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TRANFERENCIA Y  MANIPULACION DE GENES  Dr. Sergio Gutiérrez Instituto de Biología Molecular y  Biotecnología

Contenido… • • • • • •

Recombinacion Transformación Transducción Transposición Conjugación Clonamiento de genes: vectores, hospederos y  expresión • Clonamiento y expresión de genes mamíferos

Recombinación • Intercambio físico de DNA entre elementos  genéticos. • Proceso complejo (E. coli, aprox. 25 genes) • Recombinación homóloga

Recombinación homóloga

Detección de recombinación  homóloga

Transformación bacteriana Griffith, 1928: el “principio transformante”

Avery et al., 1944: el ADN es  el “principio transformante”. Hotchiss, 1949. Herschey y Chase, 1952.

Desarrollo de la  genética bacteriana

17 AA

41 AA

+ R‐ NADH oxidase (Nox)

(SSB) (DprA)

(PP)

B

B/I

(~14 genes) Streptococcus pneumoniae

Diferencias con S. Pneumoniae ¾ Fase estacionaria.

Endonucleasa “de entrada” EndA ¾ Cultivos competentes heterogéneos (mesosomas). ¾Desarrollo de la competencia:

Proteínas de Translocación ªfase de crecimiento.

ComC; ComG1‐7; ComF1‐3; ComE1 ‐3;1 ªtipo nutricional (glucosa; AA). comC/cilC

ªtipo celular (C/NC)

= comS

Bacillus subtilis

comG/cilD comE/cilE

Penetración del ADN en bacteria Gram‐positivo

EndA

ComG1

3’

Fases de la transformación natural • • • •

Competencia Unión y entrada del ADN exógeno a la célula Fase de eclipse Destino del ADN exógeno (exogenote):  recombinación con el endogenote.

Fase de Eclipse

Especificidad del ADN

Transformasoma (~12)

Transformación Artificial

¾Golpe de calor (42°C) en presencia de CaCl2 ¾Protoplastos (lizozima) en medio hipertónico y PEG ¾Electropermeabilización/Electrotransformación. 90

Flujo de ATP

80

8 ms

70 60 50 40 30 20 10 0 0

6,4 6,7

7

7,3 7,5 7,8 E (Kv/cm)

8

8,5

9

9,5

Transducción

Transducción  especializada

Es posible hacer un lisado  con un alto título del fago  transductante

Transduccion  Generalizada

Ej. Fago P1

Conjugación

Alternativas de F en la célula

Integración de F en el cromosoma

Destinos de F’

Transferencia de cromosoma mediada por F (cepas Hfr)

Mapa del factor F

OriV: replicación bidireccional OriS: replicación unidireccional

OriS

OriV

Los genes tra se clasifican de acuerdo a su función 1. Síntesis y ensamblaje del pili (traA, B, C, E, F, G, H, K, L,  Q, U, V, W). 2. Estabilización del par conjugante (traG y N) 3. Metabolismo conjugativo del DNA (traD, I, M, Y, Z) 4. Regulación de la transferencia (traJ, finO, finP) 5. Exclusión de superficie (traS y T)

Mapa del factor R

Movilización de plasmidios  no conjugativos a través de  plasmidios conjugativos

Clonación Molecular La clonación consiste en la obtención de un conjunto de elementos genéticamente  iguales entre si e iguales a su precursor. 

Manipulación de genes

Estrategia general del proceso de clonación

1. Aislamiento del ADN foráneo 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-DNA foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

Enzimas de restricción • Endonucleasas (enzimas) de restricción ‐> Enzimas de  bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo  cortan por el esqueleto azúcar‐fosfato. • Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al  azar) • Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones  invertidas o palíndromes.

5´‐GGATCC‐ 3´ 3´‐CCTAGG‐ 5´

EcoRI: E. Coli BamHI: Bacillus amyloliquefaciens

Productos generados por enzimas de restricción

extremos cohesivos EcoRI

5’…GAATTC…3’ 3’…CTTAAG…5’

5’…G 3’…CTTAA

AATTC…3’ G…5’

PstI

5’…CTGCAG…3’ 3’…GACGTC…5’

5’…CTGCA 3’…G

G…3’ ACGTC…5’

extremos romos HaeIII

5’…GGCC…3’ 3’…CCGG…5’

5’…GG 3’…CC

CC…3’ GG…5’

Vectores de clonación • Vehículos de DNA capaces de almacenar DNA  foráneo y replicarlo. • Características principales – Replicación autónoma (origen de replicación) – Presencia de regiones no esenciales para su  multiplicación y estabilidad

Creación de moléculas de DNA Recombinante in vitro

5’ ...GAATTC...

...GAATTC...

3’

3’ ...CTTAAG...

...CTTAAG...

5’

Eco RI

Eco RI

Separation of restriction fragments 5’ G

-OH

-OH

anneal

3’ CTTAA

(P)

(P)

5’ G

AATTC 3’

3’ CTTAA

(P)

anneal

AATTC 3’ G 5’

G 5’ (P)

OH

OH

DNA Ligase

5’ GAATTC 3’ CTTAAG

Recombinant DNA

Introducción del vector-DNA foráneo en la célula hospedadora • Transformación (plásmidos) • Transducción • Conjugación SELECCIÓN • Resistencia a antibióticos • Genes marcadores (gen β-galactosidasa) • GFP (green fluorescent protein) • Hibridación de colonias

En resumen…

Vectores de expresión

REQUISITOS PARA UNA BUENA EXPRESION El número de copias del gen por célula (alto vs vectores de  integración) Regulación y eficiencia del promotor. Ej. lac, trp, tac, PL, Φ10 (reconocido por la RNApolimerasa del fago T7). Iniciación de la traducción Uso de codones Estabilidad de la proteína. Proteínas de fusión. Proteínas secretadas

UN VECTOR DE EXPRESION

Las células que llevan este  plasmidio sin inserto en lacZα formarán colonias azules en placas  X‐gal‐IPTG en presencia del  fragmento lacZω (huésped debe  ser  lacZΔM15; lacZ‐, y lacIq;  α‐ complementación)

Sistema de expresión pT7‐7/pGP1‐2 452

bla

Lambda: 35711

Cla I

Hinc II

pT7-7 Orige n Col EI

2473 pb

Bgl II

φ10

Xba I

rbs

Hind III Pst I Sal I Xba I BamH I Sma I EcoR I Nde I ATG

2760

Lambda: 35259/ T7:3106

T7 Gen 1 (RNA polimerasa)

PLSma I Sac I EcoR I Pla c

pGP1-2 T7:5847 BamH I

7140 bp

Promotor T7

T7:2285 7

Hind III

CGATTCGAACTTCTCGATTCGAACTTCGATAGACTTCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGA

met ala arg ile CCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT ATG GCT AGA ATT

rsb

Nde I

arg ala arg gly ser ser arg val asp leu gln pro lys leu ile ile asp... CGC GCC CGG GGA TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAG CCC AAG CTT ATC ATC CAT... Sma I

BamH I

Xba I

Sal I Pst I

Hind III

Cla I

Sma I

Kan

EcoR I

2900 T7: 22972

Xho I

cI-857 1050 Pst I

E. coli K-38pGp1-2/pT7-7

E. coli K-38pGp1-2/p157 E. coli K-38pGp1-2/pT7-7 E. coli K-38pGp1-2/p157

T

A

S

P

T S

P

M

T

S

P

T S

P

M

T

MI ME M

T

MI

ME

B

Expresión de la proteína de la inmunidad desde p157. La flecha indica la banda correspondiente a la proteína de inmunidad. (A), PAGE-SDS-16% de los extractos obtenidos. (B), Autorradiografía de PAGE-SDS mostrado en A. T, fracción total; S, fracción soluble; P, fracción particulada; M, marcadores de peso molecular.

Localización de la proteína de la inmunidad en la membrana interna. PAGE-SDS-14% de los extractos obtenidos. La flecha indica la banda correspondiente a la proteína de inmunidad. T, fracción total; MI, fracción de membrana interna; ME, fracción de membrana externa; M, marcadores de peso molecular.