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• Elvis Moreno

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Discusiones Algunas bacterias pueden transformarse en pequeños ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. También tienen esta propiedad otros géneros de bacterias verdaderas, pero sólo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de células vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto período del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la síntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora. Técnica de Dörner En esta técnica se utilizó los el colorante carbono fucsina y el cómo decolorante tinta china, con un aumento de 1000x En la muestra se observó la endospora fucsia, debido a la absorción del tinte catiónico carbono fucsina la cual es atraída por las cargas negativas de la pared celular. Las bacterias fueron expuestas a altas temperaturas que permitieron la formación de endosporas, debido al gran nivel de estrés que son sometidas, aumentando la afinidad e ingreso del colorante al protoplasma celular. El decolorante de carácter acido funciono de forma inversa con cargas negativas, permitió eliminar el colorante catiónico en exceso arrastrándola hacia el exterior de la célula. La compactación de la pared celular debido a las altas temperaturas y las cargas negativas del decolorante evitaron la absorción de la tinta china.

Para la coloración de esporas según Dorner, se sensibiliza y colorea a la espora con fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraerá el colorante de todas las estructuras celulares excepto de las esporas y por consiguiente, se verán ls esporos rojos, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro. La técnica de Moeller utiliza ácido crómico y fucsina fenicada en caliente para sensibilizar y colorear a la espora. La decoloración se realiza con ácido-alcohol y se contracolorea con azul de metileno. Se observan los esporos rojos y el resto de la bacteria azul. Si bien es cierto que con otras coloraciones los esporos se verán incoloros, en algunos casos las bacterias pueden presentar zonas sin colorear que no corresponden a esporos y debe confirmarse su presencia mediante una coloración específica.

Técnica de Schaeffer y Fulton En esta técnica se utilizó el carbono fucsina como colorante primario y el verde malaquita como colorante de contraste en las bacterias Bacillus sp. Se obtuvo tres portaobjetos con la misma muestra, mostrando algunas diferencias. Aumento 1000x. A. En la muestra se observó menos de 5 endosporas teñidas de fucsia, se tuvo poca

retención o absorción del colorante primario debido a mantener al microorganismo en altas temperaturas con el colorante por más tiempo de lo requerido, la pared celular se deshidrato cerrando los poros dejando el colorante catiónico con poca afinidad de absorción. Sin embargo para algunas bacterias el colorante si pudo ser fijado antes de cerrar los poros.

B. En la muestra se observó que todas las endosporas de las bacterias fueron teñidas de verde maquita. Se explicaría por la baja afinidad que tuvo la pared celular por el colorante, sus cargas negativas provocadas por el peptidoglucano como otras proteínas fueron deshidratas e incluso desnaturalizadas antes de la fijación del colorante carbono fucsina. Parte de las bacterias sufrieron lisis celular siendo un motivo de no retención del tinte. El decolorante alcohol-ácido permitió el arrastre de todo el colorante primario, las cargas del ácido favorece la repulsión del tinte. Finalmente siendo el ultimo colorante el verde malaquita fijado por la endospora que se encuentra en muchos casos expuesta.

Colorantes utilizados Colorante verde de malaquita Es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por tanto, se une débilmente a la bacteria. Penetra en las células vegetativas cuando se calienta en la preparación, también penetra las esporas. Durante el lavado con agua, verde de malaquita se elimina de las células vegetativas, pero no de la espora. Colorante safranina El colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las células vegetativas(decoloradas por el agua).La safranina , es un colorante biológico de contraste que se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+, y tiñe de rosa a las bacterias Gram - ; en histología y en citología. La safranina se usa como líquido de contraste en algunos protocolos de tinción, coloreando el núcleo celular de rojo.

Cuestionario 1.- ¿Cuál de los métodos utilizados le permitió observar mejor las endosporas bacteriana? ¿A qué atribuye la diferencia? El método que nos permitió observar mejor las endosporas fue Dorner, se atribuye a que hay un buen contraste. Se sensibiliza y colorea al esporo con fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraerá el colorante de todas las estructuras celulares excepto de los esporos y por consiguiente, se verán los esporos rojos, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro. 2.- ¿Qué efecto producirá el reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante como el alcohol cetona? Gerard (2007) afirma que la función del alcohol acido es la decoloración de la pared de las células para que puedan ser clasificadas y conservarlas con más tiempo. La tinción acido alcohol resistente es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor. Rodriguez (2005) afirma que el alcohol acetona se puede utilizar como agente de blanqueo debido a que disuelve lípidos presentes en la membrana celular externa de las bacterias Gramnegativas, permitiendo que el complejo cristal violeta pueda escapar de la delgada capa de peptidoglucano. En este punto en el proceso de tinción Gram, organismos Gram-negativos son incoloros mientras que las bacterias Gram-positivas todavía retienen el cristal violeta. En conclusión si el alcohol acido es remplazado por el alcohol acetona, esta no reaccionaria debido a que solo decolora a las bacterias Gram negativas y las bacterias que forman endosporas son las Gram positivas.