una línea de montaje muy eficiente, que en cuestión de segundos transforman un compuesto o varios en otro. 6. Mínimos cambios pueden derivar en su inactivación Se debe tener presente que a veces el cambio de unos pocos aminoácidos puede significar la reducción de la actividad de una enzima o incluso la pérdida total de su actividad. Asimismo, las enzimas se pueden oxidar, por ejemplo, y bajo esas condiciones podrían verse imposibilitadas de catalizar una reacción. 7. Algunos agentes conducen a su activación Algunos compuestos pueden unirse a la enzima, no en el sitio activo, sino en otra posición, y motivar un cambio conformacional que derive en su activación. A estos se los llama activadores o efectores alostéricos. 8. Tipos de enzimas

Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo general de reacción que catalizan. Algunos grupos muy importantes los conforman las enzimas hidrolíticas (que catalizan hidrólisis), las óxido-reductasas (que catalizan reacciones rédox), las oxigenasas (que introducen oxígeno en la molécula), las polimerasas(que van uniendo unidades a una estructura repetitiva), las fosfatasas (que liberan grupos fosfato de una molécula). 9. Usos industriales La habilidad que tienen algunas enzimas para llevar adelante un proceso a veces se aprovecha a una escala industrial, con los ajustes necesarios para el cambio de escala. Por ejemplo, en la industria panadera se utiliza la amilasa, que es la enzima que degrada el almidón y lo convierte en azúcares más sencillos; estos azúcares simples son luego utilizados por las levaduras que intervienen en la fabricación del pan. También se emplean proteasas para romper la estructura del gluten y permitir un buen amasado, al lograr una masa más plástica. 10. A menudo requieren cofactores Algunas enzimas necesitan de la presencia simultánea de otras sustancias no proteicas para poder operar. Estas sustancias suelen ser iones metálicos (cobre, manganeso, magnesio) o sustancias orgánicas, en este último caso se las suele designar también como coenzimas. 2) ¿QUÉ ES VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN ENZIMÁTICA? La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética y de la dinámica química de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas. 3) ¿CUÁLES SON LAS SUSTANCIAS QUE PARTICIPAN EN UNA REACCIÓN QUÍMICA? Una reacción química, también llamada cambio químico o fenómeno químico, es todo proceso termodinámico en el cual una o más sustancias (llamadas reactantes o reactivos), se transforman, cambiando su estructura molecular y sus enlaces, en otras sustancias, llamadas productos. Los reactantes pueden ser elementos o compuestos. Un ejemplo de reacción química es la formación de óxido de hierro producida al reaccionar el oxígeno del aire con el hierro de forma natural, o una cinta de magnesio al colocarla en una llama se convierte en óxido de magnesio, como un ejemplo de reacción inducida. 4) ¿QUÉ SIGNIFICA SUSTRATO, PRODUCTO, APOENZIMA, HOLOENZIMA, ISOENZIMA, COFACTOR, GRUPO PROSTÉTICO, CENTRO ACTIVO, CENTRO DE FIJACIÓN AL SUSTRATO, CENTRO ALOSTÉRICO? DÉ EJEMPLO DE CADA UNO. SUSTRATO: En bioquímica, un sustrato es una molécula sobre la cual actúa una enzima. Las enzimas catalizan reacciones químicas que involucran sustrato(s). El sustrato se une al sitio activo de la enzima, y se forma un complejo enzima-sustrato. Por acción de la enzima, el sustrato se transforma en producto, se libera del sitio activo y queda libre para recibir otro sustrato. La ecuación general es la siguiente: E + S ⇌ ES → EP ⇌ E + P Donde E = enzima, S = sustrato(s), P = producto(s) (Nótese que sólo el paso del medio es irreversible.) Mediante el incremento de la concentración de sustrato, la velocidad de la reacción aumentará debido al aumento de la probabilidad de formación de complejos enzima-sustrato. Esto ocurrirá hasta que no haya más enzimas disponibles para la formación de complejos enzima-sustrato, lo que corresponde a un punto en que la velocidad ya no aumenta. La concentración de enzimas constituye el factor limitante. PRODUCTO: Es la molécula o moléculas finales de una ruta metabólica y también, la molécula o moléculas que se obtienen tras la acción de una enzima. APOENZIMA: Las apoenzimas son enzimas que carecen de los componentes químicos apropiados para realizar la actividad catalítica, por ello, se ayudan de otras sustancias no proteicas, denominadas cofactores que, fijadas en su superficie mediante enlaces covalentes o débiles, le aportan a la enzima los grupos y funciones químicas que necesita. En estos casos, la parte proteica de la enzima se denomina apoenzima y la fracción no proteica es el cofactor.

HOLOENZIMA: Una holoenzima es una enzima que está formada por una apoenzima y un cofactor, que puede ser un ion o una molécula orgánica compleja unida (grupo prostético) o no (una coenzima). En resumidas cuentas, es una enzima completa y activada catalíticamente. ISOENZIMA: Las isoenzimas o isozimas son enzimas que difieren en la secuencia de aminoácidos, pero que catalizan la misma reacción química. Estas enzimas suelen mostrar diferentes parámetros cinéticos, o propiedades de regulación diferentes. La existencia de las isoenzimas permite el ajuste del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un determinado tejido o etapa del desarrollo. En bioquímica, las isoenzimas son isoformas (variantes estrechamente relacionadas) de las enzimas. COFACTOR: Un cofactor es un componente no proteico, termoestable y de baja masa molecular, necesario para la acción de una enzima. El cofactor se une a una estructura proteica, denominada apoenzima, y el complejo apoenzimacofactor recibe el nombre de holoenzima. Aquellos cofactores que están covalentemente unidos a la apoenzima se denominan grupos prostéticos, ya sean orgánicos (coenzimas) o inorgánicos. Los cofactores son básicamente de dos tipos, iones metálicos y moléculas orgánicas, denominadas coenzimas. Ej: Mg, K, Cu, Mn GRUPO PROSTÉTICO: Un grupo prostético es el componente no aminoacídico que forma parte de la estructura de las heteroproteínas o proteínas conjugadas, estando unido covalentemente a la apoproteína. No debe confundirse con el cofactor que se une a la apoenzima de las enzimas (ya sea una holoproteína o heteroproteína) por enlace no covalente. Ej: Biotina (carboxilación), pirofosfato de tiamina (descarboxilación) CENTRO ACTIVO: El sitio o centro activo es la zona de la enzima en la que se une el sustrato para ser catalizado. La reacción específica que una enzima controla depende de un área de su estructura terciaria. Dicha área se llama el sitio activo y en ella ocurren las actividades con otras moléculas. Debido a esto, el sitio activo puede sostener solamente ciertas moléculas. Las moléculas del sustrato se unen al sitio activo, donde tiene lugar la catálisis. La estructura tridimensional de éste es lo que determina la especificidad de las enzimas. En el sitio activo sólo puede entrar un determinado sustrato. Dentro del centro activo hay ciertos aminoácidos que intervienen en la unión del sustrato a la enzima y se denominan residuos de unión, mientras que los que participan de forma activa en la transformación química del sustrato se conocen como residuos catalíticos. CENTRO ALOSTÉRICO: Región de una enzima donde interacciona una determinada molécula (efector alostérico), produciendo la activación o la inhibición de la enzima. 5) ¿CÓMO SE NOMBRA UNA ENZIMA? A cada enzima se le asignan dos nombres. El primero es corto y es como se conoce a la proteína de manera coloquial, es el nombre sugerido. El segundo es más completo e infiere propiedades sobre la reacción que la enzima desarrolla, se le conoce como nombre sistemático, este nombre permite reconocer a la enzima sin ambigüedad y localizarla en el metabolismo. Nombre sugerido Muchas de las enzimas poseen en su nombre el sufijo “-asa” unido al nombre del substrato de la reacción que cataliza, por ejemplo: - Ureasa: proteína cuyo sustrato es la urea - Lactasa: proteína cuyo sustrato es la lactosa También suele utilizarse este sufijo a la descripción de la reacción que la enzima cataliza: - Lactato deshidrogenasa: deshidrogena (le quita Hidrógenos) al lactato - Adenilato ciclasa: hace un ciclo en la adenina. 6) DIGA LAS CLASES DE ENZIMAS Y SUBCLASES Óxido-reductasas: estas enzimas están vinculadas con las reducciones y oxidaciones biológicas que intervienen en los procesos de fermentación y de respiración. Estas son esenciales en ciertas cadenas metabólicas como por ejemplo la escisión enzimática de la glucosa y en la producción de ATP. Catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir, transferencia de hidrógeno (H) o electrones (e -) de un sustrato a otro, según la reacción general:

AH2 + B

Ared + Box

A + BH2

Aox + Bred

Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo c oxidasa. Las oxidorreductasas se clasifican con el número 1 según el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, teniendo las siguientes clases.                      

EC 1.1, actúan con grupos CH-OH como donantes. (prostaglandina-F sintasa) EC 1.2, actúan con grupos aldehído o cetona como donantes. EC 1.3, actúan con grupos CH-CH como donantes. EC 1.4, actúan con grupos CH-NH2 como donantes. EC 1.5, actúan con grupos CH-NH como donantes. EC 1.6, actúan en la NADH o NADPH. EC 1.7, actúan con otros compuestos nitrogenados como donantes. EC 1.8, actúan con grupos de azufre como donantes. EC 1.9, actúan con grupos hemo como donantes. EC 1.10, actúan con difenoles o compuestos relacionados como donantes. EC 1.11, peroxidasas. EC 1.12, actúan con hidrógeno como donante. EC 1.13, actúan con un donante con la incorporación de oxígeno molecular. EC 1.14, actúan con dos donantes con la incorporación o reducción de oxígeno molecular. EC 1.15, actúan con superóxido como aceptor. EC 1.16, actúan oxidando iones metálicos. EC 1.17, actúan en grupos CH o CH2. EC 1.18, actúan con proteínas de hierro-azufre como donantes. EC 1.19, actúan con flavodoxina reducida como donante. EC 1.20, actúan con fósforo o arsénico como donante. EC 1.21, actúan en enlaces x-H y y-H para formar un enlace x-y. EC 1.97, Otras oxidorreductasas.

Transferasas: estas enzimas son las encargadas de catalizar la transferencia de una porción de molécula a otra. Además, estas enzimas son las que actúan sobre distintos sustratos, transfiriendo glucosilo, sulfato, amina, aldehído, entre otros grupos. Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro, según la reacción:

A-B + C

A + C-B

Un ejemplo es la glucoquinasa, que cataliza la reacción representada en la Figura de la derecha: glucosa + ATP

ADP + glucosa-6-fosfato

Corresponden al EC 2 en la catalogación mediante números EC. Sus subclases son:       

EC 2.1, incluye enzimas que transfieren grupos de un sólo carbono (metiltransferasas) EC 2.2, incluye enzimas que transfieren grupos aldehído o cetona EC 2.3, incluye aciltransferasas EC 2.4, incluye glicosiltransferasas EC 2.5, incluye enzimas que transfieren grupos alquilo o arilo EC 2.6, incluye enzimas que transfieren grupos con nitrógeno; (transaminasas) EC 2.7, incluye enzimas que transfieren grupo fosfato; (fosfotransferasas, incluyendo a polimerasas y quinasas)

 

EC 2.8, incluye enzimas que transfieren un grupo sulfurado (sulfuro transferasas y sulfotransferasas) EC 2.9, incluye enzimas que transfieren grupos que contienen selenio

Hidrolasas: estas enzimas actúan sobre las moléculas de protoplasma, tales como las de grasas, de glicógeno y de proteínas. El acto de catalizar es realizado en la escisión de los enlaces de los átomos de nitrógeno y carbono o bien, de carbono y oxígeno. Al mismo tiempo se adquiere la hidrólisis de las moléculas de agua de la que devienen las moléculas de hidrógeno y oxidrilo, que se unen a las moléculas resultantes de la ruptura de enlaces de las moléculas mencionadas. Dentro de estas enzimas se encuentran proteínas como la quimiotripsina, la tripsina y la pepsina que son esenciales en la digestión ya que son las que hidrolizan enlaces estéricos, glucosídicos y pépticos. Catalizan las reacciones de hidrólisis: A-B + H2O

AH + B-OH

Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reacción: lactosa + agua

glucosa + galactosa

Pertenecen a la categoría EC 3 en la numeración EC. Poseen como subclases:             

EC 3.1: Actúan sobre enlaces éster. (Esterasas, nucleasas, fosfodiesterasas, lipasas, fosfatasas) EC 3.2: Glicosidasas. EC 3.3: Actúan sobre enlaces éter. EC 3.4: Actúan sobre enlaces peptídicos. (Peptidasas) EC 3.5: Actúan sobre enlaces carbono-nitrógeno no peptídicos.(Arginasas) EC 3.6: Actúan sobre los anhídridos de los ácidos. (Helicasas, GTPasa) EC 3.7: Actúan sobre los enlaces carbono-carbono. EC 3.8: Actúan sobre los enlaces haluro. EC 3.9: Actúan sobre los enlaces fósforo-nitrógeno. EC 3.10: Actúan sobre los enlaces azufre-nitrógeno. EC 3.11: Actúan sobre los enlaces carbono-fósforo. EC 3.12: Actúan sobre los enlaces azufre-azufre. EC 3.13: Actúan sobre los enlaces carbono-azufre.

Isomerasas: estas son las que actúan sobre ciertas sustancias a las que transforman en otras isómeras, lo que significa que tienen la misma fórmula empírica pero un desarrollo diferente.

fosfotriosa isomerasa

gliceraldehído-3-fosfato

dihidroxiacetona-fosfato

fosfoglucosa isomerasa

glucosa-6-fosfato

fructosa-6-fosfato

Acetolactato mutasa:Proteína mitocondrial que cataliza la siguiente reacción: 2-acetolactato3-hidroxi-3-metil2-oxobutanato. Su cofactor es el ascorbato. Interviene en la biosíntesis de valina, leucina e isoleucina. Su cofactor es el ácido ascórbico, y precisa de él para realizar su labor.-También convierte el 2-aceto-2-hidroxibutanato en 3hidroxi-3-metil-2-oxopentanato. Mutasa: Enzima que cataliza la transferencia intramolecular de un grupo funcional como el fosforilo. La transferencia no tiene por qué ser directa sino que puede implicar un enzima fosforilado intermedio Crotonasa: (3-hidroxibutiril-CoA deshidratasa) Enzima que cataliza la siguiente reacción: (3R)-3-hidroxibutationilCoA crotonil-CoA + H2O. También actúa sobre los tioésteres crotoniles como una proteína transportadora de acilo. Corismato mutasa: Enzima que interviene en el primer paso de la síntesis de la fenilalanina y la tirosina. Se trata de una enzima que cataliza la reacción que origina prefenato a partir del corismato. Liasas: estas enzimas son las que actúan sobre los enlaces entre los átomos de carbono, carbono y oxígeno, carbono y azufre o carbono y nitrógeno, escindiéndolos. Catalizan reacciones de ruptura o soldadura de sustratos: A-B

A+B

Un ejemplo es la acetacetato descarboxilasa, que cataliza la reacción: ácido acetacético

CO2 + acetona

Corresponden al EC 4 en la catalogación mediante números EC. Sus subclases son: EC 4.1 Liasas Carbón-Carbón_ Esta subclase incluye enzimas que rompen enlaces carbono-carbono como las descarboxilasas (EC 4.1.1), los aldehído-liasas catalizan la reversión de una condensación aldólica (CE 4.1.2), y los oxoácido-liasas, que catalizan la ruptura de un ácido 3-hidroxi (EC 4.1.3), o las reacciones inversas. EC 4.2 Liasas Carbón-Oxígeno: Esta subclase incluye enzimas que rompen enlaces carbono-oxígeno como las hidroliasas con la eliminación de agua (EC 4.2.1), las que actúan sobre polisacáridos con la eliminación de alcohol (CE 4.2.2), las que actúan sobre sustratos fosfatados con la eliminación de fosfato (CE 4.2.3) y algunas otras que se agrupan en la subclase (CE 4.2.99). EC 4.3 Liasas Carbón-Nitrógeno: Esta subclase contiene las enzimas que liberan amoniaco o uno de sus derivados, con la formación de un doble enlace o un anillo. Algunas catalizan la eliminación real del amoniaco, amina o amida, por ejemplo:

eliminación real del amoniaco, amina o amida Otros, sin embargo, catalizan la eliminación de otro componente, por ejemplo, agua, que es seguido por las reacciones espontáneas que conducen a la rotura del enlace cianuro (CN), por ejemplo: como en CE 4.3.1.17 (L-serina amoníaco liasa), de modo que la reacción global es:

reacción global de la eliminación del amoniaco Es decir, una eliminación con reordenamiento. Las subclases de EC 4.3 son: EC 4.3.1 liasas de amoníaco EC 4.3.2 liasas que actúan en amidas, amidinas , etc, EC 4.3.3 liasas de aminas EC 3.4.99 liasas que actúan sobre enlaces diferentes.

EC 4.4 Liasas Carbón-Azufre: Las enzimas eliminan ácido sulfhídrico (H2S) o derivados sustituidos. Solo existe una sola subclase (EC 4.4.1). EC 4.5 Liasas Carbón-Halogenuro: Esta subclase se estableció originalmente sobre la base de la enzima de eliminación de ácido clorhídrico (HCl) a partir de 1,1,1-tricloro-2,2-bis-etano (DDT). EC 4.6 Liasas Fósforo-Oxígeno: Se incluyen los llamados “nucleotidil-guanilato”, sobre la base de que el difosfato se elimina del trifosfato de nucleósido. Solo existe una subclase (EC 4.6.1) EC 4.7 Liasas Carbón-Fósforo EC 4.99 Otro Liasas:Una subclase de enzimas diversas. g Ligasas: estas enzimas en cambio, son las que permiten que dos moléculas se unan. Esto se da al mismo tiempo en que el ATP se degrada y libera energías que son las necesarias para que dichas moléculas puedan unirse. Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.) A + B + XTP

A-B + XDP + Pi

Un ejemplo es la piruvato carboxilasa, que cataliza la reacción piruvato + CO2 + ATP

oxaloacetato + ADP + Pi

Las ligasas son clasificadas en seis subclases con un sistema EC-número bajo la categorización de EC 6.-.-.-. El segundo dígito define la naturaleza exacta del enlace: 

EC 6.1, incluye ligasas usadas para formar uniones oxígeno-carbono.  EC 6.1.1 Ligasas forman aminoacil-ARNt y compuestos relacionados.  EC 6.1.2 Ligasas ácido-alcohol (sintasas éster).  EC 6.2, ligasa usadas para formar uniones carbono-azufre.  EC 6.2.1 Ligasas ácido-tiol.  EC 6.3, incluye ligasas usadas para crear uniones carbono-nitrógeno.  EC 6.3.1 Ácido-amoniaco (o amina) ligasas (sintasas amida).  EC 6.3.2 Ligasas ácido-aminoácidos (péptido sintasas).  EC 6.3.3 Ciclo-ligasas.  EC 6.3.4 Otras ligasas carbono-nitrógeno.  EC 6.3.5 Carbono-nitrógeno ligasas con glutamina como amido-N-donador.  EC 6.4, abarca ligasas que forman uniones carbono-carbono.  EC 6.5, incluye ligasa que forman ésteres fosfóricos.  EC 6.6, ligasa usadas como unión nitrógeno-metal.  EC 6.6.1 Formando complejos de coordinación. Sintetasa: Tipo de enzima que cataliza la unión de dos moléculas, acoplada a la hidrólisis de un enlace pirofosfato que pertenece a una molécula de ATP o a un compuesto parecido, formando en este proceso un enlace rico en energía. Carboxilasa: Enzima que participa en reacciones sintéticas en las que se unen dos moléculas a expensas de un "enlace fosfato de alta energía" del ATP. Acetil sintetasa: Enzima clave en la unión del acetilo y la colina para la formación de uno de los neurotransmisores más abundantes en el sistema nervioso, principalmente, periférico, como es la acetilcolina.

8. ¿QUÉ ES CINÉTICA ENZIMÁTICA, COMO SE EXPRESA LA ECUACIÓN DE MICHAEL MENTEN, COMO SE DETERMINA ESTA ECUACIÓN, Y QUÉ SIGNIFICADO TIENE? La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

en donde:

v0 es la velocidad inicial de la reacción Vmax es la velocidad máxima

Km es la constante de Michaelis y Menten= [S] es la concentración de sustrato.

9. ¿QUÉ SIGNIFICADO TIENE EL KM DE UNA ENZIMA? La constante de Michaelis (Km) nos indica la concentración de sustrato a la cuál la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Este parámetro es independiente de la concentración de enzima, y es característico de cada enzima según el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km también indica la afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo ésta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto menor sea la Km menor será la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, por lo que mayor será la afinidad del enzima hacia ese sustrato. 10. Los inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. La unión de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y obstaculizar que la enzima catalice su reacción correspondiente. La unión del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma covalente y modifican su estructura química a nivel de residuos esenciales de los aminoácidos necesarios para la actividad enzimática. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones, dependiendo de la manera como el inhibidor se une a la enzima o al complejo enzima-sustrato.  Inhibición competitiva  Inhibición no competitiva  Inhibición acompetitiva

Inhibidores o sustratos reversibles

Los inhibidores reversibles se unen a las enzimas mediante interacciones no covalentes tales como los puentes de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas y los enlaces iónicos. Los enlaces débiles múltiples entre el inhibidor y el sitio activo se combinan para producir una unión fuerte y específica. Al contrario de lo que ocurre con el sustrato y los inhibidores irreversibles, los inhibidores reversibles generalmente no experimentan reacciones químicas cuando se unen a la enzima y pueden ser eliminados fácilmente por dilución o por diálisis. Existen tres tipos de inhibidores reversibles. Se clasifican en base al efecto producido por la variación de la concentración del sustrato de la enzima en el inhibidor. En la inhibición competitiva, el sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como se muestra en la figura de la derecha. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima en el que también se une el sustrato; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibición se puede superar con concentraciones suficientemente altas del sustrato, es decir, dejando fuera de competición al inhibidor. Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al sustrato verdadero (ver ejemplos expuestos más abajo). En la inhibición no competitiva, el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo tiempo que el sustrato. Sin embargo, la unión del inhibidor afecta la unión del sustrato, y viceversa. Este tipo de inhibición se puede reducir, pero no superar al aumentar las concentraciones del sustrato. Aunque es posible que los inhibidores de tipo mixto se unan en el sitio activo, este tipo de inhibición resulta generalmente de un efecto alostérico donde el inhibidor se une a otro sitio que no es el sitio activo de la enzima. La unión del inhibidor con el sitio alostérico cambia la conformación (es decir, la estructura terciaria o la forma tridimensional) de la enzima de modo que la afinidad del sustrato por el sitio activo se reduce. La inhibición mixta, es una forma de inhibición mixta donde la unión del inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unión con el sustrato. Como resultado, el grado de inhibición depende solamente de la concentración de inhibidor. Ejemplos de inhibidores reversibles Puesto que las enzimas han evolucionado para unirse a sus sustratos fuertemente, y la mayoría de los inhibidores reversibles se unen al sitio activo de las enzimas, es poco sorprendente que algunos de estos inhibidores sean muy similares en estructura a los sustratos de sus dianas. Como ejemplo de estos imitadores de sustratos caben destacar los inhibidores de la proteasa, una clase muy efectiva de fármacos antirretrovirales usados para tratar el VIH. La estructura del, un inhibidor de la proteasa, consiste en un péptido con tres enlaces peptídicos. Dicha estructura se asemeja a la proteína que es el sustrato de la proteasa del VIH, por lo que ambos compiten por la unión al sitio activo de la enzima.8 Los inhibidores enzimáticos son a menudo diseñados para imitar el estado de transición o intermedio de una reacción catalizada por una enzima. Esto asegura que el inhibidor cambie el estado de transición estableciendo un efecto en la enzima, lo que resulta en una afinidad de unión mejor (baja Ki) que los diseños basados en sustratos. Un ejemplo de un inhibidor en ese estado de transición es el fármaco antiviral oseltamivir, que imita la naturaleza plana del anillo del ion oxonio en la reacción de la neuraminidasa, una enzima del virus.9 Sin embargo, no todos los inhibidores están basados en la estructura del sustrato. Por ejemplo, la estructura de otro inhibidor de la proteasa del VIH, el tipranavir, (representada a la izquierda), no está basada en un péptido y no tiene similitudes estructurales obvias con la proteína sustrato. Estos inhibidores no peptídicos pueden ser más estables que los inhibidores que contienen enlaces peptídicos porque estos no son sustratos para las peptidasas, con lo que son menos propensas a ser degradadas en la célula.10 En el diseño de fármacos es importante considerar las concentraciones de sustrato a las cuales se expondrá la enzima en cuestión. Por ejemplo, algunos inhibidores de proteínas quinasas tienen estructuras químicas que son similares al adenosín trifosfato, uno de los sustratos de esta enzima. Sin embargo, ciertos fármacos que son simplemente inhibidores competitivos tendrán que competir con altas concentraciones de ATP en la célula. Las proteínas quinasas también pueden ser inhibidas por competencia en el sitio de unión donde la quinasa interactúa con sus proteínas sustrato, y la mayoría de las proteínas presentes en el interior de una célula se encuentran a concentraciones mucho menores que las concentraciones de ATP. En consecuencia, si dos inhibidores de proteínas quinasas se unen en sus sitios activos con afinidad similar, pero solo uno tiene que competir con el ATP, entonces el inhibidor competitivo en el sitio de unión de la proteína inhibirá a la enzima más Inhibidores irreversibles normalmente modifican una enzima covalentemente, con lo que la inhibición no puede ser invertida. Los inhibidores irreversibles suelen contener grupos funcionales reactivos como mostazas nitrogenadas, aldehídos, haloalcanos o alquenos. Estos grupos electrofílicos reaccionan con las cadenas de aminoácidos para formar uniones covalentes. Los residuos modificados son aquellos que contienen en sus cadenas laterales nucleófilos como por

ejemplo un grupo hidroxilo o un grupo sulfhidrilo. Esto incluye a los aminoácidos serina (como en el DFP, a la derecha), cisteína, treonina o tirosina. Tipos de inhibiciones irreversibles La inhibición irreversible es diferente de la inactivación enzimática reversible. Los inhibidores irreversibles son generalmente específicos para un tipo de enzima y no inactivan a todas las proteínas. No funcionan destruyendo la estructura proteínica, sino alterando específicamente la estructura tridimensional del sitio activo inhabilitándolo. Por ejemplo, el pH y las temperaturas extremas causan la desnaturalización de casi todas las proteínas, pero este no es un efecto específico. De forma similar, algunos tratamientos químicos no específicos destruyen la estructura de la proteína: por ejemplo, si son sometidas a una elevada concentración de ácido clorhídrico, el cual hidrolizará los enlaces peptídicos que mantienen unidos los aminoácidos de las proteínas. 13

Los inhibidores irreversibles dan lugar a una inhibición dependiente del tiempo y, por ello, su potencia no puede ser caracterizada mediante la determinación del valor IC . Esto se debe a que la cantidad de enzima activa a una concentración dada de inhibidor irreversible será diferente dependiendo del tiempo de pre-incubación del inhibidor con la enzima. Por ello, en lugar del valor IC , se utiliza el parámetro k /[I], donde k es el primer valor observado de la tasa de inactivación (obtenido al representar en una gráfica log (actividad) VS. tiempo) e [I] es la concentración de inhibidor. El parámetro k /[I] es válido siempre y cuando el inhibidor no se encuentre a concentraciones saturantes (en cuyo caso tendríamos que k = k ). 50

50

obs

14

obs

obs

obs

inact

Ejemplos de inhibidores irreversibles El diisopropilfluorofosfato (DFP) se muestra como un ejemplo de inhibidor irreversible de la proteasa en el apartado "Inhibidores irreversibles" arriba a la derecha. La enzima hidroliza el enlace entre el fósforo y el flúor, pero el residuo de fosfato se mantiene unido a una serina en el centro activo, inactivándolo.22 Además, el DFP también reacciona con el centro activo de la acetilcolinesterasa en la sinapsis de las neuronas, lo que lo convierte en una potente neurotoxina, con una dosis letal a partir de cantidades inferiores a 100 mg.23 La inhibición suicida es un tipo común de inhibición irreversible donde la enzima convierte al inhibidor en una sustancia reactiva en su centro activo. Un ejemplo de esto es el inhibidor de biosintetizadores de poliaminas αdifluorometilornitina o DFMO, que es un análogo del aminoácido ornitina, y es usado para tratar la Tripanosomiasis Africana (enfermedad del sueño). La ornitina decarboxilasa puede catalizar la descarboxilación del DFMO sustituyendo a la ornitina, como se muestra en la figura del apartado anterior. Sin embargo, esta reacción de descarboxilación es seguida por la eliminación del átomo de flúor, lo que convierte a este intermediario en una imina, una especie altamente electrofílica. Esta forma reactiva del DFMO reacciona posteriormente con un residuo de cisteína o lisina en el centro activo para inactivar la enzima irreversiblemente.17 Puesto que la inhibición irreversible implica a menudo la formación inicial de un complejo EI covalente, a veces es posible que un inhibidor pueda unirse a una enzima de diversas formas. Como ejemplo cabe destacar el caso de la enzima tripanotión reductasa perteneciente al protozoo y parásito humano Trypanosoma cruzi, donde dos moléculas de un inhibidor llamado mostaza quinacrina, presentan la capacidad de unirse a su centro activo. La molécula superior se une de forma reversible, pero la de abajo se une de forma covalente al reaccionar con un residuo de aminoácido a través de su grupo de mostaza nitrogenada.2 11. Los inhibidores enzimáticos son utilizados principalmente como fármacos en el tratamiento de diversas enfermedades. Muchos de estos inhibidores son capaces de actuar sobre enzimas humanas y así corregir determinadas patologías. Sin embargo, no todos los fármacos son inhibidores enzimáticos. Algunos de ellos, tales como los fármacos anti-epilépticos, alteran la actividad enzimática de forma indirecta, aumentando o disminuyendo la síntesis de dicha enzima. Estos efectos son denominados inducción e inhibición enzimática y consisten en alteraciones en el patrón de expresión génica, lo cual no está relacionado con el tipo de inhibición enzimática discutido aquí. Otras drogas interactúan con otras dianas celulares que no son enzimas, como los canales iónicos o los receptores de membrana.2829 Un ejemplo de inhibidor enzimático terapéutico es el sildenafil (Viagra), utilizado como tratamiento de la disfunción eréctil. Este compuesto es un potente inhibidor de la fosfodiesterasa tipo 5 específica de GMPc, una enzima que degrada una molécula de señalización celular, el GMPc.30 Esta molécula de señalización es la responsable de la relajación del músculo liso y permite el flujo de sangre hacia el interior de los cuerpos cavernosos del pene, lo cual causa la erección. El sildenafil inhibe la actividad de la enzima que degrada la señal, el GMPc, uniéndose al mismo sitio que éste debido a su similaridad estructural. Esto permite que el GMPc no sea degradado y pueda permanecer activo durante períodos más largos de tiempo.30

Otro ejemplo de similaridad estructural entre inhibidores y sustratos enzimáticos es entre el metotrexato, un fármaco, y el ácido fólico, un coenzima. El ácido fólico es la forma oxidada del sustrato de la dihidrofolato reductasa, una enzima implicada en la biosíntesis de timidina, purinas y aminoácidos. El metotrexato es un potente inhibidor de esta enzima que, al estar relacionada con la síntesis de nucleótidos, presenta una toxicidad específica de aquellas células con una rápida tasa de crecimiento. Por ello, el metotrexato se utiliza a menudo como fármaco anticancerígeno en quimioterapia.31 Otro tipo de inhibidores enzimáticos son utilizados con el fin de inhibir aquellas enzimas necesarias para la supervivencia de patógenos. Por ejemplo, las bacterias presentan una gruesa pared celular compuesta principalmente de un polímero denominado peptidoglicano. Ciertos antibióticos como la penicilina y la vancomicina inhiben a la enzima responsable de la producción y el entrecruzamiento de las hebras de peptidoglicano, lo cual da lugar a una pérdida de fuerza de la pared celular y, por consiguiente, a la lisis de la célula, incapaz ahora de resistir la elevada presión osmótica. En la figura se puede apreciar una molécula de penicilina unida a su diana, la transpeptidasa de la bacteria Streptomyces R61 (la proteína se muestra en un formato de cintas y la penicilina en un formato de esferas y barras). También se utilizan otro tipo de toxicidades selectivas mediante antibióticos que aprovechan las diferencias presentes en la estructura de los ribosomas o en la síntesis de ácidos grasos. El diseño de fármacos se ve muy facilitado en estos casos en los que la enzima diana es esencial para la supervivencia del patógeno y no está presente o es muy diferente en humanos. 13. infarto del miocardio: El denominado diagnóstico enzimático también contribuye a identificar un infarto cardiaco (infarto de miocardio). El tejido necrótico del miocardio libera proteínas (enzimas) cuya presencia puede detectarse en la sangre. Una de estas enzimas es una isoforma de la creatinina cinasa (CK). La creatinina cinasa se encuentra fundamentalmente en los músculos y el cerebro En el miocardio se halla un tipo especial, la enzima CK-MB. Cuando se produce la muerte de células miocárdicas tras un infarto, hay una concentración superior de la enzima cardiaca CK-MB en sangre debido a que el miocardio la libera en mayor cantidad. Se eleva entre las 6 y las 8 horas tras el infarto y se normaliza entre 24 y 48 horas después. Otras proteínas miocárdicas que posibilitan el diagnóstico del infarto son la troponina I y la troponina T. Estas enzimas son las más adecuadas para realizar una prueba rápida y diagnosticar un infarto de miocardio tras pocas horas por medio del estudio enzimático. En caso de daños del tejido miocárdico, se detectan valores elevados de estas enzimas en sangre a las pocas horas, alcanzando su concentración máxima entre las 12 y las 48 horas, permaneciendo elevadas hasta los 7 a 10 días.

Un resultado negativo de los marcadores enzimáticos realizado a las 12 horas del inicio de los síntomas excluye el infarto de miocardio. Hepatitis: El nivel de transaminasas en sangre (enzimas del hígado que en circunstancias normales, residen dentro de las células del hígado, pero cuando el hígado está con problemas, son secretadas al torrente sanguíneo) se eleva y pueden aparecer trastornos de la coagulación. En un pequeño porcentaje de personas afectadas, el cuadro clínico se comporta como una hepatitis fulminante, con fallo hepático grave y riesgo de fallecimiento si no se hace trasplante de hígado. En la mayoría de los casos se cura sin tratamiento y los pacientes quedan inmunizados, de forma que no se vuelven a contagiar y el hígado se regenera. No existen portadores de la enfermedad que puedan contagiar después de la fase aguda. A nivel del laboratorio general el rasgo más distintivo de las hepatitis agudas es el notable aumento de las aminotransferasas hepáticas; la aspartato aminotransferasa (AST) o transaminasa glutámico oxalacética (TGO) y la alanina aminotransferasa (ALT) o transaminasa glutámico pirúvica (TGP). Estas se elevan hasta valores 8 veces superiores al valor normal, en el momento que se instala la ictericia. Pancreatitis: lipasa y la amilasa Cáncer de próstata y C. Mama: La fosfatasa ácida (ACP) está presente principalmente en los glóbulos rojos (RBC), la leche materna y semen. Se analiza para determinar la ocurrencia de cáncer de próstata, cáncer de mama y algunas condiciones patológicas de células de sangre rojas.

14. ENFERMEDAD DE GAUCHER ENFERMEDAD DE GAUCHER Es una deficiencia hereditaria de la enzima glucosidasa, que ocasiona una acumulación de una sustancia tóxica (glucosilceramida) en diferentes partes del cuerpo, como el bazo, el hígado y los huesos. Causas, incidencia y factores de riesgo La enfermedad de Gaucher es un trastorno hereditario que afecta a un estimado de 1 por cada 50.000 a 1 por cada 100.000 personas en la población general. La población de mayor riesgo de ser afectada son los judíos asquenazí (oriundos de Europa Central y Oriental). La deficiencia de la enzima glucocerebrosidasa hace que los lisosomas se congestionen con glucosilceramida. Dichos lisosomas congestionados se acumulan en el hígado, el bazo, los huesos y la médula ósea. Esto, a su vez, lleva a la disminución en la producción de glóbulos rojos (anemia) y adelgazamiento de los huesos (osteopenia). Es una enfermedad autosómica recesiva, lo que significa que un niño afectado heredaría dos copias anormales de la enzima, una del padre y otra de la madre. Los padres se conocen como portadores ya que ellos no tienen la enfermedad, pero silenciosamente albergan una copia anormal del gen. •La fosfatasa alcalina (FA) se encuentra en los huesos, riñones, hígado, placenta, los intestinos y las plaquetas. Los niveles elevados de fosfatasa alcalina ósea y podría indicar enfermedades del hígado como la osteomalacia, la cirrosis hepática, y similares. • La creatina (CPK) se encuentra en el cerebro, el corazón y los músculos. Tiene tres isoenzimas: CKBB (CK1), que está presente en el cerebro, la CKMB (CK2), que está presente en el corazón, y CKMM (CK3), que está presente en los músculos. El significado de los resultados elevados por lo tanto, son las enfermedades relacionadas con el corazón, el cerebro y los músculos.

•La lactato deshidrogenasa (LDH) es conocida como la “enzima ubicua”, ya que es casi presente en todas las células del cuerpo. Se encuentra en los glóbulos rojos, músculos cardíacos, el hígado, los pulmones, el bazo y los riñones. Hay cinco isoenzimas: LDHHHH (LD1), LDHHHM (LD2), LDHHMM (LD3), LDHMMM (LD4), y LDMMMM (LD5). Se encuentra elevado en enfermedades hepáticas y enfermedades del corazón como el infarto de miocardio (IM). •Gamma glutamil transferasa (GGT) es un marcador alcohólico. Su elevación indica enfermedad hepática y alcoholismo crónico. Sólo se eleva después de un uso prolongado de alcohol. •Amilasa: degradación de carbohidratos, se produce en el páncreas y glándulas salivares. •Lipasa: degradación de lípidos, y los convierte en ácidos grasos libres en el intestino delgado, se sintetiza en el páncreas. El incremento de la lipasa produce cáncer pancreático, pancreatitis crónica y bloqueo intestinal. -Aspartato aminotransferasa (GOT O AST) Antes conocida como transaminasa glutámico-oxalacética (GOT) y también llamada aspartato transaminasa (AST), es una enzima aminotransferasa que se encuentra en varios tejidos del organismo de los mamíferos, especialmente en el corazón, el hígado y el tejido muscular. Se encuentra en cantidades elevadas en el suero en casos de infarto agudo de miocardio, de hepatopatía aguda y de miopatías, por el empleo de determinados fármacos y en casos de cualquier enfermedad o trastorno en donde las células resulten dañadas gravemente. Esta enzima cataliza la reacción de transferencia de un grupo amino desde el L-aspartato al 2-oxoglutarato, formándose L-glutamato y oxaloacetato. Esta enzima utiliza el piridoxal 5'-fosfato como cofactor. L-aspartato + 2-oxoglutarato ⇋ oxaloacetato + L-glutamato

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