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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Docente: ramón Lozada

Alumnos: Sindy Perez Yessica Jaramillo Carlos Avendaño

Licenciatura en biología y química

Universidad del atlaantico

Semestre VI

Barranquilla-Atlántico

INTRODUCCIÓN

Las enzimas de restricción se denominan también nucleasas de restricción, endonucleasas de restricción y en ocasiones restrictasas. Pertenecen a este grupo una gran diversidad de endodesoxirribonluceasas, descubiertas como enzimas propias de distintas bacterias. Se dispone hoy comercialmente de un gran número de ellas con elevada especificidad, estabilidad y pureza. Las enzimas de restricción son nucleasas que cortan ADN de doble cadena cuando reconocen un patrón de secuencia específico. Generan fragmentos de ADN conocidos como fragmentos de restricción. Las enzimas de restricción son herramientas imprescindibles en biología molecular, ingeniería genética y biotecnología. Las enzimas de restricción son nucleasas que cortan el ADN cuando reconocen un patrón de secuencia específico. Se nombran con tres letradas del género y especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguidas a veces por una letra más, que identifica el serotipo (variante antigénica de la bacteria) y, finalmente, por un número romano que las identifica cuando en una misma variante se hayan encontrado varias enzimas con distinta especificidad. La importancia de las enzimas de restricción radica en su gran especificidad para reconocer una secuencia corta de DNA bicatenario e hidrolizar un enlace fosfodiéster en cada hebra, siempre en la misma posición. Cada enzima se caracteriza, pues, por su sitio o secuencia de reconocimiento o de restricción, o secuencia diana. Los fragmentos de DNA resultantes son útiles para iniciar la clonación celular o acelular, para el análisis del DNA, para elaborar mapas físicos de restricción o para la detección de polimorfismos. Las diversas enzimas de restricción se agrupan en tres familias, de acuerdo con sus propiedades: Tipo I, Tipo II y Tipo III. Se descubrieron en los años 60 y su uso en biología molecular empezó en los 70 permitiendo el desarrollo de las tecnologías de ADN recombinante. Las enzimas de restricción tienen actividad endonucleasa y cortan enlaces fosfodiéster en las dos cadenas del ADN. Reconocen ciertas secuencias en el ADN. Las enzimas de restricción de Tipo I y III reconocen una secuencia específica pero cortan a una distancia variable del sitio de reconocimiento (sitio de restricción). Las enzimas de restricción de Tipo II reconocen una secuencia específica conocida como secuencia diana y siempre cortan entre los mismos nucleótidos. De ahí que generen siempre los mismos fragmentos de restricción. La secuencia diana es de tamaño variable, la mayoría de 4 y 6 nucleótidos, y con frecuencia es parcialmente palindrómica. Algunas enzimas de restricción cortan generando extremos llamados romos mientras que otras cortan generando extremos llamados cohesivos. Las enzimas de restricción son una herramienta básica en Biología molecular: en laboratorios de PCR, creación de sondas para hibridación, laboratorios de secuenciación de ADN, ingeniería genética, procesos de clonación, manejo de genotecas y en muchas otras áreas de genómica.

Las enzimas de restricción La clave de la transgénesis, la obtención de un organismo genéticamente modificado, está en extraer genes de interés de un organismo e introducirlos en otro, de modo de

obtener un producto con características mejoradas. Pero ¿cómo se hace para "cortar" ADN de un organismo e insertarlo en otro? Los genetistas necesitaban herramientas para hacerlo, y así descubrieron las enzimas de restricción, las “tijeras moleculares” que cortan el ADN. De esta forma, es posible extraerlo del genoma de un organismo. También descubrieron las enzimas ligasas que "pegan" el fragmento de ADN aislado dentro del ADN del nuevo organismo. Las enzimas son proteínas que cumplen una función esencial en el metabolismo celular: son catalizadores biológicos (aceleradores de reacciones químicas) que hacen posible que las reacciones se lleven a cabo en un tiempo adaptado a las necesidades vitales del organismo (ver Cuaderno Nº 30). Entre sus características fundamentales se encuentra la de ser específicas, es decir que cada tipo de enzima actúa sobre un sustrato particular o una secuencia particular de una molécula, y no sobre otra. Esta especificidad enzimática resulta fundamental en la actividad de las enzimas de restricción que cortan secuencias particulares y determinadas del ADN. Nomenclatura 



Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo (ej. Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin)); y por ello las tres primeras letras del nombre se escriben en cursiva. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli )



En números romanos, un número para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restricción.



Todas deberían llevar adelante una R de restricción o un M de metilasa según la función de la enzima, pero generalmente se omite.

De esta manera, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se construiría de la siguiente manera: Nomenclatura Ejemplo

Corresponde a:

E

Escherichia

Género de la bacteria

Co

coli

Especie de la bacteria

R

RY13

Cepa de la bacteria

I

La primera identificada

enzima Orden de identificación de la enzima en la bacteria

Así mismo, las enzimas HaeII y HaeIII provienen de Haemophilus aegyptius, MboI y MboII de Moraxella bovis, etc. Las enzimas de restricción son proteínas cuya función es cortar las hebras de ADN. Se

podría decir que son “tijeras moleculares” que cortan ADN. Lo hacen en forma específica. Esto significa que cada enzima reconoce un sitio particular del ADN, es decir que reconoce una secuencia particular de nucleótidos. Esa secuencia específica para cada enzima se denomina “sitio de restricción”. Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se posiciona sobre la molécula de ADN y corta dentro o en torno de esa secuencia. Acorde a como realizan el corte, las enzimas se pueden clasificar en: • Enzimas que generan “extremos romos” (parejos) • Enzimas que generan “extremos cohesivos” (desparejos). Estos extremos “colgantes” de simple cadena pueden pegarse con otros extremos de cadena simple que tengan la secuencia complementaria. Las enzimas encargadas de unir los extremos de ambas cadenas se denominan ligasas.

Las enzimas de restricción reconocen secuencias de 4, 6 o más bases y cortan generando extremos romos extremos cohesivos.

Los extremos, generados en diferentes moléculas de ADN, pueden sellarse con la enzima ADN ligasa y generar así una molécula de ADN nueva, denominada recombinante. El origen de las enzimas de restricción Las enzimas de restricción, conocidas también como endonucleasas, sólo cortan el ADN si reconocen en su interior una secuencia específica de nucleótidos. Estas enzimas fueron descubiertas en microorganismos. De hecho, se encuentran sólo en organismos

procariotas (bacterias). Por esto, se les dio una nomenclatura asociada al organismo de donde provienen. Por ejemplo, las enzimas de restricción que se descubrieron en la bacteria Escherichia coli se denominan Eco. Existen diferentes tipos de enzimas Eco que se diferencian en la secuencia que reconocen y cortan. Para diferenciarlas se les agregan letras y números romanos, por ejemplo: Eco RI (Eco “erre” “uno”). Así, el sitio de restricción para EcoRI es la secuencia GAATTC, como muestra la ilustración anterior. Una vez que la enzima encontró ese sitio en el ADN, se acerca a la hebra de ADN y realiza el corte entre la G y la A. Al investigar otras especies de bacterias se descubrieron cientos de enzimas de restricción distintas y cada una reconoce una región específica. Estas enzimas fueron descubiertas en la década del ’70 y hasta la fecha existen más de 250 enzimas de restricción. Se cree que la función natural de estas enzimas en las bacterias es protegerlas contra ADN de virus que podrían ingresar en sus células. De esta manera, la bacteria utiliza estas “tijeras moleculares” para cortar en pedacitos el ADN viral que la infecta. El ADN propio de la bacteria no se corta, pues lo tiene “protegido” contra sus propias Sistemas de restricción-modificación (M-R) El sistema de restricción-modificación (M-R) es usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exógenos (normalmente víricos) que ingresen en la bacteria, eliminando las secuencias ajenas al genoma de estas. El ADN propio no sufre deleción por parte de las enzimas de restricción del organismo que las produce, puesto que previamente ha sido modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosil-metionina (SAM) a bases específicas. Este sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infección del fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas “K12” y “B”). Este sistema consta de dos partes: Restricción: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exógenos para evitar la “promiscuidad” en los intercambios genéticos. Esto le confiere inmunidad frente a bacteriofagos que pudieran poner en peligro la individualidad genética o incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a través de cortes mediante endonucleasas de restricción a los DNA exógenos que ingresen a la bacteria. Modificación: Consiste en la introducción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual está catalizado por una metilasa específica. Existen varios mecanismos de acción generales de estos sistemas, de los cuales destacan el tipo I y el tipo II: M-R tipo I: Fueron los primeros en ser descritos. Lo característico de los sistemas M-R de tipo I es que las actividades de modificación y las de restricción están producidas por un complejo multiproteico, que realiza los dos tipos de actividades. Algunas características son:  

Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetrías. La actividad de restricción (de las subunidades R) corta lejos del sitio de reconocimiento (del orden de unos 1000 pb), y en lugares inespecíficos.

 

La restricción requiere de ATP. La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM) como donador de los grupos metilo.

M-R tipo II: Aquí cada subunidad del dímero reconoce la misma secuencia, presente en cada una de las partes especulares del palíndromo, y realiza un corte en un lugar específico, que obviamente tiene su correspondiente en la otra cadena de la otra mitad del palíndromo. Más de la tercera parte de las cepas bacterianas presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas de ellas son codificadas a partir de genes situados en plásmidos. Algunas características que tiene este mecanismo son: 

Las dos actividades las realizan dos proteínas distintas que no forman complejos multiproteicos.  No utilizan ATP. Sólo necesitan iones Mg++ para funcionar. La metilasa usa SAM como donador de metilos.  Cada miembro de la pareja de modificación y restricción reconoce la misma secuencia específica de ADN.  El sitio de reconocimiento consta de 4 ó 6 pb que constituyen una secuencia palindrómica.  La metilasa suele ser una proteína monomérica, que introduce grupos metilo en una A o en una G (según la metilasa en cuestión), en ambas cadenas, dentro del sitio de reconocimiento.  La enzima de restricción suele ser una proteína formada por dos subunidades del mismo tipo, ensambladas simétricamente. Pueden dejar extremos cohesivos o extremos romos. Algunas enzimas de restricción dejan extremos sobresalientes 5', mientras que otras dejan extremos sobresalientes 3'. Tipos de enzimas de restricción Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restricción: Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y modificación (metila). Al reconocer la secuencia específica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), además de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores. Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que el corte es resistente y predecible. Por esta característica es que son muy utilizadas para clonación de genes, ya que al cortar en sitios específicos se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo requieren Mg++ como cofactor, no necesitan de ATP. Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas. Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.

Hay otros sistemas de restricción descubiertos actualmente, como el sistema tipo 4 de E. coli (Eco571) que consta de una sola enzima que corta únicamente DNA metilado en una secuencia específica, y que además metila.

En esta tabla se presentan algunas enzimas de restricción, con su respectivo origen bacteriano y sitio de reconocimiento. Enzima Origen Bacteriano

EcoRI

BamHI

DpnI*

HindIII

TaqI

NotI

HinfI

Sitio Reconocimiento

de

Resultado del Corte

5'GAATTC

5'---G

AATTC---3'

3'CTTAAG

3'---CTTAA

5'GGATCC

5'---G

3'CCTAGG

3'---CCTAG

Escherichia coli

Bacillus amyloliquefaciens

G---5'

GATCC---3'

CH3

CH3

|

|

G---5'

5'GATC

5'---GA

TC---3'

3'CTAG

3'---CT

AG---5'

Diplococcus pneumoniae |

|

CH3

CH3

5'AAGCTT

5'---A

AGCTT---3'

3'TTCGAA

3'---TTCGA

5'TCGA

5'---T CGA---3'

3'AGCT

3'---AGC T---5'

5'GCGGCCGC

5'---GC GGCCGC---3'

3'CGCCGGCG

3'---CGCCGG CG---5'

5'GANTC

5'---G ANTC---3'

3'CTNAG

3'---CTNA G---5'

Haemophilus influenzae A---5'

Thermus aquaticus

Nocardia otitidis

Haemophilus influenzae

Sau3A

PovII*

SmaI*

HaeIII*

AluI*

5'GATC

5'---

GATC---3'

3'CTAG

3'---CTAG

5'CAGCTG

5'---CAG CTG---3'

3'GTCGAC

3'---GTC GAC---5'

5'CCCGGG

5'---CCC GGG---3'

3'GGGCCC

3'---GGG CCC---5'

5'GGCC

5'---GG CC---3'

3'CCGG

3'---CC GG---5'

5'AGCT

5'---AG CT---3'

3'TCGA

3'---TC GA---5'

5'GATATC

5'---GAT ATC---3'

3'CTATAG

3'---CTA TAG---5'

5'GGTACC

5'---GGTAC C---3'

3'CCATGG

3'---C CATGG---5'

5'CTGCAG

5'---CTGCA G---3'

3'GACGTC

3'---G ACGTC---5'

5'GAGCTC

5'---GAGCT C---3'

3'CTCGAG

3'---C TCGAG---5'

5'GTCGAC

5'---G TCGAC---3'

3'CAGCTG

3'---CAGCT G---5'

Streptomyces phaeochromogenes

5'GCATGC

5'---G CATGC---3'

3'CGTACG

3'---CGTAC G---5'

Xanthomonas badrii

5'TCTAGA

5'---T CTAGA---3'

Staphylococcus aureus ---3'

Proteus vulgaris

Serratia marcescens

Haemophilus egytius

Arthrobacter luteus

EcoRV* Escherichia coli

KpnI1

PstI1

SacI1

SalI1

SphI1

XbaI1

Klebsiella pneumonia

Providencia stuartii

Streptomyces achromogenes

Streptomyces albue

3'AGATCT

3'---AGATC T---5'

* = ADN queda con extremos romos

Aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades genéticas Gracias a las enzimas de restricción somos capaces de diagnosticar ciertas enfermedades genéticas, bien sean debidas a una variación en el material genético (duplicación, deleción, etc) o bien sean debidas a una mutación en una base puntual. El procedimiento para dicho diagnóstico consistiría en amplificar por PCR una región concreta del cromosoma donde sepamos que debería estar o no ese cambio genético y añadir la enzima o enzimas de restrición para que así se realicen los cortes pertinentes. Tras realizar dichos cortes, correremos nuestras muestras en un gel de electroforesis y veremos las diferencias de tamaños que existen. Si la mutación genera una deleción, al correr en la electroforesis observaremos un fragmento menor al que esperaríamos de un paciente sano, de tal manera que lo podríamos diagnosticar. Si la mutación, por el contrario, genera una mutación puntual, podremos aprovecharla para utilizar una enzima en ese punto y que así, si no existe dicha mutación, ese corte no se producirá y obtendremos un fragmento mayor en el gel de electroforesis.

Usos de las enzimas de restricción Las enzimas de restricción tienen diferentes aplicaciones que son de gran importancia en investigaciones en biología molecular y en las técnicas que emplea la biotecnología moderna:

1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago. El ADN se corta con varias enzimas de restricción, solas y en parejas, para determinar el número de sitios de corte y sus posiciones relativas en la molécula, el orden y la distancia entre ellos. 2. Fragmentar ADN para separación por electroforesis. Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos fragmentos. Por ejemplo: para la técnica de Southern blotting (ver cuaderno Nº 67) o en las usadas para identificar polimorfismos de ADN en distintos individuos (RFLP, ver cuaderno Nº 69). 3. Generación de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados, y crear ADN recombinante. Se puede cortar una molécula de ADN con una enzima y, con el mismo tipo de enzima, cortar el fragmento de ADN de interés para clonar. Se unen con ligasas estas dos moléculas de ADN, generando así una molécula de ADN recombinante. Este vector recombinante puede usarse para transformar células que expresen el gen de interés clonado (si se usó un vector de expresión con el promotor adecuado) o puede usarse simplemente para tener clonado (“guardado”) ese fragmento de ADN de interés. Por ejemplo: para los proyectos de secuenciación de genomas.

Bibliografía http://rebase.neb.com http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1¬e=34

Molecular cell biology. Lodish, Harvey F. 5. ed. : - New York : W. H. Freeman and Co., 2003, 973 s. b ill. ISBN 0-7167-4366-3