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CURSO 06/07 Tema 6. Enzimas. Clasificación. Principios de la catálisis enzimática. Energía de activación. Velocidad de reacción y equilibrio de reacción. Cinética enzimática: ecuación de Michaelis-Menten. Ecuación de los dobles recíprocos. Inhibición enzimática. Tipos de inhibición. Mecanismos de regulación de la actividad enzimática: alosterismo, modificación covalente, proenzimas. Isoenzimas

BIOQUÍMICA-1º de Medicina Dpto. Biología Molecular Jesús Navas

ENZIMAS • • • • •

Catalizadores de las reacciones biológicas. La mayoría son proteínas Gran poder catalítico Alto grado de especificidad Actúan en soluciones acuosas en condiciones suaves de temperatura y pH • Su actividad puede regularse

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

IMPORTANCIA DE LOS ENZIMAS • La medida de la actividad enzimática en fluidos biológicos o tejidos es importante para el diagnóstico de muchas enfermedades. • Muchas fármacos son inhibidores de la actividad enzimática • Importancia en la industria de alimentación y agricultura.

ENZIMAS: RESEÑA HISTORICA • • • • •

Primera descripción (finales del siglo XVIII) 1850. Estudios de Pasteur 1897. Buchner 1926. Summer cristaliza la ureasa Segunda mitad del siglo XX: se purifican y caracterizan millares de enzimas, lo que ha permitido conocer su mecanismo de acción.

Enzimas. Definiciones: - Cofactor: necesario para la actividad enzimática. Pueden ser iones metálicos o una molécula orgánica, denominada coenzima. - Apoenzima: parte proteica del enzima (no activa) - Holoenzima: apoenzima + cofactor Nomenclatura de los enzimas: SUSTRATO + TIPO DE REACCION + ASA

Un tercio de los enzimas requieren algún ión metálico para catalizar

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)33

Muchas vitaminas son cofactores o precursores de cofactores de enzimas

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

CLASES DE ENZIMAS 1. Oxidorreductasas

transferencia de electrones

2. Transferasas

reacciones de transferencia de grupo (no agua)

3. Hidrolasas

reacciones de hidrólisis (transferencia al agua)

4. Liasas

adición de grupos a dobles enlaces o formación de dobles enlaces por eliminación de grupos

5. Isomerasas

transferencia de grupos dentro de la misma molécula para dar isómeros

6. Ligasas

formación de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N por reacciones de condensación acopladas a hidrólisis de ATP

CLASES DE ENZIMAS

Los enzimas aceleran las reacciones disminuyendo la energía de activación

E + S = ES = E + P ( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

“Basic Medical Biochemistry” Marks, Marks & Smith Lippincott. 1999

Los enzimas son estereoespecíficas porque forman varias interacciones entre aminoácidos del centro activo y los distintos grupos del sustrato

(“Bioquímica”, Mathews and van Holde McGraw-Hill, 1998)

El centro activo de los enzimas es complementario al estado de transición de la reacción catalizada

Progreso de la reacción ( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Encaje inducido

Cambio conformacional inducido por glucosa en la hexoquinasa (Hexoquinasa = ATP:glucosa fosfotransferasa = 2.7.1.1 )

D-Glucosa ( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Velocidad inicial

La Vmax se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato

1/2 Vmax

Vmax (S)

=Vo

Km + (S) Km

Concentración de sustrato [S] ("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)

Relación entre Vo y [E] Vo

[E] La velocidad inicial es función lineal de la concentración de enzima siempre que la concentración de sustrato sea alta

Ecuación de Michaelis-Menten V (S) max Vo = Km + (S) K1

E+S

K2

ES K-1

Km =

K2 + K-1 K1

P

Velocidad inicial

La Vmax se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato

1/2 Vmax

Km

Concentración de sustrato [S]

("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)

Calculo de Km y Vmax por la representación de Lineweaver-Burk (“dobles recíprocas” de Michaelis-Menten)

("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)

Parámetros enzimáticos 1. Km (constante para cada enzima) = concentración de S a la que la Vo es 1/2 Vmax. Es una medida de la afinidad del enzima por S. Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad del enzima por S 2. Kcat (constante para cada enzima) = número de recambio = número de moléculas de sustrato convertidas en producto por molécula de enzima y unidad de tiempo, en condiciones de saturación de sustrato. 3. Vmax = velocidad máxima teórica = la velocidad cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad) 4. Unidad de enzima = cantidad de enzima que transforma 1 µmol de sustrato por min = una forma común de expresar la velocidad 5. Actividad específica = unidades por mg de proteína total de la preparación enzimática. En el caso de enzimas en suero: unidades/L

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Inhibición competitiva + Inhibidor Unión del Inhibidor al centro activo, compitiendo con S • Aumenta Km • No cambia Vmax

Sustrato

Inhibidor competitivo

(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Inhibición no competitiva + Inhibidor

Unión del Inhibidor a un sitio del enzima distinto del centro activo: no compite con S • No cambia Km • Disminuye Vmax Sustrato

Inhibidor Sustrato no competitivo

(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Inhibición acompetitiva + Inhibidor Unión del Inhibidor a enzima-S, estabilizando el complejo enzima-S pero impidiendo la formación de producto: • Disminuye Km • Disminuye Vmax

Sustrato

Inhibidor acompetitivo

(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Inhibidor competitivo

Sustrato

Sustrato

Sustrato

Inhibidor acompetitivo

Inhibidor no competitivo

("Biochemistry" 5th ed. Berg, Tymoczko and Stryer. Freeman and Co. 2002)

INHIBICION COMPETITIVA

INHIBICION NO COMPETITIVA

Efecto del pH sobre la actividad enzimática

(Garret and Grisham)

MECANISMOS DE REGULACIÓN ENZIMÁTICA • Regulación de la cantidad de enzima sintetizada por las células • Inhibición reversible por productos • Interacción con moduladores (proteínas u otros) - Activacion/inhibición alostérica - El modulador alostérico se une a un sitio distinto del centro activo - La unión del modulador es reversible e implica cambio conformacional - Suelen ser enzimas multiméricas - Tienen cinética sigmoidea - Modificación covalente: - fosforilación - ADP-ribosilación - metilación • Activación proteolítica de pro-enzimas

Efectos alostéricos de moduladores positivo y negativo (al no ser cinética michaeliana no se puede usar el término Km, sino el K0,5) + Modulador alostérico positivo: favorece la forma R

El sustrato es modulador positivo

+ Modulador alostérico negativo: favorece la forma T

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Activación/inactivación de enzimas por fosforilación. Ejemplo: glucógeno fosforilasa

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

Una enzima puede tener varios mecanismos de regulación

("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)

Activación de proenzimas por proteolisis: enzimas digestivas

Auto-activación de quimotripsina ( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)