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ACCION DE LAS RADIACIONES IONIZANTES SOBRE LOS MICROORGANISMOS

MICROBIOLOGIA GENERAL BAYONA ESPINOZA VENESSA. CONTRERAS REYNAGA KEVIN I. HUAYHUA GIRON I. PAMELA

ACCION DE LAS RADIACIONES IONIZANTES SOBRE LOS MICROORGANISMOS

ACCION DE LAS RADIACIONES IONIZANTES SOBRE LOS MICROORGANISMOS I.

CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES

¿Qué es la radiación? La radiación no es otra cosa que la emisión, propagación y transferencia de energía en cualquier medio en forma de ondas electromagnéticas o partículas.

Tipos de radiación La mayoría de las radiaciones son de origen electromagnético.

¿Cómo se caracteriza una radiación electromagnética? La energía que transporta una radiación electromagnética se desplaza mediante ondas. Esta energía no es continua, sino que se transmite agrupada en pequeños "cuantos" de energía llamados fotones. La onda se compone de un campo eléctrico oscilante, asociado a un campo magnético también oscilante, y ambos son perpendiculares a la dirección de propagación. Las ondas electromagnéticas se caracterizan por fundamentales: Longitud de onda, Frecuencia y Energía:

tres

parámetros

Longitud de onda (λ): Es la distancia entre las crestas de dos ondas consecutivas, y se mide en unidades de longitud (m). La amplitud de la onda depende de la potencia radiante de la fuente emisora. Frecuencia (ν o f): Es el número de veces que oscila una onda en un segundo y se mide en ciclos/segundo o hercios (Hz). Energía (E): La energía transportada por una radiación electromagnética se puede medir en Julios (J), aunque más frecuentemente se mide en electronvoltios (eV). El electronvoltio representa la energía cinética que adquiere un electrón cuando es acelerado por una diferencia de potencial de 1 voltio. Equivale a 1,602176462 × 10-19 J. La frecuencia es directamente proporcional a la energía que transporta una radiación, según la ecuación: E = h.f, (donde h es la constante de Planck = 6,63·10-34 J/s).

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Las diferentes radiaciones electromagnéticas tienen diferentes energías e interaccionan con la materia de forma distinta según esta energía. En el siguiente esquema se muestran los distintos tipos de radiaciones electromagnéticas ordenadas por energía. Es lo que se conoce como espectro electromagnético. Seguro que muchas de estas radiaciones te son familiares.

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Las radiaciones electromagnéticas se clasifican en dos grandes grupos en función de su energía, o dicho de otra manera en función del tipo de cambios que provocan en los átomos con los que interaccionan: Radiaciones ionizantes: Corresponden a las radiaciones de mayor energía (menor longitud de onda) dentro del espectro electromagnético. Tienen energía suficiente como para arrancar electrones de los átomos con los que interaccionan, es decir, para producir ionizaciones. Radiaciones no ionizantes: Estas radiaciones no tienen suficiente energía para producir ionizaciones en los átomos con los que interaccionan y de ahí su nombre. De todas las radiaciones electromagnéticas mostradas en el esquema anterior (espectro electromagnético) sólo los rayos X y los rayos gamma tienen suficiente energía como para producir fenómenos de ionización en los átomos, es decir son radiaciones ionizantes. El resto de las radiaciones electromagnéticas (ondas de radio, microondas, rayos infrarrojos, luz visible, rayos ultravioleta) son radiaciones no ionizantes.

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Radiaciones ionizantes Como se ha comentado anteriormente, las radiaciones ionizantes son aquellas que tienen suficiente energía para arrancar un electrón del átomo cuando interaccionan con él, este fenómeno es conocido como ionización, de ahí la denominación de este tipo de radiaciones. En otros temas del apartado "Teoría sobre las radiaciones" vas a encontrar más información sobre distintos aspectos de las radiaciones ionizantes, cómo, por ejemplo, sus unidades de medida, los efectos biológicos perjudiciales que pueden producir, cómo podemos protegernos de dichos efectos, etc. Por eso, en este tema sólo te damos conceptos básicos sobre ellas. Si queremos comprender qué son las radiaciones ionizantes, tenemos que adentrarnos en la unidad más pequeña de un elemento químico que mantiene su identidad o sus propiedades y que no es posible dividir mediante procesos químicos: EL ÁTOMO. El átomo está formado por un núcleo, compuesto a su vez por protones y neutrones y por una corteza que lo rodea, en la cual se encuentran los electrones. Las partículas subatómicas que componen el átomo no pueden existir aisladamente salvo en condiciones muy especiales. Los núcleos inestables, con exceso de energía, siempre tienden a estabilizarse, por lo que tarde o temprano liberan el exceso de energía, sufriendo una transformación (o desintegración). Así pues, durante la transformación se libera una gran cantidad de energía en forma de radiaciones ionizantes, conociéndose a este fenómeno con el nombre de radiactividad. Lógicamente cada núcleo inestable emitirá su exceso de energía de forma diferente, es decir producirá distintos tipos de radiaciones ionizantes (alfa, beta y/o gamma). También hay que tener en cuenta el grado de inestabilidad, es decir el número de neutrones en exceso o en defecto respecto al número de protones en el núcleo, ya que cuanto más se aleje el número de neutrones de la configuración estable, más intensa será la tensión y mayor la velocidad con la que el núcleo liberará el exceso de energía.

Las radiaciones ionizantes son de tres tipos: Partículas alfa α. Son núcleos de helio (formados por dos protones y dos neutrones). Las partículas alfa son las radiaciones ionizantes con mayor masa, por lo que su capacidad de penetración en la materia es limitada, no pudiendo atravesar una hoja de papel o la piel de nuestro cuerpo. Las partículas alfa son muy energéticas.

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Partículas beta β. Son electrones o positrones y poseen una masa mucho menor que las partículas alfa, por lo que tienen mayor capacidad para penetrar en la materia. Una partícula beta puede atravesar una hoja de papel, pero será detenida por una fina lámina de metal o metacrilato y por la ropa. Son menos energéticas que las partículas alfa. Rayos gamma γ. Son radiaciones electromagnéticas, por lo que no tienen masa ni carga, lo que les hace tener un gran poder de penetración en la materia. Para detenerlas es necesaria una capa gruesa de plomo o una pared de hormigón. Los rayos gamma y los rayos X tienen las mismas propiedades, diferenciándose únicamente en su origen. Mientras que los rayos gamma se producen en el núcleo del átomo, los rayos X proceden de las capas externas del átomo, donde se encuentran los electrones. Existe un cuarto tipo de radiación ionizante, los neutrones, si bien hay que saber que éstos no son ionizantes por sí mismos, es decir cuando interaccionan con la materia no arrancan electrones. Sin embargo, cuando chocan con un núcleo atómico pueden activarlo o hacer que éste emita una partícula cargada o un rayo gamma, por lo que son ionizantes de forma indirecta. Los neutrones son las radiaciones ionizantes con mayor capacidad de penetración, por lo que para detenerlos hace falta una gruesa pared de hormigón, agua ligera y/o pesada, grafito, berilio y/o boro-10.

II.

FUENTES DE RADIACIONES

Las radiaciones ionizantes de origen natural La radiación ionizante forma parte de nuestra vida cotidiana, ya que es un agente natural con el que convivimos. Es más, como dijo Eric J.Hall, Profesor de la Universidad de Columbia (Nueva York): "La vida en la tierra se ha desarrollado en presencia de radiación. No es nada nuevo, inventado por el hombre. La radiación siempre ha estado aquí". La radiación ionizante natural (o de fondo) puede tener orígenes muy diversos: los rayos cósmicos, la tierra, el cuerpo humano o el aire que respiramos. ¿Alguna vez te ha caído encima un rayo de partículas de alta energía? Esta clase de lluvia de partículas de alta energía se produce cuando rayos cósmicos energéticos golpean la parte superior de la atmósfera terrestre.

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Los rayos cósmicos se descubrieron en 1912 por el físico austriaco Víctor Franz Hess. Ahora se sabe que la mayoría de los rayos cósmicos son, en realidad, núcleos atómicos de hidrógeno, helio o elementos pesados. La mayor parte de los rayos cósmicos de menor energía provienen del Sol, pero se desconoce el origen de los rayos cósmicos de muy alta energía. Cuando los rayos cósmicos interaccionan en la atmósfera terrestre con elementos estables, se producen los denominados radionúclidos cosmogénicos. Estos radionúclidos son el carbono-14 (C-14), el tritio (H-3) y el berilio-7 (Be-7). La radiación cósmica es la fuente principal de estos radionúclidos en la Tierra. La atmósfera terrestre atenúa la radiación cósmica, así que cuanto más aire haya entre nosotros y el espacio exterior más protegidos estaremos. Por tanto, la exposición a la radiación cósmica depende, entre otros factores, de la altitud a la que nos encontremos. Así, durante los vuelos en aviones comerciales recibimos más radiación cósmica que en la superficie de la tierra. La cantidad de radiación cósmica aumenta aproximadamente al doble cada 6.000 pies de altitud (o cada 1.800 metros, ya que 1 pie equivale a aproximadamente 0,3 metros). La latitud también influye en la radiación cósmica que recibimos, ya que el campo magnético terrestre desvía la radiación, de tal manera, que la dosis es menor en el Ecuador que en los Polos. El aire que respiramos es naturalmente radiactivo El aire que respiramos contiene un gas radiactivo llamado radón, el cual se produce cuando hay una desintegración del elemento radiactivo uranio, que se encuentra en la corteza terrestre. El radón es un gas invisible, inodoro, insípido, 7 veces más pesado que el aire. Cuando el radón escapa al aire libre se dispersa rápidamente y sus concentraciones son bajas. Sin embargo, cuando entra en un edificio, a través del suelo o de los propios muros, la concentración aumenta a menos que el edificio sea adecuadamente ventilado. Los materiales radiactivos naturales existentes en la corteza terrestre son absorbidos por las plantas y los animales y se disuelven en el agua. Por tanto los alimentos y líquidos que ingerimos contienen cantidades variables, aunque pequeñas, de isótopos radiactivos. Algunos alimentos contienen más radiactividad que otros y las personas que toman grandes cantidades de ellos pueden recibir por tanto mayor dosis. Estos alimentos incluyen nueces de Brasil, té, café y pan. Esto no significa que deban evitarse estos alimentos ya que la dosis resultante es muy pequeña y no hay evidencia de riesgo para la salud. En realidad una dieta basada en una radiactividad mínima representaría un riesgo mucho mayor debido a una nutrición inadecuada. Los principales radionúclidos en nuestro organismo son el carbono 14 (C-14), el tritio (H-3), y el potasio 40 (K-40). El K-40 aporta una dosis de radiación de unos 0,2 mSv/año.

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Las radiaciones ionizantes de origen artificial A la radiación ionizante de origen natural, anteriormente mencionada, se le ha sumado la radiación ionizante artificial que el ser humano aprendió a producir para satisfacer sus necesidades e intereses. Ambas radiaciones, natural y artificial, se comportan de la misma forma. Las radiaciones ionizantes tienen muchas aplicaciones beneficiosas para el hombre en áreas tan distintas como la medicina, la conservación del medio ambiente, la industria, agroalimentación, la erradicación de plagas de insectos y la producción de energía. Estas aplicaciones de las radiaciones ionizantes son descritas con más detalle en otros temas de esta unidad didáctica. Las fuentes artificiales de radiaciones ionizantes pueden ser controladas más eficazmente que las fuentes naturales y de este control se encarga la protección radiológica.

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El descubrimiento de las radiaciones ionizantes artificiales A finales de 1930 los experimentos más comunes en física nuclear en Europa consistían en poner en contacto una sustancia radiactiva y otra inerte (no radiactiva) y estudiar lo que sucedía. Dos investigadores alemanes, Walter Bothe y Herbert Becker, bombardearon un fragmento de berilio con partículas alfa procedentes de una fuente de radio, observando que se producía una radiación muy penetrante, capaz de atravesar 2 cm de plomo. Muchos investigadores, entre ellos Fréderic e Irène Joliot-Curie, pensaron que se trataba de una nueva clase de radiación gamma. A principios de 1932 el matrimonio Joliot comenzó a trabajar con una fuente de polonio (elemento

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descubierto por los padres de Irene, Marie y Pierre Curie). En sus experimentos irradiaban aluminio con las partículas alfa de su fuente de polonio y observaron que se producía una radiación muy penetrante y de vida larga, que no se podía explicar con los conocimientos de entonces. Dicha radiación se detectaba aún después de suprimir la fuente emisora de partículas alfa y su intensidad disminuía siguiendo una ley exponencial. Habían realizado uno de los descubrimientos más importantes de la ciencia: el de la radiactividad artificial.

La Academia de Ciencias de Suecia otorgó el premio Nobel de química a Fréderic e Irène Joliot-Curie el 12 de diciembre de 1935 por sus trabajos sobre la síntesis de elementos radiactivos.

III.

CLASES DE EFECTOS DE LAS RADIACIONES

Son muchas las posibles clasificaciones que se podrían realizar sobre los efectos de las radiaciones ionizantes. Sin embargo, nos vamos a referir aquí a aquella que más frecuentemente se utiliza en protección radiológica y que hace referencia a la transmisión celular de los efectos y a su relación con la dosis. En primer lugar, los efectos pueden clasificarse en: Somáticos y genéticos: en función de si son inducidos sobre las células de la línea somática o germinal. El daño somático se manifiesta durante la vida del individuo irradiado, mientras que los efectos genéticos son inducidos sobre

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su descendencia. Los efectos somáticos se dividen a su vez en inmediatos y tardíos, en función del tiempo transcurrido desde su irradiación. A su vez y en función de la incidencia que tiene la radiación sobre los efectos, éstos se clasifican en deterministas y en estocásticos. La Comisión Internacional de Protección Radiológica, publicación 60, 1990, define los efectos estocásticos como aquéllos para los cuales la probabilidad de que un efecto ocurra, más que su severidad, es función de la dosis, sin umbral. Los efectos deterministas son aquellos para los cuales la severidad del efecto varía con la dosis, siendo necesario un valor umbral). Los efectos estocásticos se pueden presentar tanto en el individuo expuesto (efectos estocásticos somáticos, como sería en caso de la carcinogénesis), como también en la descendencia (efectos estocásticos hereditarios). Al igual que en la irradiación de células no germinales, las células germinales irradiadas pueden experimentar efectos deterministas (esterilidad); efectos que evidentemente no son hereditarios y por lo tanto no hemos de identificar los efectos producidos por la irradiación de las gónadas con los efectos genéticos. Clasificación de los tipos de efectos biológicos estocásticos/deterministas y somáticos/genéticos:

Efectos hereditarios Efectos somáticos

Los efectos somáticos inmediatos: aparecen en la persona irradiada en un margen de tiempo que va desde unos días hasta unas pocas semanas después de la exposición. Se trata de efectos deterministas y se pueden manifestar en un tejido concreto o sobre el cuerpo considerado como un todo, bajo un síndrome de denominación específica (por ejemplo, síndrome hematológico, gastrointestinal, etc.), y su severidad varía considerablemente con la dosis, tipo de energía de la radiación, así como la parte del cuerpo irradiada. Para estos efectos somáticos inmediatos, se supone que existe en cierta medida, un proceso de recuperación celular como, por ejemplo, en el caso de la fibrosis pulmonar debida a una dosis excesiva de radiación o los eritemas de la piel. Los efectos somáticos tardíos: son aquéllos que ocurren al azar dentro de una población de individuos irradiados. Son, por tanto, estocásticos, no siendo posible en ningún caso, establecer para ellos una relación dosis-efecto individual. La relación entre la inducción de una malignidad (leucemia, tumor, etc.) y la dosis, sólo podemos establecerla sobre grandes grupos de población

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irradiada, como un incremento en la probabilidad de que ocurra una enfermedad determinada por encima de su incidencia natural. Decimos que son tardíos cuando el efecto se manifiesta entre 10 y 40 años después de la exposición. Por ejemplo, es frecuente encontrar períodos de latencia de 20-26 años para cánceres inducidos por radiación y de 10-15 años en el caso de leucemias. Los efectos genéticos afectan a la descendencia. Pueden aparecer en la primera generación, en cuyo caso el daño se dice que es dominante. Más frecuentemente el efecto se manifiesta en individuos de las generaciones sucesivas (enfermedades hereditarias, defectos mentales, anormalidades del esqueleto, etc.). Son efectos estocásticos, puesto que dependen de la probabilidad de que una célula germinal con una mutación relevante, tome parte en la reproducción.

IV. 4.1

EFECTOS DE LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS APLICACIONES EFECTO DE LAS RADIACIONES IONIZANTES1

En general, los microorganismos son más resistentes a las radiaciones ionizantes que los seres superiores. Por ejemplo la dosis de reducción decimal para las endoesporas de ciertas especies de clostridium es de 2000 – 3000 GY y las células vegetativas de la bacteria Deinococcus Radiodurans es de 2200 GY. Las fuentes de radiaciones ionizantes son los aparatos de rayos X, los rayos  y los radioisótopos como el Co60 o el Cs137. Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos como indirectos, así como mutagénicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis de radiación, mientras que los letales indirectos y mutagénicos se consiguen a menores dosis. 1.Efecto letal directo: Por impacto de cuantos de radiación ionizante sobre alguna molécula esencial para la vida, que es el ADN (ya que obviamente es absolutamente esencial y suministra una sola copia de la mayoría de los genes bacterianos). Los daños al ADN son, principalmente: roturas en ambas cadenas, y entrecruzamiento entre dichas cadenas, que no puedan repararse.

2.

Efecto mutagénico:

1 http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/13agfisicos.htm#_Toc59451635

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Deriva de la producción de daños menores al ADN que pueden repararse por mecanismos propensos a error.

3.

Efecto letal indirecto:

Este tipo de efecto es el más importante, y deriva de la radiolisis del agua, que genera hidrógeno naciente (H·) y radical hidroxilo (OH·). El radical hidroxilo reacciona fácilmente con macromoléculas, sobre todo con ADN, provocando roturas en ambas cadenas, lo cual se traduce en efectos de letalidad. Si, además, la bacteria está expuesta al oxígeno mientras se la está irradiando, el efecto es aún más intenso, debido a que el O2 reacciona con los radicales libres, originando cadenas de reacciones de autooxidación, muy destructivas, y promoviendo la formación de peróxidos y epóxidos, asimismo letales. H + O2

HO2

HO2

H2O2 + O2

4.2

APLICACIONES DE LAS RADIACIONES IONIZANTES

A.

Material farmacéutico (antibióticos, hormonas, etc.)

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B. Material médico-quirúrgico (guantes de cirujano, suturas de nylon, jeringas desechables, agujas, bisturíes, catéteres, prótesis, etc.)

C. Alimentos envasados (aunque en algunos países aún sigue abierta la polémica por parte de ciertos grupos sobre la seguridad de este tratamiento 2

Bacillus Thuringiensis

V.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA INACTIVACION MICROBIANA

Son muchos los parámetros que determinan la resistencia microbiana a las radiaciones ionizantes; estos factores pueden clasificarse en dos grandes grupos: aquellos dependientes del genotipo microbiano, y aquellos dependientes del ambiente. Dado que en la mayoría de las investigaciones publicadas se han utilizado como medios de tratamiento alimentos concretos, y solo ocasionalmente medios simples de laboratorio, resulta difícil discernir el efecto real de cada uno de los factores implicados. Es por ello que trataremos de forma general la influencia de los distintos factores en la sensibilidad microbiana a las radiaciones.

A.FACTORES DEPENDIENTES DEL MICROORGANISMO.3 Dentro de estos factores, el tipo de microorganismo y la fase de crecimiento son las principales variables que pueden determinar la sensibilidad microbiana a las 2 http://www.gastronomiaycia.com/2008/04/27/bacterias-para-conservar-losalimentos/

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radiaciones ionizantes. En lo referente al tipo de microorganismo, podemos concluir, como se ha comentado anteriormente, que la resistencia a las radiaciones disminuye conforme aumenta la complejidad genética del organismo. Así, los virus, debido al menor contenido en ADN, su menor tamaño y su bajo contenido en agua, son los más resistentes, seguidos de las bacterias, mohos y levaduras. Dentro de las bacterias, las células vegetativas son entre 10 y 50 veces más sensibles que los esporos, posiblemente debido a que el contenido acuoso del protoplasto es mucho más elevado (un 70% en las células vegetativas y menos de un 10% en los esporos). Así, Deinococcus radiodurans muestra una resistencia incluso mayor que los esporos bacterianos, seguramente debido a que ha desarrollado un complejo mecanismo de reparación del ADN. Los enzimas de reparación del ADN de esta especie actúan a gran velocidad prácticamente desde el mismo instante en el que se producen los daños, y además poseen entre 4 y 10 copias de su propio genoma asegurando, de este modo, la integridad de alguna de las copias tras el tratamiento. Afortunadamente la supervivencia de esta especie bacteriana al tratamiento no parece tener ningún significado desde el punto de vista de la salud pública y además no es responsable del deterioro de los alimentos.

 FASE DE CRECIMIENTO La organización estructural del ADN determina la sensibilidad a las radiaciones ionizantes; así, las células bacterianas que están dividiéndose activamente y en las que el ADN está totalmente desplegado, son más sensibles que aquellas que se encuentran en la fase de latencia o en la estacionaria de crecimiento. B.EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES4

3 http://www.catedu.es/ctamagazine/index.php? option=com_content&view=article&id=372&catid=61%3Amarzo-2008 4 http://www.catedu.es/ctamagazine/index.php? option=com_content&view=article&id=372&catid=61%3Amarzo-2008

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La sensibilidad de los microorganismos a las radiaciones ionizantes también depende de las condiciones medioambientales, como la naturaleza del medio de tratamiento, la temperatura del producto, la atmósfera que rodea al alimento y la existencia de conservantes químicos. Naturaleza del medio de tratamiento En general, la radio resistencia de los microorganismos en los alimentos suele ser entre 2 y 3 veces mayor que en los medios de laboratorio (tampones); además, el efecto protector es tanto mayor cuanto mayor es el contenido proteico. Este último efecto se ha asociado con la conocida capacidad de las proteínas para secuestrar los radicales libres producidos por la radiolisis del agua. Desde un punto de vista práctico, es importante recordar que la naturaleza físico-química del alimento ejerce una notable influencia en la resistencia microbiana y que, por tanto, es muy recomendable determinar los parámetros de tratamiento en el propio alimento que pretendemos conservar por irradiación. Este aspecto tiene especial importancia en alimentos deshidratados donde, al minimizarse la radiolisis del agua, la resistencia microbiana puede llegar a aumentar hasta 10 veces.  Temperatura del producto De forma similar a lo que sucede en los productos deshidratados, la menor disponibilidad de agua en los alimentos congelados minimiza los efectos indirectos de las radiaciones ionizantes. Es por ello que la resistencia microbiana a estos tratamientos es mayor a temperaturas de congelación. Por ejemplo, se ha observado que el valor D para Campylobacter jejuni en carne picada es de 0,32 k Gy a -30 0C, de 0,16 a 0-5 0C y de 0,17 a 30 0C. Estos resultados demuestran además que es el estado de las moléculas de agua, más que la temperatura en sí misma, lo que determina la sensibilidad de los microorganismos a las radiaciones ionizantes. Sin embargo, esto último solo es cierto en el rango de 0 0C hasta temperatura ambiente aproximadamente, dejando de cumplirse a mayores temperaturas. En resumen, resulta fundamental conocer la eficacia de los tratamientos de irradiación tanto sobre los microorganismos como sobre las propiedades organolépticas de los alimentos con el fin de conseguir el máximo grado de inactivación microbiana minimizando el impacto del tratamiento en las propiedades sensoriales del alimento. En general es preferible aplicar radiaciones ionizantes a alimentos deshidratados o congelados que a los frescos ya que, aunque la resistencia microbiana es mayor en estas condiciones, la velocidad de las reacciones químicas responsables de los posibles efectos adversos de la irradiación en las propiedades organolépticas de los alimentos es mucho menor.

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 Composición de la atmósfera de tratamiento

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La presencia de oxígeno generalmente incrementa la sensibilidad microbiana a las radiaciones ionizantes (hasta tres veces). La molécula de oxígeno, al poseer electrones desapareados, puede participar en la formación de radicales libres, potenciando el efecto de los radicales hidroxilo sobre el ADN. Se ha demostrado que la presencia de oxígeno potencia también la aparición de radicales peróxido que son más estables y dificultan la reparación del daño celular. La presencia de oxígeno durante la irradiación puede producir ocasionalmente cambios no deseados en las propiedades sensoriales de los alimentos, como la oxidación de lípidos. Para minimizar estos efectos adversos se ha sugerido la aplicación de los tratamientos a vacío o en atmósfera modificadas en las que la aparición de estas alteraciones se reduce y la sensibilidad microbiana a las radiaciones se ve relativamente poco afectada. Por ejemplo, los valores D para Escherichia coli tratada en carne de pollo a 4º C fueron de 0,35, 0,29, 0,27 y 0,23 k Gy cuando se utilizaron como atmósferas de tratamiento aire, un 100% de CO2, vacío o nitrógeno, respectivamente. En la actualidad se considera que el tratamiento combinado de radiaciones ionizantes a bajas dosis con un posterior almacenamiento en atmósferas modificadas o a vacío es una de las estrategias de conservación más adecuadas con esta tecnología; se ha demostrado que un tratamiento de 1,5 k Gy aplicado a carne de cerdo envasada en una atmósfera de un 75% de N2 y un 25% de CO2 permite prolongar la vida útil a 4º C entre 8 y 12 días y mejorar la calidad microbiológica del producto.

 Presencia de conservantes La presencia de diversos conservantes químicos, como el benzoato sódico, sorbeto sódico, cloruro sódico, nisina, EDTA, etc. parece aumentar el efecto letal de las radiaciones ionizantes. Álvarez y col han observado que la adición de 1 g/l de ácido sórbico al huevo entero líquido permite reducir los valores D de Salmonella enteritidis desde 0,50 hasta 0,31 k Gy. La mayor letalidad de las radiaciones ionizantes en presencia de conservantes parece lógica si consideramos que, independientemente de los efectos sobre el ADN, el tratamiento produce daños sobre otras estructuras celulares, como la membrana. Este efecto sinérgico puede ser debido a un mecanismo doble: por una parte la presencia de radicales libres puede dificultar la reparación de los daños celulares; y por otra, el daño generado en las membranas celulares altera su permeabilidad facilitando el acceso al citoplasma celular de los compuestos hidrofóbicos con actividad antimicrobiana. En resumen, son muy diversos los factores medioambientales que pueden condicionar la resistencia microbiana a las radiaciones ionizantes lo que, unido a la existencia de daño celular, abre grandes posibilidades para el desarrollo de procesos combinados sanitariamente más seguros y tecnológicamente más 5http://www.catedu.es/ctamagazine/index.php? option=com_content&view=article&id=372&catid=61%3Amarzo-2008

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adecuados. Un conocimiento más profundo de los mecanismos de muerte microbiana sin duda ayudaran al diseño de nuevos y más eficaces procesos combinados y al desarrollo de modelos matemáticos de inactivación microbiana de base biológica, y por tanto más fiables. VI.

MECANISMOS DE INACTIVACION MICROBIANA

Es conveniente recordar que los efectos de las radiaciones ionizantes sobre los materiales biológicos son la suma de su acción directa e indirecta. 1. LA ACCIÓN DIRECTA

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Es consecuencia de los cambios químicos producidos sobre las moléculas como resultado de la absorción de la energía radiante, es decir, como consecuencia de la ionización desplazamiento de electrones de sus órbitas habituales dando lugar a la formación de iones, radical libres y partículas excitadas. Esta absorción es, en principio, mayor cuanto mayor es el número de electrones de los átomos de una molécula y, por tanto, cuanto mayor es su masa molecular. Al ser los ácidos nucleicos los componentes de mayor complejidad a nivel celular, la posibilidad de que el material genético sufra daños directos es muy elevada. Es por ello que el ADN es una de las principales moléculas diana de esta acción directa. Una consecuencia es que la dosis letal de irradiación para cada organismo vivo disminuye a medida que aumenta la complejidad de su ADN. 2. LA ACCIÓN INDIRECTA:

6http://www.catedu.es/ctamagazine/index.php? option=com_content&view=article&id=81&catid=94:artlos-del-mesarchivo&Itemid=41

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La acción indirecta se debe a la interacción de los radicales libres formados por la acción directa de la radiación en los componentes celulares o del medio, especialmente del agua con moléculas vitales para la supervivencia microbiana. El mecanismo de acción indirecta es, según la mayoría de los autores, el principal responsable de la mayoría de los efectos biológicos de la irradiación. Este efecto secundario es lógicamente mayor cuanto mayor es el contenido acuoso del medio tratado, dado que la irradiación provoca la formación, a partir del agua, de diferentes especies reactivas, como iones y radicales. Además, el oxígeno molecular disuelto en el agua puede reaccionar con el radical hidrógeno para formar radicales hidroperóxido, o con los electrones libres para formar aniones superóxido. De entre todos los radicales formados, el más reactivo es el radical hidroxilo (OH-).

3. DAÑO E INACTIVACIÓN

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La radiación ionizante inactiva a las células alterando algunas de las estructuras críticas para su supervivencia; la mayoría de las veces el material genético, como se ha comentado anteriormente. El daño a la doble hélice afecta a la expresión de algunos genes y a la biosíntesis de varias enzimas que interfieren con la división celular, tanto en células procariotas como eucariotas; por ello, la irradiación es tan útil para impedir la proliferación de microorganismos, como para inhibir la germinación y ralentizar la maduración de ciertos vegetales. Finalmente, la supervivencia o muerte de la célula irradiada vendrá condicionada por la magnitud del daño infringido a las estructuras vitales y a su capacidad de reparación y/o eliminación de las porciones dañadas del material genético, aspecto este muy dependiente del organismo, como se verá más adelante. Según se ha indicado, el daño sobre el material genético se produce como consecuencia de una colisión directa de la energía radiante (fotón o electrón) 7 http://tratado.uninet.edu/c090104.html

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con la cadena de ADN (acción directa), o como resultado de la interacción con una molécula adyacente agua en la mayoría de los casos que, al ionizarse, reacciona con el material genético próximo (acción indirecta). El resultado final de cualquiera de las dos acciones es la rotura de una o de las dos ramas de la doble cadena de ADN. La ruptura completa de la doble hélice se cree poco frecuente ya que para ello se requeriría una orientación muy concreta del ADN en relación con la fuente de radiación, o que los radicales formados actuasen en puntos muy próximos de ambas hebras de la doble hélice, circunstancia esta también poco probable. De los dos posibles mecanismos de acción de las radiaciones ionizantes, la acción indirecta se considera actualmente la principal responsable de las lesiones del ADN: las roturas del ADN se producen como consecuencia del ataque de los radicales libres, formados por la radiolisis del agua, sobre la desoxirribosa y especialmente sobre las bases nitrogenadas de la doble hélice. Se cree que aproximadamente el 20% de los radicales libres actúan a nivel de los azúcares del ADN sustrayendo los átomos de hidrógeno de la desoxirribosa y el 80% restante a nivel de las bases nitrogenadas, siendo la base más sensible la timina, seguida de la citosina, la adenina y la guanina. 4. CINÉTICA DE INACTIVACIÓN MICROBIANA POR RADIACIONES IONIZANTES 8

Se representa en forma de gráficas de supervivencia. Las líneas de supervivencia se obtienen representando la fracción de supervivientes, en escala logarítmica, frente a la dosis de radiación absorbida, en escala lineal. A partir de los datos observados se ha deducido que en la mayoría de las ocasiones la línea de supervivencia es recta o, dicha en otras palabras, que la velocidad de inactivación se mantiene constante e independiente de la fracción de supervivientes. Esta cinética puede explicarse asumiendo que todas las células que componen la población tienen la misma resistencia a la irradiación y que el daño que provocan las radiaciones se produce al azar. En estas circunstancias las potenciales lesiones letales se dispersarán aleatoriamente en la población y por tanto cada componente de la misma tendrá idéntica probabilidad de morir; es decir, que la cinética de muerte bacteriana sigue un patrón semejante al de una reacción de primer orden, con la misma proporción de muertes en el tiempo. En una gráfica de supervivencia típica, tal como la que muestra la figura, el número de supervivientes desciende exponencialmente con la dosis de radiación absorbida (medida en kGy) a una intensidad constante.

8http://www.catedu.es/ctamagazine/index.php? option=com_content&view=article&id=81&catid=94:artlos-del-mesarchivo&Itemid=41

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Esta cinética exponencial permite definir un parámetro, conocido como valor de reducción decimal o valor D -conceptualmente similar al valor Dt de los tratamientos térmicos-, con el que se puede comparar directamente la radiorresistencia de diferentes microorganismos y cuantificar la influencia de un factor medioambiental en la sensibilidad microbiana a las radiaciones ionizantes. El valor D se define como la dosis de radiación (kGy) necesaria para reducir la población microbiana en un 90%, es decir un ciclo logarítmico decimal. El valor D es la inversa negativa de la pendiente de la recta de supervivencia y se calcula matemáticamente mediante la ecuación:

Dónde: N0: Es el número inicial de microorganismos N: El número de supervivientes tras el tratamiento de irradiación con una dosis d

MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN La reparación del ADN bacteriano dañado se produce básicamente por dos mecanismos bien diferenciados: el primero es un mecanismo rápido entre 1 y 2 minutos a 20-37 0C, o 10 minutos a 0 0C, independiente del medio de recuperación y que requiere que un enzima, la DNA polimerasa I, elimine y reemplace las bases dañadas para que posteriormente otro enzima, la polinucleótido ligasa, una los extremos de la cadena rota. El segundo mecanismo es lento 40 a 60 minutos a 37 0 C, dependiente del medio de recuperación y que conlleva un proceso de recombinación utilizando el ADN de la hebra parental como patrón. Un aspecto que hay que destacar es que, como consecuencia de los mecanismos de reparación, las radiaciones ionizantes pueden llegar a producir mutaciones, especialmente cuando se produce la rotura de una sola hebra. Afortunadamente, por el momento, nunca se ha observado que como consecuencia de las mutaciones se haya inducido patogenicidad en bacterias no patógenas; de hecho, más bien parece ocurrir lo contrario. Se ha observado que algunas especies patógenas

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disminuyen o incluso pierden totalmente su virulencia como consecuencia de la mutación. Por otra parte, la mayoría de las células mutadas por acción de la radiación ionizante son más susceptibles al estrés generado por otros factores medioambientales; así, se ha demostrado que la irradiación a dosis subletales -0,1 – 0,3 kGy, reduce hasta 5 veces la resistencia al calor de células del género Salmonella. Al margen de los efectos descritos sobre el material genético, la radiación puede alterar también otros componentes y/o estructuras celulares, tales como enzimas, componentes citoplasmáticos diversos y, sobre todo, a las envolturas, cuya permeabilidad puede alterar comprometiendo la viabilidad de la célula. Así, se ha demostrado que los radicales formados por radiolisis del agua pueden actuar sobre los ácidos grasos poliinsaturados de las membranas celulares, afectando a la actividad de las enzimas y proteínas asociadas a la membrana, ocasionando la pérdida de líquido intracelular, e incluso produciendo la ruptura de la membrana y la posterior muerte de la célula al cabo de un cierto tiempo del tratamiento. Es decir, las radiaciones ionizantes pueden producir distintas lesiones subletales en la célula a muy diversos niveles, lo que puede jugar un papel fundamental en la supervivencia de los microorganismos incluso cuando no se ha producido ningún daño genético irreparable. Desde un punto de vista práctico, la existencia de estos daños subletales y su efecto sensibilizante frente a otros agentes estresantes resultan de gran interés en la Tecnología de los Alimentos, ya que abren la posibilidad de desarrollar “procesos combinados” de conservación. Estos procesos serán, lógicamente, de menor intensidad y permitirán conseguir un determinado nivel de inactivación de la población microbiana de interés, minimizando el impacto de los tratamientos en las propiedades sensoriales del alimento.

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VII.

EFECTOS DE LA RADIACIONES ULTRAVIOLTA

La radiación UV se divide en tres bandas: UVA (320 a 400 nm), UVB (280 a 320), y la UVC (200 a 280 nm). La UVA no es filtrada por la capa de ozono en el mismo grado que la UVB y la UVC, y cantidades suficientes de la misma penetran a través de las nubes y de los vidrios. En un día de verano, la UVB comprende aproximadamente el 5% de la radiación UV, y la UVA el 95% restante. Sin embargo la UVB es más responsable que la UVA en producir daño biológico, ya que contribuye con cerca del 80% de los efectos dañinos que se asocian a la exposición solar, la UVA sólo produce el 20% restante. 9

La radiación UV tiene un efecto letal y mutagénico, que depende de su longitud de onda. Ello se debe a la absorción selectiva de longitudes de onda por parte de ciertas moléculas biológicas:

9 http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S037848352006000700003&script=sci_arttext

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 Las proteínas tienen dos picos (es decir, máximos) de absorción: uno a 280 nm, debido a los aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230 nm, debido a los enlaces peptídicos.  El ADN y el ARN absorben a 260 nm, debido al enlace doble entre las posiciones 4 y 5 de las bases púricas y pirimidínicas. Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios químicos en las moléculas absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadas genéricamente fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivación de macromoléculas, aunque, como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismos para paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas. Las consecuencias de inactivar proteínas o ARN no se dejan sentir a efectos de letalidad, ya que existen muchas copias de cada uno de estos tipos de macromoléculas, y se pueden volver a sintetizar. En cambio, la inactivación del único cromosoma de la bacteria tiene efectos letales primarios y efectos mutagénicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de acción biológica de la luz UV equivale al de absorción del UV por el ADN (260 nm).

a. Fotoproductos del ADN Ocasionados Por la Luz UV Los fotoproductos generados por la luz UV en el ADN derivan principalmente de alteraciones en las bases pirimidínicas (citosina, timina): Los dímeros de pirimidina son los fotoproductos más importantes en las células vegetativas bacterianas. El principal es el dímero de timina (T-T), aunque también se producen T-C y C-C. Como se puede observar, se trata de aductos (uniones) entre dos pirimidinas adyacentes en la misma hebra de ADN, mediante la creación de un anillo de ciclobutano. Su efecto principal es la distorsión local de la configuración de la doble hélice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases complementarias; ello, a su vez, provoca una interferencia en los procesos de replicación y transcripción, y secundariamente en el crecimiento y la respiración.

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A dosis muy altas de rayos UV se forman también dímeros entre pirimidinas de las dos cadenas, es decir, se provocan entrecruzamientos de las dos hebras que igualmente afectan a la replicación y a la transcripción, aunque este tipo de daños reviste menos significación biológica. El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina, se forma en la endospora bacteriana debido al alto grado de deshidratación, pudiendo ejercer igualmente efectos inactivantes. Aunque la acumulación de fotoproductos de la espora puede ser igual de letal que la de los dímeros de pirimidina, cuando germina la espora se pone inmediatamente en marcha un eficiente sistema de reparación específico de ese fotoproducto.10 Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se forman a altas dosis de luz UV. Tienen efecto mutagénico (no letal), favoreciendo la aparición de transiciones T=A a C=G. b. Mecanismos de Reparación de los Fotoproductos Debido al carácter esencial del ADN como molécula central informativa de los seres vivos, la evolución ha desarrollado una serie de mecanismos capacitados para enfrentarse con los posibles daños ocasionados por la luz ultravioleta. Los principales mecanismos hallados en bacterias se pueden agrupar así:  Reparación fotoenzimática: Se debe a la actuación de una enzima denominada fotoliasa o enzima fotorreactivante, que muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las fotoliasas reparan directamente los dímeros de pirimidina, en una reacción que 10 http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/09esporas.htm

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requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda (luz azul). Estas enzimas poseen dos grupos prostéticos coloreados (cromóforos): -flavina reducida (FADH2) -

una pterina.

Mecanismo 1) La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa reconoce el dímero de pirimidina, y se une a él, formando un complejo enzimasustrato [E-S]. 2) La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz (l=300-500), se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dímero de pirimidina, rompiéndolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar. Aunque se sabe que el segundo cromóforo (la pterina) favorece la reparación, no está claro cuál es su papel exacto.  Reparación por escisión-resíntesis La distorsión en la doble hélice provocada por el dímero es reconocida por un complejo proteico con actividad de endonucleasa correctora, conocido como correndonucleasa o escinucleasa. El daño se repara indirectamente (es decir, no se actúa sobre el propio fotoproducto), sino que las bases dañadas se eliminan (se escinden) formando parte de un oligonucleótido, y el hueco resultante se rellena por resíntesis reparadora de ADN.

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Mecanismo: 1) Un complejo formado por dos subunidades de la proteína UvrA y una de la UvrB (Uvr [A2B]) se une cerca del dímero de pirimidina, usando la energía de la hidrólisis del ATP, y merced a su actividad helicasa, desenrolla localmente la doble hélice. 2) Se une la proteína UvrC, con lo que se completa el complejo Uvr [A2BC], es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena dañada del ADN, cerca del dímero. 3) La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el dímero: corta el 8º enlace fosfodiéster “a la izquierda” del dímero (o sea, hacia el lado 5') respecto de la localización del dímero y corta el 4º o 5º enlace fosfodiéster “a la derecha” (en dirección 3' del dímero). Por lo tanto, se produce y libera un fragmento de unos 12 nucleótidos de longitud, que incluye al dímero de pirimidina, al mismo tiempo que se retira la escinucleasa, que se separa en sus polipéptidos constituyentes. 4) Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este hueco es ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II (codificada por el gen uvrD), que llevan a la síntesis de nuevo ADN para rellenar el hueco (por supuesto, en sentido 5' à 3'), tomando como molde la cadena intacta, y usando como cebador (“primer”) el extremo 3'-OH que se había generado en la fase anterior. 5) Finalmente, la actuación de la ADN-ligasa sella la cadena (regeneración del enlace fosfodiéster del lado 5').

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 Reparación por recombinación Cuando la ADN-polimerasa-III bacteriana (que es la enzima que normalmente replica el cromosoma) se encuentra, en la cadena que está usando como molde, con un dímero de pirimidina, deja de replicar esa zona, y “salta” unos 1000 nucleótidos más adelante para seguir la replicación. Por lo tanto, deja un gran hueco o mella de unos 1000 nucleótidos. Esta discontinuidad (llamada mella post-replicativa) se puede rellenar por el mecanismo de reparación por recombinación general, recurriendo a la proteína RecA, que verifica una recombinación con la hebra parental homóloga intacta.

Mecanismo: 1) Numerosas unidades de proteína RecA recubren la zona de cadena sencilla de la mella posreplicativa, formando estructuras helicoidales. 2) La proteína RecA promueve emparejamiento homólogo de la cadena sencilla a la que recubre con la doble cadena “hermana” intacta. 3) Se produce un intercambio recíproco de cadenas. 4) El extremo 3'-OH libre de la cadena dañada (que merced al intercambio recíproco está ahora emparejada con la cadena complementaria procedente de la doble hélice “hermana”) sirve de cebador a la ADN-polimerasa-I, que sintetiza ADN nuevo usando como molde la cadena complementaria intacta del dúplex.

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5) Ligación e isomerización espontáneas, que produce la llamada “estructura de Holliday”, una figura en “X” donde hay dos sobrecruzamientos (“crossing-over”) que mantienen unidos entre sí a los dos duplex. 6) Resolución de los dos sobrecruzamientos por sendas roturas y religaciones, lo cual genera dos dobles hélices ininterrumpidas. Como se ve en la figura, uno de estos dúplex lleva el dímero de pirimidina, y el otro es una doble cadena intacta, aunque parte de ella contiene ADN de nueva síntesis. Como se puede ver, el mecanismo de reparación por recombinación no repara por sí mismo la lesión en el ADN, pero logra reparar la mella postreplicativa, evitando que se detenga la replicación del cromosoma. Al final del proceso el dímero como tal sigue sin reparar, pero ahora tendrá una oportunidad de ser reparado por algún otro mecanismo, como el de escisión-resíntesis.  Reparación de emergencia (SOS) propensa a error Cuando la bacteria se somete a dosis elevadas de luz UV o a determinados agentes químicos que dañan severamente el ADN, o que interfieren seriamente con la replicación, puede ocurrir que los sistemas de reparación que hemos visto hasta ahora no sean suficientes para reparar todos los daños; en estas circunstancias se pone en marcha un nuevo mecanismo, que es inducible y que calificamos como de emergencia, ya que tiende a salvaguardar la viabilidad de la célula, a costa de acumular mutaciones con frecuencia elevada (y por eso lo llamamos también propenso a error).

Descripción del sistema en una célula normal (no sometida a daños al ADN): El gen lexA posee un nivel basal de expresión, de modo que codifica la proteína LexA, que actúa como represor sobre su propio gen (represión autógena), así como sobre los genes recA, uvrA, B, C, umuDC. La represión no es total, sino que

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se da un nivel basal de producción de los polipéptidos correspondientes a estos genes. Así, por ejemplo, el nivel de proteína RecA es suficiente para efectuar los procesos normales de recombinación, y los niveles de UvrABC son suficientes para reparar pequeños daños en el ADN. Descripción del sistema en una célula severamente dañada: Una célula seriamente afectada por un agente que daña el ADN o interfiere con su replicación poseerá zonas de cromosoma con ADN de cadena sencilla (c.s.) sin reparar. Pues bien, este ADN de c.s. constituye una señal de situación de emergencia para la proteína RecA: dicha proteína se une a esas regiones de c.s., de modo que adquiere una actividad proteasa muy específica (para distinguir esta actividad, usamos la nomenclatura RecA*). La proteína RecA* (activada como proteasa) induce la proteólisis del represor LexA (rompiéndolo entre dos aminoácidos concretos hacia la mitad de la molécula). Por lo tanto, ya no hay suficiente proteína LexA intacta como para seguir reprimiendo a los genes citados (recA, uvrABC, umuDC). Dichos genes (llamados genéricamente genes SOS) se pueden expresar ahora a altos niveles, de modo que: Aumentan los niveles de RecA, lo que conlleva un aumento de la eficiencia de la reparación por recombinación; Aumentan los niveles de la escinucleasa (Uvr [A2BC]), lo que supone mejorar la reparación por escisión-resíntesis; Se expresan los genes umuDC, lo que se traduce en un aumento de la mutagénesis. El mecanismo exacto no está claro. Se sabe que en esta situación de emergencia algunos dímeros de pirimidina son procesados con la intervención de los productos de recA y de umuD y umuC, de modo que hay una síntesis de emergencia de ADN que acarrea la frecuente introducción de bases incorrectas (es decir, es un proceso de reparación propenso a error). De esta manera, la célula salvaría su integridad en esta situación “límite”, pero a costa de adquirir frecuentes mutaciones. c. Aplicaciones Prácticas de la Luz UV Mecanismo de desinfección UV Dimerización del ADN Los microorganismos son inactivados por la luz UV como resultado del daño fotoquímico a sus ácidos nucleicos. La radiación UV es absorbida por los nucleótidos, los bloques constitutivos del ADN y ARN de la célula, según la longitud de onda, con los valores más altos cerca de 200 y 260 nm. La UV absorbida promueve la formación de enlaces entre nucleótidos adyacentes, con lo que se crean moléculas dobles o dímeros. Si bien la formación de dímeros de tiamina-tiamina son los más comunes, también suelen ocurrir dímeros de citosina-citosina, citosinatiamina, y dimerización del uracilo. La formación de un número suficiente de dímeros dentro de un microbio impide que éste replique su

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ADN y ARN, lo que impide su reproducción. Debido a la dependencia de la longitud de onda para la absorción de UV por parte del ADN, la inactivación UV de los microbios también está en función de la longitud de onda. La figura presenta el espectro de acción germicida de la inactivación de E.Coli con luz UV (DIN, 1996). El espectro para el E. Coli alcanza su punto máximo en las longitudes de onda cercanas a 265nm y 220nm. Es conveniente que la salida de la lámpara de baja presión a 254nm coincida con el punto de máxima inactivación que se ubica cerca de 265 nm.11

Cuadro: Radiación de energía ultravioleta necesaria para destruir hasta en un 99.99% de los microorganismos patógenos del agua BACTERIAS

ENERGIA µW/cm2

Bacillus antharacis

8.700

S. enteritidis

7.600

B. Megatherium sp.(veg) B. Megatherium sp.(sporas) B. peratyphosus

2.500 5.200 6.100

B. subtilis

11.000

B. subtilis spores

22.000

Clostridium tetani Corynebacterium diphtheriae Eberthella typosa Escherichlia coli Micrococcus candidus Mycobacterium tuberculosis Neisseria catarrhalis Phytomonas tumefaciens

OTROS ORGANISMOS

ENERGIA µW/cm2

LEVADURA Saccharomyces ellipsoideus Saccharomyces sp. Saccharomyces cerevisiae Levadura para cerveza Levadura para panadería Levadura para repostería

13.200 1.600 13.200 660 800 13.200

22.000 6.500

ESPORAS

4.100 6.600 12.300 10.000 8.500 500

Penicillium roqueforti Penicillium expansum Mucor racemosus A Mucor racemosus B Oospora lactis

26.400 22.000 35.200 5.200 1.100

11 http://bvsper.paho.org/bvsacg/e/fulltext/simposio/ponen10.pdf

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Proteus vulgaris Pseudomonas aeryginosa Pseudomonas fluorescens

6.600 10.500 6.600

S. typhimurium

15.200

Salmonella

10.000

Sarcina lutea

26.400

Serratia marcescens Dysentry bacilli Shigella paradysenteriae Spirillum rubrum Staphylococcus alous Staphylococcus aureus Streptoccus hemolyticus Streptoccus lactis Streptoccus viridans Fuente:12

VIRUS

6.160 4.200

Bacteriophage (E. coli) Virus de la influencia Virus de la hepatitis Poliovirus(Poliomy elitis) Rotavirus

6.600 6.600 8.000 1.000 24.000

3.400 6.160

ALGAS

5.720 6.600

Chlorella vulgaris

2.000

5.500 8.800 3.800

VIII. EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE A diferencia de la UV, la luz visible es de baja energía, y además, sus cuantos no tienen efectos selectivos sobre el ADN, por lo que no sería de esperar, en principio, que este tipo de radiación tuviera efectos negativos sobre las bacterias. Sin embargo, la luz visible puede ejercer un efecto negativo indirecto, en el fenómeno de sensibilización fotodinámica. La luz visible de fuerte intensidad (exposición a pleno sol) es capaz de matar las bacterias, debido a que ciertas moléculas de éstas (riboflavinas, porfirinas, citocromos) absorben la energía de los cuantos y se excitan durante 10-6-10-8 segundos, tras lo cual reemiten la energía a otras moléculas, originando fotooxidaciones en residuos His y Trp de las proteínas y en las bases de los ácidos nucleicos. También se puede generar oxígeno singlete (1O2), que es un radical muy reactivo, oxidante, que puede destruir la célula con rapidez.

12 http://www.bvsde.paho.org/bvsacg/fulltext/desinfeccion/capitulo4.pdf

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Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintéticas, y las que se propagan vía aérea) poseen abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las protegen de estos efectos fotosensibilizadores. (Los carotenoides captan la energía del oxígeno singlete y la reenvían al estado basal, no excitado). a. Sensibilización Fotodinámica Natural Los experimentos fotodinámicos en bacterias han revelado que la envoltura celular parece ser el componente atacado por el oxígeno singlete y la eficacia de la desinfección depende principalmente de la estructura de la membrana. Ensayos con colorantes en fase heterogénea, separados físicamente de las bacterias objetivo por una delgada capa de aire, han puesto de manifiesto que el sensibilizador no necesita estar unido ni penetrar en la membrana para inactivar las células de forma eficaz. Se ha demostrado que las reacciones del oxígeno singlete están involucradas en la fotomodificación de otras membranas como las de los glóbulos rojos, mitocondrias, microsomas y liposomas. Se han encontrado grupos sensibles al oxígeno singlete no sólo en las membranas lipídicas, sino también en proteínas y ácidos nucleicos. Así, por ejemplo, tras una irradiación de 5 minutos con luz de 675 nm en presencia de una concentración 1 µM de fotosensibilizador, tiene lugar una disminución de hasta 4–5 órdenes de magnitud en la supervivencia del Staphylococcus aureus (bacteria Gram positiva), tanto en una cepa salvaje como en una cepa resistente a meticilina. Se han observado diferencias entre la capacidad de desactivación de bacterias Gram (+) y Gram (–) por ciertos fotosensibilizadores, siendo este segundo tipo bacteriano habitualmente más resistente a la inactivación por oxígeno singlete. Algunos autores sugieren que la cubierta de lipopolisacáridos (LPS) de las bacterias Gram (–) puede ofrecer alguna protección frente a los efectos letales de ciertos agentes exógenos, de forma que permitiría a estas bacterias sobrevivir en los que, de otra manera, se considerarían ambientes hostiles. Los LPS son una barrera física y química a través de la cual el 1O2 y los radicales hidroxilos generados en el exterior celular deben penetrar para interaccionar con sus dianas, como son por ejemplo ciertos componentes de la membrana y algunos componentes citoplasmáticos. b. Sensibilización Fotodinámica Artificial La terapia fotodinámica (PDT) está emergiendo como una prometedora técnica para el tratamiento de ciertos cánceres, infecciones localizadas y enfermedades como la degeneración macular, el acné y otras alteraciones de la piel. Requiere la presencia simultánea de tres componentes: un agente fotosensibilizador, luz y

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oxígeno, debido a que el oxígeno singlete es el principal agente citotóxico producido durante PDT (aunque no el único). 13 La luz necesaria para activar la mayoría de los fotosensibilizadores no puede penetrar más de aproximadamente un tercio de una pulgada de tejido (1 centímetro). Por esta razón, la terapia fotodinámica normalmente se usa para tratar tumores en la piel o justo por debajo de la misma, o en el revestimiento de órganos o cavidades internas. La terapia fotodinámica es también menos eficaz para tratar tumores grandes, porque la luz no puede penetrar lo suficiente a través de estos tumores. La terapia fotodinámica es un tratamiento local y por lo general no se puede usar para tratar el cáncer que se ha diseminado (metastatizado).14

13 https://www.psa.es/webesp/projects/solarsafewater/documents/libro/15_Capitulo_15. pdf 14 http://www.cancer.gov/espanol/cancer/tratamiento/tipos/cirugia/hoja-informativaterapia-fotodinamica

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