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• Yuranis Cantillo Ortiz

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CARBOHIDRATOS: Determinación de glucosa en sangre 1. Objetivos: 1. Conocer la técnica mediante la cual se determina la glucosa en sangre 2. Diferenciar pacientes con hipo e hiperglicemia 2. Fundamento teórico: La glucosa es la principal fuente de energía de las células en el organismo. La glucosa es un monosacárido con una concentración postpandrial de 90 mg/dl en la sangre y sirve como una fuente de energía indispensable para la función celular. El diagnóstico de los trastornos del metabolismo de los hidratos de carbono se apoya en parte en la medición de la glucosa plasmática, ya sea en ayuna o tras estimulación o pruebas de supresión. Los resultados de la glucosa plasmática pueden clasificarse como hiperglucémicos (como la diabetes mellitus) o hipoglucémicos. Principio de la reacción: La prueba utilizada se determina mediante el método enzimático colorimétrico, basado en la reacción de Trinder. Glucosa + O2 + H2O GOD (glucosa oxidasa) ácido glucónico + H2O2 2H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol POD (peroxidasa) quinoneimina (rojo) + 4H2O La glucosa se determina después de la oxidación enzimática en presencia de glucosa oxidasa. El peróxido de hidrógeno formado reacciona bajo la catálisis de peroxidasa con fenol y 4aminoantipirina formando un complejo rojo violeta llamado quinoneimina. Punto final de una reacción: Las reacciones catalizadas por enzimas son únicas en el sentido de que presentan aumentos muy grandes de la velocidad en relación a las reacciones no catalizadas y muestran una cinética de saturación, es decir la velocidad de la reacción alcanza un valor máximo a una concentración determinada de sustrato, no dan por resultado aumento de la velocidad de la reacción. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos. En el caso de la reacción de la glucosa catalizada por la enzima glucosa oxidasa y la peroxidasa llega a su punto final cuando todo el sustrato (glucosa) se ha oxidado, y después se mide el cambio de color. Espectofotómetro: La absorbancia y la transmitancia de una sustancia en disolución se miden con un aparato denominado espectrofotómetro, el cual consta básicamente de los siguientes componentes: Fuente de luz: Lámpara que emite una mezcla de longitudes de onda. Colimador: Conjunto de lentes que enfocan la luz convirtiéndola en un haz de rayos paralelos. Monocromador: Dispositivo que selecciona luz de una única longitud de onda. Detector fotoeléctrico: Transductor de luz en electricidad. La luz provoca el desplazamiento de electrones en el metal del detector, produciendo una corriente eléctrica que es proporcional a la intensidad de la luz recibida. Registrador: Mide la señal del detector, la compara y genera una medida en una escala determinada.

A) Esquema de un espectrofotómetro de un solo haz B) Esquema de un espectrofotómetro de doble haz, en el cual se corrigen las variaciones espectrales de los diferentes elementos ópticos que lo componen El funcionamiento del espectrofotómetro es el que sigue: la luz de una fuente continua pasa a través de un monocromador, que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz incidente. Esta luz “monocromática” atraviesa una muestra de espesor b, y se mide la potencia radiante de la luz que sale. Es necesario calibrar el espectrofotómetro con un blanco antes de medir las absorbancias de la disolución problema. Esta celda o cubeta de referencia sirve para compensar los efectos de reflexión, dispersión o absorción de luz de la celda con el disolvente. Cuando emerge poca luz de la muestra (absorbancia alta), la intensidad es difícil de medir. Cuando emerge mucha luz de la muestra (absorbancia baja), es difícil detectar la diferencia de absorbancia entre las celdas de muestra y de referencia. 3. Parte experimental: 3.1. Procedimiento: Ensayo: Longitud de onda: Hg 546 nm. Paso de luz: 1 cm Temperatura: 20-25ºC Medición: frente a un blanco de reactivo. Se requiere un blanco de reactivo por serie Esquema de pipeteo: Microdeterminación Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo STD ó muestra STD ó muestra 5 ul Reactivo para glucosa 500 ul 500 ul Mezclar, incubar por 10 minutos de 20-25ºC ó 5 minutos a 37ºC. Medir la absorbancia del STD y las muestras frente a un blanco de reactivo antes de 60 minutos.

Materiales y reactivos: Materiales Espectrofotómetro

Reactivos Reactivo para glucosa

Tubos de ensayo Estándar de glucosa (100 mg/dl) Gradilla Muestras de suero sanguíneo (ó plasma) Pipetas automática Puntas de plástico para pipetas automát.. Reloj Cubetas de plástico para espectrofot. Nota: El espectrofotómetro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las absorbancias. 2. Cálculo de la concentración de la glucosa C (mg/dl)= 100 x ∆A muestra ∆A Estándar

Valores de referencia: 70 – 100 mg/dl TRABAJO EN CLASE: Realizar el análisis de glucosa en un suero sanguíneo y luego reportar los cálculos en la carpeta con la respectiva interpretación del resultado