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Revista Científica Agropecuaria 9(1): 63-70 (2005) © 2005 Facultad de Ciencias Agropecuarias - UNER

Notas

OPTIMIZACIÓN DE UNA TÉCNICA DE TINCIÓN PARA DETERMINACIÓN DE EFECTOS CITOGENÉTICOS EN ÁPICES RADICALES DE ALLIUM CEPA * Florencia URTEAGA OMAR1, Víctor H. LALLANA2 1 Becaria Auxiliar de Investigación. Proyecto de Trabajo Final de Graduación y 2Prof. Tutor y Titular de la Cátedra Fisiología Vegetal. Facultad de Ciencias Agropecuarias. UNER. C.C. 24 (E3100WAA) Paraná, Entre Ríos. Argentina

RESUMEN

Para poner a punto la técnica de tinción para observaciones de efectos citogenéticos en los ápices radicales de Allium cepa, se realizaron dos ensayos exploratorios con el método de Allium test (Fiskesjö, 1985). En el primero se asignaron bulbos de Allium cepa a dos medios de crecimiento: agua destilada (testigo) y dilución de herbicida. A las 72 horas algunos ápices radicales fueron sometidos a tinción con orceína mediante el protocolo convencional. Microscópicamente se observaron campos adecuadamente teñidos, con núcleos y cromosomas de color rosáceo-morado y campos más difusos, indicativos de deficiencias en la tinción. Se ajustó el protocolo de tinción en los siguientes aspectos: empleo de segmentos radicales más pequeños (0,5 cm); agregado de un segundo vidrio de reloj (uno para fijación y otro para tinción) y duplicación del tiempo de flameo del colorante (20’). La técnica así modificada fue probada en un segundo ensayo con cinco diferentes tratamientos: agua destilada (testigo) y aguas provenientes de plantas de tratamiento de un frigorífico, un municipio, un arroyo colector y una papelera. Se lograron tinciones más uniformes que permitieron observar ciertas aberraciones citológicas y calcular los índices mitóticos para cada muestra. Las aguas más contaminadas (efluentes industriales), tuvieron efectos inhibitorios sobre la actividad celular, provocando aberraciones citológicas (invaginaciones citoplasmáticas, células redondeadas, bi-nucleadas) y disminución del índice mitótico por encima del 90 % con respecto al testigo (21,9). La técnica de tinción optimizada permite mejores determinaciones de los efectos citogenéticos y se sugiere su empleo como complemento de la detección de sustancias tóxicas mediante el Allium test.

Palabras clave: Allium test - técnica de tinción - mutágenos - alteraciones ciclo celular Allium cepa *

Original recibido (29/04/05) Original aceptado (22/06/05)

Florencia Urteaga Omar y Víctor H. Lallana SUMMARY

Optimization of staining technique to evaluate cytogenetic effects with Allium test methodology With the purpose of adjusting staining technique for observations of cytogenetic effects on Allium cepa L root apexes, two exploring assays were carried out following the Allium test methodology. In the first assay, Allium cepa bulbs were assigned to two growing media: distilled water (control) and herbicide dilution. After 72 hours some root apexes were stained with orcein following the conventional protocol. At the microscope some fields were found adequately stained with pink and purple nuclei and chromosomes; and more diffusse fields indicating deficiencies in staining. The staining protocol was adjusted in the following aspects: usage of smaller radical segments (0.5 cm), adding a second watch glass (one for fixation and the other for staining) and duplication of stain flaming time (20’). The technique, modified as described above, was tried in a second assay with five different treatments: distilled water (control treatments) and water samples from a meat packing plant, a township, a collector stream and a paper mill treatment plants. More uniform stainings were achieved that allowed to observe certain cytologic aberrations and to estimate mitotic indexes for each sample. Most contaminated water (industrial effluents) had inhibiting effects on cell activity producing cytologic aberrations (cytoplasmatic invaginations, rounded binuclear cells) and a mitotic index decrease of above 90 % as compared with control sample (21.9 %). The improved staining technique allowed better determinations of cytogenetic effects reason why its usage is suggested as a complement technique in the detection of toxic substances when using Allium test. Key words: Staining technique - mutagens - alterations in cell cycle - onion roots Introducción En los últimos años se observa un creciente interés por el desarrollo y empleo de pruebas biológicas para evaluar los potenciales efectos tóxicos y genotóxicos de la contaminación sobre los seres humanos y los ecosistemas (Forget et al., 2000). Según Fiskesjö y Dutka (1996), los organismos biológicos tienen la capacidad de expresar las alteraciones más sutiles que operan durante cierto tiempo en un ecosistema mediante respuestas individuales (reacciones fisiológicas, etológicas, morfológicas, bioquímicas), o de conjunto (cambio en la estructura y dinámica de las comunidades, perturbaciones en las ramas tróficas, etc.). Por su capacidad para detectar cambios en la calidad de los efluentes y controlar que la 64

toxicidad esté por debajo de los límites permitidos, los ensayos o tests biológicos se están transformando en herramientas valiosas para la evaluación del impacto ambiental. Comparativamente con las pruebas analíticas rutinarias, estos bioensayos ofrecen una cantidad de ventajas para el diagnóstico ecotoxicológico. Ya que, mientras que las primeras pueden ser costosas, demandar varias semanas para su realización y aún así no proporcionar información sobre posibles respuestas tóxicas sinérgicas o sobre la biovariabilidad de los agentes tóxicos, los bioensayos son instrumentos simples, rápidos, económicos y pueden ser ejecutados con diferentes especies (especialmente las de fácil RCA. Rev. cient. agropecu. 9(1): 63-70 (2005)

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disponibilidad y que germinen y crezcan rápidamente). En este contexto, las pruebas de ecotoxicidad con plantas vasculares, entre ellas el Allium test (Fiskesjö, 1988), están demostrado una potencialidad diagnóstica significativa (Kristen, 1997). El Allium test es un bioensayo que permite determinar la toxicidad total y genotoxicidad de diferentes agentes tóxicos o contaminantes (Fiskesjö, 1993), a partir de la observación del crecimiento y las mutaciones cromosómicas del ápice radical de la cebolla (Allium cepa). Kumar et al. (2000) señalan que las raíces de plantas superiores, por ser sistemas no fotosintéticos y libres de cloroplastos, presentan reacciones similares a las de los tejidos y células de los vertebrados, por lo que son tan válidas como los grupos celulares de los mamíferos para detectar citotoxicidad basal. En esta misma línea argumental, Fiskesjö (1997) subraya que los meristemas radicales pueden ser empleados, además, para investigar la genotoxicidad mediante análisis microscópicos de las aberraciones celulares durante la división mitótica. Estudios microscópicos de células radicales de cebolla, creciendo en diferentes medios tóxicos, han mostrado un amplio rango de alteraciones citológicas, lo que indica la fina sensibilidad de las raíces de Allium cepa para detectar sustancias potencialmente peligrosas tanto para la salud humana como para el medio ambiente en general. Particularmente ilustrativas son las investigaciones de Smaka-Kincl et al. (1996), quienes identificaron parámetros citológicos en meristemas de cebolla tratados con efluentes industriales y aguas municipales, tales como inhibición de la división celular, aparición de células aberrantes tanto en metafase como en anafase y aumento de células con micronúcleo en la interfase. En esta misma línea de estudios, Chauhan et al. (1999), evaluando los efectos de dos insecticidas RCA. Rev. cient. agropecu. 9(1): 63-70 (2005)

comerciales, observaron inhibición del índice mitótico y aberraciones mitóticas y cromosómicas desde las 6 a las 24 horas del tratamiento. Odeigah et al. (1997), al estudiar las propiedades tóxicas y genotóxicas de desechos sólidos de industrias nigerianas, encontraron que las mezclas lixiviadas causaron modificaciones de los índices mitóticos y alteraciones en profase, metafase, anafase y telofase. Por su parte, Zoldoš et al. (1997), quienes analizaron la citotoxicidad de químicos comunes en los efluentes de fábricas croatas de gas y aceite, encontraron disturbios mitodepresivos en el ciclo de división mitótica de las células de cebolla. Resultados similares fueron informados por Rank y Nielsen (1998), Manosalva et al. (1999) y Nielsen (1997), al estudiar los efectos citotóxicos y mutagénicos de insecticidas de uso frecuente, pertenecientes al grupo de carbamatos; y al evaluar los efectos de aguas de desagüe provenientes de industrias papeleras dinamarquesas con altas concentraciones de metales pesados, respectivamente. Mas recientemente, Evseeva et al. (2003), Monarca et al. (2000) y Vidakovi-Cifrek et al. (2002), a partir de análisis de agua proveniente de un reservorio natural próximo a una fábrica eslovena de radio; de diluciones con desinfectantes alternativos al cloro (tales como dióxido de cloro, ozono y ácido peracético), y de soluciones de agua saturada con cloruro de Ca y bromuro de Ca, comúnmente usadas en la industria del aceite, respectivamente, informaron aberraciones tales como anafase con puentes cromáticos trinucleados, desbalanceados, o con micronúcleos. El objetivo del presente estudio es poner a punto la técnica de tinción para observaciones microscópicas de efectos citogenéticos en los ápices radicales de Allium cepa y evaluar el método en muestras de agua de distintos orígenes. 65

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Materiales y métodos Ensayo exploratorio Se seleccionaron 6 bulbos de Allium cepa (de 4 cm de diámetro aproximado), los que fueron asignados a dos medios de crecimiento: 1 testigo con agua destilada y 1 dilución de herbicida (Tordón D30) de 0,005 l/ha a partir de una dilución inicial de 3 l/ha. Al cabo de las primeras 72 horas, se retiraron las cebollas de sus respectivos tratamientos y se procedió a preparar 2-3 raíces de cada cebolla para exámenes microscópicos. Se realizó la tinción y fijación de células en base al procedimiento de Alzola (2001). Se cortaron con bisturí dos o tres raicillas, tomando solamente la parte apical de 12 cm y se añadieron gotas de la solución de fijación (Carnoy) hasta cubrirlas. Se fijaron durante 10 minutos. El exceso de fijador se eliminó con pipeta y papel de filtro e inmediatamente se añadió el colorante (orceína acético-clorhídrica). Se flameó hasta la emisión de vapores, evitando la ebullición. Se dejó enfriar y se repitió 2-3 veces durante 15 minutos. Sobre un porta objetos se cortó un fragmento apical de aproximadamente 3 milímetros al que se le añadió una gota del colorante. Se realizó el “squash” del tejido y se sellaron los bordes del cubre con barniz de uñas transparente para evitar la deshidratación celular. Observaciones microscópicas: Los preparados fueron observados a través de un microscopio óptico equipado con cámara digital. Se observaron tres campos por preparado. Se calculó el índice mitótico (IM) que estima el porcentaje de células en división que existe en un tejido y, por lo tanto, es una medida del potencial proliferativo del mismo. Para el cálculo del IM y la duración de cada fase del ciclo celular se emplearon las siguientes fórmulas:

%IM =

nº de célulasen mitosis(P + M + A + T ) x 100 nº total de células

Tiempo en fase =

n º células fase x 1 2 x 60 n º células total

Resultados preliminares Con la técnica de tinción utilizada se observaron los núcleos y los cromosomas en color rosáceo-morado. La preparación presentó 66

el aspecto de una dispersión de células por todo el campo que abarcaba el objetivo. En todas las células se pudieron diferenciar: a. El citoplasma no teñido. b. El núcleo densamente teñido y en su interior una o dos regiones poco o nada teñidas, correspondientes a los nucleolos (por ser ricos en RNA no se tiñen). c. La pared celular (que aunque ésta no se tiñe, se dedujo su presencia por la forma rectangular que tiene la célula). d. Los cromosomas en las células que se encontraban en mitosis. A partir del la observación de campos en los que sólo o mayoritariamente hubiera células meristemáticas, se procedió al recuento de las mismas, lo que permitió calcular el porcentaje de células correspondientes a cada etapa del ciclo celular. El procedimiento de conteo se repitió en otros campos cuidando que no se solaparan, hasta obtener los datos de cómo mínimo 50 células. A su vez, y asumiendo que la duración total del ciclo celular de Allium cepa es de 12 horas (Bishop y Klein, 1973), se estimó la duración en minutos de cada fase del ciclo (Cuadro 1). Cuadro 1. Porcentaje de células en cada fase del ciclo celular y estimación de la duración (min) de las fases correspondientes a los segmentos radicales de Allium cepa Grupo Grupo testigo: experimental: agua destilada herbicida Duración Duración Fases % % (minutos) (minutos) Interfase 79,80 574 98.98 712,72 Profase 10,34 74,48 0.005 3,63 Metafase 3,940 28,37 --Anafase 0,009 7,09 --Telofase 0,049 35,46 0.005 3,63

La dilución conteniendo herbicida inhibió significativamente la actividad mitótica de las células de Allium cepa (Cuadro 1). El segmento radical sometido a crecimiento en la dilución de herbicida, registró una disminución del índice mitótico (1,01) por encima del 95 % con respecto al grupo testigo (20,19) y permaneció en interfase (sin división celular) la mayor parte del RCA. Rev. cient. agropecu. 9(1): 63-70 (2005)

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ciclo. Situación que permite deducir sus efectos tóxicos. La técnica de tinción elegida fue apropiada, ya que permitió registrar muchos detalles de la actividad citológica. No obstante, como durante las observaciones microscópicas muchos campos no fueron adecuadamente observados, se decidió optimizar el protocolo de tinción para lograr aún mejores determinaciones de los índices mitóticos. Con tal propósito se procedió a realizar un segundo ensayo que constó de 4 experimentos mediante la técnica del Allium test (Fiskesjö, 1989) cuya metodología se describe a continuación: Experimento 1: se utilizó agua de efluente de un frigorífico (pileta secundaria) preparando 4 medios de crecimiento, 1 testigo con agua destilada y 3 diluciones (10 %, 50 % y 100 %) del agua problema. Experimento 2: con la aguas servidas (pileta secundaria) de un municipio, se prepararon 3 medios de crecimiento, 1 testigo con agua destilada, 2 diluciones (50 % y 100 %). Experimento 3: se prepararon dos medios de crecimiento, 1 testigo con agua destilada y 1 con el agua de un arroyo colector sin diluir. Experimento 4: se utilizó aguas servidas de una industria papelera, preparando 4 medios de crecimiento, 1 testigo con agua destilada y 3 diluciones (10 %, 50 % y 100 %) del agua de deshecho.

En cada experimento y por medio de crecimiento se asignaron 12 bulbos de Allium cepa (n=156). Siguiendo el Protocolo 8 (Fiskesjö, 1989), al tercer día se retiró una cebolla de cada tratamiento para exámenes microscópicos. La finalidad de tales exámenes fue la de verificar si, además de las diferencias macroscópicas, observadas a simple vista en cuanto a longitudes radicales, los diferentes medios de crecimiento provocaban algún tipo de alteración citológica. En esta oportunidad se introdujeron las siguientes modificaciones en el procedimiento de tinción y fijación de las células radicales: a. Se utilizaron segmentos radicales más pequeños (de sólo 0,5 cm en lugar de 1-2 cm). b. Se emplearon dos vidrios de reloj: uno para realizar la fijación y otro para la tinción con orceína. De esta forma se evitó que restos del fijador se mezclaran con el colorante. c. Se aumentó de 15 a 25 minutos el tiempo de flameo del colorante

Resultados y discusión Los resultados de los índices mitóticos de cada Experimento y la duración de cada fase del ciclo celular se presentan en el Cuadro 2.

Cuadro 2. Indices mitóticos correspondientes a los 4 experimentos (Exp) realizados y estimación de la duración (min) de cada fase del ciclo celular de los efluentes en su estado puro Tratamientos Internase Profase Metafase Anafase Telofase Total IM Exp1: Testigo 162 21 8 2 10 203 20,19 Exp1: 10 % 152 25 9 4 9 199 23,61 Exp1: 50 % 182 2 -1 2 187 2,67 Exp1: 100 % 192 ----192 -Duración (min) 720 ----720 -Exp2: Testigo 124 23 3 -12 162 23,45 Exp2: 50 % 168 10 4 -2 184 8,69 Exp2: 100 % 166 2 -1 2 171 2,92 Duración (min) 698,94 8,42 -4,21 8,42 720 Exp3: Testigo 128 19 8 3 7 165 22,42 Exp3: 100 % 156 2 -1 1 159 1,88 Duración (min) 701,88 9,05 -4,53 4,53 720 Exp4: Testigo 127 15 8 3 9 162 21,60 Exp4: 10 % 141 7 5 2 2 157 10,19 Exp4: 50 % 163 3 -1 2 169 3,55 Exp5: 100 % 163 -1 1 2 167 2,39 Duración (min) 702,75 -4,31 4,31 8,62 720 Referencias: Exp. 1; Aguas de piletas de tratamiento de un establecimiento frigorífico; Exp2, Aguas de piletas de tratamiento de aguas servidas domiciliarias de un Municipio; Exp3, Aguas de un curso colector de aguas servidas industriales y domiciliarias y Exp4, Aguas de desecho de una industria papelera

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Se registro una importante reducción del índice mitótico de las células de cebolla sometidas a crecer en los efluentes más concentrados del frigorífico (Cuadro 2). La ausencia de actividad celular en su estado puro (Exp1: 100 %) está indicando que se trata de un efluente altamente tóxico (Cuadro 2). Por la respuesta celular observada en las diferentes diluciones de las aguas de pileta del municipio, se puede inferir que el efluente municipal está menos contaminado que el del frigorífico, habida cuenta que no sólo se registra una mayor actividad celular en la dilución intermedia,

Células con citoplasma invaginado (achatado y deformado) en muestra del frigorífico

sino que también se observa cierta actividad en su estado puro. El arroyo colector, sufre el impacto de las aguas provenientes del frigorífico por lo que las células de cebolla responden con un índice mitótico muy bajo. Finalmente, en los tratamientos conteniendo agua de la papelera, se registró una disminución gradual de los índices mitóticos en función del aumento de la concentración del efluente. A pesar de la probable presencia de compuestos químicos contenidos en el efluente, se observó cierta respuesta celular de Allium cepa, aún en su mayor concentración (Cuadro 2).

Células bi y trinucleadas de muestras del frigorífico y células redondeadas en muestras de la papelera Células con aspecto deshidratado en muestras del sitio papelera

Figura 1. Células de los ápices radicales de cebolla con distintas aberraciones y deformaciones

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De la duración en minutos de cada fase del ciclo celular se desprende que cuando las cebollas crecen en los medios que contienen las aguas problema en su estado puro (100 %), sus células radicales transcurren la mayor parte del ciclo celular en interfase. Esta es una evidencia del impacto del medio de crecimiento sobre la actividad mitótica. En este sentido, los medios más perjudiciales resultan los provenientes del frigorífico, la papelera y el arroyo colector, en ese orden. En tales medios se pudieron observar las aberraciones celulares que ilustran la Figura 1. Conclusiones Las modificaciones introducidas a la técnica de tinción han permitido detectar con mayor detalle los efectos citogenéticos de los diferentes efluentes agroindustriales sobre los ápices radicales de la cebolla constituyendo un complemento valioso de la detección de sustancias tóxicas mediante el Allium test. Los medios de crecimiento con agua de efluentes en su estado puro provocaron los menores índices mitóticos y sus células transcurrieron la mayor parte del ciclo en interfase. Las muestras de agua del establecimiento frigorífico y de una papelera, en su estado puro y diluidas al 50 %, resultaron las más perjudiciales sobre la actividad mitótica de las células radicales de cebolla. Referencias bibliográficas ALZOLA, R. (2001). Técnicas histológicas. Departamento de Ciencias Biológicas, UNCPBA.

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