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• Erik Joel Rosales Risalve

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FACULTAD DE CIENCIAS DE INGENIERIA ZOOTECNIA

PRACTICA N° 4

CÀTEDRA

: CULTIVO DE MICROORGANISMOS

: Microbiología

CATEDRÀTICO : Dr. Elmer Rene Chavez Araujo CICLO

: “IV”

ALUMNO

: Joseth Sthif, Rivera Centeno

HUANCAVELICA - 2018

MICROBIOLOGÍA UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA

I.

INTRODUCCIÓN Para estudiar a los microorganismos es necesario cultivarlos en los medios apropiados. La técnica y el medio seleccionado dependen de la naturaleza de la investigación. En general se puede presentar tres situaciones: 1) Se puede levantar una cosecha de células de una especie en particular que se tiene a mano, 2) puede ser necesario determinar el número y tipos de microrganismos presentes en el material dado, 3) si se desea aislar un tipo particular de microorganismos de una fuente natural. Un cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio En esta práctica realizada utilizamos tres formas de cultivo de microorganismos: por superficie, estría e incorporación.

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II.

MARCO TEORICO : DIFERENTES MÉTODOS DE SIEMBRA Sembrar: Es el acto de colocar el material bacteriológico en el medio de cultivo para promover su crecimiento y desarrollo, y subsiguiente multiplicación. El resultado de una siembra se llama: Cultivo · Las siembras pueden ser: 

Primarias: Cuando el material es inoculado en los medios por primera vez.



Secundarias: Cuando el material a inocular procede de una siembra primaria.

MÉTODOS GENERALES: 1) SIEMBRA POR DILUCIÓN: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada con el material bacteriológico, se agita, con movimientos moderados. Medio de cultivo: 

Liquido

Instrumento 

Asa

Finalidad 

poner la bacteria en suspensión

DILUCIONES SUCESIVAS Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas células que, tras inocularse en un medio de cultivo, generen colonias aisladas. 2) SIEMBRA POR ESTRÍAS EN SUPERFICIE: Se siembra el material en la superficie del agar inclinado en un tubo de ensayo, allí se extiende por toda la superficie con el asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias,

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pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo. Medio de cultivo: agar base inclinado Instrumento: asa o aguja bacteriológica 3) SIEMBRA POR ESTRÍA POR AGOTAMIENTO: Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estrías. Esto puede realizarse de varias formas: a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías. Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri, para lo cual se repite la operación sin tomar con el asa nuevo material. b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estría luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el último cuadrante aparecerán las colonias aisladas c- El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa, próxima al borde, se esteriliza el asa y se traza otra estría a partir del depósito y así sucesivamente. Medio de cultivo: solido en placa de Petri Instrumento. Asa Finalidad. Obtener colonias aisladas.

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4) POR PICADURA O PUNCIÓN Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio semisólido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal de punción, trayecto por el cual la retiraremos luego. Este método se utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias. Medio de cultivo. Semisólido Instrumento: aguja bacteriológica Finalidad: Estudiar la movilidad de las bacterias

5) SIEMBRA EN TSI: (POR PICADURA Y ESTRÍAS EN SUPERFICIE) El TSI (Triple Sugar Iron) es un medio que contiene glucosa, sacarosa y lactosa, hierro y un indicador que es el rojo fenol. En este medio sembraremos por picadura y estrías en superficie, como ya conocemos, para estudiar los cambios que ocurrirán en superficie y profundidad. A lo largo del canal se desarrollan los microorganismos, y según lo hagan en la parte superior o inferior del tubo, estarán indicando su comportamiento frente a los azucares, los cambios indican lo siguiente:

CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LÍQUIDO Si la bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente formándose una suspensión de células libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano: 1.- Fase lag o de adaptación durante que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial. 2.- Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio. La 5

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evolución del número de células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos que describiremos a continuación.

3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial.

Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales. 4.- Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del cultivo.

CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SÓLIDO Las fases, parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos líquidos se presentan también en cultivos sólidos. La cinética de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolución del número de células viables por unidad de superficie o por unidad de masa. Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas 6

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da lugar a la producción de una colonia en un breve lapso de tiempo. Si el número inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama un césped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio. En el caso de microorganismos móviles (deslizantes) o en el de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento trófico no se producen colonias aisladas sino formaciones más difusas o miceliares.

III.

OBJETIVO: 1.1. OBJETIVO GENERAL 

Conocer

los

diferentes

procedimientos

para

el

cultivo

de

microorganismos. 

Tener un manejo adecuado de las técnicas para el sembrado y aislamiento de microorganismos.

1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 

Separar

colonias

individuales

a partir de

una mezcla de

microorganismos, utilizando técnicas de aislamiento. 

IV.

Aprender sobre los distintos medios de cultivo existentes.

MATERIALES Y METODOS: 4.1. MATERIALES: 

Agua de albañal.



9 Placas Petri



Asa bacteriológica.



Asa de Digralsky.



2 Pipetas.



Probeta de 100 ml.



2 Mechero de ron.



Estufa



3 Tubos de ensayo.



Matraz 250 ml.



Papel craf



Pavilo 7

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4.2.EQUIPOS DE LABORATORIO: 

Autoclave



Refrigeradora.



Balanza analítica



Incubadora bacteriológica

4.3. AGARES 

Agar Nutritivo 2.8gr.

4.3. METODO. 4.1. PROCEDIMIENTO: 4.1.1. SIEMBRA POR INCORPORACIÓN. 

Preparamos el Agar Nutritivo, pesamos con la balanza analítica 2.8gr.



Con la probeta medimos 100ml de agua destilada para poder mesclar el agar nutritivo.

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

Echamos el agar nutritivo 2.8gr al matraz y 100ml de agua destilada.



Luego hacemos calentar en la estufa eléctrica hasta el punto de ebullición realizando movimientos de vaivén para poder homogenizar la muestra.



Una vez llegado al punto de ebullición el agar, lo cubrimos la boca del matraz con algodón, papel craf y sujetamos con pabilo para llevar al autoclave por 15 min a una temperatura de 120 ºC y asi eliminar todo tipo de microrganismos externos.

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

Con marcadores rotulamos los tubos de ensayo, el matraz y ponemos a una lata los 3 tubos de ensayo y con papel craf tapamos y con el pabilo cerramos y llevamos al autoclave para poder matar todos los microorganismos en el proceso de preparación.

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

Una vez esterilizado, limpiamos nuestro lugar de trabajo con alcohol para poder trabajar en un ambiente desinfectado.



Echamos 1 ml de agua de albañal con la pipeta en la placa Petri y esparcimos, luego echamos el agar nutritivo hasta que se solidifique.



Rotulamos en la base de la placa Petri para luego poder llevar a la incubadora bacteriológica la placa Petri invertido a 37ºC por 48 horas.



Esterilizamos la asa de Digralsky con alcohol y sometiendo al fuego del mechero hasta que se prenda.

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4.1.2. SIEMBRA EN SUPERFICIE: 

Con la pipeta medimos 9 ml de agua destilada en 3 tubos de ensayo.



En el primer tubo de ensayo ponemos 1 ml de agua de albañal que seria 10-1, En el segundo tubo de ensayo extraemos 1 ml del primer tubo de ensayo y echamos al segundo tubo de ensayo que seria 10-2



En el tercer tubo de ensayo extraemos 1 ml del segundo tubo de ensayo y echamos al tercer tubo de ensayo que sria 10-3.

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

Rotulamos la placa petri, luego echamos el agar nutritivo a 2 placa Petri hasta que se solidifique y luego del segundo tubo de ensayo extraemos 0.1 ml echamos a la placa Petri número 1y del tubo número tres echamos 0.1ml a la placa Petri número 2 y

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

Esparcimos con la asa de drigralsky por toda la superficie del agar en la primera placa del tubo 2



Del tubo número 3 extraemos 1 ml para la segunda placa Petri.



Llevar la placa Petri invertido a la incubadora bacteriológica a 37 ºC durante 48 horas.

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

Pasando las 48 horas retiramos las placas Petri de la incubadora, para poder observar.



Observamos.

Observamos: Se observó que claramente hubo crecimiento de microrganismos y que se lograron aislar varias colonias que se identifican como pequeñas manchas en la placa Petri

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4.1.3. SIEMBRA POR ESTRIA: 

Echamos el agar nutritvo sobre 2 placas Petri, con la ayuda de la asa bacteriológica calentamos al calor de mechero hasta que esté al rojo vivo.



Se toma una muestra del agua de albañal con la asa bacteriológica y se siembra por estrías en la placa Petri imaginándose un cuadrante en la placa Petri, para poder echar en el 1er cuadrante mayor cantidad, en el 2do cuadrante menos

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MICROBIOLOGÍA UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA cantidad que en el primer cuadrante, en el 3er cuadrante menos que el segundo cuadrante y en el 4to cuadrante se pasa solamente dos líneas. llevar laplaca Petri invertido a la incubadora bacteriológica a 37 ºC por 24 a 48 horas



Pasando las 48 horas retiramos las placas Petri de la incubadora, para poder observar. Observamos.

Pasado las 48 horas retiramos de la incubadora

Que en el primer cuadrante se observa mayor cantidad de ya que una colonia es un mismo tipo de bacteria, en el segundo cuadrante hay menor cantidad de bacterias que en el primer cuadrante.

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III.

RESULTADOS: Pudimos observar que claramente hubo crecimiento de microrganismos y que se lograron aislar varias colonias que se identifican como pequeñas manchas en la placa Petri en nuestra siembra de microrganismos en la siembra por incorporación no pudimos observar ya que nos faltó agar nutritivo.

IV.

DISCUSIÓN O COMENTARIOS: La siembra en placa a partir d dilución permite cultivar los microorganismos ya que posee los nutrientes necesarios para su desarrollo. “El cultivo de microorganismos es una técnica que puede llevarse a cabo al proporcionar a los microorganismo un medio favorable para su crecimiento. Ello significa que las nuevas células dispongan de los nutrimientos necesarios en forma adecuada para emplearlos como materiales sintéticos, una fuente de energía y temperatura, oxígeno y otros factores que sean adecuados”. (Carpenter, 1969)

El crecimiento de los microorganismos se manifiesta de diferentes formas, dependiendo del tipo de dilución y siembra realizada. “Las descripciones de colonias en placas de Agar incluirán tamaño, forma, color. Pueden obtenerse también datos semejantes de los medios de cultivos en medios inclinado de Agar. Estas características del crecimiento con frecuencia son típicas de ciertas especies, aunque como en el caso de la morfología, aparecen a veces variaciones temporales en distintas condiciones de cultivo. (Carpenter, 1969)

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V.

CONCLUSIÓN:

Al concluir la práctica se concluyó en lo siguiente: Al realizar una siembra de microorganismos, debemos tener en cuenta que técnica se va a utilizar, debido a que estas varían respecto a las características del microorganismo a tratar. También debe tenerse en cuenta la forma, espacio y el objetivo al que se quiere llegar, pues dependiendo de esto la técnica de siembra es diferente. Un microorganismo se puede sembrar en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar .Un cultivo de bacterias o de hongos es con el fin de aislarlas en el medio para lograr un mejor estudio de ellos. los objetivos que nos planteamos fueron cumplidos de manera generalmente exitosa, pero que sin embargo existieron pequeños errores y confusiones durante la experiencia, que a pesar de todo, no la llevaron al desastre, ya que se llevó a cabo el método de siembra por incorporación ya que nos faltó agar nutritivo y no pudimos calcular la cantidad.

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VI.

BIBLIOGRAFÍA:  CARPENTER, Philip. 1969. Microbiología. 2da Edición. Editorial Interamericana, S.H. México.  GRASSINI, Luis. 1967. Microbiología Agraria. UCV-Facultad de Agronomía. Caracas-Venezuela.  Ingraham, J. (1998). Introduccion a la microbiologia. Editorial Reverte Barcelona, España.  Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (2da edición). Venezuela.  Evangeline Olivas E, Manual de practica de Microbiología 1ª edición, Editorial D.R. Ciuda de Juarez, Mexico.

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VII.

ACTIVIDAD: Averiguar sobre otros tipos de siembra en microbiología (aerófilo, microaerofilos y anaerobios)

Para aislar microorganismos anaerobios que son rápidamente destruidos por el contacto con el oxígeno, una vez que la muestra ingresa al laboratorio debe ser procesada evitando su exposición al oxígeno atmosférico. Los medios de cultivo sólidos deben ser preparados inmediatamente antes de ser usados para evitar una posterior difusión de oxígeno al medio. Por el mismo motivo, los medios líquidos deben ser regenerados por calentamiento a baño maría durante 10 min.

Los medios de cultivo que se utilizan contienen agentes reductores (convierten el O2 en H2O) como por ejemplo la cisteína, glutatión, tioglicolato. Algunos son tapados con agentes semisólidos (una capa de vaselina-parafina o agar al 0,5%) para evitar el acceso de aire. Otros medios contienen trozos de tejidos, lo que da una atmósfera reducida. En la figura se esquematiza el crecimiento de los microorganismos según su tolerancia o dependencia del oxígeno en caldo tioglicolato.

1. Aerobios estrictos 2. Anaerobios estrictos 3. Anaerobios facultativos 4. Anaerobios aerotolerantes 5. Microaerófilos

MÉTODOS PARA INCUBAR EN ANAEROBIOSIS. Puede recurrirse al uso de tubos con pirogalol o velas, pero más frecuentemente suelen usarse jarras anaerobias de las cuales existen varios tipos (Brewer, Torbal, Gas Pack, etc.). Generalmente todas ellas se basan en el mismo principio que es extraer el oxígeno o, mejor dicho, consumirlo. El material de la jarra suele ser plástico, vidrio o metal. Tiene además una tapa que asegura el cierre hermético.

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La generación de hidrógeno permite la reducción del oxígeno y da lugar a la formación de agua. Se utiliza el paladio como catalizador, el cual es inactivado con el ácido sulfhídrico, exceso de humedad y otros productos metabólicos volátiles de las bacterias. Al catalizador se lo puede reactivar en horno de calor seco a 160-170 °C durante dos horas. Como indicador de óxido-reducción suelen utilizarse tiras de papel embebidas con azul de metileno, las cuales son incoloras en estado reducido o azulado cuando están oxidadas.

MÉTODOS

DE

CULTIVO

PARA

MICROAERLOFILICOS

Y

BACTERIAS ANAEROBIAS ACTINOMYCES Son microorganismos microaerófilos, que presentan características tanto de bacterias como de hongos. Ej.: A. Bovis Métodos de Cultivo TIOGLICOLATO - Semisólido - Contiene: cistina, tioglicolato, agar y resazurina.

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